相關(guān)申請信息

本申請要求于2014年8月19日提交的美國臨時專利申請62/039,341號的優(yōu)先權(quán)，其通過引用其全文納入本文用于所有目的。

背景技術(shù)：

細(xì)菌和古細(xì)菌crispr-cas系統(tǒng)依賴于與cas蛋白負(fù)荷的短引導(dǎo)rna以引導(dǎo)入侵外來核酸內(nèi)存在的互補(bǔ)序列的直接降解。參見deltcheva，e.等，通過反式編碼小rna和宿主因子rna酶iii的crisprrna突變(crisprrnamaturationbytrans-encodedsmallrnaandhostfactorrnaseiii).nature471，602-607(2011)；gasiunas，g，barrangou，r.，horvath，p.和siksnys，v.cas9-crrna核蛋白蛋白復(fù)合物介導(dǎo)細(xì)菌的獲得性免疫的特異性dna切割(cas9-crrnaribonucleoproteincomplexmediatesspecificdnacleavageforadaptiveimmunityinbacteria).proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica109，e2579-2586(2012)；jinek，m.等，獲得性細(xì)菌免疫中可編程的雙rna-引導(dǎo)的dna內(nèi)切核酸酶(aprogrammabledual-rna-guideddnaendonucleaseinadaptivebacterialimmunity).science337，816-821(2012)；sapranauskas，r.等，嗜熱鏈球菌crispr/cas系統(tǒng)提供大腸桿菌中的免疫(thestreptococcusthermophiluscrispr/cassystemprovidesimmunityinescherichiacoli).nucleicacidsresearch39，9275-9282(2011)；和bhaya，d.，davison，m.和barrangou，r.細(xì)菌和古細(xì)菌中的crispr-cas系統(tǒng)：獲得性防御和調(diào)節(jié)的通用小rna(crispr-cassystemsinbacteriaandarchaea：versatilesmallrnasforadaptivedefenseandregulation).annualreviewofgenetics45，273-297(2011)。最近的釀膿鏈球菌(s.pyogenes)ii型crispr系統(tǒng)的體外重建證明與正常反式編碼tracrrna融合的crrna(“crisprrna”)(“反式-作用crisprrna”)足夠引導(dǎo)cas9蛋白序列特異性切割匹配cdrna的靶dna序列。表達(dá)與靶位點同源的grna導(dǎo)致cas9招募以及靶dna降解。參見h.deveau等，對嗜熱鏈球菌中crispr編碼的抗性的噬菌體響應(yīng)(phageresponsetocrispr-encodedresistanceinstreptococcusthermophilus).journalofbacteriology190，1390(2008年2月)。已知crispr/cas9系統(tǒng)的各種用途。參見wo2014/099744、wo2013176772、us8,697,359和sternberg等，nature，第507卷，第62-67頁(2014)。

發(fā)明概述

本發(fā)明的方面涉及檢測靶核酸序列的方法，包括使靶核酸序列與引導(dǎo)rna序列接觸，所述引導(dǎo)rna序列具有與靶核酸序列互補(bǔ)的部分和cas9蛋白，其中引導(dǎo)rna和cas9蛋白共定位至靶核酸序列以形成復(fù)合物，并且其中檢測該復(fù)合物從而檢測靶核酸序列。根據(jù)一個方面，離體，例如，體外進(jìn)行該方法，如在容器內(nèi)或在基材上。根據(jù)一個方面，引導(dǎo)rna和cas9蛋白經(jīng)制備并分離以用作本發(fā)明的體外方法中的試劑。本發(fā)明的方法的方面包括探測，如對核酸，如dna的分析型探測或制備型探測、檢測、標(biāo)記、作圖、和測序。例如，本發(fā)明涉及探測dna的方法，如在單分子水平上，用于鑒定存在dna，探測dna，用于親和純化該dna、對dna作圖，以沿著dna標(biāo)注具體重要區(qū)域，或產(chǎn)生測序起始位點。

根據(jù)本文所述的方法，形成包含引導(dǎo)rna、dna結(jié)合蛋白如cas9蛋白、和雙鏈dna靶序列的復(fù)合物。根據(jù)某些方面，本發(fā)明范圍內(nèi)的dna結(jié)合蛋白包括與引導(dǎo)rna形成復(fù)合物的蛋白質(zhì)，并且引導(dǎo)rna將復(fù)合物引導(dǎo)到雙鏈dna序列，復(fù)合物在該序列處結(jié)合至dna序列。本發(fā)明的這一方面可被稱為rna和dna結(jié)合蛋白共定位至雙鏈dna或與雙鏈dna共定位。通過這種方式，可施用dna結(jié)合蛋白-引導(dǎo)的rna復(fù)合物來在具體靶dna序列處形成可檢測的復(fù)合物，從而檢測靶dna序列的存在。根據(jù)某些方面，由于存在可檢測標(biāo)記物，可檢測復(fù)合物。根據(jù)某些方面，復(fù)合物可直接標(biāo)記或間接標(biāo)記。根據(jù)某些方面，可檢測標(biāo)記物可存在于引導(dǎo)rna、cas9蛋白或復(fù)合物上。

根據(jù)某些方面，引導(dǎo)rna的共定位因子可能不是dna-結(jié)合蛋白?？墒褂迷噭﹣碛靡龑?dǎo)rna在靶核酸序列處共定位。根據(jù)某些方面，引導(dǎo)rna不需要存在可用于本發(fā)明的某些方面的dna結(jié)合蛋白?？赡懿淮嬖赿na結(jié)合蛋白。例如，引導(dǎo)rna本身可結(jié)合至靶核酸序列，并且引導(dǎo)rna可具有與之接合的標(biāo)記物或其他功能部分以將標(biāo)記物或其他功能部分定位在靶核酸序列處或其附近。

根據(jù)某些方面，可通過檢測沒有可檢測標(biāo)記物的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)來檢測復(fù)合物。復(fù)合物的物理結(jié)構(gòu)被探測，與觀察熒光或其他視覺或光譜上可檢測的部分相反。根據(jù)某些方面，可通過檢測沒有可檢測標(biāo)記物的復(fù)合物的物理化學(xué)性質(zhì)，如靜電荷來檢測復(fù)合物。這類方法包括使用納米孔檢測方法、電子顯微術(shù)、光學(xué)顯微術(shù)、掃描探針顯微術(shù)、原子力顯微術(shù)、懸臂檢測方法、石英晶體檢測方法、效應(yīng)晶體管檢測方法檢測復(fù)合物，其全部都是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將易于想象其他能夠檢測基于本發(fā)明的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)的方法。

根據(jù)某些方面，crisprcas9系統(tǒng)內(nèi)容中的術(shù)語“引導(dǎo)rna”是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且包括部分，如20個核苷酸部分，其與靶核酸互補(bǔ)。設(shè)計引導(dǎo)rna的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。本文所述的方法包括使靶核酸序列與多種引導(dǎo)rna序列互補(bǔ)，這些序列各自具有與靶核酸序列互補(bǔ)的部分。本文所述的方法包括使隊中靶核酸序列與多種相應(yīng)引導(dǎo)rna序列互補(bǔ)，其各自具有與相應(yīng)靶核酸序列互補(bǔ)的部分。

根據(jù)某些方面，本發(fā)明的引導(dǎo)rna包括與靶核酸互補(bǔ)的部分和與探針序列或可檢測標(biāo)記物互補(bǔ)或可與之互補(bǔ)或者與之結(jié)合的3’-尾部分或序列。根據(jù)一個方面，3’尾部分提供了特異性功能。3’尾部分可以是模塊或含有多個元件，針對相同或針對多種功能。根據(jù)一個方面，3’尾部分可與一個或多個或多重探針序列或可檢測標(biāo)記物互補(bǔ)或者與之結(jié)合(例如，通過適體機(jī)制)。各探針序列或可檢測標(biāo)記物可用起到不同作用(例如，一種序列的作用可以是結(jié)合至cy3標(biāo)記的寡核苷酸并且第二種序列的作用可以是結(jié)合至cy5標(biāo)記的寡核苷酸)。例如，尾序列可用于將功能性蛋白定位至靶核酸序列。例如，尾序列可結(jié)合被引導(dǎo)rna取代的靶雙鏈的部分。

根據(jù)一個方面，探針序列包括可檢測標(biāo)記物，并且該探針序列結(jié)合至3’尾序列。根據(jù)一個方面，探針序列包括多個可檢測標(biāo)記物，并且該探針序列結(jié)合至3’尾序列。根據(jù)一個方面，探針序列包括可檢測標(biāo)記物，并且該探針序列結(jié)合至3’尾序列，并且其中探針序列經(jīng)擴(kuò)增。根據(jù)一個方面，探針序列結(jié)合至3’尾序列，并且其中探針序列經(jīng)擴(kuò)增。根據(jù)一個方面，引導(dǎo)rna包括3’尾序列作為與探針或可檢測標(biāo)記物的結(jié)合對。根據(jù)一個方面，尾序列可在結(jié)合至模板序列時起到引物的作用。尾序列然后延伸以納入一個或多個可檢測標(biāo)記物，如熒光核苷酸，或一個或多個結(jié)合部分，如生物素或地高辛(dig)標(biāo)記的核苷酸，一個或多個標(biāo)記物可直接或間接與這些結(jié)合部分結(jié)合。根據(jù)一個方面，滾環(huán)擴(kuò)增可與尾引物序列和滾環(huán)擴(kuò)增模板聯(lián)用以產(chǎn)生具有多個可檢測部分或可檢測部分可與之接合的結(jié)合部分的滾環(huán)多聯(lián)體產(chǎn)物。通過這種方式，可使用滾環(huán)擴(kuò)增來擴(kuò)增信號強(qiáng)度。滾環(huán)擴(kuò)增方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且包括drmanac等，使用對自組裝dna納米陣列的解鏈的堿基讀數(shù)的人基因組測序(humangenomesequencingusingunchainedbasereadsonself-assemblingdnananoarrays)，science，第327卷，第78-81頁(2009)。

根據(jù)一個方面，靶核酸是雙鏈核酸。根據(jù)一個方面，靶核酸是雙鏈基因組dna。根據(jù)一個方面，靶核酸是染色體dna。

根據(jù)某些方面，引導(dǎo)rna包括種子區(qū)域序列。根據(jù)某些方面，引導(dǎo)rna在引導(dǎo)rna的非種子區(qū)域處包括簡并位置或序列或通用堿基。

根據(jù)一個方面，靶核酸在基材，如平面基材或孔或通道上延長，即，靶核酸在孔或通道內(nèi)延長。

根據(jù)一個方面，cas9蛋白是野生型cas9、cas9切口酶或無核酸酶cas9，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。分離野生型cas9的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。制備cas9切口酶的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。制備無核酸酶cas9的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。

根據(jù)一個方面，可檢測標(biāo)記物直接或間接結(jié)合至cas9蛋白。根據(jù)一個方面，可檢測標(biāo)記物直接或間接結(jié)合至引導(dǎo)rna。根據(jù)一個方面，可檢測標(biāo)記物是引導(dǎo)rna的部分(例如，熒光標(biāo)記的核苷酸在引導(dǎo)rna的制備期間納入(例如，通過體外轉(zhuǎn)錄))。根據(jù)一個方面，可檢測標(biāo)記物直接或間接結(jié)合至該復(fù)合物。

根據(jù)一個方面，提供方法從而通過測序方法來確定靶核酸的序列。根據(jù)一個方面，cas9蛋白是cas9切口酶，其使靶核酸的鏈產(chǎn)生切口并且其中從切口開始引物延伸或鏈延伸，互補(bǔ)鏈用作模板，從而對靶核酸，如靶核酸的鏈之一進(jìn)行測序。相對于其他切口方法，如使用切口內(nèi)切核酸酶和dna酶1的優(yōu)勢在于可通過使用引導(dǎo)rna對產(chǎn)生切口的位置進(jìn)行編程，并且可靶向多個特定位置?？墒褂糜嬎銠C(jī)執(zhí)行方法和軟件來鑒定用于合成的感興趣基因組的部分，對制備grna所需的dna模板進(jìn)行排序，體外轉(zhuǎn)錄引導(dǎo)rna并且然后在所需位置處執(zhí)行切口以進(jìn)行靶向測序。通過沿著模板的引物延伸進(jìn)行測序的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。使用切口作為引物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。本發(fā)明的這一特征也可用于在延伸產(chǎn)物中包括可檢測標(biāo)記物，從而檢測靶核酸，如代替或另外從靶核酸獲得序列信息。因此，cas9蛋白是cas9切口酶，其在靶核酸的鏈上形成切口，并且其中引物延伸從切口開始以包括可檢測標(biāo)記物，互補(bǔ)鏈用作模板，從而檢測靶核酸。根據(jù)這一方面，一旦標(biāo)記物納入延伸產(chǎn)物，grna/cas9不需要與靶dna保持在一起，因為檢測到已經(jīng)納入延伸產(chǎn)物的標(biāo)記物。

根據(jù)一個方面，分離的引導(dǎo)rna和分離的cas9蛋白在合適條件下結(jié)合并且然后在反應(yīng)或復(fù)合物形成介質(zhì)中與靶核酸體外接觸。根據(jù)一個方面，靶核酸在樣品，如核酸樣品內(nèi)。核酸樣品可包括多個核酸并且可被稱為核酸的復(fù)雜混合物。根據(jù)某些方面，提供了用于在核酸的復(fù)雜混合物內(nèi)用對靶核酸有特異性的引導(dǎo)rna鑒定靶核酸的方法。根據(jù)一個方面，提供了在核酸的復(fù)雜混合物內(nèi)用對一種或多種或數(shù)種靶核酸有特異性的引導(dǎo)rna鑒定一種或多種或數(shù)種靶核酸的方法。在這一方面，提供了用于檢測多種靶核酸的多重方法。多種靶核酸中的各靶核酸可被相應(yīng)的引導(dǎo)rna/cas9蛋白復(fù)合物結(jié)合，并且因此能夠如本文所述或本領(lǐng)域已知的那樣被檢測或測序。

根據(jù)某些方面，提供了用于在核酸的復(fù)雜混合物內(nèi)用對靶核酸有特異性的引導(dǎo)rna對靶核酸進(jìn)行親和純化的方法。根據(jù)一個方面，提供了在核酸的復(fù)雜混合物內(nèi)用對一種或多種或數(shù)種靶核酸有特異性的引導(dǎo)rna親和純化一種或多種或數(shù)種靶核酸。在這一方面，提供了用于親和純化多種靶核酸的多重方法。多種靶核酸中的各靶核酸可被相應(yīng)引導(dǎo)rna/cas9蛋白復(fù)合物結(jié)合。根據(jù)這些方面，可使用采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的結(jié)合對的親和系統(tǒng)。通過消耗復(fù)雜混合物中的其他核酸來純化靶核酸。通過從復(fù)雜混合物中消耗靶核酸來純化靶核酸。消耗可通過待消耗的靶標(biāo)的親和捕獲進(jìn)行。或者，消耗可通過待消耗的靶標(biāo)的切割進(jìn)行。在一些情況中，可能需要從復(fù)雜混合物中消耗混合物內(nèi)具有高豐度的核酸以分析較低豐度的靶標(biāo)。例如，可能需要從樣品中消耗相應(yīng)的dna或其他高濃度核酸。

根據(jù)某些方面，提供了用于在核酸的復(fù)雜混合物內(nèi)用對針對消耗靶向的核酸有特異性的引導(dǎo)rna消耗靶核酸的方法。根據(jù)一個方面，提供了在核酸的復(fù)雜混合物內(nèi)用對一種或多種或數(shù)種靶核酸有特異性的引導(dǎo)rna一種或多種或數(shù)種靶核酸。在這一方面，提供了用于消耗多種靶核酸的多重方法。多種針對消耗靶向的核酸中的各靶核酸可被相應(yīng)引導(dǎo)rna/cas9蛋白復(fù)合物結(jié)合。

根據(jù)某些方面，靶核酸在溶液樣品內(nèi)。根據(jù)某些方面，靶核酸在基材上。根據(jù)某些方面，靶核酸結(jié)合至基材。根據(jù)某些方面，靶核酸在細(xì)胞內(nèi)。根據(jù)一個方面，細(xì)胞是真核細(xì)胞。根據(jù)一個方面，細(xì)胞是酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞或動物細(xì)胞。根據(jù)一個方面，細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。在某些實施方式中，哺乳動物細(xì)胞是活細(xì)胞并且引導(dǎo)rna或dna結(jié)合蛋白，如cas9或其他dna結(jié)合蛋白通過電穿孔、載體介導(dǎo)的遞送(例如，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染)、微注射和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法。在某些實施方式中，哺乳動物細(xì)胞是固定的細(xì)胞，其在含有引導(dǎo)rna和dna結(jié)合蛋白，如cas9或其他待遞送的dna結(jié)合蛋白的溶液中沉浸。通過相似的方式，使用grna和dna結(jié)合蛋白在靶核酸序列處共定位可在中期染色體分散上進(jìn)行。

根據(jù)一個方面，引導(dǎo)rna在約10至約500個核苷酸之間。根據(jù)一個方面，引導(dǎo)rna在約20至約100個核苷酸之間。根據(jù)一個方面，引導(dǎo)rna是tracrrna-crrna融合體。根據(jù)一個方面，tracrrna和crrna是分開的物質(zhì)并且被融合。

根據(jù)一個方面，dna是基因組dna、線粒體dna、病毒dna、或外源性dna。

根據(jù)一個方面，提供了用于探測包含兩種或更多種由其dna含量表征的不同多核苷酸物質(zhì)或細(xì)胞的混合物的方法，通過選擇與樣品中的一種或多種多核苷酸物質(zhì)互補(bǔ)的一種或多種序列，產(chǎn)生包括互補(bǔ)序列的一種或多種grna，合并一種或多種grna與cas9，使樣品接觸grna和cas9，檢測grna/cas9與樣品中一種或多種多核苷酸物質(zhì)的結(jié)合；基于檢測確定樣品的細(xì)胞或多核苷酸組分的種類。根據(jù)一個方面，grna和cas9體外產(chǎn)生或存在于體外。根據(jù)一個方面，grna和cas9體外合并。根據(jù)一個方面，grna體外產(chǎn)生或存在于體外，而cas9體內(nèi)產(chǎn)生。根據(jù)另一個方面，樣品包含多種不同的多核苷酸物質(zhì)，如許多可存在于數(shù)十或數(shù)百或數(shù)千或數(shù)萬種不同多核苷酸物質(zhì)的復(fù)雜混合物中。

其他應(yīng)用包括評價靶生物體的種類的方法，包括使用引導(dǎo)rna和cas9；評價靶生物體的狀態(tài)的方法，包括使用引導(dǎo)rna和cas9；對dna分子作圖的方法，包括解析結(jié)合在dna分子上的多種cas9和引導(dǎo)rna復(fù)合物；或在dna分子中解析等位基因變體的方法，包括使用多種cas9和引導(dǎo)rna復(fù)合物和多種探針。這些具體應(yīng)用各自基于使用本文所述的grna/cas9系統(tǒng)在靶dna位點處形成復(fù)合物并檢測grna/cas9復(fù)合物來探測dna的方法。

dna分子可以是染色體或染色體外的。cas9核酸內(nèi)切酶可以是活性的，或無活性的或部分無活性的。cas9可與熒光蛋白(如gfp、熒光素酶等)和/或一個或多個親和標(biāo)簽融合。親和標(biāo)簽可被一個或多個熒光探針識別。親和標(biāo)簽可被一個或多個標(biāo)簽識別，其向cas9添加可測量的屬性(例如，電荷或形狀)。cas9可含有一個或多個正交氨基酸。正交氨基酸可向其他分子提供親和性，如探針、標(biāo)簽、接頭。

可直接使用一個或多個熒光探針來探測引導(dǎo)rna。引導(dǎo)rna可被一個或多個向cas9添加可測量的屬性(例如，電荷或形狀)的標(biāo)簽直接探測。引導(dǎo)rna可含有一個或多個修飾的堿基。修飾的堿基可向其他分子提供親和性，如探針、標(biāo)簽、接頭。

生物體可以是原核或真核，單細(xì)胞或多細(xì)胞。從生物體提取dna。dna可以是其天然形式，或者dna可在表面上或裝置中拉伸。dna可通過通道或納米孔移位。生物體經(jīng)固定并可滲透體外合成的cas9和引導(dǎo)rna復(fù)合物。

在某些實施方式中，cas9和引導(dǎo)rna在用于靶向dna之前復(fù)合。引導(dǎo)rna與靶dna互補(bǔ)。通過測量熒光信號來檢測與dna結(jié)合的復(fù)合物。通過測量當(dāng)前信號同時通過納米孔傳感器或靠近納米孔或納米間隙傳感器移位來檢測與dna結(jié)合的復(fù)合物。

可一次檢測dna上的一個或多個復(fù)合物。dna上的任意兩個復(fù)合物之間的分辨率可低至1納米或5納米或10納米或高至1000毫米(和之間的任何數(shù)字)。檢測到特定復(fù)合物表示存在特定等位基因。可產(chǎn)生與dna結(jié)合的復(fù)合物的圖案并用于提供dna分子的圖?？僧a(chǎn)生與dna結(jié)合的復(fù)合物的圖案并用于提供生物體的種類和/或狀態(tài)。根據(jù)一個方面，可向活或無活性(即，死)細(xì)胞提供引導(dǎo)rna或cas9或引導(dǎo)rna/cas9復(fù)合物。

提供了使用cas9和引導(dǎo)rna復(fù)合物來在dna分子上產(chǎn)生序列特異性起始位點的方法?？墒褂镁酆厦富蜻B接酶來進(jìn)行單分子測序。起始位點可靠近基因組變體、重復(fù)序列、高變區(qū)。

提供了使用cas9和引導(dǎo)rna復(fù)合物來拉下dna分子的方法，即親和純化。能允許拉下的親和標(biāo)簽結(jié)合至cas9和引導(dǎo)rna復(fù)合物。親和標(biāo)簽在復(fù)合物結(jié)合至dna之前或之后結(jié)合至復(fù)合物。可從集合中提取結(jié)合至一個或多個cas9和引導(dǎo)rna復(fù)合物的一個特異性或多個特異性靶dna分子。提取的靶dna分子可經(jīng)過測序，如深度測序。

在某些實施方式中，在某些條件下，使用引導(dǎo)rna而不使用cas9(或其他dna結(jié)合蛋白)，并且當(dāng)針對某些類型的序列靶向時，引導(dǎo)rna足夠形成與dna靶標(biāo)的穩(wěn)定或瞬時接合。

在某些實施方式中，grna/cas9共定位復(fù)合物提供雙鏈切割，但是grna/cas9共定位復(fù)合物保持與靶核酸結(jié)合?？墒褂脳l件如添加7m尿素開始打斷復(fù)合物來從靶核酸去除這種grna/cas9共定位(參見sternberg等，nature507：62(2014)，通過引用全文納入本文)。

在一些實施方式中，grna和cas9的復(fù)合物在結(jié)合至靶核酸序列，如dna之前形成。在一些實施方式中，復(fù)合物在cas9首先與本核酸相互作用之后形成，即cas9與靶核酸相互作用，然后與引導(dǎo)rna形成共定位復(fù)合物。

本發(fā)明的某些實施方式的其他特征和優(yōu)勢將在權(quán)利要求中以及以下附圖和實施方式的說明下更為顯而易見。

附圖說明

結(jié)合附圖，通過以下示例性實施方式的詳述能夠更清楚地理解本發(fā)明的上述和其他特征和其他優(yōu)點，其中：

圖1表示用標(biāo)記的grna/cas9探測的固定的小鼠細(xì)胞的圖。

圖2表示按照圖1所示的cas9探測方案用標(biāo)記的寡核苷酸探測的固定的小鼠細(xì)胞的圖。

圖3表示grna/cas9切割的瓊脂糖凝膠和凝膠遷移試驗。

圖4表示用于探測grna尾的各種示意圖。

圖5表示側(cè)流試驗的圖。

圖6表示用標(biāo)記的grna/cas9探測的拉伸的dna的圖。

圖7表示使用grna/cas9探測鑒定基因組重排的圖。

圖8表示使用與grna/cas9接合的折紙(origami)條碼鑒定基因組區(qū)域的圖。

圖9表示引發(fā)從切口位點開始測序的圖。

圖10表示使用chopchop鑒定grna/cas9靶位點以鑒定her2的輸出圖。

圖11表示pcr組裝策略以從寡核苷酸集合制備grna模板。

圖12表示使用grna/cas9探測鑒定基因組融合的圖。

發(fā)明詳述

本發(fā)明的實施方式基于使用dna結(jié)合蛋白和引導(dǎo)rna在靶核酸處共定位或復(fù)合，然后通過檢測與復(fù)合物結(jié)合或接合的可檢測部分或通過物理探測復(fù)合物本身來檢測靶核酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員易于知道這類dna結(jié)合蛋白(包括rna-引導(dǎo)的dna結(jié)合蛋白)結(jié)合dna用于各種目的。這種dna結(jié)合蛋白可以是天然產(chǎn)生的。本發(fā)明范圍內(nèi)包括的dna結(jié)合蛋白包括由rna引導(dǎo)的那些，在本文中稱為引導(dǎo)rna。根據(jù)該方面，引導(dǎo)rna和rna引導(dǎo)的dna結(jié)合蛋白在dna處形成共定位復(fù)合物。根據(jù)某些方面，dna結(jié)合蛋白可以是無核酸酶dna結(jié)合蛋白。根據(jù)這一方面，無核酸酶dna結(jié)合蛋白可產(chǎn)生自對具有核酸酶活性的dna結(jié)合蛋白的改變或修飾。這類具有核酸酶活性的dna結(jié)合蛋白為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，并且包括具有核酸酶活性的天然產(chǎn)生的dna結(jié)合蛋白，例如在ii型crispr系統(tǒng)中存在的cas9蛋白。這種cas9蛋白和ii型crispr系統(tǒng)在本領(lǐng)域中充分記載。參見makarova等，naturereviews，microbiology，第9卷，2011年6月，第467-477頁，包括所有補(bǔ)充信息，通過引用全文納入本文。

具有核酸酶活性的示例性dna結(jié)合蛋白的功能是切開或切割雙鏈dna。這種核酸酶活性可來自具有顯示核酸酶活性的一個或多個多肽序列的dna結(jié)合蛋白。這類示例性dna結(jié)合蛋白可具有2個分開的核酸酶結(jié)構(gòu)域，各結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)切割或切開雙鏈dna的特定鏈。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的具有核酸酶活性的示例性多肽序列包括mcra-hnh核酸酶相關(guān)結(jié)構(gòu)域和ruvc-樣核酸酶結(jié)構(gòu)域。因此，示例性的dna結(jié)合蛋白是天然含有一個或多個mcra-hnh核酸酶相關(guān)結(jié)構(gòu)域和ruvc-樣核酸酶結(jié)構(gòu)域的那些。根據(jù)某些方面，dna結(jié)合蛋白經(jīng)改變或修飾以使得核酸酶活性滅活。這類改變或修飾包括改變一個或多個氨基酸以使核酸酶活性或核酸酶結(jié)構(gòu)域滅活。這類修飾包括去除顯示出核酸酶活性的一個或多個多肽序列，即核酸酶結(jié)構(gòu)域，使得dna結(jié)合蛋白上沒有顯示出核酸酶活性的一個或多個多肽序列，即核酸酶結(jié)構(gòu)域?；诒景l(fā)明，滅活核酸酶活性的其他修飾將對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，無核酸酶的dna結(jié)合蛋白包括經(jīng)修飾以滅活核酸酶活性或去除一個或多個多肽序列以滅活核酸酶活性的多肽序列。無核酸酶dna結(jié)合蛋白保留了結(jié)合至dna的能力，即使核酸酶活性已經(jīng)被滅活。因此，dna結(jié)合蛋白包括dna結(jié)合所需的一個或多個多肽序列，但是可缺少顯示核酸酶活性的一個或多個或全部核酸酶序列。因此，dna結(jié)合蛋白包括dna結(jié)合所需的一個或多個多肽序列，但是可具有顯示滅活的核酸酶活性的一個或多個或全部核酸酶序列。

根據(jù)一個方面，具有2個或更多個核酸酶結(jié)構(gòu)域的dna結(jié)合蛋白可經(jīng)修飾或改變以使除了核酸酶結(jié)構(gòu)域之一以外的全部核酸酶結(jié)構(gòu)域滅活。這種經(jīng)修飾或改變的dna結(jié)合蛋白被稱為dna結(jié)合蛋白切口酶，該dna結(jié)合蛋白僅切割或切開雙鏈dna的一條鏈。當(dāng)由rna引導(dǎo)至dna時，dna結(jié)合蛋白切口酶被稱為rna引導(dǎo)的dna結(jié)合蛋白切口酶。因此，可用的cas9蛋白可以是野生型cas9、cas9切口酶或無核酸酶cas9及其同源物和直向同源物。參見jinek等，science337，816-821(2012)，通過引用全文納入本文。

在釀膿鏈球菌(s.pyogenes)中，cas9通過由蛋白質(zhì)中的以下2個催化結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的過程在原型間隔子-相鄰基序(pam)上游3bp處生成鈍末端雙鏈斷裂：切割dna的互補(bǔ)鏈的hnh結(jié)構(gòu)域和切割非互補(bǔ)鏈的ruvc-樣結(jié)構(gòu)域。參見jinek等，science337，816-821(2012)，通過引用全文納入本文。已知cas9蛋白存在于許多ii型crispr系統(tǒng)，包括makarova等，naturereviews，microbiology，卷9，2011年6月，第467-477頁的補(bǔ)充信息中所鑒定的以下系統(tǒng)：海沼甲烷球菌(methanococcusmaripaludis)c7；白喉棒桿菌(corynebacteriumdiphtheriae)；高效棒桿菌(corynebacteriumefficiens)ys-314；谷氨酸棒桿菌(corynebacteriumglutamicum)atcc13032kitasato；谷氨酸棒桿菌(corynebacteriumglutamicum)atcc13032bielefeld；谷氨酸棒桿菌(corynebacteriumglutamicum)r；果聚糖棒桿菌(corynebacteriumkroppenstedtii)dsm44385；膿腫分枝桿菌(mycobacteriumabscessus)atcc19977；皮諾卡氏菌(nocardiafarcinica)ifm10152；紅串紅球菌(rhodococcuserythropolis)pr4；紅球菌(rhodococcusjostii)rha1；混濁紅球菌(rhodococcusopacus)b4uid36573；解纖維熱酸菌(acidothermuscellulolyticus)11b；氯酚節(jié)桿菌(arthrobacterchlorophenolicus)a6；黃克里布所菌(kribbellafiavida)dsm17836uid43465；彎曲熱單孢菌(thermomonosporacurvata)dsm43183；齒雙歧桿菌(bifidobacteriumdentium)bd1；長雙歧桿菌(bifidobacteriumlongum)djo10a；還原天芥菜堿斯奈克氏菌(slackiaheliotrinireducens)dsm20476；海皮爾氏菌(persephonellamarina)exh1；脆弱擬桿菌(bacteroidesfragilis)nctc9434；黃褐二氧化碳嗜纖維菌(capnocytophagaochracea)dsm7271；嗜冷黃桿菌(flavobacteriumpsychrophilum)jip0286；黏液阿克曼菌(akkermansiamuciniphila)atccbaa835；卡氏玫瑰彎菌(roseiflexuscastenholzii)dsm13941；玫瑰彎菌(roseiflexus)rs1；集胞藍(lán)細(xì)菌(synechocystis)pcc6803；小迷蹤菌(elusimicrobiumminutum)pei191；未培白蟻1組細(xì)菌種系rsd17；產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌(fibrobactersuccinogenes)s85；蠟狀芽孢桿菌(bacilluscereus)atcc10987；無害利斯特氏菌(listeriainnocua)；干酪乳桿菌(lactobacilluscasei)；鼠李糖乳桿菌(lactobacillusrhamnosus)gg；唾液乳桿菌(lactobacillussalivarius)ucc118；無乳鏈球菌(streptococcusagalactiae)a909；無乳鏈球菌(streptococcusagalactiae)nem316；無乳鏈球菌(streptococcusagalactiae)2603；停乳鏈球菌(streptococcusdysgalactiaeequisimilis)ggs124；馬鏈球菌(streptococcusequizooepidemicus)mgcs10565；雞鏈球菌(streptococcusgallolyticus)ucn34uid46061；格氏鏈球菌(streptococcusgordonii)challissubstch1；變異鏈球菌(streptococcusmutans)nn2025uid46353；變異鏈球菌(streptococcusmutans)；釀膿鏈球菌(streptococcuspyogenes)m1gas；釀膿鏈球菌(streptococcuspyogenes)mgas5005；釀膿鏈球菌(streptococcuspyogenes)mgas2096；釀膿鏈球菌(streptococcuspyogenes)mgas9429；釀膿鏈球菌(streptococcuspyogenes)mgas10270；釀膿鏈球菌(streptococcuspyogenes)mgas6180；釀膿鏈球菌(streptococcuspyogenes)mgas315；釀膿鏈球菌(streptococcuspyogenes)ssi-1；釀膿鏈球菌(streptococcuspyogenes)mgas10750；釀膿鏈球菌(streptococcuspyogenes)nz131；嗜熱鏈球菌(streptococcusthermophiles)cnrz1066；嗜熱鏈球菌(streptococcusthermophiles)lmd-9；嗜熱鏈球菌(streptococcusthermophiles)lmg18311；肉毒梭菌(clostridiumbotulinum)a3lochmaree；肉毒梭菌(clostridiumbotulinum)beklund17b；肉毒梭菌(clostridiumbotulinum)ba4657；肉毒梭菌(clostridiumbotulinum)flangeland；解纖維梭菌(clostridiumcellulolyticum)h10；微小微單胞菌(finegoldiamagna)atcc29328；直腸假桿菌(eubacteriumrectale)atcc33656；雞敗血枝原體(mycoplasmagallisepticum)；運動枝原體(mycoplasmamobile)163k；穿透枝原體(mycoplasmapenetrans)；關(guān)節(jié)液枝原體(mycoplasmasynoviae)53；念珠狀鏈桿菌(streptobacillusmoniliformis)dsm12112；慢生根瘤菌(bradyrhizobium)btai1；漢堡硝化桿菌(nitrobacterhamburgensis)x14；血色紅假單胞菌(rhodopseudomonaspalustris)bisb18；血色紅假單胞菌(rhodopseudomonaspalustris)bisb5；食清潔劑細(xì)小棒菌(parvibaculumlavamentivorans)ds-1；恒雄芝氏溝鞭玫瑰桿屬(dinoroseobactershibae)dfl12；固氮葡糖酸醋酸桿菌(gluconacetobacterdiazotrophicus)pal5faperj；固氮葡糖酸醋酸桿菌(gluconacetobacterdiazotrophicus)pal5jgi；固氮螺菌(azospirillum)b510uid46085；深紅紅螺菌(rhodospirillumrubrum)atcc11170；絮凝劑產(chǎn)生菌(diaphorobacter)tpsyuid29975；蚯蚓蟲腎桿菌(verminephrobactereiseniae)ef01-2；腦膜炎奈瑟球菌(neisseriameningitides)053442；腦膜炎奈瑟球菌(neisseriameningitides)alpha14；腦膜炎奈瑟球菌(neisseriameningitides)z2491；需鹽脫硫弧菌(desulfovibriosalexigens)dsm2638；空腸彎曲桿菌(campylobacterjejunidoylei)26997；空腸彎曲桿菌(campylobacterjejuni)81116；空腸彎曲桿菌(campylobacterjejuni)；紅嘴鷗彎曲桿菌(campylobacterlari)rm2100；肝螺桿菌(helicobacterhepaticus)；產(chǎn)琥珀酸沃林氏菌(wolinellasuccinogenes)；甲苯單胞(tolumonasauensis)dsm9187；交替假單胞菌(pseudoalteromonasatlantica)t6c；希瓦氏菌(shewanellapealeana)atcc700345；嗜肺軍團(tuán)菌(legionellapneumophila)paris；產(chǎn)琥珀酸放線桿菌(actinobacillussuccinogenes)130z；多殺巴斯德菌(pasteurellamultocida)；新兇手弗朗西絲氏菌(francisellatularensisnovicida)u112；土拉熱弗朗西絲氏菌全北區(qū)亞種(francisellatularensisholarctica)；土拉熱弗朗西絲氏菌(francisellatularensis)fsc198；土拉熱弗朗西絲氏菌(francisellatularensis)；土拉熱弗朗西絲氏菌(francisellatularensis)wy96-3418；和齒垢密螺旋體(treponemadenticola)atcc35405。因此，本發(fā)明的方面設(shè)計在ii型crispr系統(tǒng)中存在的cas9蛋白，其已被賦予無核酸酶，或已經(jīng)被賦予切口酶，如本文所述。

在文獻(xiàn)中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可將cas9蛋白稱為csn1。釀膿鏈球菌cas9蛋白序列如下所示。參見deltcheva等，nature471，602-607(2011)，通過引用全文納入本文。

mdkkysigldigtnsvgwavitdeykvpskkfkvlgntdrhsikknligallfdsgetae

atrlkrtarrrytrrknricylqeifsnemakvddsffhrleesflveedkkherhpifg

nivdevayhekyptiyhlrkklvdstdkadlrliylalahmikfrghfliegdlnpdnsd

vdklfiqlvqtynqlfeenpinasgvdakailsarlsksrrlenliaqlpgekknglfgn

lialslgltpnfksnfdlaedaklqlskdtydddldnllaqigdqyadlflaaknlsdai

llsdilrvnteitkaplsasmikrydehhqdltllkalvrqqlpekykeiffdqskngya

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klvsdfrkdfqfykvreinnyhhahdaylnavvgtalikkypklesefvygdykvydvrk

miakseqeigkatakyffysnimnffkteitlangeirkrplietngetgeivwdkgrdf

atvrkvlsmpqvnivkktevqtggfskesilpkrnsdkliarkkdwdpkkyggfdsptva

ysvlvvakvekgkskklksvkellgitimerssfeknpidfleakgykevkkdliiklpk

yslfelengrkrmlasagelqkgnelalpskyvnflylashyeklkgspedneqkqlfve

qhkhyldeiieqisefskrviladanldkvlsaynkhrdkpireqaeniihlftltnlga

paafkyfdttidrkrytstkevldatlihqsitglyetridlsqlggd-(seqidno：7)

靶核酸包括可使用本文所述的共定位復(fù)合物來檢測的任意核酸序列。靶核酸包括基因。靶核酸可在從單細(xì)胞提取的dna內(nèi)。靶核酸可以是從單染色體提取的dna。出于本發(fā)明的目的，dna，如雙鏈dna可包括靶核酸并且共定位復(fù)合物可結(jié)合至或與dna共定位在靶核酸處或與之相鄰或其附近，并且以一定方式以檢測靶核酸。這類靶核酸可包括內(nèi)源性(或天然產(chǎn)生)核酸和外源性(或外來)核酸。這類靶核酸可以在核酸的混合物中。這類靶核酸可結(jié)合至基材。這類靶核酸可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法延長或拉伸。拉伸dna的方法描述于khrasmussen，rmarie，jmlange，wesvendsen，akristensen，和kumir，labchip，2011，11：1431-44和用于從人染色體提取、操作和拉伸dna的裝置；dlvbauer，rmarie，khrasmussen，akristensen，kumir，2012nuclacidsres，2012，1-7，dna連鎖維持人中期染色體的結(jié)構(gòu)。

可檢測標(biāo)記物或部分是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。本文所用術(shù)語“可檢測標(biāo)記物”是指可用于鑒定靶核酸的標(biāo)記物?？蓹z測標(biāo)記物使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法接合至grna或cas9蛋白。或者，grna或cas9蛋白可包括結(jié)合對的一半，而相應(yīng)結(jié)合對的另一半結(jié)合至可檢測標(biāo)記物。通過這種方式，由于結(jié)合對的結(jié)合，標(biāo)記物可間接結(jié)合至grna或cas9蛋白。合適的結(jié)合對或結(jié)合力是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且包括互補(bǔ)核酸序列、生物素-親和素、生物素-鏈霉親和素、nhs-酯等、硫醚連接、靜電相互作用、范德華力等(參見例如，holtke等，美國專利號5,344,757；5,702,888；和5,354,657；huber等，美國專利號5,198,537；miyoshi，美國專利號4,849,336；misiura和gait，pct公開號wo91/17160)。生物素，或其衍生物可用作寡核苷酸標(biāo)記物(例如，作為靶向部分、可恢復(fù)部分和/或可檢測標(biāo)記物)，并隨后被親和素/鏈霉親和素衍生物(例如，可檢測標(biāo)記的，例如，藻紅蛋白-偶聯(lián)的鏈霉親和素)，或抗-生物素抗體(例如，可檢測標(biāo)記的抗體)結(jié)合。地高辛可以標(biāo)記物納入并隨后被可檢測地標(biāo)記的抗-地高辛抗體(例如，可檢測地標(biāo)記的抗體，例如，熒光素化的抗-地高辛)結(jié)合。氨基烯丙基-dutp殘基可納入寡核苷酸并隨后偶聯(lián)至n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)衍生的熒光染料。一般而言，可將偶聯(lián)物對的任何一員納入可恢復(fù)部分和/或可檢測標(biāo)記物，限制條件是可檢測地標(biāo)記的偶聯(lián)物伴侶能被結(jié)合，以允許檢測。本文中所用的術(shù)語抗體指的是任何類別的抗體分子，或其任何子片段，例如fab。

可檢測標(biāo)記物可在尺寸和組成上廣泛變化；以下參考文獻(xiàn)提供了選擇特定實施方式的合適寡核苷酸標(biāo)簽的指南：brenner，美國專利號5,635,400；brenner等，proc.natl.acad.sci.，97：1665；shoemaker等，(1996)naturegenetics，14：450；morris等，ep專利公開號0799897a1；wallace，美國專利號5,981,179等。

將可檢測標(biāo)記物納入核酸探針的方法是眾所周知的。一般而言，可檢測標(biāo)記物(例如，半抗原-或熒光團(tuán)-偶聯(lián)的脫氧核糖核苷酸)納入核酸中，如核酸探針，在聚合或擴(kuò)增步驟期間，例如，通過pcr、切口平移、隨機(jī)引物標(biāo)記、末端轉(zhuǎn)移酶加尾(例如，一個或多個標(biāo)記物可在引物序列切割之后添加)，和其他(參見ausubel等，1997，《新編分子生物學(xué)實驗指南》(currentprotocolsinmolecularbiology)，格林出版和韋利科學(xué)公司(greenepublishingandwiley-interscience)，紐約)。

可使用可檢測部分、標(biāo)記物或報告物來檢測本文所述的靶核酸?？梢远喾N方式標(biāo)記引導(dǎo)rna或cas9蛋白，包括直接或間接接合可檢測部分，如熒光部分、半抗原、比色部分等。標(biāo)記物可接合的位置在本文中稱為標(biāo)記物添加位點或可檢測部分添加位點，并且可包括標(biāo)記物能夠接合的核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠參考針對核酸或蛋白質(zhì)標(biāo)記的參考文獻(xiàn)。可檢測部分的示例包括各種放射性部分、酶、輔基、熒光標(biāo)志物、發(fā)光標(biāo)志物、生物發(fā)光標(biāo)志物、金屬顆粒、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合對、蛋白質(zhì)-抗體結(jié)合對等。熒光部分的示例包括但不限于，黃色熒光蛋白(yfp)、綠色熒光蛋白(gfp)、青色熒光蛋白(cfp)、傘形花內(nèi)酯、熒光素、熒光素異硫氰酸酯、羅丹明、二氯三嗪胺熒光素、花青、丹磺酰氯、藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白等。生物發(fā)光標(biāo)志物的示例包括但不限于螢光素酶(如細(xì)菌、螢火蟲、叩頭蟲(clickbeetle)等)、螢光素、發(fā)光蛋白等。有可見檢測信號的酶系統(tǒng)示例包括但不限于半乳糖苷酶、葡糖醛酸苷酶(glucorimidase)、磷酸酶、過氧化物酶、乙酰膽堿酯酶等?？设b定標(biāo)志物也包括放射活性化合物，如125i、35s、14c、或3h。可鑒定標(biāo)志物可以從各種來源市售獲得。

熒光標(biāo)記物及其與核苷酸和/或寡核苷酸的接合描述于許多綜述，包括haugland，《熒光探針和研究化學(xué)品》(handbookoffluorescentprobesandresearchchemicals)，第9版(分子探針公司(molecularprobes，inc.)，尤金(eugene)，2002)；keller和manak，《dna探針》(dnaprobes)，第2版(斯托克頓出版社(stocktonpress)，紐約，1993)；eckstein編，《寡核苷酸和類似物：實踐方法》(oligonucleotidesandanalogues：apracticalapproach)(irl出版社，牛經(jīng)，1991)；和wetmur，生物化學(xué)與分子生物學(xué)評論(criticalreviewsinbiochemistryandmolecularbiology)，26：227-259(1991)?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的具體方法公開于以下參考文獻(xiàn)的樣本中：美國專利號4,757,141、5,151,507和5,091,519。在一個方面中，一個或多個熒光染料用作標(biāo)記的靶序列的標(biāo)記物，例如，美國專利號5,188,934(4，7-二氯熒光素染料)；5,366,860(光譜可分辨若丹明染料)；5,847,162(4，7-二氯若丹明染料)；4,318,846(醚-取代的熒光素染料)；5,800,996(能量轉(zhuǎn)移染料)；lee等，5,066,580(黃嘌呤染料)；5,688,648(能量轉(zhuǎn)移染料)等所述。也可用量子點進(jìn)行標(biāo)記，如以下專利和專利公開中所示：美國專利號6,322,901、6,576,291、6,423,551、6,251,303、6,319,426、6,426,513、6,444,143、5,990,479、6,207,392，2002/0045045和2003/0017264。本文所用術(shù)語“熒光標(biāo)記物”包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)部分，其通過一個或多個分子的熒光吸收和/或發(fā)射性質(zhì)傳遞信息。這種熒光性質(zhì)包括熒光強(qiáng)度、熒光壽命、發(fā)射光譜特異性、能量轉(zhuǎn)移等。

易于納入核苷酸和/或寡核苷酸序列的市售熒光核苷酸類似物包括，但不限于cy3-dctp、cy3-dutp、cy5-dctp、cy5-dutp(新澤西州皮斯卡塔韋的安瑪西亞生物科學(xué)公司(amershambiosciences，piscataway，nj))、熒光素-12-dutp、四甲基若丹明-6-dutp、德州紅^tm-5-dutp、級聯(lián)藍(lán)^tm-7-dutp、bodipy^tmfl-14-dutp、bodipy^tmr-14-dutp、bodipy^tmtr-14-dutp、若丹明綠^tm-5-dutp、俄勒岡綠^tm488-5-dutp、德州紅^tm-12-dutp、bodipy^tm630/650-14-dutp、bodipy^tm650/665-14-dutp、alexafluor^tm488-5-dutp、alexafluor^tm532-5-dutp、alexafluortm568-5-dutp、alexafluor^tm594-5-dutp、alexafluor^tm546-14-dutp、熒光素-12-utp、四甲基若丹明-6-utp、德州紅^tm-5-utp、mcherry、級聯(lián)藍(lán)^tm-7-utp、bodipy^tmfl-14-utp、bodipy^tmr-14-utp、bodipy^tmtr-14-utp、若丹明綠^tm-5-utp、alexafluor^tm488-5-utp、lexafluor^tm546-14-utp(俄勒岡州尤金的分子探針有限公司)等。或者，上述熒光團(tuán)和本文所述的那些可使用例如亞磷酰胺或nhs化學(xué)試劑在寡核苷酸合成期間加入。定制合成具有其他熒光團(tuán)的核苷酸的方案是本領(lǐng)域已知的(參見，henegariu等，(2000)naturebiotechnol.18：345)。2-氨基嘌呤是熒光堿基，其可在其合成期間直接納入寡核苷酸序列中。核酸也可先用例如dapi、yoyo-1、溴化乙錠、花青染料(例如，sybr綠)等染色。

可用于合成后接合的其他熒光團(tuán)包括但不限于alexafluor^tm350、alexafluor^tm405、alexafluor^tm430、alexafluor^tm532、alexafluor^tm546、alexafluor^tm568、alexafluor^tm594、alexafluor^tm647、bodipy493/503、bodipyfl、bodipyr6g、bodipy530/550、bodipy^tmr、bodipy558/568、bodipy558/568、bodipy564/570、bodipy576/589、bodipy581/591、bodipytr、bodipy630/650、bodipy650/665、級聯(lián)藍(lán)、級聯(lián)黃、丹磺酰、麗絲胺若丹明b、瑪麗娜藍(lán)、俄勒岡綠488、俄勒岡綠514、太平洋藍(lán)、太平洋橙、若丹明6g、若丹明綠、若丹明紅、四甲基若丹明、德州紅(購自俄勒岡州尤金的分子探針公司)、cy2、cy3、cy3.5、cy5、cy5.5、cy7(新澤西州皮斯卡塔韋的安瑪西亞生物科學(xué)公司)等。也可使用fret串聯(lián)熒光團(tuán)，包括但不限于，percp-cy5.5、pe-cy5、pe-cy5.5、pe-cy7、pe-德州紅、apc-cy7、pe-alexa染料(610，647，680)、apc-alexa染料等。

也可使用fret串聯(lián)熒光團(tuán)，如percp-cy5.5、pe-cy5、pe-cy5.5、pe-cy7、pe-德州紅、和apc-cy7；以及pe-alexa染料(610，647，680)和apc-alexa染料。

金屬銀或金顆粒也可用于增強(qiáng)來自熒光標(biāo)記的核苷酸和/或寡核苷酸序列的信號(lakowicz等，(2003)biotechniques34：62)。

生物素或其衍生物，也可用作核苷酸和/或寡核苷酸序列上的標(biāo)記物，并且后續(xù)被可檢測地標(biāo)記的親和素/鏈霉親和素衍生物(例如藻紅蛋白偶聯(lián)的鏈霉親和素)，或可檢測地標(biāo)記的抗生物素抗體結(jié)合。生物素/親和素是配體-配體結(jié)合對的示例?？贵w/抗原結(jié)合對也可與本文所述的方法聯(lián)用。其他配體-配體結(jié)合對或偶聯(lián)物結(jié)合對也是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。地高辛可以標(biāo)記物納入，并后續(xù)被可檢測地標(biāo)記的抗地高辛抗體(例如熒光素化的抗地高辛)結(jié)合。氨基烯丙基-dutp或氨基己基丙烯酰胺-dctp殘基可納入寡核苷酸序列并隨后偶聯(lián)至n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)衍生的熒光染料。一般而言，可將偶聯(lián)物對的任何一員納入檢測寡核苷酸，限制條件是可檢測地標(biāo)記的偶聯(lián)物伴侶能被結(jié)合，以允許檢測。本文中所用的術(shù)語抗體指的是任何類別的抗體分子，或其任何子片段，例如fab。

其他合適的標(biāo)記物包括熒光素(fam，fitc)、地高辛、二硝基酚(dnp)、丹磺酰、生物素、溴脫氧尿苷(brdu)、六聚組氨酸(6xhis)、磷光體-氨基酸(例如，p-tyr，p-ser，p-thr)等。在一個實施方式中，以下半抗原/抗體對用于檢測，其中各抗體用以下可檢測標(biāo)記物衍生化：生物素/α-生物素、地高辛/α-地高辛、二硝基酚(dnp)/α-dnp、5-羧基熒光素(fam)/α-fam。

在某些示例性實施方式中，核苷酸和/或寡核苷酸序列可間接標(biāo)記，尤其是用隨后被捕獲劑結(jié)合的半抗原，例如，如美國專利號5,344,757、5,702,888、5,354,657、5,198,537和4,849,336、pct公開號wo91/17160等所述?？墒褂迷S多不同的半抗原-捕獲劑對。示例性的半抗原包括但不限于生物素、des-生物素和其他衍生物、二硝基酚、丹磺酰、熒光素、cy5、地高辛等。對于生物素，捕獲劑可以是親和素、鏈霉親和素或抗體?？贵w可用作其他半抗原的捕獲劑(許多染料-抗體對是市售的，例如，俄勒岡州尤金的分子探針公司)。

根據(jù)某些方面，本文所述的可檢測部分是光譜可分辨的。針對多種熒光標(biāo)記物的“光譜可分辨”表示標(biāo)記物的熒光發(fā)射帶足夠不同，即，足夠不重疊，使得可通過標(biāo)準(zhǔn)光檢測系統(tǒng)基于由相應(yīng)標(biāo)記物生成的熒光信號區(qū)分相應(yīng)標(biāo)記物接合的分子標(biāo)簽，例如，采用帶通濾光片和光電倍增管的系統(tǒng)等，如美國專利號4,230,558，4,811,218等，或wheeless等，《流式細(xì)胞術(shù)：設(shè)備與數(shù)據(jù)分析》(flowcytometry：instrumentationanddataanalysis)(學(xué)術(shù)出版社，紐約，1985)中第21-76頁所述的系統(tǒng)所例示。在一個方面中，光譜可分辨的有機(jī)染料，如熒光素、若丹明等表示波長發(fā)射峰間隔至少20nm，并且在另一個方面中，至少40nm。在另一個方面中，對于鑭系化合物、量子點等，光譜可分辨表示波長發(fā)射峰間隔至少10nm，并且在另一個方面中，至少15nm。

在某些實施方式中，可檢測部分可在與電子顯微術(shù)聯(lián)用時與常用核酸相比提供更高的可檢測性。具有較高可檢測性的部分通常為金屬和有機(jī)金屬，如乙酸汞、二甲基亞砜鉑、幾種金屬-二吡啶基復(fù)合物(例如，鋨-bipy、釕-bipy、鉑-bipy)。雖然這些部分中的一些可易于對核酸特異性染色，但也可使用接頭來連接這些部分與核酸。在合成期間添加至核苷酸的這類接頭是丙烯酰胺-和巰基-修飾的實體，氨基反應(yīng)基團(tuán)，以及疊氮化物和炔烴基團(tuán)，用于進(jìn)行點擊化學(xué)。也更容易檢測到一些核酸類似物，如γ-腺苷-三磷酸酯、碘脫氧胞苷-三磷酸酯、和一般金屬核苷(參見例如，dale等，proc.nat.acad.sci.usa，第70卷，第8期，第2238-2242頁(1973))。在合成期間添加修飾的核苷酸。合成可指代，例如，寡核苷酸的固體支持物合成。在這種情況中，修飾的核酸(其可以是核酸類似物、或用可檢測部分修飾的核酸、或具有接合化學(xué)接頭)可一個接著一個添加至正在固體支持物上形成的核酸片段，通過亞磷酰胺合成是最常見的方法。合成也可指代由聚合酶進(jìn)行的過程，同時其合成核酸模板的互補(bǔ)鏈。某些dna聚合酶能夠使用并納入核酸類似物，或修飾的核酸(用可檢測部分或接合化學(xué)接頭修飾)至互補(bǔ)核酸模板。

使用的檢測方法將取決于反應(yīng)性標(biāo)記物、可恢復(fù)標(biāo)記物和/或可檢測標(biāo)記物中使用的具體可檢測標(biāo)記物。在某些示例性實施方式中，通過本文所述的探針具有與其結(jié)合的一個或多個反應(yīng)性標(biāo)記物、可恢復(fù)標(biāo)記物、或可檢測標(biāo)記物的包括但不限于間期、早前期、前期、前中期、中期、后期、末期和胞質(zhì)分裂的細(xì)胞周期各階段期間的靶核酸，如染色體和染色體的亞染色體區(qū)域可經(jīng)選擇和/或掃描用于使用顯微鏡、分光光度計、管發(fā)光計或板發(fā)光計、x-射線膜、閃爍器、熒光活化的細(xì)胞分選(facs)設(shè)備、微流體設(shè)備等。

本文所用術(shù)語“染色體”是指活細(xì)胞中攜帶遺傳的基因的支持物，包括dna、蛋白質(zhì)、rna和其他相關(guān)因子。本文中使用用于鑒定和編號人基因組染色體的常規(guī)國際系統(tǒng)。單個染色體的尺寸將在多染色體基因組內(nèi)變化并且在基因組間變化。染色體可獲自任何物種。染色體可獲自成年對象、青少年對象、嬰兒對象、未出生對象(例如，來自胎兒，例如，通過產(chǎn)前測試如羊膜穿刺術(shù)、絨膜絨毛取樣、等或直接來自胎兒，例如胎兒手術(shù)期間)來自生物樣品(例如，生物組、流體或細(xì)胞(例如，痰液、血液、血細(xì)胞、組織或細(xì)針活檢樣品、尿液、腦脊液、腹膜液、和胸膜液、或來自其的細(xì)胞)或來自細(xì)胞培養(yǎng)樣品(例如，原代細(xì)胞、永生細(xì)胞、部分永生細(xì)胞等)。在某些示例性實施方式中，一種或多種染色體可獲自一個或多個屬，包括但不限于人屬、果蠅屬、線蟲屬、魚丹屬、鯉屬、貓屬、犬屬、羊?qū)?、大馬哈魚屬、鱒屬、牛屬、豬屬、原雞屬、番茄屬、小麥屬、稻屬、玉蜀黍?qū)佟⒋篼湆?、芭蕉屬、燕麥屬、楊屬、蕓薹屬、甘蔗屬等。

當(dāng)使用熒光標(biāo)記的靶向部分或可檢測標(biāo)記物時，可使用熒光光學(xué)顯微鏡來檢測并記錄采用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法的原位雜交的結(jié)果?；蛘撸墒褂镁哂袌D像處理能力的數(shù)字(計算機(jī)執(zhí)行)熒光顯微鏡。2種熟知的用于對具有與之結(jié)合的多色標(biāo)記物的染色體的成像fish的系統(tǒng)包括多重-fish(m-fish)和光譜核型分析(sky)。參見schrock等，(1996)science273：494；roberts等，(1999)geneschrom.cancer25：241；fransz等，(2002)proc.natl.acad.sci.usa99：14584；bayani等，(2004)curr.protocol.cellbiol.22.5.1-22.5.25；danilova等，(2008)chromosoma117：345；美國專利號6,066,459；和fishtagtmdna多色試劑盒說明書(分子探針公司)，針對用于噴涂染色體和檢測噴涂的染色體的方法的綜述。

在某些示例性實施方式中，使用帶修飾(例如，軟件，chroma84000濾片組，和增強(qiáng)濾波器)的計算機(jī)成像系統(tǒng)，如appliedimagingcorporationcytovision系統(tǒng)(加利福尼亞州圣克拉拉的應(yīng)用成像公司(appliedimagingcorporation，santaclara，calif.))來檢測并記錄熒光標(biāo)記的染色體的圖像。其他合適的系統(tǒng)包括計算機(jī)成像系統(tǒng)，使用與zeissaxiophot顯微鏡偶聯(lián)的冷卻的ccd相機(jī)(photometrics，裝配kodakkaf1400ccd的nu200系列)，圖像處理如ried等，(1992)proc.natl.acad.sci.usa89：1388所述。其他合適的成像和分析系統(tǒng)由schrock等，同上和speicher等，同上描述

使用本文所述的方法生成的探針的原位雜交方法可在多種生物或臨床樣品上，在處于任何(或全部)細(xì)胞周期(例如，有絲分裂、減數(shù)分裂、間期、g0、g1、s和/或g2)的細(xì)胞中進(jìn)行。示例包括全部類型的細(xì)胞培養(yǎng)物、動物或植物組織、外周血淋巴細(xì)胞、口頰涂片、從未經(jīng)培養(yǎng)的原代腫瘤制備的涂片標(biāo)本、癌細(xì)胞、骨髓、從活檢獲得的細(xì)胞、或體液(例如，血液、尿液、痰液等)中的細(xì)胞、來自羊水的細(xì)胞、來自母體血液的細(xì)胞(例如，胎兒細(xì)胞)、來自睪丸和卵巢的細(xì)胞等。樣品經(jīng)制備用于使用常規(guī)技術(shù)的本發(fā)明的試驗，其一般取決于獲得樣品或試樣的來源。這些例子不構(gòu)成對可用于本文所述的方法和/或組合物的樣品類型的限制。

在某些示例性實施方式中，探針包括差異標(biāo)記的多個grna/cas9復(fù)合物(即，grna/cas9復(fù)合物中的至少兩個是差異標(biāo)記的)。多色染色體噴涂的各種方法已經(jīng)在本領(lǐng)域中描述并且可按照本文提供的指南適用于本發(fā)明。這種差異標(biāo)記的示例(“多色fish”)包括schrock等，(1996)science273：494，和speicher等，(1996)naturegenet.12：368所述的那些。schrock等描述了光譜成像方法，其中使用落射熒光濾波器組和計算機(jī)軟件來檢測并區(qū)分差異標(biāo)記的dna探針，其同時與靶染色體組雜交。speicher等描述了使用5種熒光團(tuán)的不同組合在27-色fish(稱為“組合多熒光fish”)中標(biāo)記人染色體(或染色體臂)。也可使用其他合適方法(參見例如，ried等，1992，proc.natl.acad.sci.usa89：1388-92)。

根據(jù)某些方面，cas9-grna復(fù)合物用于探測并評價天然雙鏈dna上的感興趣區(qū)域，而不需要使靶dna變成單鏈。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法設(shè)計針對感興趣的靶雙鏈核酸序列有特異性的引導(dǎo)rna，用cas9預(yù)孵育，然后添加至含有靶dna的樣品。引導(dǎo)rna和cas9然后將共定位至靶dna并與靶dna形成復(fù)合物。

基于本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能易于鑒定或設(shè)計引導(dǎo)rna和cas9蛋白，其共定位至包括靶核酸的dna。本領(lǐng)域技術(shù)人員還將能夠鑒定用于直接或間接結(jié)合至引導(dǎo)rna或cas9蛋白的可檢測部分。dna包括基因組dna、線粒體dna、病毒dna或外源性dna。

根據(jù)一個方面，設(shè)計了針對感興趣的序列有特異性的引導(dǎo)rna。grna與cas9預(yù)孵育，然后向含有靶dna的樣品中添加組合，或者與靶dna接觸。grna或cas9可包括可檢測標(biāo)記物或者該可檢測標(biāo)記物可在復(fù)合物形成之后添加。組分混合物將全部以溶液提供或者靶核酸可固定在表面上或存在于細(xì)胞或組織內(nèi)。

根據(jù)本發(fā)明的方面，本文所述的crisprcas9系統(tǒng)具有序列特異性的優(yōu)勢(適當(dāng)設(shè)計)并且靶序列通過grna上的17-25個核苷酸間隔子序列“程序化”。

當(dāng)某些序列用于grna的“種子”區(qū)域中時，cas9系統(tǒng)顯示高效結(jié)合；基于這些短序列的基因組中的頻繁出現(xiàn)，這可用作基因組作圖工具。

cas9系統(tǒng)也可經(jīng)編程以變?yōu)樽鲌D工具，通過在grna的非種子區(qū)域處使用簡并位置(和/或通用堿基)。

為了增加標(biāo)記的特異性，引導(dǎo)物的聚類可在感興趣基因座周圍結(jié)合。

可通過rna的直接固相合成(購自供應(yīng)商如idt)或通過固相合成的dna寡聚物的體外轉(zhuǎn)錄來制備引導(dǎo)rna。

grna可易于從陣列-合成的寡聚物(其在大于所需的約100-200nt的長度上可得)合成，并經(jīng)擴(kuò)增使得各引導(dǎo)物的價值非常低，并且使大量grna的生成更易于放大。例如，定制陣列公司(customarrayinc.)在其設(shè)備的一輪運行中可提供90000個適于grna生成的陣列合成的寡聚物。

反應(yīng)動力學(xué)是等溫的(37℃，可能室溫)、快速的、在1分鐘內(nèi)，并且所得的復(fù)合物非常穩(wěn)定并易于用作探針。

靶dna可以是溶液中或固定在表面上的堆積dna、細(xì)胞中的原位dna、在表面上鋪展的染色體上的dna、和在表面上或納米通道中拉伸的單個dna分子。

其他工程改造的核酸酶，如尋靶核酸內(nèi)切酶(he)、大范圍核酸酶、轉(zhuǎn)錄活化樣效應(yīng)子核酸酶(talen)、鋅指核酸酶(zfn)、原核阿爾古蛋白質(zhì)(pago)、或burrh-基核酸酶(budn)可代替cas9使用，或與cas9平行使用。例如，ttago對rna有高親和性并且對dsdna有低親和性。

根據(jù)某些方面，可通過直接標(biāo)記cas9蛋白來檢測dna-結(jié)合的cas9-sgrna(例如，通過與量子點或有機(jī)染料結(jié)合的親和標(biāo)簽)。市售的cas9蛋白已經(jīng)含有親和標(biāo)簽(來自pnabio公司的cas9包含人流感病毒血凝素(ha)；來自新英格蘭生物實驗室公司的cas9包含組氨酸(his)標(biāo)簽)。可通過標(biāo)記grna來檢測dna-結(jié)合的cas9-sgrna，如在grna的3’端的尾部分處，并且其中可探測尾部分。例如，熒光部分可結(jié)合至尾，不同顏色的探針可結(jié)合以產(chǎn)生編碼方案，探針可交換以增加代碼庫。與dna-paint結(jié)合，可實現(xiàn)超高分辨率成像。與流體裝置結(jié)合，可進(jìn)行exchange-paint，其使得能夠在超高分辨率下進(jìn)行多重化。在該方案中，通過進(jìn)行試劑交換循環(huán)，有限數(shù)量的代碼可用于對大量基因座的超高分辨率成像，其中在各循環(huán)處使用相同顏色但連接至不同dnapaint成像器序列。例如，僅2種標(biāo)記物(包括cy3b，atto655)使用5次，每次與不同成像器序列偶聯(lián)，具有編碼10種grna的容量。在每次循環(huán)中，grna的亞組變得被標(biāo)記。在循環(huán)已經(jīng)完成之后，通過確定顏色和特定grna點亮?xí)r的循環(huán)數(shù)來解碼grna的種類。

為了增加信號強(qiáng)度，用多種熒光團(tuán)標(biāo)記的寡聚物可結(jié)合至grna的尾部分。或者，可進(jìn)行通過使用結(jié)合尾并以鎖式探針環(huán)化的寡聚物由尾的3’端引發(fā)的滾環(huán)擴(kuò)增。也可使用雜交鏈反應(yīng)或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他信號擴(kuò)增方法。

檢測方法包括熒光檢測方法、電致發(fā)光檢測方法、生物發(fā)光檢測方法和比色檢測方法。

可使用除涉及檢測熒光、電致發(fā)光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光或比色部分或復(fù)合物的那些以外的檢測方法如使cas9-sgrna結(jié)合的dna鏈通過納米孔或納米間隙或納米通道來確定cas9-sgrna的結(jié)合位置，使用電子顯微術(shù)或掃描探針顯微術(shù)來檢測cas9-sgrna與表面上延伸/拉伸的dna的結(jié)合位置，使用懸臂、石英晶體微天平、場效應(yīng)晶體管等檢測cas9-sgrna與靶dna的結(jié)合。

根據(jù)某些方面，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的納米孔或納米間隙檢測技術(shù)或者納米孔或納米間隙測序技術(shù)來確定靶核酸處的grna和cas9的復(fù)合物的存在。簡言之，在導(dǎo)電介質(zhì)中，具有與之結(jié)合的grna和cas9的靶核酸在電壓差的影響下通過納米孔。使用離子電流中的界面依賴性變化來區(qū)分單個核苷酸和與核酸結(jié)合的grna/cas9復(fù)合物?？赏ㄟ^這種方式檢測grna/cas9復(fù)合物的存在。根據(jù)一個方面，離子電流中的界面依賴性變化決定靶核酸進(jìn)入納米孔或納米間隙和grna/cas9是否結(jié)合至靶核酸以及結(jié)合的位置。當(dāng)線性聚合物的核酸進(jìn)入納米孔時，離子電流下降，因為孔中聚合物的物理存在干擾離子流過孔。如果grna/cas9復(fù)合物結(jié)合至dna上的具體位置，則當(dāng)該位置進(jìn)入孔時，離子流進(jìn)一步減少，降低了離子電流。這種電流的降低表明grna/cas9復(fù)合物結(jié)合至靶核酸。根據(jù)其尺寸和物理-化學(xué)性質(zhì)，與靶核酸(即，dna聚合物)結(jié)合的各種類型的結(jié)構(gòu)或復(fù)合物將產(chǎn)生離子電流的特征性變化?？刹町悩?biāo)記靶向不同位置或等位基因的grna-cas9復(fù)合物，使得可通過納米孔讀取來區(qū)分它們。

“納米孔”表示具有納米級寬度的洞或通道，如通過膜的平坦表面的洞或通道?？赏ㄟ^多亞基蛋白環(huán)，如在脂質(zhì)雙層中形成納米孔。納米孔可以氮化硅、石墨烯或這類非生物材料的固態(tài)平面表面中的物理洞。一般而言，通道是0.2-25nm寬。本文所用的納米孔可包括跨膜結(jié)構(gòu)，其可使分子通過膜。納米孔的示例包括α-溶血素(金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus))和mspa(恥垢分枝桿菌(mycobacteriumsmegmatis))。納米孔的其他示例可在說明納米孔測序的領(lǐng)域中發(fā)現(xiàn)，或在孔形成毒素領(lǐng)域中描述，如β-pftpanton-valentine殺白細(xì)胞素s、氣單胞菌溶素、和梭菌ε毒素、α-pft溶細(xì)胞素a、二元pft炭疽毒素、或其他如肺炎鏈球菌溶血素或短桿菌肽。隨著納米孔測序技術(shù)的出現(xiàn)，納米孔在技術(shù)和經(jīng)濟(jì)上正變得重要。納米孔測序的方法是本領(lǐng)域已知的，例如，如u.s.p.n.5,795,782中所述，其通過引用納入本文。簡言之，納米孔檢測包括將納米孔-穿孔的膜浸入電壓-導(dǎo)電流體中，如包含例如kcl、nacl、nicl、licl或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他離子形成無機(jī)化合物的離子溶液?？缒な┘与妷?，并且從通過納米孔的離子傳導(dǎo)產(chǎn)生電流。當(dāng)納米孔與聚合物相互作用如dna時，根據(jù)在任何給定時間移位通過孔的聚合物亞片段的特性調(diào)節(jié)通過納米孔的流，如以單體-特異性方式，產(chǎn)生能夠鑒定單體或亞片段的電流變化。本發(fā)明范圍內(nèi)的納米孔包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的固態(tài)非蛋白納米孔和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的dna折紙納米孔。這種納米孔提供比已知的蛋白質(zhì)納米孔更大的納米孔寬度，其使得能夠通過較大的分子用于檢測，如帶雙鏈靶核酸的cas9/grna復(fù)合物，同時仍然足夠敏感以檢測復(fù)合物通過納米孔時的離子電流變化。

“納米孔分析”表示基于聚合物與納米孔的相互作用確定聚合物組分，如包含grna/cas9復(fù)合物的多核苷酸的方法?？赏ㄟ^測量當(dāng)通過與聚合物相互作用改變開口尺寸時發(fā)生的通過納米孔的離子的導(dǎo)電性變化來實現(xiàn)納米孔分析。

除了納米孔以外，本申請設(shè)想使用作為兩個電極之間的間隙的本領(lǐng)域已知的納米間隙，其中間隙的寬度為約幾納米，如約0.2nm至約25nm或約2nm至約5nm。間隙模擬納米孔中的開口并且使dna通過或跨過兩個電極之間的間隙。本發(fā)明的方面還設(shè)想使用納米通道。電極與dna通過的納米通道相鄰放置。另外或或者，當(dāng)復(fù)合物經(jīng)光學(xué)標(biāo)記時，可確定納米通道中拉伸的dna聚合物的復(fù)合物結(jié)合位置。應(yīng)理解本領(lǐng)域技術(shù)人員將易于設(shè)想分子或部分鑒定和測序的不同實施方式，其基于通過電場的分子或部分運動并產(chǎn)生代表通過電場的結(jié)構(gòu)的電場變形。

根據(jù)另一個方面，可使用cas9切口酶來切開靶標(biāo)雙鏈核酸并且該切口用作基于聚合酶或連接酶的測序的序列限定的起始位點，從而顯示cas9-sgrna靶標(biāo)位點附近的序列信息?？稍O(shè)計引導(dǎo)物文庫，其能夠?qū)蚪M的許多選擇部分，例如，外顯子，由gwas信號鑒定的區(qū)域，與心臟病、癌癥等相關(guān)的特定基因進(jìn)行測序。也可使用引物延伸來標(biāo)記切口位點，如通過納入熒光核苷酸，通過連接或通過納入熒光核苷酸，之后進(jìn)行連接。如果引物延伸置換已有的鏈，則可通過例如用寡聚體與之雜交來標(biāo)記置換的側(cè)翼。如果存在多個切口位點，如當(dāng)部分引導(dǎo)物含有簡并序列時，則多個標(biāo)記位點可用作作圖工具。引物延伸方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。

本文所述方法的具體應(yīng)用包括鑒定或診斷或作圖方法。通常人類基因組的“暗物質(zhì)”，如著絲粒重復(fù)，如圖6a所示。由于高重復(fù)性，現(xiàn)有的參考基因組中大多數(shù)沒有著絲粒dna序列。使用crispr/cas9的本文所述的單分子作圖或測序方法使得以靶向的方式在超高分辨率下通過對重復(fù)位點進(jìn)行作圖來對參考基因組進(jìn)行更完全組裝，并且也使得能夠從這些位點進(jìn)行測序。這類方法可用于個人基因組。

本發(fā)明的方法包括以比目前使用標(biāo)記的克隆進(jìn)行的那些更高的效率和分辨率進(jìn)行對染色體分散上的fish。標(biāo)記的grna/cas9復(fù)合物是本文所述的示例性方法中的有效fish探針，因為其使得能夠獲得更清晰的信號。該方法使得能夠?qū)εc許多癌癥和不孕不育問題相關(guān)的染色體斷裂點、復(fù)合物易位或重排進(jìn)行更快且更好的鑒定。

本發(fā)明的方法使得能夠進(jìn)行體外診斷。

本發(fā)明的方法能夠在快速診斷平臺中探測在細(xì)菌或病毒中編碼多重耐藥性的基因；在這種情況下，cas9-sgrna可用于直接并穩(wěn)定地靶向dsdna。

本發(fā)明也設(shè)想以下示例性方法。

包括mg存在的野生型cas9

在一些實施方式中，本發(fā)明包括檢測、標(biāo)記、拉下或靶向核酸中的位點的方法，包括：(a)使核酸與包含具有或保留蛋白酶活性的cas9蛋白和引導(dǎo)rna的復(fù)合物在下述條件下接觸：使復(fù)合物結(jié)合核酸，切割核酸，但不易于從核酸解離(即，保持接合核酸，將2條切割的鏈保持在一起)，和(b)分析步驟(a)的產(chǎn)物。在一些實施方式中，這種條件包括存在二價陽離子如mg²⁺。在一些實施方式中，在步驟(a)和步驟(b)之間存在至少一個洗滌步驟。在一些實施方式中，所得復(fù)合物的至少一種組分被標(biāo)記或帶標(biāo)簽。在一些實施方式中，引導(dǎo)rna結(jié)合與天然pam位點相鄰的序列。在一些實施方式中，引導(dǎo)rna結(jié)合與人工pam位點相鄰的序列。在一些實施方式中，cas9是cas9的變化形式。在一些實施方式中，引導(dǎo)rna是截短的引導(dǎo)rna。在一些實施方式中，截短的引導(dǎo)物包括引導(dǎo)rna的僅種子區(qū)域，即，與pam位點相鄰的4-7個核苷酸。

mg不存在下的野生型cas9

在一些實施方式中，本發(fā)明包括檢測、標(biāo)記、拉下或靶向核酸中的位點的方法，包括：(a)使核酸與包含具有或保留蛋白酶活性的cas9蛋白和引導(dǎo)rna的復(fù)合物在下述條件下接觸：使復(fù)合物結(jié)合核酸，不切割核酸且不易于從核酸解離，和(b)分析步驟(a)的產(chǎn)物。在一些實施方式中，這種條件包括不存在二價陽離子如mg²⁺。在一些實施方式中，在步驟(a)和步驟(b)之間存在至少一個洗滌步驟。在一些實施方式中，所得復(fù)合物的至少一種組分被標(biāo)記或帶標(biāo)簽。在一些實施方式中，引導(dǎo)rna結(jié)合與天然pam位點相鄰的序列。在一些實施方式中，引導(dǎo)rna結(jié)合與人工pam位點相鄰的序列。在一些實施方式中，cas9是cas9的變化形式。在一些實施方式中，引導(dǎo)rna是截短的引導(dǎo)rna。在一些實施方式中，截短的引導(dǎo)物包括引導(dǎo)rna的僅種子區(qū)域，即，與pam位點相鄰的4-7個核苷酸。

無效/死cas9

在一些實施方式中，本發(fā)明包括檢測、標(biāo)記、拉下或靶向核酸中的位點的方法，包括：(a)使核酸與包含無酶活性或核酸酶無效的cas9蛋白(例如，d10a/h840adcas9)和引導(dǎo)rna的復(fù)合物在復(fù)合物不切割核酸且不易于從核酸解離的條件下接觸，和(b)分析步驟(a)的產(chǎn)物。在一些實施方式中，在步驟(a)和步驟(b)之間存在至少一個洗滌步驟。在一些實施方式中，所得復(fù)合物的至少一種組分被標(biāo)記或帶標(biāo)簽。在一些實施方式中，引導(dǎo)rna結(jié)合與天然pam位點相鄰的序列。在一些實施方式中，引導(dǎo)rna結(jié)合與人工pam位點相鄰的序列。在一些實施方式中，cas9是cas9的變化形式。在一些實施方式中，引導(dǎo)rna是截短的引導(dǎo)rna。在一些實施方式中，截短的引導(dǎo)物包括引導(dǎo)rna的僅種子區(qū)域，即，與pam位點相鄰的4-7個核苷酸。

切口酶cas9

在一些實施方式中，本發(fā)明包括檢測、標(biāo)記、拉下或靶向核酸中的位點的方法，包括：(a)使核酸與包含cas9切口酶(即，cas9蛋白的切口突變體如cas9d10a或h840a突變體)和引導(dǎo)rna的復(fù)合物在復(fù)合物不易于從核酸解離的條件下接觸，和(b)分析步驟(a)的產(chǎn)物。在一些實施方式中，在步驟(a)和步驟(b)之間存在至少一個洗滌步驟。在一些實施方式中，所得復(fù)合物的至少一種組分被標(biāo)記或帶標(biāo)簽。在一些實施方式中，引導(dǎo)rna結(jié)合與天然pam位點相鄰的序列。在一些實施方式中，引導(dǎo)rna結(jié)合與人工pam位點相鄰的序列。在一些實施方式中，cas9是cas9的變化形式。在一些實施方式中，引導(dǎo)rna是截短的引導(dǎo)rna。在一些實施方式中，截短的引導(dǎo)物包括引導(dǎo)rna的僅種子區(qū)域，即，與pam位點相鄰的4-7個核苷酸。

沒有dna結(jié)合蛋白的情況下使用引導(dǎo)rna的方法

在一些實施方式中，本發(fā)明包括檢測、標(biāo)記、拉下或靶向核酸中的位點的方法，包括：(a)使核酸與引導(dǎo)rna在其不易于從核酸解離的條件下接觸，和(b)分析步驟(a)的產(chǎn)物。在一些實施方式中，在步驟(a)和步驟(b)之間存在至少一個洗滌步驟。在一些實施方式中，所得引導(dǎo)rna-dna復(fù)合物經(jīng)標(biāo)記或帶標(biāo)簽。在一些實施方式中，標(biāo)記物或標(biāo)簽在尾上。在一些實施方式中，引導(dǎo)rna結(jié)合與天然pam位點相鄰的序列。在一些實施方式中，引導(dǎo)rna結(jié)合與人工pam位點相鄰的序列。在一些實施方式中，引導(dǎo)rna不需要結(jié)合與pam位點相鄰的序列。在一些實施方式中，引導(dǎo)rna是截短的引導(dǎo)rna。在一些實施方式中，截短的引導(dǎo)rna包括引導(dǎo)rna的僅種子區(qū)域，即，與pam位點相鄰的4-7個核苷酸。在一些實施方式中，靶基因座是重復(fù)dna的區(qū)域并且信號被放大。在一些實施方式中，靶核酸在添加引導(dǎo)rna之前變性。

使用rna的方法

在一些實施方式中，本發(fā)明包括檢測、標(biāo)記、拉下或靶向核酸中的位點的方法，包括：(a)使核酸與rna在其結(jié)合核酸的條件下接觸，和(b)分析步驟(a)的產(chǎn)物。在一些實施方式中，在步驟(a)和步驟(b)之間存在至少一個洗滌步驟。在一些實施方式中，所得rna-dna復(fù)合物經(jīng)標(biāo)記或帶標(biāo)簽。在一些實施方式中，標(biāo)記物或標(biāo)簽在尾上。在一些實施方式中，靶基因座是重復(fù)dna的區(qū)域并且信號被放大。

雙鏈體去穩(wěn)定/開口劑和rna

在一些實施方式中，本發(fā)明包括檢測、標(biāo)記、拉下或靶向核酸中的位點的方法，包括：(a)使核酸與雙鏈體去穩(wěn)定/開口劑和引導(dǎo)rna或rna在下述條件下接觸：復(fù)合物形成并結(jié)合核酸，且復(fù)合物不易于從核酸解離，和(b)分析步驟(a)的產(chǎn)物。在一些實施方式中，在步驟(a)和步驟(b)之間存在至少一個洗滌步驟。在一些實施方式中，所得復(fù)合物的至少一種組分被標(biāo)記或帶標(biāo)簽。在一些實施方式中，標(biāo)記物或標(biāo)簽在尾上。在一些實施方式中，cas9是cas9的變化形式。在一些實施方式中，引導(dǎo)rna是截短的引導(dǎo)rna。在一些實施方式中，截短的引導(dǎo)物包括引導(dǎo)rna的僅種子區(qū)域，即，與pam位點相鄰的4-7個核苷酸。在一些實施方式中，靶基因座是重復(fù)dna的區(qū)域并且信號被放大。去穩(wěn)定劑(其包括單鏈dna穩(wěn)定劑)包括解旋酶、復(fù)制蛋白a(rpa)、大腸桿菌單鏈結(jié)合蛋白(ssb)、甜菜堿、甜菜堿/甘氨酸、甲酰胺、尿素、dmso等。雙鏈體開口劑包括引發(fā)體蛋白pria、三鏈體形成雙-pna、γpna等。

體外rna合成和探測

在一些實施方式中，本發(fā)明包括檢測、標(biāo)記、拉下或靶向核酸中的位點的方法，包括：(a)在無細(xì)胞系統(tǒng)中合成rna，(b)使核酸與rna或其他組分接觸，形成復(fù)合物并且所述復(fù)合物不易于從核酸解離，和(c)分析步驟(b)的產(chǎn)物。在一些實施方式中，在步驟(b)和步驟(c)之間存在至少一個洗滌步驟。在一些實施方式中，所得復(fù)合物的至少一種組分被標(biāo)記或帶標(biāo)簽。在一些實施方式中，標(biāo)記物或標(biāo)簽在尾上。在一些實施方式中，cas9是cas9的變化形式。在一些實施方式中，引導(dǎo)rna是截短的引導(dǎo)rna。在一些實施方式中，截短的引導(dǎo)物包括引導(dǎo)rna的僅種子區(qū)域，即，與pam位點相鄰的4-7個核苷酸。

切口和測序

在一些實施方式中，本發(fā)明包括靶向測序，包括(a)使核酸與包含cas9蛋白的切口突變體和靶向特定位置的引導(dǎo)rna在復(fù)合物誘導(dǎo)核酸的一條鏈中的切口的條件下接觸，(b)用核苷酸延伸切口的3’端，(c)檢測步驟(b)的產(chǎn)物并以一定方式重復(fù)步驟(b)以對dna進(jìn)行測序。在一些實施方式中，核苷酸經(jīng)標(biāo)記。在一些實施方式中，核苷酸在末端磷酸酯處經(jīng)標(biāo)記。在一些實施方式中，核苷酸含有超過三個磷酸酯。在一些實施方式中，核酸在堿基處通過可切割連接標(biāo)記。在一些實施方式中，核苷酸是可逆終止子。在一些實施方式中，在堿基處的標(biāo)記物提供可逆終止。在一些實施方式中，在糖上3’或2’位處的修飾提供了可逆終止。在一些實施方式中，延伸同時可使用所有4種核苷酸。在一些實施方式中，使用單分子檢測方法。在一些實施方式中，以線性串分析單分子。在一些實施方式中，在細(xì)胞中原位分析核酸。在一些實施方式中，在細(xì)胞中原位分析核酸的情況中，在分析之前固定細(xì)胞。在一些實施方式中，原位分析的核酸是dna分子并且在分析之前去除rna分子。在一些實施方式中，使用試劑在切口后從核酸去除復(fù)合物。在一些實施方式中，在步驟(b)和步驟(c)之間存在至少一個洗滌步驟。在一些實施方式中，cas9是cas9的變化形式。在一些實施方式中，引導(dǎo)rna是截短的引導(dǎo)rna。在一些實施方式中，截短的引導(dǎo)物包括引導(dǎo)rna的僅種子區(qū)域，即，與pam位點相鄰的4-7個核苷酸。

切口和捕獲

在一些實施方式中，用修飾的核苷酸延伸切口的3’端。在一些實施方式中，修飾的核苷酸是生物素修飾的。在一些實施方式中，使用納入的生物素來標(biāo)記靶dna，例如，通過與自身標(biāo)記(或變得標(biāo)記)的鏈霉親和素/中性親和素或抗-生物素抗體的相互作用。在一些實施方式中，使用納入的生物素，例如，通過與自身結(jié)合(或變得結(jié)合)生物素包被的捕獲材料如磁珠或瓊脂糖珠，或表面的鏈霉親和素/中性親和素或抗-生物素抗體的相互作用來捕獲靶dna。在一些實施方式中，使用cas9/grna引導(dǎo)的切口和經(jīng)修飾以輔助捕獲的堿基納入在溶液中進(jìn)行的反應(yīng)中分離核酸樣品的特定單個或多個部分。在該實施方式中，例如，在切口和納入生物素化的dutp之后，產(chǎn)物與鏈霉親和素包被的磁珠反應(yīng)一段時間(例如，1小時)，這段時間使基因組的生物素化的部分被珠上的鏈霉親和素結(jié)合。然后施加磁體并且接合至固相珠的基因組的靶向的部分從上清分離，從而分離靶向的感興趣區(qū)域。棄去上清。在各種程度的洗滌嚴(yán)謹(jǐn)性并去除上清之后，通過本領(lǐng)域已知的方法從珠分離選擇的基因組dna(例如，通過加熱超過90℃)。然后可通過如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的下一代測序方法和裝置來對捕獲的分子進(jìn)行測序，其可包括選自尺寸選擇、拋光、條碼化、加尾、文庫制備、聚類擴(kuò)增、集落擴(kuò)增等的步驟。本文所述的用于選擇或富集核酸樣品的部分或亞組的切口和納入方法比引導(dǎo)rna/cas9的結(jié)合有優(yōu)勢，因為延伸使得能夠納入多個生物素，從而改善了捕獲效率。另一個優(yōu)勢是降低的脫靶捕獲，因為在靶標(biāo)變得可捕獲之前需要三個步驟：grna/cas9結(jié)合、切口和延伸。這種選擇方法比現(xiàn)有方法更清楚(例如，sureselect)，并且導(dǎo)致更少測序，因為脫靶序列更少。在一些實施方式中，在切口的5’端上進(jìn)行反應(yīng)，如連接反應(yīng)，如連接生物素化的寡核苷酸，作為示例。在一些實施方式中，可分離dna雙鏈體的正義和反義鏈。根據(jù)這一方面，通過grna/cas9結(jié)合或通過納入生物素化的核苷酸捕獲一條鏈并且從上清收集另一條鏈?；蛘?，可通過結(jié)合至單鏈結(jié)合蛋白、羥基磷灰石或結(jié)合至序列特異性寡核苷酸來捕獲由grna結(jié)合置換的雙鏈體的鏈。

切口和直接測序

在一些實施方式中，用接合至表面的靶核酸，即dna進(jìn)行g(shù)rna引導(dǎo)的切口，或者，在進(jìn)行切口之后，dna接合至表面。在一些實施方式中，然后可使用切口的3’端來啟動dna測序。切口的3’端允許進(jìn)行基于聚合酶的測序，如通過合成的億明達(dá)(illumina)測序。切口的3’和5’端都支持基于連接的測序，如solid(生命技術(shù)公司)和通過連接的測序(完整基因組學(xué)公司(completegenomicsinc))。在一些實施方式中，基因組dna在長的長度上保留并且在其已經(jīng)接合至表面之前或之后進(jìn)行切口。在一些實施方式中，dna接合至表面并拉伸或延長使得能夠分析序列或沿著其長度的特征。這種分析可通過光學(xué)、電子、x-射線、或掃描探針顯微術(shù)來進(jìn)行。在一些實施方式中，在通過光學(xué)方法進(jìn)行分析的情況中，在設(shè)置在表面上的多核苷酸上的測序反應(yīng)上進(jìn)行全內(nèi)反射或漸消波/波導(dǎo)成像。在一些實施方式中，多核苷酸可以線性化，但是不接合至表面。在一些實施方式中，可通過多核苷酸接合在一端并在流中懸空來產(chǎn)生線性化。在一些實施方式中，通過流體力學(xué)拖曳力使靶核酸，即dna基本呈線性。在一些實施方式中，通過設(shè)置在納米縫、納米通道或納米溝中的納米-限制來拉伸dna。一些實施方式中，線性dna是基本直的。在一些實施方式中，grna引導(dǎo)的切口引導(dǎo)在長線性多核苷酸上的多個選擇序列位置處進(jìn)行通過合成的測序。在該實施方式中，通過納入在通過分析的測序中可檢測的核苷酸從切口延伸聚合酶(例如，9degreenorth或其突變體或者phi29或其突變體)。這種檢測可通過ph(如離子激流測序)。在一些實施方式中，檢測是通過核苷酸上的熒光標(biāo)記物。在一些實施方式中，也被熒光標(biāo)記的核苷酸也發(fā)揮可逆終止子的作用并且因此允許通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行逐步四色測序(如億明達(dá)或lasergen測序)。納入的核苷酸可以是閃電終止子(lasergen)，其中光可切割部分的切割是通過uv光。在一些實施方式中，grna/cas9復(fù)合物形成之后的測序是出于進(jìn)行選擇性或靶向測序的目的。在其他實施方式中，grna含有至少一部分的簡并部分，并且測序從基因組上分布的多個起始位點開始并且對于特定基因組不是選擇性的。在一些實施方式中，發(fā)生切口同時dna在細(xì)胞內(nèi)。在一些實施方式中，細(xì)胞被固定。例如，切口可形成熒光原位測序(fisseq)反應(yīng)的部分，其中對dna進(jìn)行測序。在一些實施方式中，使用切口來誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)基因組dna中的切口，然后啟動與切口相鄰的區(qū)域的擴(kuò)增，例如，通過鏈置換聚合酶如phi29的分支或滾環(huán)擴(kuò)增。然后在擴(kuò)增的產(chǎn)物上進(jìn)行測序。或者，使用單分子測序方法，如trueseq(helicosbio/seqll)直接從切口開始對切口的基因組dna進(jìn)行測序。

結(jié)合和納米孔分析

在一些實施方式中，本發(fā)明包括檢測核酸中結(jié)合位點或序列的位置的方法，包括：(a)使核酸與包含cas9蛋白和引導(dǎo)rna的復(fù)合物在該復(fù)合物不易于從核酸解離的條件下接觸；(b)使核酸通過納米孔或納米間隙，和(c)分析結(jié)合位置。在一些實施方式中，使用單分子檢測方法。在一些實施方式中，使用單通道記錄。在一些實施方式中，以線性串分析單分子。

脫靶結(jié)合

在一些實施方式中，本發(fā)明包括檢測引導(dǎo)rna脫靶結(jié)合位點的方法，包括：(a)使核酸與包含cas9蛋白和引導(dǎo)rna的復(fù)合物在該復(fù)合物不易于從核酸解離的條件下接觸，(b)確定結(jié)合的位置，(c)確定結(jié)合的靶向的位置，(d)確定脫靶結(jié)合的位置，和(e)通過脫靶結(jié)合的位置確定脫靶結(jié)合的序列的相同性。在一些實施方式中，使用標(biāo)記物來提供標(biāo)志，可通過參考其來確定靶或脫靶結(jié)合。在一些實施方式中，標(biāo)記物包含在核酸上產(chǎn)生物理圖的結(jié)合試劑。在一些實施方式中，結(jié)合試劑可以是以下的一種或多種：非-混雜grna、限制性酶、切口酶、寡核苷酸等。在一些實施方式中，使用單分子檢測方法。在一些實施方式中，以線性串分析單分子。

檢測拷貝數(shù)

在一些實施方式中，本發(fā)明包括確定染色體或基因組的區(qū)域的拷貝數(shù)，包括(a)使靶核酸序列接觸引導(dǎo)rna序列，該引導(dǎo)rna序列具有與拷貝數(shù)待確定的該染色體或基因組區(qū)域和cas9蛋白互補(bǔ)的部分，以及與參考染色體和/或基因組區(qū)域和cas9蛋白互補(bǔ)的部分，(b)獲得來自拷貝數(shù)待確定的基因組的區(qū)域/染色體與參考染色體或基因組區(qū)域的信號之比。在一些實施方式中，該方法應(yīng)用于非整倍性檢測。在一些實施方式中，非整倍性是21三體。在一些實施方式中，拷貝數(shù)待確定的基因組是lsi21q22.13-q22.2。

her2

在一些實施方式中，本發(fā)明包括確定her2擴(kuò)增程度的方法，包括：(a)使靶核酸序列與引導(dǎo)rna序列接觸，該引導(dǎo)rna序列具有與her2基因座和cas9互補(bǔ)的部分，以及與參考基因座和cas9蛋白互補(bǔ)的部分，和(b)獲得來自her2基因座與參考基因座的信號之比。

基因融合

在一些實施方式中，本發(fā)明包括確定出現(xiàn)基因融合的方法，包括：(a)使靶核酸序列與具有與第一基因組基因座和cas9蛋白互補(bǔ)的部分的引導(dǎo)rna探針序列，和具有與第二基因座基因座和cas9蛋白互補(bǔ)的部分的引導(dǎo)rna探針序列接觸，(b)檢測第一和第二基因座之間的共定位事件，其中基因融合是基因組區(qū)域之間的任意融合。根據(jù)一個方面，共定位產(chǎn)生互相相鄰的探針。

斷裂試驗

在一些實施方式中，本發(fā)明包括確定出現(xiàn)基因融合的方法，包括：(a)使靶核酸序列與具有與基因組基因座(第一基因座)和cas9蛋白互補(bǔ)的部分的引導(dǎo)rna序列，和具有與相鄰基因座基因座(第二基因座)和cas9蛋白互補(bǔ)(按照參考)的部分的引導(dǎo)rna序列接觸，(b)確定是否沒有檢測到第一和第二基因座之間的共定位事件。在一些實施方式中，該方法應(yīng)用于間變性淋巴瘤激酶，如alk(參見圖12)。在一些實施方式中，該方法應(yīng)用于ros1。ros1是胰島素受體家族的受體酪氨酸激酶。在一些實施方式中，該試驗應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌的診斷。

基因組重排

在一些實施方式中，本發(fā)明包括檢測基因組區(qū)域間重排的方法，包括(a)使基因組dna樣品接觸多個引導(dǎo)rna序列，所述引導(dǎo)rna序列各自具有與基因組區(qū)域的特定子區(qū)域和cas9蛋白互補(bǔ)的部分，其中各子區(qū)域的grna包括使其能夠與其他子區(qū)域的grna區(qū)分的編碼，和(b)對基因組dna進(jìn)行成像并對編碼解碼并比較編碼與參考的順序，其中在感興趣基因組區(qū)域的大致長度上存在編碼的共定位。在一些實施方式中，在尾處編碼grna。在一些實施方式中，通過使尾的編碼部分與解碼器分子接觸來進(jìn)行對編碼的解碼，該解碼器分子包含dna或蛋白質(zhì)探針。在一些實施方式中，除了確定基因組重排以外，也可區(qū)分特定基因組區(qū)段的不同等位基因。在一些實施方式中，針對不同等位基因以及針對不同基因組區(qū)段使用不同編碼。在一些實施方式中，感興趣區(qū)域是基因組的brca1和/或brca2區(qū)域。在一些實施方式中，感興趣區(qū)域是mhc或hla區(qū)域。在一些實施方式中，感興趣區(qū)域是mmr基因mlh1-pms2和msh2-epcam-msh6周圍的區(qū)域，并且可用于診斷或分析遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌(nhpcc)。在一些實施方式中，針對各基因組區(qū)段使用多種grna并且這多種引導(dǎo)rna各自用相同編碼標(biāo)記。

列舉重復(fù)數(shù)

在一些實施方式中，以線性串分析基因組dna的鏈。在一些實施方式中，拉伸該dna。在一些實施方式中，進(jìn)行納米孔/納米間隙分析。在一些實施方式中，該方法用于對人染色體4和10上含3.3kb-d4z4重復(fù)的基因座上的重復(fù)單元的數(shù)量進(jìn)行列舉。在一些實施方式中，使用對d4za區(qū)域的列舉來診斷或分析患有面肌營養(yǎng)不良(fshd)的患者。在一些實施方式中，該方法用于對端粒亞單元重復(fù)數(shù)量進(jìn)行列舉。在一些實施方式中，該方法用于對著絲粒重復(fù)數(shù)量進(jìn)行列舉。在一些實施方式中，該方法用于對大隨體(majorsatellite)重復(fù)數(shù)量進(jìn)行列舉。在一些實施方式中，該方法用于對小隨體(minorsatellite)重復(fù)數(shù)量進(jìn)行列舉。

cas9/引導(dǎo)rna原位雜交

根據(jù)某些方面，用于進(jìn)行cas9介導(dǎo)的原位雜交的方法包括以下步驟：使靶核酸序列與具有與感興趣染色體或基因組區(qū)域和cas9蛋白互補(bǔ)的部分的引導(dǎo)rna序列接觸，其中該引導(dǎo)rna和cas9蛋白共定位至靶核酸序列以形成復(fù)合物，其中感興趣的染色體或基因組區(qū)域設(shè)置在流動池中，其中原位雜交的試劑和洗滌試劑流過感興趣染色體或基因組區(qū)域之上。根據(jù)某些方面，使用選自下組的方法來檢測復(fù)合物的位置，包括熒光、化學(xué)發(fā)光、電致發(fā)光、比色檢測等。

等位基因-特異性檢測

在一些實施方式中，本發(fā)明包括確定特定等位基因存在的方法，包括(a)使靶核酸序列與具有與待檢測的等位基因和cas9蛋白互補(bǔ)的種子部分(與pam位點相鄰的前4-7個核苷酸)的引導(dǎo)rna序列接觸，和(b)檢測與核酸共定位的grna/cas9的存在。

結(jié)合試驗

根據(jù)某些方面，提供了檢測特定序列的診斷方法，包括以下步驟：(a)使靶核酸序列與引導(dǎo)rna序列接觸，該引導(dǎo)rna序列具有與靶核酸序列和cas9蛋白互補(bǔ)的部分，(b)在表面上的位置上捕獲復(fù)合物，(c)通過僅存在于復(fù)合物且不存在于靶核酸序列的標(biāo)記物來檢測該位置上捕獲的復(fù)合物。根據(jù)某些方面，提供了檢測特定序列的診斷方法，包括以下步驟：(a)使靶核酸序列與引導(dǎo)rna序列接觸，所述引導(dǎo)rna序列具有與靶核酸序列和cas9蛋白互補(bǔ)的部分，(b)在表面上的位置上捕獲復(fù)合物，(c)通過僅存在于復(fù)合物且不存在于cas9/grna的標(biāo)記物來檢測該位置上捕獲的復(fù)合物。在一些實施方式中，作為側(cè)流試驗、浸漬條試驗、紙微流體試驗、點印跡試驗、微陣列試驗的部分進(jìn)行該試驗。在一些實施方式中，該試驗是診斷試驗。

免疫組化和grna/cas9原位雜交

在一些實施方式中，本發(fā)明包括在同一樣品上組合免疫組化(ihc)和grna/cas9介導(dǎo)的原位雜交(ish)的方法，包括以下步驟：(a)使靶染色質(zhì)內(nèi)的靶核酸序列與引導(dǎo)rna序列接觸，所述引導(dǎo)rna序列具有與靶核酸序列和cas9蛋白互補(bǔ)的部分，其中引導(dǎo)rna和cas9蛋白共定位至靶核酸序列以形成復(fù)合物，(b)使靶染色質(zhì)與蛋白質(zhì)結(jié)合試劑接觸，和(c)檢測引導(dǎo)rna/cas9復(fù)合物和蛋白質(zhì)結(jié)合試劑的比較位置。在一些實施方式中，蛋白質(zhì)結(jié)合試劑是抗體。在一些實施方式中，蛋白質(zhì)結(jié)合試劑是適體。在一些實施方式中，引導(dǎo)rna/cas9復(fù)合物和蛋白質(zhì)結(jié)合試劑被差異標(biāo)記。在一些實施方式中，ihc試劑和引導(dǎo)rna/cas9ish一起添加。在一些實施方式中，ihc試劑和引導(dǎo)rna/cas9ish連續(xù)，即一個接著一個添加。在一些實施方式中，因為引導(dǎo)rna/cas9ish不需要變性步驟，蛋白質(zhì)和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)保持完成用于待進(jìn)行的ihc。在一些實施方式中，使用引導(dǎo)rna/cas9復(fù)合物來分離染色質(zhì)的特定部分，并且使用分析方法來檢測分離的染色質(zhì)上存在的蛋白質(zhì)。

探測引導(dǎo)rna尾

在一些實施方式中，本發(fā)明包括檢測靶核酸序列的方法，包括以下步驟：(a)使靶核酸序列與引導(dǎo)rna序列接觸，所述引導(dǎo)rna序列具有與靶核酸序列和cas9蛋白互補(bǔ)的部分，其中引導(dǎo)rna和cas9蛋白共定位至靶核酸序列以形成復(fù)合物，并且其中引導(dǎo)rna包含3’尾序列并且所述尾與探針序列互補(bǔ)或可作為引物，和(b)檢測復(fù)合物從而檢測靶核酸序列。根據(jù)某些方面，尾包含與靠近grna結(jié)合位置的序列互補(bǔ)的序列。根據(jù)某些方面，尾包含與雙鏈體的置換鏈互補(bǔ)的序列。根據(jù)某些方面，雙鏈體的靶鏈之一被引導(dǎo)rna隔離，留下其他鏈開口與其他試劑結(jié)合。示例性的試劑可包含單鏈結(jié)合蛋白、可標(biāo)記的互補(bǔ)寡核苷酸、或與該鏈互補(bǔ)的尾的部分。根據(jù)一個方面，尾包含用于dnapaint的?？奎c(dockingsite)或柄(handle)。在一些實施方式中，具有另一條鏈的cas9/引導(dǎo)rna復(fù)合物穩(wěn)定化。在一些實施方式中，結(jié)合單鏈結(jié)合蛋白，如rpa或結(jié)合寡核苷酸或其類似物/模擬物至置換鏈，可使具有另一條鏈的cas9/引導(dǎo)rna復(fù)合物穩(wěn)定。在一些實施方式中，穩(wěn)定化效果是由于存在減少的與天然雙鏈體的再扣緊(re-zipping)的競爭。

具有改變的pam特異性的cas9

在一些實施方式中，本發(fā)明包括標(biāo)記或靶向核酸中位點的方法，包括以下步驟：(a)使核酸與標(biāo)記的復(fù)合物在復(fù)合物結(jié)合至核酸的條件下接觸，所述復(fù)合物包含經(jīng)改變以結(jié)合至非規(guī)范pam序列附近的cas9蛋白和引導(dǎo)rna，和(b)分析步驟(a)的產(chǎn)物。根據(jù)一個方面，在步驟(a)和步驟(b)之間任選地存在至少一個洗滌步驟，并且任選地提供輔助試劑以促進(jìn)grna的結(jié)合。

通常對于本文所述的實施方式，引導(dǎo)rna和rna可包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的修飾的rna核苷酸。通常對于本文所述的實施方式，引導(dǎo)rna和rna可包括rna/dna嵌合體或rna/pna嵌合體。在一些實施方式中，在無細(xì)胞系統(tǒng)中制備引導(dǎo)rna或rna。制備grna或rna的方法包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的體外轉(zhuǎn)錄和自動化化學(xué)rna合成方法。在一些實施方式中，grna或cas蛋白或輔助蛋白在細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)并且在無細(xì)胞系統(tǒng)中純化。在一些實施方式中，grna或rna在無細(xì)胞系統(tǒng)中與cas蛋白或輔助蛋白復(fù)合。

以下實施例是本發(fā)明的代表。這些實施例并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制，因為這些和其他等價實施方式將對于本發(fā)明、附圖和所附權(quán)利要求而言是顯而易見的。

實施例1

方案

grna的合成方案：

如下進(jìn)行pcr組裝。

制備包含以下的反應(yīng)混合物：

●12μl的q5dna聚合酶2x主混合物(neb)

●3μl的10μmt7正向引物

●3μl的10μm條碼反向引物

●3μl的10μmsp.grna.spli60(正向)

●3μl的10μmgrna.end(反向)

pcr裝置中的循環(huán)條件：

1.98℃持續(xù)30秒

2.98℃持續(xù)10秒

3.52℃持續(xù)20秒

4.72℃持續(xù)15秒

5.重復(fù)步驟2保持29個循環(huán)

6.72℃持續(xù)2分鐘

7.保持4℃

在離心柱(zymo)上純化dna。通常產(chǎn)生約1μg的dsdna模板。

如下進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄(ivt)：

制備包含以下的反應(yīng)混合物：

●5.8μl無rna酶的水

●2.5μlampliscribet7-flash10x反應(yīng)緩沖液(億明達(dá))

●1.8μl100mmatp

●1.8μl100mmctp(+2ulcy3-dutp)

●1.8μl100mmgtp

●1.8μl100mmutp

●2μl100mmdtt

●0.5ulriboguardrna酶抑制物

●5μldna模板

●2.0μlampliscribet7-flash酶溶液

也可用修飾的ntp合成引導(dǎo)rna，其中進(jìn)行以下修飾：

●添加1∶1摩爾比的待修飾的ntp和經(jīng)修飾的-ntp(例如，0.9μlutp和0.9μlutp-cy3)。

在pcr裝置中在37℃下孵育2-16小時，然后保持4℃。在離心柱(zymo)上純化rna。通常產(chǎn)生約100μg的rna(即，條碼化grna)。

cas9-grna復(fù)合物組裝方案：

作為參考，1μg在尾上帶單個條碼的grna是25pmol的rna。cas9蛋白和grna一般以1∶1摩爾比混合，以形成cas9-grna復(fù)合物?？墒褂孟嗤磻?yīng)條件來復(fù)合野生型cas9、切口酶cas9和核酸酶無效或死cas9。當(dāng)使用野生型cas9并且目標(biāo)是為了防止切割時，可省去mgcl。用于表達(dá)的質(zhì)粒、野生型cas9、核酸酶無效cas9和cas9切口酶購自艾德基因公司(addgene)。質(zhì)?？稍诤线m宿主中表達(dá)并且可通過本領(lǐng)域已知的方法純化蛋白，如在表達(dá)蛋白中使用his標(biāo)簽?？墒褂幂^高的cas9與grna的比率(例如，3∶1)來確保更多的grna與cas9復(fù)合。一般通過在37℃下預(yù)孵育15分鐘來形成活性復(fù)合物。反應(yīng)緩沖液可變化。示例性的緩沖液包括20mmhepes，100mmnacl，5mmmgcl2，0.1mmedta，ph6.5；20mmtris-hcl，100mmkcl，5mmmgcl2，5％甘油，1mmdtt，ph7.5；和1xpbs，5mmmgcl2，0.5％吐溫-20，ph7.0?；钚詮?fù)合物可立即使用或在4℃下儲存數(shù)周。

cas9-grna熒光原位試驗：

根據(jù)該試驗，樣品已經(jīng)固定至顯微鏡載玻片(或蓋玻片)。玻片可在科普林氏缸(coplinjar)內(nèi)孵育，或在流動腔室或流動池中組裝以進(jìn)一步最小化反應(yīng)提及并使過程自動化。反應(yīng)以以下順序進(jìn)行并且玻片在科普林氏缸內(nèi)孵育，除非另外說明(對于流動腔室，括號中提供信息)。用含0.5％吐溫-20的1xpbs孵育2分鐘(用2倍流動腔室體積洗滌，孵育30秒，在各洗滌之間)。用含0.5％曲通-100的1xpbs孵育5分鐘(用2倍流動腔室體積洗滌，孵育2分鐘，在各洗滌之間)。用0.1nhcl孵育5分鐘(用2倍流動腔室體積洗滌，孵育2分鐘，在各洗滌之間)。用含0.5％吐溫-20的1xpbs孵育2分鐘(用2倍流動腔室體積洗滌，孵育30秒，在各洗滌之間)。在cas9緩沖液中孵育5分鐘(用2倍流動腔室體積洗滌，孵育30秒，在各洗滌之間)。這段時間可用于cas9-grna在37℃下在cas9緩沖液中預(yù)復(fù)合，或使冷凍的復(fù)合物升溫至37℃。一般而言，5μm的grna和5μm的cas9在25ul體積/樣品中復(fù)合在一起。在cas9緩沖液中添加25ulcas9-grna，并且在37℃下的濕度箱中孵育4小時?；蛘?，用可移去的橡皮泥密封并在37℃下孵育。通過2次在37℃下在cas9緩沖液中孵育5分鐘(用4倍流動腔室體積洗滌，孵育30秒，在各洗滌之間)進(jìn)行洗滌。用含0.5％吐溫-20的1xpbs孵育2分鐘(用2倍流動腔室體積洗滌，孵育30秒，在各洗滌之間)。可選的：如果需要，通過向各樣品中添加含0.5％吐溫-20的20μl2xscc中的1μm寡聚探針，并在濕度箱中孵育15分鐘來進(jìn)行探測。或者，在孵育之前用可移去的橡皮泥密封。通過2次含0.5％吐溫-20的1xpbs中孵育2分鐘(用4倍流動腔室體積洗滌，孵育30秒，在各洗滌之間)進(jìn)行洗滌。裝載10ul含dapi的抗褪色顯微介質(zhì)并且用指甲油(例如，antifade或vectashield)密封。玻片準(zhǔn)備用于成像或可在黑暗中儲存1周。在一些情況中，可省去hcl步驟。

流動池

可通過使用雙面膠帶或片(粘合劑研究公司(adhesiveresearch)或3m)以制成屏障來制成流動池，其夾在含有感興趣樣品的蓋玻片或載玻片與第二蓋玻片或載玻片之間?？墒褂觅徸詉bidi的用于制造流動池的系統(tǒng)(粘性-載玻片vi^0.4或粘性-載玻片iluer)。在此，上面設(shè)置細(xì)胞、染色體或dna的載玻片或蓋玻片接合至流動池的粘性部分以在基材頂上產(chǎn)生流動池。試劑通過手動抽吸至入口區(qū)域并芯吸(例如，使用吸水紙)到出口區(qū)域流入流動池?；蛘撸噭┩ㄟ^自動試劑流動和交換系統(tǒng)以驅(qū)動流體和多向閥流入。這可通過使用注射泵，壓力驅(qū)動流和抽氣來完成。該自動系統(tǒng)與顯微鏡或成像設(shè)備整合，其中加載流動池。

dna的分子梳理

男性基因組dna(普洛麥格公司(promega)或諾瓦基公司(novagen))或使用膠柱方法從細(xì)胞中提取的dna被梳理(comb)到包被乙烯基硅烷(7-辛烯基三氯硅烷)的蓋玻片上。這通過將蓋玻片(例如，22x22mm)浸入含有覆蓋大部分(例如，對于22x22蓋玻片是1-1.5ml)蓋玻片的0.5mmes緩沖溶液中dna的槽中來實現(xiàn)，使dna末端結(jié)合至表面涂層(一般為1分鐘至10分鐘)，然后從槽中撤回蓋玻片?？烧{(diào)整槽中dna的濃度以得到所需密度的梳理的dna。例如，高至0.5ng/ul的濃度可得到合理的密度，其中可分辨單個拉伸的dna分子。然后以恒定速度(例如，300μm/s)從dna溶液中撤回蓋玻片，使dna由于撤回蓋玻片時彎液面的力而被拉伸。任選地，dna然后使用約10-20焦/cm²的紫外輻射能交聯(lián)到蓋玻片上。任選地，如上所述在蓋玻片上形成流動池。可通過在梳理過程期間或之后用一種或多種插入染料，如yoyo-1染色來使經(jīng)梳理的dna可視化。通常使用5∶1至10∶1的dna堿基對與yoyo-1染色比率。

cas9/grna結(jié)合至在蓋玻片上預(yù)拉伸的dna

夾有經(jīng)梳理的基因組dna以制成流動池的蓋玻片首先通過用pbs吐溫和pbs洗滌來水合。任選地，用blockaid(生命技術(shù)公司)來封閉基材。任選地，用cas9反應(yīng)緩沖液來洗滌流動池。cas9-grna在37℃下預(yù)復(fù)合并且然后添加至流動池并靜置孵育30分鐘至1小時。通過用緩沖液如反應(yīng)緩沖液和pbs吐溫20和pbs洗滌來終止反應(yīng)。

圖6a和6b使用的引導(dǎo)rna是

著絲粒16grna，具有尾：

gacgccuucguuggaaacguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuuutcctctaccacctacatcacttatacatcta(seqidno：8)

熒光標(biāo)記的探針與尾雜交

確定流動池保持水合并且在cas9/grna復(fù)合物已經(jīng)形成之后，通過在以下雜交緩沖液中向尾添加dna探針來對復(fù)合物進(jìn)行成像：200ul甲酰胺，20ulsds，120ulblockaid，40ulof20xssc，和20ul水。

用于探測尾的序列是

tagatgtataagtgatgtaggtggtagagga(seqidno：9)

這可在4℃下靜置過夜。根據(jù)針對探針-尾雜交體的熱穩(wěn)定性，也可使用其他雜交溫度和雜交緩沖液組合物。

可在一個或兩個末端處用熒光標(biāo)記物如atto647n、atto655、alexa647進(jìn)行標(biāo)記。當(dāng)使用合適的熒光標(biāo)記物(例如，atto655)時，可通過storm方法進(jìn)行超高分辨率成像。

探針-尾雜交和成像

向成像溶液中添加雜交緩沖液中的dnapaint成像探針以得到超高分辨率所需的隨機(jī)打開和關(guān)閉圖案。與尾上的序列互補(bǔ)或與結(jié)合尾的探針上的序列互補(bǔ)并且在圖6a和圖6b和相似實驗中使用的paint序列是

/5alex647n/tagatgtataaaaaaatttaataaggt/3alexf647n(seqidno：10)

或

/5atto647nn/tagatgtataaaaaaa/3atto647nn/(seqidno：11)

成像使用nikonti-e倒置顯微鏡上的633、640或647nm激光光線和適于cy3的過濾塊在全內(nèi)反射(tirf)模式下完成并且在減薄背照式andorixonx3emccd相機(jī)上捕獲。

超高分辨率成像

可通過使用以下成像器鏈進(jìn)行dnapaint過程來進(jìn)行如圖6b所示的超高分辨率成像：p9成像器：accttatta。這結(jié)合至含有p9柄(?？啃蛄?的尾或已經(jīng)結(jié)合至于含有p9柄的尾的探針：taataaggt。用于對dnapaint進(jìn)行成像的合適緩沖劑是5mmtrisph8，10mmmgcl2，1mmedtaph8和0.05％吐溫-20?？墒褂胣ikonniselements軟件持續(xù)15分鐘至30分鐘拍攝影像，并且使用以labview編寫的dnapaint圖像分析代碼來構(gòu)建超高分辨率圖像(參見jungmann等，nanolett.，2010，10(11)，第4756-4761頁)。

在溶液中結(jié)合cas9/grna至基因組dna

在緩沖溶液存在下向dna添加cas9-grna復(fù)合物組裝(在37℃下預(yù)孵育10分鐘)并在37℃下孵育1小時。任選地純化結(jié)合cas9/grna的dna。然后，如果需要dna拉伸，反應(yīng)在0.5mmes溶液中稀釋并且其上裝飾grna/cas9復(fù)合物的dna被梳理到乙烯基硅烷蓋玻片表面上。這種方法用于圖6c。

復(fù)合的dna的純化

根據(jù)使用的引導(dǎo)rna的尺寸，可使用多種不同的純化方法來分離靶dna/grna/cas9復(fù)合物，包括尺寸排阻、親和純化(例如，使用結(jié)合鏈霉親和素珠的可切割接頭或脫硫生物素)、或透析膜。

cas9切口和靶向測序

cas9-grna在靶dna上的特定位置處結(jié)合dsdna模板。靶dna可以在天然基因組中，并且反應(yīng)在體內(nèi)進(jìn)行。靶dna可在細(xì)胞中或生物體固定至表面并且原位進(jìn)行反應(yīng)。在這些情況中，優(yōu)選保持基因組的空間位置。此外，可提取靶dna并且離體進(jìn)行反應(yīng)。提取的靶dna也可固定在表面上或流體系統(tǒng)(例如，納米通道)中并且離體進(jìn)行反應(yīng)。

使用突變體切口酶(例如，攜帶d10a或h840a突變體的cas9)來進(jìn)行g(shù)rna/cas9介導(dǎo)的切口反應(yīng)。參見圖9。cas9的ruvc結(jié)構(gòu)域可被d10a突變滅活并且hnh結(jié)構(gòu)域可被h840a突變滅活。

可使用2種切口機(jī)制之一，一個在與grna堿基配對的頂部鏈上，另一個在底部鏈，即置換鏈上。d10a位置的突變能夠切口頂部鏈而不是底部鏈。h840a位置的突變能夠切口底部鏈而不是頂部鏈。通過cas9(d10a)切口酶的切割出現(xiàn)在原型間隔子鄰近基序(pam)上游3bp處。cas9(h840a)切割出現(xiàn)在底部鏈上的互補(bǔ)位置處。與識別在基因組中出現(xiàn)許多次的特定短序列的切口內(nèi)切核酸酶相比，grna在基因組中可能只出現(xiàn)一次的較長識別序列處切口。這可用于靶向基因組中的特定獨特序列。可通過以下步驟來進(jìn)行靶向的測序：選擇d10a切口酶或h840a切口酶；選擇待測序的區(qū)域附近的引導(dǎo)rna；用選擇的grna和cas9突變體進(jìn)行g(shù)rna/cas9反應(yīng)以形成復(fù)合物；任選地從靶dna中去除cas9/grna復(fù)合物；添加合適的緩沖液中的聚合酶和熒光標(biāo)記的可逆終止子核苷酸以進(jìn)行納入、洗滌和切割的測序循環(huán)。這使得能夠?qū)Π邢虻奈恢眠M(jìn)行測序。

在一些實施方式中，可從靶dna和樣品中完全去除cas9-grna復(fù)合物。去除試劑可以是去污劑(例如，十二烷基硫酸鈉)、有機(jī)化合物(例如，尿素、鹽酸胍/異硫氰酸胍)、酰胺(例如，甲酰胺)、蛋白水解酶(例如，蛋白酶)、物理性質(zhì)(例如，溫度)或其組合。

如果使用cas9(d10a)，測序通過pam基因座并行進(jìn)至該基因座的下游，對含pam的鏈進(jìn)行測序。如果使用cas9(h840a)，測序在pam基因座的上游方向上進(jìn)行，并且對與nggpam序列互補(bǔ)的鏈進(jìn)行測序。為了避免測序通過引導(dǎo)rna序列，可選擇d10a突變體?？稍诟信d趣區(qū)域上選擇多種引導(dǎo)物。

如果進(jìn)行通過合成的逐步測序，各納入的核苷酸含有可逆終止子，在去除終止子和標(biāo)記物并且在各靶向的位置處重復(fù)下一個堿基的循環(huán)之前檢測到在各靶向的位置處納入單核苷酸的結(jié)果(優(yōu)選通過使用tirf照射和ccd或cmos檢測器)。

各種億明達(dá)sbs試劑盒(例如，sbs試劑盒2)可用于測序，按以下順序進(jìn)行試劑添加和成像：通用測序緩沖液；納入主混合物；通用測序緩沖液；成像靶向的基因座；通用掃描混合物；切割試劑主混合物；切割洗滌混合物。億明達(dá)試劑盒的詳細(xì)內(nèi)容可從萬維網(wǎng)support.illumina.com/downloads/hiseq-rapid-sbs-kit-v2-reagent-prep-guide-15058772.html上下載到。通過使用針對核苷酸上的四種染料中的兩種的532nm激光和針對染料中另外兩種的660nm激光來進(jìn)行成像。由各激光激發(fā)的兩種染料各自通過使用特定發(fā)射濾器和設(shè)計成確定各染料的標(biāo)識的算法來區(qū)分。

可使用的多種不同億明達(dá)測序設(shè)備之一包括genomeanalyzeriix?？墒褂门c億明達(dá)流動池固定器以及入口和出口端口相容的流動池跡線(footprint)?；蛘?，包含倒置顯微鏡，具有高數(shù)值孔徑物鏡，激光，ccd相機(jī)，熒光團(tuán)選擇性濾器和基于注射泵或壓力驅(qū)動的試劑交換系統(tǒng)和加熱平臺的自制系統(tǒng)。自制系統(tǒng)可適用于除億明達(dá)提供的以外的其他核苷酸/染料組合。

如果以實時反應(yīng)(例如，pacbio或starlight測序)進(jìn)行測序，在末端磷酸酯處標(biāo)記核苷酸，末端磷酸酯一旦摻入了核苷酸就是天然離去基團(tuán)。在ccd或cmos相機(jī)上連續(xù)監(jiān)測該反應(yīng)。

對拉伸的dna雙鏈體的靶向測序

可從細(xì)胞中提取基因組dna并且保持長的長度(例如，通過在膠柱中進(jìn)行提取)，以保留序列的線性位置。這在確定基因組中序列的組織上有重要應(yīng)用。基因組組織中的結(jié)構(gòu)變異(sv)可能引起疾病，如本文所述的alk、brca、fshm和her2示例所證明。然而，某些sv，如白血病中的bcr-abl易位可被藥物如gleevac靶向，因此確定白血病患者是否具有可由這種藥物靶向的易位是重要的。

優(yōu)選地，使用例如分子梳理來在拉伸的dna上進(jìn)行測序，使得能夠觀察到靶向的序列的基因組中的線性組織?？赏ㄟ^使用切口突變體cas9和設(shè)計在感興趣位置處結(jié)合的grna，進(jìn)行切口反應(yīng)，并且然后從該切口處延伸來選擇靶向的區(qū)域?？稍谑崂韉na之前在溶液中進(jìn)行切口反應(yīng)?；蛘撸稍谝呀?jīng)梳理dna之后使用梳理的dna頂部的流動池來進(jìn)行切口反應(yīng)。測序反應(yīng)通過用納入緩沖液水合并預(yù)調(diào)節(jié)dna來初步進(jìn)行，然后通過使測序試劑流入流動池。結(jié)果是不僅獲得了靶標(biāo)區(qū)域的序列，也獲得其在基因組中的位置。這何時重要的示例是：當(dāng)基于grna的靶向的測序涉及基因組中作為易位熱點的序列，但不知道其易位至基因組中的何處和其與什么序列融合時。

原位靶向測序

本文所述的方法涉及確定細(xì)胞或核內(nèi)基因組的部分的空間位置和這種空間位置如何影響基因調(diào)控和基因組功能?？墒褂脤@些序列有特異性的grna來靶向特定基因組序列在細(xì)胞中的空間位置。在固定的細(xì)胞中的基于泥足dna上產(chǎn)生grna/cas9介導(dǎo)的切口并且在基因組dna上進(jìn)行原位熒光基測序。如lee等，2015：(natprotoc.2015，10(3)：442-58)所述，細(xì)胞在玻璃底平皿上生長或者通過本領(lǐng)域已知的方法來裝載組織切片。固定細(xì)胞(例如，使用pbs中10％甲醛在25℃下持續(xù)15分鐘，或100％甲醇在-20℃下持續(xù)20分鐘)。在含曲通x-100的pbs和僅pbs中進(jìn)行洗滌。任選地添加尿素以從切口的dna中去除grna/cas9。任選地，通過使用rna酶來去除rna。

可直接在細(xì)胞內(nèi)對單分子的基因組dna進(jìn)行測序。使用聚合酶在切口位點處納入核苷酸。優(yōu)選地，核苷酸含有帶熒光團(tuán)的熒光標(biāo)記物，其提供高量子產(chǎn)率，如cy3b或多重標(biāo)記的核苷酸?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的各種嚴(yán)謹(jǐn)性的洗滌來減少來自未納入的核苷酸的信號。通過單分子成像方法來進(jìn)行成像，但是，因為僅部分細(xì)胞接觸表面，tirf成像可能僅獲得納入信號的一小部分?？墒褂霉簿劢癸@微術(shù)或光-層照顯微術(shù)來獲得在細(xì)胞和組織內(nèi)的3d空間上分布的信號。使用多光子或雙光子激光顯微術(shù)來獲得信號，尤其是當(dāng)其深埋時。這類方法也有效降低背景信號。

在pbs洗滌之后，用于測序反應(yīng)的緩沖液用于在添加測序反應(yīng)混合物之前調(diào)整樣品。根據(jù)使用的引物、成像設(shè)置以及是否有溫度控制，應(yīng)用solid化學(xué)、cyclic化學(xué)、sbl化學(xué)或通過合成化學(xué)的測序如億明達(dá)測序或lasergen測序來納入核苷酸以及切割標(biāo)記物和終止子。在各納入步驟之后拍攝圖像。處理圖像以產(chǎn)生間斷信號。記錄來自各連續(xù)循環(huán)的圖像。在各圖像上進(jìn)行堿基判定并且堆疊堿基判定以在各灶點處提供序列讀數(shù)?？赏ㄟ^在讀數(shù)積累過程中僅包含序列來濾去非特異性信號，這在許多已記錄的圖像上一致。使用bowtie1.0或其他比對算法來將讀數(shù)以參考比對，并且進(jìn)一步濾去不感興趣的噪音或脫靶序列。觀察測序讀數(shù)的不同灶點以提供細(xì)胞內(nèi)靶向序列的空間定位的信息。測序，而不是僅標(biāo)記靶向的位置，具有顯示感興趣區(qū)域內(nèi)序列變體及其空間位置的潛力。

grna/cas9復(fù)合沿核酸聚合物的納米孔分析

制造sin膜，并且用透射電子顯微鏡(tem)來鉆出20nm直徑納米孔(janssen，x.j.a.；jonsson，m.p.；plesa，c.；soni，g.v.；dekkerc.；dekker，n.h.nanotechnology2012，23(47)，475302)。然后用聚二甲基硅氧烷(pdms)涂布膜來降低電容并改善信噪比。膜裝載在流動池中，含有由膜隔開的頂部和底部儲器，之后用1mkcl，10mmtris，1mmedta，ph8填充2個儲器。向頂部儲器添加核酸聚合物并且在頂部(-ve)和底部(+ve)儲器之間施加電壓，使得能夠電泳驅(qū)動核酸聚合物以基本線性的方式通過孔。用包括axopatch200b放大器和digidata1322adaq數(shù)字轉(zhuǎn)換器的離子通道記錄系統(tǒng)來記錄電流。使用transalyzermatlab包來分析記錄(參見plesa，c.；dekker，c.nanotechnology2015，26(8)，084003)。針對核酸聚合物進(jìn)入納米孔時增加的電流堵塞，和然后grna/cas9結(jié)合的區(qū)域通過孔的狹窄結(jié)構(gòu)時阻斷中的進(jìn)一步間斷升高來分析數(shù)據(jù)。

實施例2

產(chǎn)生cas9-grna復(fù)合物用于her2/erbb2診斷

her2(也由國際人類基因組組織命名委員會稱為erbb2)基因序列可獲自不同的在線儲存庫，如ncbi萬維網(wǎng)ncbi.nlm.nih.gov/gene/2064。

分析her2序列以沿著dsdna發(fā)現(xiàn)pam基序。優(yōu)選的基序是5’-ggnnnnnnnnnnnnnnnnnngg-3’(seqidno：12)。5’gg通過t7rna聚合酶提供了最優(yōu)rna合成。3’ngg是由cas9識別的pam序列。中間的17個堿基n用于靶向的序列并且提供高特異性。優(yōu)選外顯子組，因為該方法可區(qū)分基因變體(即，同種型)。

可在因特網(wǎng)上自由獲得多個程序以尋找靶序列。圖10顯示了使用chopchop時提供的輸出的圖(參見tessag.montague；josem.cruz；jamesa.gagnon；georgem.church；eivindvalen.(2014).chopchop：用于基因組編輯的crispr/cas9和talen網(wǎng)頁工具(chopchop：acrispr/cas9andtalenwebtoolforgenomeediting).nucleicacidsres.42.w401-w407)。

表1中顯示了her2的靶序列的部分列表。該表也包含關(guān)于人類基因組上靶標(biāo)的位置、外顯子編號、dna鏈(即，正義(+)對比反義(-))、和基因組中其他地方的二級靶標(biāo)的潛在數(shù)量(即，錯配，mm)的信息。

表1.

應(yīng)注意到可易于靶向基因以外的區(qū)域。靶向特定區(qū)域，如外顯子和內(nèi)含子，其可小于1kb至30kb，數(shù)十或數(shù)百個千堿基，或幾個兆堿基的完整基因。

序列靶標(biāo)用作模板以制備grna。這包括添加針對grna支架的各靶序列。下文提供了組裝模型的圖，并且該組裝使用采用高保真dna聚合酶(提供熔融溫度(tm))的pcr進(jìn)行。簡言之，從市售供應(yīng)商獲得或定制合成寡核苷酸。存在2個通用寡核苷酸：fwd-t7-grna，也包括t7rna聚合酶識別基序的部分的正向pcr引物；和grna.split60，通用grna支架。另外，存在2個可變寡核苷酸：sp.grna.split60，針對感興趣靶標(biāo)有特異性的序列；和rev-b1-grna.18，也包括用于多重鏈監(jiān)測的條碼化的柄的反向pcr引物。

這種設(shè)計使得能夠低成本合成并組裝grna，同時通過亞磷酰胺化學(xué)合成寡核苷酸的最優(yōu)序列準(zhǔn)確性，并且提供各種類型的條碼柄，其是標(biāo)記的實體可?？康木幋a?？梢圆煌?guī)模合成dna模板，包括在寡核苷酸合成以上，或市售獲得?？赏ㄟ^pcr擴(kuò)增和再擴(kuò)增模板，并且保持模板，其比從頭合成成本更低。

圖11所示的示例性pcr組裝可耗時不到1小時。在pcr之后，通過向模板dna添加t7rna聚合酶混合物由體外轉(zhuǎn)錄(ivt)來合成grna。在這種情況中，較長的反應(yīng)將提供較多的grna?？稍诎雮€小時內(nèi)制備用于有限數(shù)量用途的快速產(chǎn)生的cas9-grna試劑盒?？捎眠M(jìn)行16小時的反應(yīng)產(chǎn)生大量。在ivt之后，通過dna酶i降解dna模板并且通過使用市售柱純化試劑盒或通過在乙酸銨存在下的乙醇沉淀來純化rna。

然后，在鎂離子存在下，條碼化的grna與cas9蛋白以1∶1的比例復(fù)合以形成cas9-grna復(fù)合物。然后可使用試劑。也可在這一階段添加檢測探針，其是結(jié)合至條碼以促進(jìn)條碼解碼的標(biāo)記的寡核苷酸，這使得能夠在下游進(jìn)行更快的雜交檢測方法?；陬A(yù)期的信噪比來作出決定。例如，如果預(yù)期低噪音(例如，在顯微鏡載玻片表面上鋪展的染色體上監(jiān)測her2)，則可向樣品中簡單添加cas9-grna-標(biāo)記物試劑盒，使得在37℃下進(jìn)行反應(yīng)。洗滌未反應(yīng)的復(fù)合物并且可對樣品進(jìn)行成像。試劑盒是探測基因座所需的所有cas9-grna復(fù)合物的集合。cas9-grna-標(biāo)記物試劑盒是所有預(yù)標(biāo)記的cas9-grna的集合。

編碼cas9-grna用于多重檢測的示例。

可向grna添加一個或多個編碼或條碼柄(探針的停靠點)。原理是確定與dna樣品結(jié)合的cas9-grna復(fù)合物的種類。這通過雜交可檢測的對grna柄有特異性的“解碼器”探針來進(jìn)行。grna柄可含有一個或多個條碼，其可以各種方式排列，如連續(xù)堆疊或互相部分重疊。后者能夠降低多重條碼的總體長度，其增加了針對給定的grna柄長度的多重化容量。

多重化容量與條碼的數(shù)量成比例并且等于條碼組合的數(shù)量，如ncr＝r(n+r-1)！/r！(n-1)！，其中n是條碼的數(shù)量，r是讀取條碼時的事件數(shù)量。通過例如2個條碼b1和b2，對于總共3個編碼(b1b1，b1b2，b2b2)而言，獲得c＝1并且p＝2。用3個條碼，獲得10個編碼。可用少至5個條碼生成126個編碼，而10個條碼提供總共92378個編碼，足夠測量外顯子組。

本文提供的編碼方法針對以下。每個基因座可分配一個代碼，其使得能夠在單一試驗中鑒定多個靶標(biāo)。對于給定的基因座，每個同種型可分配一個編碼，其使得能夠鑒定變異。對于給定的基因座可分配2個編碼，其提供給定靶標(biāo)的信號種類的共定位，使得靶標(biāo)種類的置信度增加。這在具有高背景的樣品的情況中有利，在這種情況中，試驗僅在相同基因座上檢測到2種信號時是陽性的。對于給定的基因座，可分配超過2個編碼，其也允許共定位，但提供改善鑒定并改善分辨率的特征。例如，可由2組cas9-grna來識別2個基因座，第一個用條碼b1b2和b1b3編碼，第二個用條碼b1b3和b1b4編碼。共有的b1將提供在基因座上可易于檢測到的信號?？筛禺愋缘鼐劢褂谛盘栁恢貌⑶铱蓹z測基因座1的剩余條碼b2b3，和基因座2的b3b4。

表2提供了5個條碼的列表，其從在人類基因座中出現(xiàn)不超過一次的12個核苷酸長的序列的列表生成：

表2.

12個堿基的條碼尺寸足夠允許在一定長度和解鏈溫度范圍上設(shè)計一定范圍的探針。例如，10-12聚體允許在某些離子濃度(例如，5mmmgcl2)下更穩(wěn)定的相互作用，而仍然可使用變性劑(例如，50％甲酰胺)去除。8-9聚體探針允許使用dna-paint技術(shù)來進(jìn)行超高分辨率成像，該技術(shù)描述于jungmannr，ms，woehrsteinjb，daim，shihwm，yinp.使用dna-paint和exchange-paint的多重化3d細(xì)胞超高分辨率成像(multiplexed3dcellularsuper-resolutionimagingwithdna-paintandexchange-paint).natmethods.2014年3月；11(3)：313-8。

條碼特異性探針可以是許多類型并且可適應(yīng)試驗。例如，探針可以是與序列互補(bǔ)的寡核苷酸。又例如，探針可由環(huán)形ssdna模板組成，如鎖式探針，探針的一個區(qū)域與條碼雜交并且一個或多個區(qū)域用于第二組探針的輔助雜交。然后可使用滾環(huán)擴(kuò)增來擴(kuò)增環(huán)形探針，其增加了信號強(qiáng)度。又例如，雜交探針是線性的并且含有二級探針的位點，二級探針也含有二級或三級探針的位點，以此類推，使得高支化探針能自組裝，其將增加信號強(qiáng)度。雖然大部分本文所述的探針是熒光標(biāo)記的，在另一個示例中，這些探針接合至允許發(fā)色檢測的分子，例如，給出僅納米顆粒的高密度，檢測可能是比色的并且在定位至核的特定區(qū)域時仍然可見。

圖7中提供了區(qū)位rgb編碼的示例，按照表3中所示列出的顏色方案條碼化引導(dǎo)rna尾，表3中列出了grna至熒光條碼brca1重排。r是紅色，g是綠色，b是藍(lán)色。以形成預(yù)期的連續(xù)顏色圖案的方式隔離條碼。根據(jù)該方案，各條碼與顏色相關(guān)，標(biāo)識需要生成的3個條碼序列，其然后按照顏色編碼組合。例如，如果grna編碼是r，則僅需要向grna尾添加條碼r，而如果grna編碼是rgb，則需要在grna尾處合并所有3個條碼。通過添加其相應(yīng)熒光探針來檢測條碼，其顯示實際連續(xù)顏色圖案。任何未預(yù)期的圖案將被鑒定為基因組重排。

表3.

另一個示例使用折紙編碼(origamicodes)(參見natchem.2012年10月；4(10)：832-9)；參見圖8。核酸折紙方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。按照表3中所列的折紙多色方案來條碼化grna尾。以形成預(yù)期的連續(xù)grna圖案的方式隔離條碼。根據(jù)該方案，折紙是grna尾探針。各折紙多色探針具有針對grna的特異性接合，意味著對于741個折紙?zhí)结?，我們?41個獨特的grna尾序列。折紙多色探針具有3個熒光標(biāo)記物的接合位置，其可通過高分辨率或超高分辨率成像，即點1，點2，點3來物理分辨。各點具有與之相關(guān)的多個顏色編碼。這些編碼的組合提供對折紙多色探針的種類。

通過添加其相應(yīng)的熒光標(biāo)記的折紙多色探針來檢測grna條碼。顯示了實際連續(xù)grna圖案。任何未預(yù)期的圖案將被鑒定為基因組重排。與分辨基因組區(qū)域的區(qū)位rgb編碼示例相比，折紙編碼可在單個grna水平上分辨，提供對基因組區(qū)域或基因座上排列的高得多且詳細(xì)的鑒定。

her2試驗

所有侵入性乳腺癌都推薦使用原位雜交技術(shù)確定her2狀態(tài)。對目前批準(zhǔn)的臨床診斷的現(xiàn)有綜述突出了不同臨床試驗的現(xiàn)有挑戰(zhàn)(參考文獻(xiàn)：franchetc，filleront，cayrea，mouniée，penault-llorcaf，jacquemierj，macgrogang，arnouldl，lacroix-trikim.瞬時-質(zhì)量熒光原位雜交作為乳腺癌中her2測試的新工具：比較研究(instant-qualityfluorescencein-situhybridizationasanewtoolforher2testinginbreastcancer：acomparativestudy).histopathology.2014年1月；64(2)：274-83)。

采用現(xiàn)有的試驗報道了多種挑戰(zhàn)。其一，傳統(tǒng)fish是漫長的過程，其一般需要一天來制備用于雜交的樣品(脫石蠟、預(yù)處理、胃蛋白酶消化、變性)，在12-24小時期間進(jìn)行漫長的雜交，并且第二天充分洗滌雜交并進(jìn)行觀察。

根據(jù)本文所述的示例性方面，方法不需要對樣品的任何預(yù)處理、胃蛋白酶消化、或變性。cas9-grna復(fù)合物易于特異性雜交至固定樣品中的天然雙鏈dna。同樣也易于洗去非雜交的復(fù)合物。因此，可在一天以內(nèi)進(jìn)行整個過程。這種時間線與通常進(jìn)行fish試驗的her2免疫組化試驗一致。此外，編碼方法將允許ihc和cas9-grnafish同時進(jìn)行。

試驗之間的差異和精確性也被報道為一個問題?？紤]到乳腺癌治療的高成本，通常長達(dá)數(shù)年，錯誤的治療造成明顯的社會和經(jīng)濟(jì)影響。根據(jù)本文所述的某些方面，以提供冗余性和共定位的方式編碼cas9-grna?？膳c偏差相比區(qū)分陽性樣品。此外，本文所述的方法允許對樣品進(jìn)行再探測，即，可去除探針，同時cas9-grna仍然結(jié)合至靶dna，并且可在更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下進(jìn)行新一輪探測。

現(xiàn)有的fish試驗耗費幾百美元(參考文獻(xiàn)：萬維網(wǎng)ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc2706184/)。這部分是由于探針?biāo)褂玫牟牧?，其在一些情況中是插入大載體的非常長的dna拷貝，具有插入熒光分子(pathvysion)、或昂貴的肽核酸(pna)探針(pharmdx)、或使用抗體和二抗來檢測dna探針(inform)。本文所述的方法將帶來與進(jìn)行fish試驗的常規(guī)her2ich測試(約100美元)一致的成本。cas9是細(xì)菌來源的蛋白質(zhì)并且從廉價細(xì)菌系統(tǒng)中高效表達(dá)并純化。其也是市售可得的。寡核苷酸陣列合成器中合成grna模板是目前合成dna的最廉價方式(0.0004美元/堿基，市價)。在陣列合成之后，可使用pcr來擴(kuò)增寡核苷酸，從而產(chǎn)生可無限廉價再擴(kuò)增的grna模板的集合。體外轉(zhuǎn)錄是非常高效的，每個dna分子產(chǎn)生500-1000個rna分子。

her2試驗將每個細(xì)胞的her2基因座的平均拷貝數(shù)報告成染色體17的比率。染色體17的最常見報告物靶向著絲粒區(qū)域的α隨體重復(fù)。這是已經(jīng)較好表征并且含有超過1000個單體重復(fù)的區(qū)域(參見wayejs，willardhf.來自人染色體17的α隨體dna的結(jié)構(gòu)、組織和序列：通過不相等交換進(jìn)化的證據(jù)和人x染色體共有的祖先五聚體重復(fù)(structure，organization，andsequenceofalphasatellitednafromhumanchromosome17：evidenceforevolutionbyunequalcrossing-overandanancestralpentamerrepeatsharedwiththehumanxchromosome).molcellbiol.1986年9月；6(9)：3156-65)。重復(fù)特別適于本文所述的cas9-grna方法。在這種情況中，僅需要幾個不同的grna。表4標(biāo)識grna靶標(biāo)的列表。該列表中充分表征的d17z1基因座中提取，其他cep17探針基于此。該列表也覆蓋了由以下報道的變體：o′keefecl，warburtonpe，materaag，α隨體dna變體的寡核苷酸探針可通過fish區(qū)分同源染色體(oligonucleotideprobesforalphasatellitednavariantscandistinguishhomologouschromosomesbyfish).hummolgenet.1996年11月；5(11)：1793-9。然而，采用本文所述的方法，可使用僅11種grna來靶向這些重復(fù)中的大部分，因為sac9一般在其5’末端附近有1-2個錯配(表5)。

表4.

表5.

另外，本文所述的方法允許篩選等位基因變體，其是個性化醫(yī)療中的必要信息，并且可能影響治療。例如，her2變體i655v已經(jīng)涉及降低他莫昔芬用作乳腺癌治療的功效，其應(yīng)該被考慮(參見changnw，chendr，chenfn，linc，wuct.her2密碼子655g-等位基因與用他莫昔芬治療的乳腺癌患者中血漿高密度脂蛋白水平降低相關(guān)(her2codon655g-alleleisassociatedwithreductionsinplasmahigh-densitylipoproteinlevelsinbreastcancerpatientstreatedwithtamoxifen).jinvestigmed.2011年12月；59(8)：1252-7.doi：10.231/jim.0b013e3182354923)。2種鑒定的grna靶標(biāo)可用于鑒定變體(靶標(biāo)1：tctgacgtccatcatctctgcgg(seqidno：145)和靶標(biāo)2gccaaccaccgcagagatgatgg(seqidno：146))。使用一組4種帶有等位基因特異性條碼的grna(2個/靶標(biāo))，提供方法來區(qū)分異亮氨酸等位基因(atc)或纈氨酸等位基因(gtc)，作為標(biāo)準(zhǔn)her2試驗的部分。

應(yīng)理解可靶向染色體17的其他區(qū)域。例如，top2a位于her2基因座附近并且已經(jīng)觀察到與her2共擴(kuò)增，其也可影響合適治療的選擇。參見smithk，houlbrooks，greenallm，carmichaelj，harrisal.拓?fù)洚悩?gòu)酶iiα在人原發(fā)乳腺癌和乳腺癌細(xì)胞系中與erbb2共擴(kuò)增：與m-amsa的關(guān)系和米托蒽醌敏感性(topoisomeraseiialphaco-amplificationwitherbb2inhumanprimarybreastcancerandbreastcancercelllines：relationshiptom-amsaandmitoxantronesensitivity).oncogene.1993年4月；8(4)：933-8。

下文描述了用于篩選her2/cen17的fish方案的示例。如果免疫組化和fish試驗都在相同樣品上進(jìn)行，細(xì)胞或組織樣品在4℃下在含10％甲醛的pbs中持續(xù)1小時至16小時來固定在顯微鏡相容的支持物上(例如，干凈的鋁硼硅酸鹽顯微鏡載玻片或顯微鏡蓋玻片)?；蛘撸瑯悠吩?20℃下在100％甲醇中固定20分鐘至1小時(甲醇在保留樣品中dna，同時提取許多蛋白質(zhì)上更高效)。在固定至載玻片之前，石蠟包埋的組織切片應(yīng)該脫石蠟，其一般通過在二甲苯中孵育5分鐘，之后2次乙醇洗滌，和一次用水洗滌來完成。固定的樣品然后用pbst(含0.5％吐溫-20的pbs緩沖液)洗滌一次，然后用含0.5％曲通x-100的pbs孵育5分鐘。樣品然后在pbst中洗滌并且向含5mmmgcl2的pbst中的樣品添加cas9-grna-標(biāo)記物復(fù)合物混合物，并在37℃下孵育2小時至16小時(即，混合物同時含有her2和cen17以及它們相應(yīng)的鑒定標(biāo)簽的組)。孵育之后，通過在37℃下在pbst中洗滌3次來去除未結(jié)合的cas9。樣品用抗衰減固定試劑和dapi(例如，含dapi的prolong或vectashield)固定，并密封。使用油浸63x物鏡對樣品進(jìn)行成像?；蛘?，如果保持避光并且在4℃下時，樣品穩(wěn)定持續(xù)數(shù)周。然后計數(shù)至少20個腫瘤區(qū)域中的核，并且針對它們中的每個記錄her2和cen17共定位灶點的數(shù)量?？砂凑沼?013asco/cap指南所述的現(xiàn)有臨床實踐來計算并報告her2與cen17之比(參見wolffac，hammondme，hicksdg，dowsettm，mcshanelm，allisonkh，allreddc，bartlettjm，bilousm，fitzgibbonsp，hannaw，jenkinsrb，mangupb，paiks，perezea，pressmf，spearspa，vancegh，vialeg，hayesdf；美國臨床腫瘤學(xué)協(xié)會；美國病理學(xué)學(xué)院。乳腺癌中人表皮生長因子受體2測試的推薦：美國臨床腫瘤學(xué)協(xié)會/美國病理學(xué)學(xué)院臨床實踐指南更新(recommendationsforhumanepidermalgrowthfactorreceptor2testinginbreastcancer：americansocietyofclinicaloncology/collegeofamericanpathologistsclinicalpracticeguidelineupdate).jclinoncol.2013年11月1日；31(31)：3997-4013)。

實施例3

圖1涉及對小鼠胚胎成纖維細(xì)胞核的大隨體和小隨體，以及端粒區(qū)域的原位cas9-grna探測。用熒光標(biāo)記的utp合成3種grna以靶向小鼠大隨體重復(fù)(cy5)、小隨體重復(fù)(alexa-488)、和端粒(cy3)。(圖1圖例：大隨體(a)，小隨體(b)，端粒(c)，基因組dna的dapi染色(d)，和覆蓋圖(e))。grna在按照本文所述的方案添加到pfa-固定的樣品之前與cas9復(fù)合。圖案匹配這些靶標(biāo)的預(yù)期探測(參見guenatrim，baillyd，maisonc，almouznig.小鼠著絲粒和臂間隨體重復(fù)形成不同功能異染色質(zhì)(mousecentricandpericentricsatelliterepeatsformdistinctfunctionalheterochromatin).jcellbiol.2004年8月16日；166(4)：493-505)。在裝配63x/1.40油浸物鏡，和led光源以及針對各熒光通道合適的濾器的zeissaxioobserverz1上拍攝圖像。以下圖例與圖1相關(guān)：a，大隨體；b，小隨體；c，端粒；dna的dapi染色；e，覆蓋。

實施例4

圖2涉及圖1的對照實驗。靶向小鼠大隨體重復(fù)(cy5)、小隨體重復(fù)(alexa-488)、和端粒(cy3)的常用fish寡核苷酸，在使用時，使用與圖1中相同的cas9探測方案。除了對dna的dapi染色(d)以外，其他熒光信號比圖1中捕獲的圖像更彌漫，并且必須在顯微鏡上高度對比。(圖2圖例：大隨體(a)，小隨體(b)，端粒(c)，基因組dna的dapi染色(d)，和覆蓋圖(e))。缺少變性防止這些fish寡聚體與它們的靶標(biāo)雜交，這些靶標(biāo)也在核外聚集。在裝配63x/1.40油浸物鏡，和led光源以及針對各熒光通道合適的濾器的zeissaxioobserverz1上拍攝圖像。以下圖例與圖1相關(guān)：a，大隨體；b，小隨體；c，端粒；dna的dapi染色；e，覆蓋。

實施例5

圖3涉及cas9-grna凝膠移位和切割試驗，顯示天然cas9結(jié)合和切割活性互相獨立并且依賴于鎂離子的存在或缺乏。如下所示制備反應(yīng)：2pmol的核酸酶活性cas9(neb)，2pmol的合成的grna(在l22116位置處靶向lambdadna)，和0.2pmol的2kbpcr擴(kuò)增的dna片段(來自lambdadnal21333-l23332)，在存在5mmmgcl2(泳道1)或不存在鎂(泳道2)的情況下，混合并在37℃下孵育1小時。泳道1顯示鎂存在下的二級切割產(chǎn)物，而泳道2顯示沒有切割產(chǎn)物，但顯示由仍然與之結(jié)合的復(fù)合物導(dǎo)致的小幅上移。分別在與泳道1和2相似的條件下進(jìn)行泳道3和泳道4，除了從反應(yīng)中省去cas9蛋白以外。泳道3和4中沒有觀察到切割和偏移。

實施例6

圖4a-4l涉及grna尾條碼和探測的示例。圖4a顯示cas9蛋白(1)和復(fù)合的grna(2)，具有伸出的四核苷酸環(huán)(3)和伸出的含條碼的grna尾(4)。該條碼可通過含可檢測部分，或標(biāo)記物(6)的雜交探針(5)檢測。圖4b顯示可由超過一種條碼編碼grna尾。在圖4b中，顯示了2個條碼(4和7)，其可由它們含有可檢測部分或標(biāo)記物(6)的相應(yīng)雜交探針(5和8)檢測到。在圖4c中，雜交探針可含有多個可檢測部分或標(biāo)記物(9)以放大信號。在圖4d中，可檢測部分可能不是可直接檢測的(10)并且可能需要使用二級檢測試劑(11)，其對可檢測部分有特異性親和性。該二級試劑含有可檢測部分或標(biāo)記物(12)用于檢測或放大檢測到的信號。圖4e-4i描述了通過滾環(huán)擴(kuò)增探測grna尾的方式。圖4e顯示cas9蛋白(1)和復(fù)合的grna(2)，具有突出的四核苷酸環(huán)(3)和含條碼的grna尾(4)。由環(huán)狀雜交探針(13)檢測條碼，在探針的一個區(qū)域中具有針對條碼的親和性并且扎起另一個區(qū)域中具有標(biāo)記的-探針雜交靶位點(14)。圖4f顯示環(huán)狀探針(13)可用作滾環(huán)擴(kuò)增聚合酶(15)的模板以延伸grna尾(16)。圖4g顯示滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)生定位的放大的雜交探針(17)，其具有多個緊密定位的標(biāo)記的-探針雜交靶位點(18)。圖4h顯示可通過添加可檢測探針(19)產(chǎn)生信號放大的grna尾探針(20)使標(biāo)記的-探針雜交靶位點可被檢測到。圖4i顯示與圖4h相似的滾環(huán)擴(kuò)增的探針(20)，其被生成并標(biāo)記(21)而環(huán)狀探針不與grna條碼雜交，從而避免在grna自身上發(fā)生滾環(huán)擴(kuò)增和標(biāo)記步驟。這種脫離grna生成的探針可通過區(qū)域(5)與圖4a(4)所示的grna尾的條碼區(qū)域雜交。圖4j-4l描述了通過核酸自組裝探測grna尾的方式。圖4j顯示了以連續(xù)方式互相線性組裝核酸探針。第一片段包含條碼雜交區(qū)域(5)，組裝區(qū)域(21)和標(biāo)記物(6)首先雜交至grna尾條碼(圖4a，4)。添加與21或22或23部分互補(bǔ)的標(biāo)記的組裝片段(22和23)的混合物并且只要反應(yīng)中存在部分互補(bǔ)的片段就會自組裝。在此僅顯示了部分結(jié)構(gòu)。這與之前所述的雜交鏈反應(yīng)(hcr)相似。參見dirksrm，piercena.通過雜交鏈反應(yīng)引發(fā)的擴(kuò)增(triggeredamplificationbyhybridizationchainreaction).procnatlacadsciusa.2004年10月26日；101(43)：15275-8。圖4k顯示了高分支核酸探針枝狀聚合物結(jié)構(gòu)的自組裝。第一片段包含條碼雜交區(qū)域(5)，組裝區(qū)域(24)和標(biāo)記物(6)首先雜交至grna尾條碼(圖4a，4)。添加與24或25或26部分互補(bǔ)的標(biāo)記的組裝片段(24，25和26)的混合物并且只要反應(yīng)中存在部分互補(bǔ)的片段就會自組裝成高分支結(jié)構(gòu)。在此僅顯示了部分結(jié)構(gòu)。之前已經(jīng)描述了這種類型的核酸枝狀聚合物。參見liy，tsengyd，kwonsy，d′espauxl，bunchjs，mceuenpl，luod.枝狀聚合物-狀dna的受控組裝(controlledassemblyofdendrimer-likedna).natmater.2004年1月；3(1)：38-42。圖4l顯示了組裝核酸探針的分支以線性擴(kuò)增信號。第一片段包含條碼雜交區(qū)域(5)，組裝區(qū)域(27)首先雜交至grna尾條碼(圖4a，4)。添加與27或29或30部分互補(bǔ)的標(biāo)記的組裝片段(29和30)的混合物并且可自組裝。可檢測的探針(28)可雜交至組裝片段(27)和(30)的部分，只要反應(yīng)中存在部分互補(bǔ)的片段。在此僅顯示了部分結(jié)構(gòu)。這與之前所述的分支dna(bdna)相似。參見collinsml，irvineb，tynerd，finee，zayatic，changc，hornt，ahled，detmerj，shenlp，kolbergj，bushnells，urdeams，hodd.用于對低于100個分子/ml的核酸靶標(biāo)進(jìn)行定量的分支dna信號放大試驗(abrancheddnasignalamplificationassayforquantificationofnucleicacidtargetsbelow100molecules/ml).nucleicacidsres.1997年8月1日；25(15)：2979-84。

應(yīng)理解可檢測部分(例如，6，9，10，12)可提供多種檢測方式，如熒光、化學(xué)發(fā)光或發(fā)色，或共振。應(yīng)理解雜交探針(例如，5，8，9，14)可由多種核酸組分，如dna、rna、修飾的dna、修飾的rna制成。

實施例7

圖5a涉及與側(cè)流測試系統(tǒng)的表面接合的cas9-grna復(fù)合物。研究中的dna的群加載到系統(tǒng)中并且側(cè)流將其置換到測試區(qū)，靶標(biāo)-特異性cas9-grna在該區(qū)結(jié)合至特異性dna。其余的dna保持流過試驗結(jié)束并且被控制區(qū)(controlzone)捕獲，而靶dna仍然在測試區(qū)與cas9-grna復(fù)合物結(jié)合。dna檢測可如下進(jìn)行：在含有可檢測部分的特異性或通用寡核苷酸引物存在下，通過dna的酶促擴(kuò)增(例如，等位擴(kuò)增)，通過核酸染色，或?qū)⒖蓹z測探針雜交至dna，或通過可檢測探針共價接合至dna。通常用于側(cè)流試驗的可檢測部分包括金或銀納米顆粒。其他部分如生物素、地高辛、二硝基苯基、熒光素通常以二級檢測試劑(例如，針對生物素、地高辛、二硝基苯基或熒光素有特異性的金或銀包被的抗體)聯(lián)用。圖5b涉及使用具有不同性質(zhì)來滯留dna或蛋白質(zhì)，如疏水性或電荷的2種材料的側(cè)流系統(tǒng)。例如，硝酸纖維素膜滯留蛋白質(zhì)比dna更有利，而尼龍膜比蛋白質(zhì)更優(yōu)先結(jié)合dna。在加載待研究的dna的群之后，cas9-grna復(fù)合物結(jié)合靶dna。與dna結(jié)合的cas9在測試區(qū)中被dna滯留膜滯留，而未結(jié)合的cas9將通過并結(jié)合至控制區(qū)的蛋白質(zhì)滯留膜。進(jìn)行檢測以檢測帶dna的cas9-grna復(fù)合物。以本文所述的方式探測grna?；蛘?，cas9蛋白本身可攜帶部分(例如，金納米顆粒、銀納米顆粒、生物素、地高辛、二硝基苯基、熒光素)。圖5c涉及側(cè)流系統(tǒng)，其中首先通過分子相互作用(例如，電荷、疏水性、共價相互作用、或親和相互作用如生物素-鏈霉親和素)在測試區(qū)的表面上捕獲。cas9-grna然后在測試區(qū)結(jié)合至表面-捕獲的靶標(biāo)dna。剩余未反應(yīng)的cas9-grna通過并且在控制區(qū)被捕獲。進(jìn)行檢測以檢測帶dna的cas9-grna復(fù)合物。以本文所述的方式探測grna?；蛘撸琧as9蛋白本身可攜帶部分(例如，金納米顆粒、銀納米顆粒、生物素、地高辛、二硝基苯基、熒光素)。

實施例8

使用引導(dǎo)rna/cas9復(fù)合物探測靶dna

體外設(shè)計、制備、表達(dá)和純化引導(dǎo)rna。合成單鏈dna(ssdna)寡核苷酸(idt或定制陣列芯片)。這些寡聚體含有用于體外rna合成的t7轉(zhuǎn)錄起始位點，和形成待用于探測的3’末端尾的延伸。進(jìn)行t7rna合成，純化rna。

根據(jù)一個方面，設(shè)計延伸的序列或尾以最小化空間位阻，具有低復(fù)雜性和低自由能以實現(xiàn)使用dna-paint的超高分辨率成像(其可實現(xiàn)2.7nm分辨率，其是8個dna堿基，因此低于cas9的20bp跡線)。設(shè)計的引導(dǎo)rna具有20個不同的paint?？课稽c，其長度為9聚體，并含有不同的a、t和c堿基(非g)排列，而paint探針是互補(bǔ)序列加熒光團(tuán)。

通過洗去探針并且在成像之間加載新探針，可實現(xiàn)20種探針/熒光團(tuán)，即，每個熒光團(tuán)可用20種不同grna成像。因此，4種熒光團(tuán)能夠在80個grna之間區(qū)分。

引導(dǎo)rna結(jié)構(gòu)的一個實施方式是(5’至3’)grna-uuuuu-paint停留(dock)。引導(dǎo)rna序列是與spcas9常聯(lián)用的單個引導(dǎo)rna的最小長度。

對于高分辨率成像，延伸的序列或尾設(shè)計成最小化空間位阻，具有低復(fù)雜性和低自由能。然而，對于高分辨率成像，使用較長的退火區(qū)域。延伸的序列或尾的結(jié)構(gòu)可用作條碼，其可用序列特異性寡核苷酸，或鎖式探針之后進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增來探測。

spcas9在大腸桿菌中表達(dá)。使用gibson等位組裝來組裝并克隆cas9編碼基因到適于在大腸桿菌中表達(dá)的質(zhì)粒中。孵育之后，裂解細(xì)胞并純化蛋白質(zhì)。

通過在沒有進(jìn)一步制備的情況下裂解細(xì)胞來獲得靶dna。因此，樣品包含來自染色體和染色體外(例如，質(zhì)粒)來源的dna的混合物。

cas9與grna混合并且添加至dna樣品中持續(xù)足夠的時間，使cas9、grna和靶核酸形成復(fù)合物(約15分鐘)，之后添加檢測探針。然后獲得成像數(shù)據(jù)(數(shù)秒至數(shù)分鐘)。

對于納米孔檢測，cas9-grna復(fù)合物在dsdna片段上設(shè)計的間隔處結(jié)合。然后dna易位通過或靠近納米孔(或納米間隙電極)。測量電流變化：dsdna將在特定電流下運行，而與dna結(jié)合的復(fù)合物將部分阻斷電流，我們將其記錄為電流尖峰。通過隨時間分析這些尖峰，可推導(dǎo)靶dna上cas9/grna的位置并與基于引導(dǎo)rna設(shè)計的預(yù)測位置比較。

使用上述方法，可一次檢測多種靶標(biāo)以獲得關(guān)于dna靶標(biāo)性質(zhì)的信息，如著絲粒的重復(fù)區(qū)域、與這些重復(fù)連接的染色體的種類、藥物抗性基因的種類(包含于細(xì)菌基因組或質(zhì)粒)、可移動元件的種類(例如，轉(zhuǎn)座子、藥物抗性盒)、疾病相關(guān)基因的特定等位基因(例如，癌基因，自身免疫，神經(jīng)變性)等。

實施例9

使用引導(dǎo)rna/cas9復(fù)合物探測靶dna

人基因組dna(諾瓦基公司)在ph5.5的0.5mmes緩沖液中稀釋至約0.2ng/ul，并在乙烯基硅烷包被的基材(巴黎的genomicvision公司)上進(jìn)行分子梳理，按照michalet等所述(動態(tài)分子梳理(dynamicmolecularcombing)，science1999)。簡言之，這包括將乙烯基硅烷包被的蓋玻片浸入含dna的溶液中，然后以固定速度將其拉出，與langmuirblodgett裝置相似。這用于通過“彎液面”機(jī)制將dna拉伸到基材上。當(dāng)dna完全脫離溶液時，其在10000微焦/cm²下經(jīng)過uv交聯(lián)。這在表面上產(chǎn)生大量單向?qū)R的dna。如果小心制備dna，可使用dna染色如yoyo-1觀察到兆堿基長度的dna。

在基材上拉伸的基因組dna用緩沖液潤濕，然后向基材中加入預(yù)形成(通過在37℃下預(yù)孵育10分鐘)的grna/cas9(neb)并允許反應(yīng)1小時。然后洗去過量復(fù)合物。引導(dǎo)rna設(shè)計成具有與著絲粒序列互補(bǔ)的部分，并且引導(dǎo)物的3’端設(shè)計成具有與探針序列互補(bǔ)的尾核酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將易于理解可針對任何需要的基因組序列設(shè)計引導(dǎo)rna。包括引導(dǎo)rna和尾序列，啟動子和終止信號序列(idt)的序列可用于體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中以合成具有與來自模板的探針序列互補(bǔ)的尾序列的引導(dǎo)rna。使用zymo清潔/濃縮器來純化具有與探針序列互補(bǔ)的尾序列的引導(dǎo)rna。然后在添加到拉伸的dna之前，如上所述用cas9孵育轉(zhuǎn)錄的rna。

用blockaid(英杰公司)處理載玻片。具有與grna上的尾的互補(bǔ)性的16ntdna探針然后與復(fù)合物在非嚴(yán)謹(jǐn)條件(4xssc，50％甲酰胺，blockaid)下反應(yīng)。使用的探針在2端用atto657n染料標(biāo)記(來自英杰公司的定制合成訂單)。合成反應(yīng)在4℃下放置過夜。然后洗滌載玻片以去除過量染料并且在tirf顯微鏡上成像。

因為dna靶標(biāo)仍然是雙鏈的，可在atto647n成像之前或之后用yoyo-1染料染色。通過使用紅色激光和合適濾器檢測引導(dǎo)rna上的標(biāo)記物，并且通過使用藍(lán)色激光和合適濾器檢測dna染色。通過寬視野tirf顯微鏡進(jìn)行成像。

圖6a是顯示與表面上延長或預(yù)拉伸的雙鏈人基因組dna(線)結(jié)合的著絲粒特異性引導(dǎo)rna(grna)/cas9復(fù)合物(點)的結(jié)果的圖像。圖6b是grna/cas9(點)結(jié)合至人著絲粒dna(灰色)的超高分辨率圖像。

如圖6a所示，粗略估計，探針靶向的著絲粒dna占基因組的約1％。檢驗多個視場并且通常用沿線相關(guān)的探針標(biāo)記點觀察場，如圖6a所示。染色的dna顯示載玻片具有許多不顯示沿線相關(guān)的標(biāo)記物的拉伸的dna分子，從而證明本文所述的方法可使用可檢測grna/cas9復(fù)合物鑒定包括多種核酸的樣品內(nèi)的特定靶核酸。

crispr/cas9緩沖液包含20mmhepes，100mmnacl，5mmmgcl2，0.1mmedta，并且在25℃下ph為6.5。雜交緩沖液包含200ul“純”甲酰胺，20ul10％sds，120ulblockaid，40ul的20xssc和20ul水。使用的cas9是終濃度為25-30nm的cas9核酸酶，化膿鏈球菌(s.pyogenes)(neb)。使用的標(biāo)記的寡核苷酸(idt)濃度為約800nm。

圖6c設(shè)計cas9體外結(jié)合試驗。全長lambdadna(約48kb)用cas9單獨探測或與crispr-grna復(fù)合并在乙烯基硅烷官能化的玻璃表面上拉伸。cas9然后由藻紅蛋白-偶聯(lián)的抗體(深色)標(biāo)記并且dna由yoyo-1(淺色)標(biāo)記。在裝配tirf模式的100x/1.47油浸物鏡的leicadm1600上獲取圖像。

實施例10

圖7涉及應(yīng)用于brca1基因座的區(qū)位紅-綠-藍(lán)(rgb)條碼化系統(tǒng)。brca1和brca2基因內(nèi)的大重排是女性和男性中的乳腺癌和卵巢癌易感性的重要標(biāo)志物。重排可提供關(guān)于發(fā)展癌癥的風(fēng)險，和合適治療的信息。(judkinst，rosenthale，arnellc，burbidgela，gearyw，barrust，schoenbergerj，trostj，wenstruprj，roabb.brca1和brca2中大重排的臨床顯著性(clinicalsignificanceoflargerearrangementsinbrca1andbrca2).cancer.2012年11月1日；118(21)：5210-6.；liedea，karlanby，narodsa.brca1或brca2種系突變的男性攜帶者的癌癥風(fēng)險：文獻(xiàn)綜述(cancerrisksformalecarriersofgermlinemutationsinbrca1orbrca2：areviewoftheliterature).jclinoncol.2004年2月15日；22(4)：735-42)。這些大重排的范圍是非常廣泛的，并且一般使用對pcr擴(kuò)增的dna的sanger測序來表征這些重排。沿基因座使用特異性顏色圖案(表3，區(qū)位編碼)，我們的grna/cas9探測策略以高密度標(biāo)記各brca基因座的全長(每100bp大約1個探測的位點)。對于在基因座內(nèi)重排的任何區(qū)域，顏色圖案將改變，使得能夠鑒定這些大重排。我們的方法提供了測序的更簡單替代。我們的方法也用于檢測其他癌癥，如急性骨髓性白血病，發(fā)育疾病，如叢綜合征(bushysyndrome)，和神經(jīng)發(fā)育疾病，如自閉癥中的類似重排。適用于該方法的另一種類別的重排包括免疫細(xì)胞受體的vdj重組。

實施例11

圖8涉及應(yīng)用于由grna/cas9復(fù)合物靶向的特定位置的dna折紙條碼。各條碼對于grna靶向的位置而言是獨特的。brca1和brca2基因易受各種幅度的基因組重排的影響，包括較小的插入和刪除，其僅可通過sanger測序檢測到。使用對各grna/cas9靶位點特定的條碼，我們的grna/cas9探測策略以高密度標(biāo)記各brca基因座的全長(每100bp大約1個探測的位點)。該條碼采取熒光折紙條碼，如前所述(linc，jungmannr，leiferam，lic，levnerd，churchgm，shihwm，yinp.亞微米幾何編碼的從dna自組裝的熒光條碼(submicrometregeometricallyencodedfluorescentbarcodesself-assembledfromdna).natchem.2012年10月；4(10)：832-9)。通過對各條碼(表3，折紙編碼)進(jìn)行解碼，我們鑒定各grna/cas9及其在基因座上的位置，其提供了關(guān)于基因座內(nèi)插入、刪除和重排區(qū)域的信息。當(dāng)決定合適的癌癥治療時，臨床醫(yī)師可考慮這種分辨率水平。我們的方法提供了測序的更簡單替代。我們的方法也用于檢測其他癌癥、發(fā)育疾病、和神經(jīng)發(fā)育疾病中的類似重排。適用于該方法的另一種類別的重排包括免疫細(xì)胞受體的vdj重組。

實施例12

圖9a-9b涉及從grna/cas9切口的聚合酶延伸。圖9a顯示了由grna和cas9的d10a突變體切割的靶dna的頂部鏈。圖9b顯示了由grna和cas9的h840a突變體切割的靶dna的底部鏈。彎曲的箭頭顯示從切口的引物延伸方向?？墒褂靡镅由靵順?biāo)記靶向的區(qū)域或啟動對靶向的區(qū)域的測序。我們的grna/cas9切口和測序方法允許對基因組上的測序起始位點進(jìn)行精確靶向定位。簡言之，grna/cas9切口酶在感興趣的靶向位置處在dna鏈中產(chǎn)生切口。然后由多種方法之一來置換grna/cas9，如去污劑、變性劑或溫度。然后加入具有鏈置換活性的dna聚合酶，和標(biāo)記的dntp，從而從切口位點延伸dna。大量的感興趣基因組區(qū)域適用于這種grna/cas9切口啟動方法。重復(fù)區(qū)域，如著絲粒dna本身對于測序和比對而言是困難的，由于它們的大量短重復(fù)?；蚪M重排通常含有較小的突變。另外，許多基因組重排難以表征，并且重排或融合的位置未知。

實施例13

圖10是使用chopchop來找到pam位點時提供的輸出圖。chochop是許多在線工具使用算法之一，以發(fā)現(xiàn)給定基因座上的grna/cas9靶標(biāo)和脫靶并對其打分(tessag.montague；josem.cruz；jamesa.gagnon；georgem.church；eivindvalen.(2014).chopchop：用于基因組編輯的crispr/cas9和talen網(wǎng)頁工具(chopchop：acrispr/cas9andtalenwebtoolforgenomeediting).nucleicacidsres.42.w401-w407)。該圖顯示在her2外顯子上搜索靶標(biāo)的圖形輸出。小三角形標(biāo)識her2外顯子上的grna/cas9靶位點。靶序列的列表可經(jīng)提取，管理(curate)以僅保留沒有或有少量脫靶的靶標(biāo)，并且然后用于設(shè)計grna。這種工具用于尋找其他基因座的grna/cas9靶標(biāo)。其他工具可用于訊在內(nèi)含子和外顯子上，或基因座以外的靶標(biāo)。

實施例14

圖11涉及使用高保證聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)對用于體外轉(zhuǎn)錄引導(dǎo)rna的dna模板的組裝。該策略依賴于2個通用寡核苷酸：fwd-t7-grna，也包括用于體外轉(zhuǎn)錄的t7rna聚合酶識別基序的部分的正向pcr引物；和grna.split60，通用grna支架。另外，存在2個聚體寡核苷酸：sp.grna.split60，針對感興趣靶標(biāo)有特異性的序列；和rev-b1-grna.18，也包括用于多重鏈監(jiān)測的條碼化的柄的反向pcr引物。也提供了建議的熔融溫度(tm)。這種設(shè)計是低成本的，最小化擴(kuò)增錯誤，并且適用于小規(guī)?；虼笠?guī)模寡核苷酸。擴(kuò)增后，可通過pcr再擴(kuò)增模板以生成并保持模板，其比從頭合成成本更低。pcr組裝耗時不到1小時。在pcr之后，通過向模板dna添加t7rna聚合酶混合物由體外轉(zhuǎn)錄(ivt)來合成grna。

實施例15

圖12是cas9-grna靶向alk易位的示意圖。該圖顯示當(dāng)已知2個融合區(qū)域時，可通過使用含grna/cas9的特異性條碼來檢測融合存在。alk基因座易產(chǎn)生染色體內(nèi)和染色體間重排和倒置。存在7種具有不良臨床結(jié)構(gòu)的這類重排(solomonb，varella-garciam，camidgedr.alk基因重排：非小細(xì)胞肺癌的分子限定亞組中的新治療靶標(biāo)(alkgenerearrangements：anewtherapeutictargetinamolecularlydefinedsubsetofnon-smallcelllungcancer).jthoraconcol.2009年12月；4(12)：1450-4)。我們的grna/cas9探測策略使用與各基因座相關(guān)的顏色以高密度(大約1個探測位點/100bp)標(biāo)記特定基因座區(qū)域。該策略可用于檢測基因融合和倒置。當(dāng)2個標(biāo)記的基因座相鄰時，它們相應(yīng)的標(biāo)記物被檢測為共定位信號。在重排的情況中，2個信號不再共定位，并且是非常遠(yuǎn)的。在倒置的情況中，信號不共定位，但仍然在附近。為了增加置信度，標(biāo)記第三基因座，其在基因融合中(由于alk染色體間重排)或alk倒置中提供了不同共定位組合。檢測這種alk缺陷在鑒定多種癌癥，如間變性大細(xì)胞淋巴瘤(alk-npm1融合)，肺腺癌(alk-eml4融合和倒置)，和某些小兒成神經(jīng)細(xì)胞瘤中是重要的。存在對某些alk重排的治療。幾種其他疾病通過基因融合表征并且適用于我們的方法?；蛉诤习袠?biāo)的一些示例包括abl1-bcr、aml1-runx1t1、aml1-etv6、bcl-2-igh、bcl-2-mlt、c-myc-igh、col1a1-pdgfb、cycd1-igh、etv6-trkc、etv6-jak、fli1-ews、pax8-pparg、pmi-nr1b1、tcr-rrtn2、ss18-ssx。