核酸的多重檢測的制作方法
【專利摘要】本文描述新的方法，其中使用多個特異性探針來檢測含有多個獨特靶標(biāo)序列的所關(guān)注核酸物質(zhì)(例如染色體)，所述探針通過滾環(huán)擴增來擴增并加以檢測。多個探針用于提供可檢測信號，其中信號的幅度與識別其靶標(biāo)序列的探針的數(shù)目成比例。通過經(jīng)由多重探測來擴增個別信號，來自多個探針的個別信號被轉(zhuǎn)化成單一累積可檢測信號。十個或更多個探針產(chǎn)生十倍或更大的信號擴增。所產(chǎn)生的信號取決于在靶標(biāo)識別后正確反應(yīng)的探針，其使用序列特異性雜交和酶催化來產(chǎn)生特異性產(chǎn)物，從所述產(chǎn)物獲得信號。
【專利說明】核酸的多重檢測
[0001 ]交叉引用
[0002] 本申請要求2013年12月2日提交的英國申請?zhí)枺?321196.6的權(quán)益，所述申請通過 引用并入本文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明設(shè)及使用結(jié)合特定序列的探針來并行檢測多個核酸序列的多重方法。本發(fā) 明還設(shè)及量化核酸物質(zhì)，例如確定樣品中的兩種不同染色體的相對數(shù)量，包括運類方法在 胎兒異倍體性的非侵入性出生前診斷中的使用。
[0004] 背景
[0005] 許多疾病的病因或特征是與物種的染色體或染色體節(jié)段的正常數(shù)目比較，個體的 細(xì)胞中的染色體數(shù)目的不平衡(異倍體性)或染色體節(jié)段數(shù)目的不平衡(部分異倍體性）。人 二倍體基因組具有23對染色體;成對染色體1至22和性染色體XX或XY。術(shù)語單體性和S體性 是指缺失或額外染色體，而部分單體性和部分=體性是指由染色體一部分的相應(yīng)損失或增 加所導(dǎo)致的遺傳物質(zhì)的不平衡。個體基因組中的異倍體性和部分異倍體性與先天性病癥諸 如唐氏綜合征(人染色體21的=體性)和特納氏綜合征(性染色體的單體性或部分單體性） 相關(guān)聯(lián)。異倍體性和部分異倍體性還可經(jīng)由成人組織中的體細(xì)胞突變而出現(xiàn)。舉例來說，許 多癌細(xì)胞展現(xiàn)染色體脆性，導(dǎo)致染色體片段易位和腫瘤細(xì)胞的異倍體性。
[0006] 已開發(fā)診斷與染色體缺陷相關(guān)聯(lián)的疾病的方法。傳統(tǒng)的核型分析方法包含獲得組 織樣品，將染色體染色并且在光學(xué)顯微鏡下對其檢查。Sch巧Ck等人(Science 273(5274): 494-497 1996)描述多色光譜核型分析，其使用巧光原位雜交(FISH)來同時W不同顏色顯 現(xiàn)所有人染色體。通過用不同巧光團來標(biāo)記染色體特定DNA來制成針對每個染色體的巧光 標(biāo)記探針。因為光譜不同巧光團的數(shù)目有限，所W組合標(biāo)記方法用于產(chǎn)生所需數(shù)目的不同 發(fā)射光譜。將由組合標(biāo)記產(chǎn)生的光譜差異捕獲并且使用連接至巧光顯微鏡的干設(shè)儀來分 析。然后，圖像處理軟件為每個光譜不同組合指派顏色，從而允許顯現(xiàn)個別著色的染色體。
[0007] 比較基因組雜交（C細(xì)）設(shè)及從待比較的兩個來源，最通常測試和參考來源分離 DNA，將每個DNA樣品用不同顏色(通常紅色和綠色）的巧光團單獨地標(biāo)記，將DNA變性W使得 它是單鏈的，并且兩個所得樣品Wl: 1比率雜交至正常中期染色體涂片，經(jīng)標(biāo)記DNA樣品在 其起點基因座處結(jié)合至所述涂片。然后使用巧光顯微鏡和計算機軟件，將差異著色的巧光 信號沿著每個染色體的長度比較W識別兩個來源之間的染色體差異。染色體的特定區(qū)域中 的測試樣品顏色的較高強度指示相應(yīng)來源樣品中的此區(qū)域的材料增加，而參考樣品顏色的 較高強度指示此特定區(qū)域中的測試樣品的材料損失。中性顏色(在巧光團標(biāo)記為紅色和綠 色時，中性顏色是黃色）指示在此位置的兩個樣品之間沒有差異。C細(xì)由Kallioniemi等人， Science 258(5083):818-21 1992和Pinkel等人，Nat Genet.20(2) :207-11 1998描述。
[000引最近，已開發(fā)數(shù)字或假核型分析方法來在基因組規(guī)模上量化拷貝數(shù)(Wang等人， PNAS 99(25):16156-16161 2002)。與常規(guī)核型分析或基于染色體的CGH相比，數(shù)字核型分 析允許在較高分辨率下檢測拷貝數(shù)的差異。分離并計數(shù)來自整個基因組上的特定基因座的 短DNA序列。各自2化P的標(biāo)簽可從基因組中的特定位置獲得并且總體上含有唯一地識別產(chǎn) 生所述標(biāo)簽的基因組基因座的足夠信息。因此，標(biāo)簽可與精確染色體位置匹配并且標(biāo)簽密 度可在移動窗口上評估W檢測DNA序列內(nèi)含物的異常。將序列標(biāo)簽與其染色體位置匹配的 方法包括高通量測序、使用陣列比較基因組雜交和SNP陣列。
[0009] 陣列由與基因組中的所關(guān)注區(qū)域互補的數(shù)百至數(shù)百萬個探針組成。將來自測試樣 品的DNA片段化、標(biāo)記并且雜交至陣列。對于陣列上的每個位置，將每個探針的雜交信號強 度量化。知道陣列上的每個探針的地址和基因組中的每個探針的地址，使用算法來將探針 W染色體順序排齊并且在計算機中重建基因組。數(shù)字核型分析的分辨率取決于陣列上的探 針密度。
[0010] 需要高精度分析的一個領(lǐng)域是非侵入性出生前核型分析。懷孕母親在其血液中帶 有無細(xì)胞循環(huán)DNA，其中4-30 %來自胎兒?？赏ㄟ^確定來源于每個染色體的無細(xì)胞DNA的豐 度來確定胎兒的核型。舉例來說，如果無細(xì)胞DNA由95 %母體和5 %胎兒DNA組成，并且如果 胎兒患有染色體21的S體性(唐氏綜合征），那么來自染色體21的無細(xì)胞DNA的總量應(yīng)超過 相同大小的任何其他基因組區(qū)域的無細(xì)胞DNA的總量2.5%。觀察胎兒DNA中的染色體異倍 體性需要非常精確的測量來檢測不同染色體的相對數(shù)量的運些輕微不平衡。由于需要用相 對較小樣品來研究W便為患者和臨床醫(yī)生提供便利并且可接受的方法，因此上述困難加 重。
[0011] 來自單一或少許DNA分子的特定祀標(biāo)的分析在傳統(tǒng)上一直是技術(shù)難題。通常需要 拷貝DNA的方法W便獲得用于下游分析程序的足夠信號。分析方法諸如DNA測序、凝膠電泳 和DNA微陣列通常需要所提供的樣品中的DNA的信號擴增。擴增特定DNA祀標(biāo)的最常見擴增 方法是PCR，其可提供來自DNA樣品的特定祀標(biāo)的數(shù)百萬(或數(shù)十億)個拷貝。然而，當(dāng)需要擴 增基因組樣品的許多區(qū)域W便分析時，可由于在同一反應(yīng)混合物中一起執(zhí)行多個不同擴增 而出現(xiàn)擴增假象。另外，擴增步驟可導(dǎo)致?lián)p失關(guān)于樣品中的序列的相對數(shù)量的信息，因為與 擴增核酸產(chǎn)物的絕對量相比，相對數(shù)量的初始差異可能很小，并且因為不同序列可W不同 效率來擴增。
[0012] 發(fā)明概述
[0013] 本文所述方法的一些實施方案引入新方法，其中含有多個獨特祀標(biāo)序列的所關(guān)注 核酸物質(zhì)（例如染色體)使用多個特定探針來檢測。多個探針用于提供可檢測信號，其中信 號的幅度與識別其祀標(biāo)序列的探針的數(shù)目成比例。來自多個探針的個別信號轉(zhuǎn)化成單一累 積可檢測信號，從而經(jīng)由多重探測來擴增個別信號。十個或更多個探針產(chǎn)生十倍或更大的 信號擴增。所產(chǎn)生的信號取決于在祀標(biāo)識別后正確反應(yīng)的探針，其使用序列特異性雜交和 酶催化來產(chǎn)生特異性產(chǎn)物，從所述產(chǎn)物獲得信號。
[0014] -些實施方案使用檢測所關(guān)注祀標(biāo)分子的核酸物質(zhì)上的多個基因座作為信號擴 增步驟，并且由此能夠在不需要擴增反應(yīng)探針的產(chǎn)物的情況下實現(xiàn)信號產(chǎn)生和檢測。然而， 來自多重產(chǎn)物的信號可任選地通過傳統(tǒng)信號擴增步驟來擴增?？蓤?zhí)行信號的克隆擴增。合 適擴增技術(shù)包括滾環(huán)擴增、橋式PCR、emPCR和數(shù)字PCR。
[0015] 識別其祀標(biāo)序列的每個探針產(chǎn)生連接產(chǎn)物，并且通過每個探針雜交產(chǎn)生的連接產(chǎn) 物可個別地檢測，W使得個別信號可從每個連接產(chǎn)物獲得。然而，本發(fā)明方法的一些實行方 案的極好特征是運些個別信號不一定個別地檢測，而是替代地合并成累積信號并且檢測累 積信號。累積信號是個別信號的組合并且由此可用于檢測和/或量化連接產(chǎn)物，所述連接產(chǎn) 物代表所研究的核酸物質(zhì)的存在或數(shù)量。與設(shè)及測序和微陣列的方法相比，運允許更早合 并探針信號，在所述方法中對于在區(qū)域上的多個探針，產(chǎn)生個別信號，然后信號在分析中合 并W代表區(qū)域。信號可在檢測之前合并，W使得個別信號無需單獨定位或查詢。運能夠?qū)崿F(xiàn) 更簡單讀出格式。
[0016] 通過多重處理的信號擴增方法可用于檢測樣品中的所關(guān)注核酸物質(zhì)，例如其中核 酸物質(zhì)是復(fù)雜核酸樣品中的次要或微量組分。通過多重處理的擴增能夠?qū)崿F(xiàn)可靠檢測。運 可用于例如出于診斷目的來檢測樣品，諸如患者樣品中的微生物核酸。樣品可用對于多種 微生物核酸物質(zhì)具有特異性的探針來探測，W檢測并識別所存在的核酸。運適用于檢測傳 染病媒介物，諸如細(xì)菌、病毒和真菌。可檢測具體核酸轉(zhuǎn)錄物。通過多重處理的擴增還可用 于量化核酸物質(zhì)。通過探測兩種或更多種核酸物質(zhì)，一或多種所關(guān)注物質(zhì)和一或多種參考 核酸物質(zhì)，本發(fā)明方法能夠量化樣品中的兩種物質(zhì)的相對量。在應(yīng)用于檢測或量化染色體 或染色體基因座，例如用于染色體拷貝數(shù)檢測時，所述方法尤其有用。特別有價值的應(yīng)用是 使用運類方法來識別染色體缺陷，包括診斷癌癥和先天性異倍體性。尤其描述用于非侵入 性出生前診斷(NIPT)的用途。在查詢/檢測包括許多祀標(biāo)序列的較大核酸時，本發(fā)明方法特 別有用，尤其如果運些核酸W低摩爾量存在，并且在其必須W很高精確度來測量或量化時 更是如此，如在NIPT中的情況下。
[0017] 樣品中的核酸物質(zhì)可通過使樣品與一組探針接觸來檢測，其中每個探針特異性識 別待檢測的核酸物質(zhì)中的不同祀標(biāo)序列，并且其中由每個探針來識別每個祀標(biāo)序列產(chǎn)生產(chǎn) 物，并且檢測作為來自產(chǎn)物的信號的組合的累積信號，其中檢測到信號指示樣品中的核酸 物質(zhì)的存在。核酸物質(zhì)可通過量化累積信號W確定信號水平來量化，其中信號水平與樣品 中的核酸物質(zhì)的數(shù)量成比例，并且由此確定樣品中的核酸物質(zhì)的數(shù)量。第一核酸物質(zhì)可通 過使樣品與第一組探針和第二組探針接觸來相對于第二或參考核酸物質(zhì)量化，其中第一組 探針各自特異性識別第一核酸物質(zhì)內(nèi)的不同祀標(biāo)序列并且其中第二組探針各自特異性識 別第二或參考核酸物質(zhì)內(nèi)的不同祀標(biāo)序列。檢測第一和第二累積信號，第一累積信號是來 自由識別其祀標(biāo)序列的第一組探針?biāo)a(chǎn)生的產(chǎn)物的個別信號的組合，并且第二累積信號是 來自由識別其祀標(biāo)序列的第二組探針?biāo)a(chǎn)生的產(chǎn)物的個別信號的組合。將第一和第二信號 量化W分別確定第一和第二信號水平，運些水平與樣品中的第一和第二核酸物質(zhì)的數(shù)量成 比例。因此，樣品中的第一和第二核酸物質(zhì)的相對數(shù)量可通過比較第一和第二信號水平來 確定。
[0018] 舉例來說，累積信號可為識別其祀標(biāo)序列的探針的克隆擴增和/或標(biāo)記產(chǎn)物的匯 總計數(shù)，例如滾環(huán)擴增的產(chǎn)物，或從所有產(chǎn)物發(fā)射的巧光信號，其中每個產(chǎn)物發(fā)射巧光信 號。為了量化多種核酸物質(zhì)的相對量，對于每一種物質(zhì)使用不同信號，例如與另一組探針的 產(chǎn)物相比，一組探針的產(chǎn)物可發(fā)射不同波長或光譜的巧光。
[0019] 在探針祀標(biāo)識別依賴于雜交和酶辨別時獲得優(yōu)勢，W使得信號輸出取決于正確的 酶促探針反應(yīng)。優(yōu)選地，通過探針來識別祀標(biāo)序列包括探針雜交至祀標(biāo)序列和產(chǎn)生連接產(chǎn) 物，其中連接產(chǎn)物的產(chǎn)生取決于探針特異性雜交至其祀標(biāo)序列。本文描述被設(shè)計成尤其適 合于用于本發(fā)明方法的探針。然而，探針不限于探針的任何一種設(shè)計，并且可便利地使用各 種已知核酸探針，包括例如掛鎖探針、選擇子探針、寡核巧酸連接探針、分子倒轉(zhuǎn)探針和串 聯(lián)探針。
[0020] 本公開的第一方面提供檢測樣品中的核酸物質(zhì)的方法，其包括
[0021] 使樣品與一組探針接觸，其中每個探針特異性識別待檢測的核酸物質(zhì)內(nèi)的不同祀 標(biāo)序列，
[0022] 提供使得核酸物質(zhì)中的祀標(biāo)序列變成至少部分單鏈的條件，
[0023] 提供用于退火和連接的條件，在所述條件下探針雜交至其祀標(biāo)序列并且產(chǎn)生連接 產(chǎn)物，每個連接產(chǎn)物包括連接接合處，W及
[0024] 檢測作為來自所有連接產(chǎn)物的個別信號的組合的累積信號，
[0025] 其中檢測到信號指示樣品中的核酸物質(zhì)的存在。
[0026] 本公開的第二方面提供量化樣品中的核酸物質(zhì)的方法，其包括
[0027] 使樣品與一組探針接觸，其中每個探針特異性識別待量化的核酸物質(zhì)內(nèi)的不同祀 標(biāo)序列，
[0028] 提供使得核酸物質(zhì)中的祀標(biāo)序列變成至少部分單鏈的條件，
[0029] 提供用于退火和連接的條件，在所述條件下探針雜交至其祀標(biāo)序列并且產(chǎn)生連接 產(chǎn)物，每個連接產(chǎn)物包括連接接合處，W及
[0030] 檢測作為來自所有連接產(chǎn)物的個別信號的組合的累積信號，
[0031] 量化累積信號W確定信號水平，其中信號水平與樣品中的核酸物質(zhì)的數(shù)量成比 例，并且
[0032] 由此確定樣品中的核酸物質(zhì)的數(shù)量。
[0033] 所述方法可用于相對于樣品中的第二核酸物質(zhì)來量化第一核酸物質(zhì)。因此，所述 方法可包括
[0034] 使樣品與第一組探針和第二組探針接觸，其中第一組探針各自特異性識別第一核 酸物質(zhì)內(nèi)的不同祀標(biāo)序列并且其中第二組探針各自特異性識別第二核酸物質(zhì)內(nèi)的不同祀 標(biāo)序列，
[0035] 提供使得第一和第二核酸物質(zhì)中的祀標(biāo)序列變成至少部分單鏈的條件，
[0036] 提供用于退火和連接的條件，在所述條件下探針雜交至其祀標(biāo)序列并且產(chǎn)生連接 產(chǎn)物，每個連接產(chǎn)物包括連接接合處，
[0037] 檢測作為來自由第一組探針?biāo)a(chǎn)生的連接產(chǎn)物的個別信號的組合的第一累積信 號，并且將其量化W確定第一信號水平，其中第一信號水平與樣品中的第一核酸物質(zhì)的數(shù) 量成比例，
[0038] 檢測作為來自由第二組探針?biāo)a(chǎn)生的連接產(chǎn)物的個別信號的組合的第二累積信 號，并且將其量化W確定第二信號水平，其中第二信號水平與樣品中的第二核酸物質(zhì)的數(shù) 量成比例，W及
[0039] 比較第一和第二信號水平，從而確定樣品中的第一和第二核酸物質(zhì)的相對數(shù)量。
[0040] 另一個方面提供相對于樣品中的第二染色體或染色體基因座來量化第一染色體 或染色體基因座的方法，其包括
[0041] 使樣品與第一組探針和第二組探針接觸，其中第一組探針各自特異性識別第一染 色體或染色體基因座內(nèi)的不同祀標(biāo)序列并且其中第二組探針各自特異性識別第二染色體 或染色體基因座內(nèi)的不同祀標(biāo)序列，
[0042] 提供使得第一和第二染色體或染色體基因座中的祀標(biāo)序列變成至少部分單鏈的 條件，
[0043] 提供用于退火和連接的條件，在所述條件下探針雜交至其祀標(biāo)序列并且產(chǎn)生連接 產(chǎn)物，每個連接產(chǎn)物是包括連接接合處的核酸環(huán)，
[0044] 提供用于核酸環(huán)的滾環(huán)復(fù)制的條件，
[0045] 計數(shù)第一滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物的數(shù)目，其中滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物從由第一組探針產(chǎn)生的連接產(chǎn) 物擴增W提供第一計數(shù)，
[0046] 計數(shù)第二滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物的數(shù)目，其中第二滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物從由第二組探針產(chǎn)生的連 接產(chǎn)物擴增W提供第二計數(shù)，W及
[0047] 比較第一和第二計數(shù)，從而確定樣品中的第一和第二核酸物質(zhì)的相對數(shù)量。
[0048] 在運些實施方案中，滾環(huán)擴增產(chǎn)物可個別地通過W下步驟來計數(shù)：（a)獲得底物， 所述底物包括分布在底物表面上的多個復(fù)合物，其中每個復(fù)合物包括單一 RCA產(chǎn)物和雜交 至RCA產(chǎn)物的多個標(biāo)記寡核巧酸探針，其中對應(yīng)于第一滾環(huán)擴增產(chǎn)物的復(fù)合物和對應(yīng)于第 二滾環(huán)擴增產(chǎn)物的復(fù)合物可區(qū)分地標(biāo)記;并且(b)計數(shù)存在于底物區(qū)域中的第一 RCA產(chǎn)物的 數(shù)目并且獨立地計數(shù)第二RCA產(chǎn)物的數(shù)目。在此實施方案中，寡核巧酸可巧光標(biāo)記。
[0049] 總體上，對于待檢測或量化的每一種核酸物質(zhì)，探針的數(shù)目至少為十種。數(shù)目當(dāng)然 是指不同探針的數(shù)目，而非探針分子的絕對數(shù)。因此，核酸含有至少十種不同特定祀標(biāo)序 列，并且累積信號是至少十種獨特探針的個別信號的組合，此累積信號代表一種核酸物質(zhì)。 高水平的多重處理可用于獲得相應(yīng)地高水平信號擴增。舉例來說，至少100種、至少1，〇〇〇 種、至少10,000種或甚至更大數(shù)目的探針可用于待檢測或量化的每一種核酸物質(zhì)。
[0050] 如提及，各種探針設(shè)計適合于用于本發(fā)明方法。在正確雜交至其祀標(biāo)序列之后產(chǎn) 生連接產(chǎn)物的探針包括：
[0051] a)掛鎖探針，其中探針通過雜交至祀標(biāo)序列來環(huán)化，并且探針核酸的環(huán)通過連接 來產(chǎn)生。掛鎖探針描述于US5,854，033(Lizardi)、W099/49079(Landegren)和US 5,871,921 化andegren&Kwiatkowski )中。被稱為倒轉(zhuǎn)探針的掛鎖探針形式描述于US 6,858,412 (Willis等人）中。倒轉(zhuǎn)探針是含有探針骨架中的裂解位點的掛鎖探針，從而允許環(huán)化探針 裂解W形成線性產(chǎn)物，然后其可擴增并檢測。
[0052] b)串聯(lián)探針，其在結(jié)合至祀標(biāo)序列時與橋連寡核巧酸一起環(huán)化。祀標(biāo)序列充當(dāng)兩 個探針序列的連接的模板，其中在所述探針序列之間具有橋連寡核巧酸。然后，兩個探針序 列連接W形成環(huán)。此類型的探針描述于US2013/0172212(Ariosa)中。串聯(lián)探針類似于掛鎖 探針，但是在連接之后的單獨步驟中而非在連接期間使探針環(huán)化。
[0053] C)祀標(biāo)環(huán)化探針。在此類型的探針中，祀標(biāo)序列片段通過模板寡核巧酸來環(huán)化。祀 標(biāo)序列的末端可連接在一起，任選地在所述末端之間具有插入序列。祀標(biāo)環(huán)化探針描述于 W02008/033442(Stanford)中。EP1997909(源自 W099/49079)描述一種探針，所述探針具有 與界定5'祀標(biāo)序列和界定3'祀標(biāo)序列互補的兩個相鄰序列，W使得祀標(biāo)片段與探針的雜交 使祀標(biāo)末端放在一起W充當(dāng)祀標(biāo)末端連接的模板，從而使祀標(biāo)核酸環(huán)化。
[0054] d)選擇子探針，其為具有與祀標(biāo)序列的末端互補的一個或兩個突出末端的雙鏈選 擇子構(gòu)建體，所述探針雜交至祀標(biāo)序列并且連接至祀標(biāo)序列的每個末端，形成含有探針核 酸和祀標(biāo)序列的環(huán)形或線性連接產(chǎn)物。各種選擇子探針是已知的。選擇子描述于例如 W02005/111236(Dahl);W02011/009941(01 ink Genomics);W02011/067378(01 ink Genomics)和W02008/153492(Agilent)中。
[0055] e)0LA(寡核巧酸連接測定)探針。運些探針已經(jīng)描述用于SNP基因分型。每個探針 包括一對寡核巧酸，其雜交至祀標(biāo)序列的相鄰區(qū)域W使得一個寡核巧酸的5'末端相鄰于另 一個核巧酸的3'末端退火并且然后末端得W連接。OLA探針方法形式包括上游間隙填充聚 合(golden gate測定）或通過將額外寡核巧酸連接于兩個側(cè)接探針之間來進(jìn)行間隙填充 (DANSR 測定 Kgolden gate 測定描述于 Fan,J.B.等人 Highly parallel SNP genotyping.Cold Spring 化rb.Symp.Quant.Biol .68,69-78(2003)中。DANSR測定描述于 A.B.Sparks,E.T.Wang,C.A.Struble等人，Selective analysis of cell-free DNA in maternal blood for ev曰Iimtion of fet曰I trisomy,Prenat Di曰gn(2012)中。
[0056] 通常，用于本發(fā)明方法的所需探針是雜交至祀標(biāo)序列并且產(chǎn)生連接產(chǎn)物的探針， 其中連接產(chǎn)物的產(chǎn)生取決于探針與其祀標(biāo)序列的特異性雜交。運包括W上列出的所有示例 性探針。優(yōu)選地，連接產(chǎn)物是雙重連接產(chǎn)物(例如選擇子探針和串聯(lián)探針）。優(yōu)選地，連接產(chǎn) 物包括祀標(biāo)序列本身，例如當(dāng)祀標(biāo)序列是核酸物質(zhì)片段時，片段本身連接至探針并且因此 并入連接產(chǎn)物中。運允許通過將產(chǎn)物測序來驗證祀標(biāo)序列。連接產(chǎn)物可為環(huán)形或線性核酸， 但是對于環(huán)形產(chǎn)物(例如使用掛鎖探針、選擇子探針或祀標(biāo)環(huán)化探針)存在某些優(yōu)勢，諸如 克隆擴增并檢測滾環(huán)復(fù)制的產(chǎn)物的能力。
[0057] 因此，在一些情況下，用于本發(fā)明方法的探針具有一個或多個上述特征。
[0058] 本文描述可理想地用于本發(fā)明方法的探針的新設(shè)計。探針具有尤其合乎需要的特 征組合，包括(在各種實施方案中）所有上述屬性。運些新探針包括
[0059] 祀向寡核巧酸，其比所述祀標(biāo)片段更長并且含有內(nèi)部祀標(biāo)互補序列，W使得所述 祀向寡核巧酸與所述祀標(biāo)片段之間的雜交形成位于所述祀向寡核巧酸的上游和下游側(cè)接 序列之間的雙鏈序列，和
[0060] 分別具有自由5 '和3 '末端的頭部和尾部序列，其中頭部和尾部序列分別與上游和 下游側(cè)接序列互補。
[0061] 在用于退火和連接的條件下，頭部和尾部序列雜交至側(cè)接序列，并且祀標(biāo)片段，如 果存在，雜交至祀標(biāo)互補序列，從而將祀標(biāo)片段的末端與頭部序列的5'末端和尾部序列的 3'末端并置定位。頭部序列的5'末端和祀標(biāo)片段的3'末端雜交至祀向寡核巧酸的相鄰核巧 酸，并且尾部序列的3'末端和祀標(biāo)片段的5'末端雜交至祀向寡核巧酸的相鄰核巧酸。如果 祀標(biāo)片段存在，祀標(biāo)片段的3'末端連接至頭部序列的5'末端W形成第一連接接合處，并且 祀標(biāo)片段的5 '末端連接至尾部序列的3 '末端W形成第二連接接合處，從而產(chǎn)生雙重連接產(chǎn) 物，所述產(chǎn)物包括包含頭部和尾部序列和祀標(biāo)片段的連續(xù)核酸鏈。
[0062] 根據(jù)在本文中別處闡述的特定探針設(shè)計，雙重連接產(chǎn)物可為環(huán)形或線性。
[0063] 本文提供樣品分析方法。在某些實施方案中，所述方法包括:a)使包括片段化DNA 的樣品（例如，已經(jīng)通過限制酶來消化的樣品）與包括第一組探針的探針混合物雜交，其中 第一組探針的探針雜交至第一染色體中的不同位點（即，不同序列)并且在雜交至來自第一 染色體的DNA片段時，形成含有可連接相鄰接合處的非共價環(huán)形產(chǎn)物。在運種情況下，術(shù)語 "可連接相鄰"意指在兩個寡核巧酸之間沒有插入核巧酸并且其可使用連接酶來彼此連接。 運類探針的實例在W上和W下更詳細(xì)地描述。運類探針的實例在圖3和4中示例性說明。接 下來，如圖2中示出，所述方法包括:b)將可連接相鄰接合處連接在一起W產(chǎn)生多個共價環(huán) 形連接產(chǎn)物。因此，所述方法的下一個步驟包括:C)通過滾環(huán)擴增(RCA)來擴增共價環(huán)形連 接產(chǎn)物W產(chǎn)生多個RCA產(chǎn)物分子。然后，RCA產(chǎn)物可標(biāo)記并量化，從而提供對應(yīng)于樣品中的第 一染色體的DNA的量的估計值。環(huán)化產(chǎn)物提供用于檢測的顯著優(yōu)勢，因為其可通過滾環(huán)擴增 (RCA)來擴增。RCA產(chǎn)生單一分子中的環(huán)化產(chǎn)物的數(shù)百或數(shù)千個拷貝，從而有效地擴增環(huán)化 產(chǎn)物并且使得通過使用例如雜交至產(chǎn)物中的基元的標(biāo)記寡核巧酸來對所述產(chǎn)物個別地檢 測變得相對容易。量化來自個別RCA產(chǎn)物的信號是重要的，因為在許多應(yīng)用(例如，通過分析 無細(xì)胞DNA的非侵入性出生前診斷）中，對應(yīng)于具體染色體(例如，染色體21)的片段的數(shù)目 需要相當(dāng)精確地并且沒有偏差地確定。典型分析方法使用PCR，如熟知，所述PCR是非常容易 出現(xiàn)偏差的程序，因為一些序列W比其他序列高得多的效率擴增。運使得基于PCR的策略對 于許多診斷工作來說是不切實際的。
[0064] 圖8示出可如何量化滾環(huán)擴增產(chǎn)物。在此方法中，量化步驟可通過W下步驟來進(jìn) 行:將在步驟C)中產(chǎn)生的個別滾環(huán)擴增產(chǎn)物分子彼此分離，并且計數(shù)界定區(qū)域或體積中的 個別滾環(huán)擴增產(chǎn)物分子的數(shù)目。如圖8中示出，包括祀標(biāo)序列X和側(cè)接序列A和B的環(huán)化產(chǎn)物 22(由環(huán)化產(chǎn)物22a、22b、22c和22d組成)通過引物52擴增W產(chǎn)生一組RCA產(chǎn)物。然后，RCA產(chǎn) 物分布于表面上，并且RCA產(chǎn)物的數(shù)目可通過顯微術(shù)來直接計數(shù)，其中術(shù)語"分布"意指RCA 產(chǎn)物沉積于平面底物的表面上，并且允許擴散開。RCA產(chǎn)物不需要結(jié)合至底物，但是在某些 情況下其可(例如，經(jīng)由生物素等)來結(jié)合。
[0065] 在運些實施方案中，量化步驟可通過W下來進(jìn)行：i.使標(biāo)記寡核巧酸雜交至RCA產(chǎn) 物分子，其中標(biāo)記寡核巧酸雜交至在RCA產(chǎn)物中重復(fù)的序列，從而產(chǎn)生多個復(fù)合物，所述復(fù) 合物各自包括單一RCA產(chǎn)物和雜交至RCA產(chǎn)物的多個標(biāo)記寡核巧酸;和ii .計數(shù)在底物表面 上的界定區(qū)域中的標(biāo)記復(fù)合物的數(shù)目。如圖2中示出，在檢測時點，RCA產(chǎn)物是復(fù)合物的一部 分，所述復(fù)合物含有RCA產(chǎn)物本身、單一環(huán)化產(chǎn)物，和雜交至在RCA產(chǎn)物中重復(fù)的序列的多個 標(biāo)記寡核巧酸。
[0066] 如將認(rèn)識到，RCA產(chǎn)物可在其分布于底物上之前或之后標(biāo)記。因此，在運些實施方 案中，量化步驟可通過W下來進(jìn)行：（a)獲得包括分布在底物表面上的標(biāo)記復(fù)合物的底物； 和(b)計數(shù)存在于底物的第一區(qū)域中的RCA產(chǎn)物的數(shù)目。所述方法可多重執(zhí)行W使得其他環(huán) 狀產(chǎn)物可同時量化。舉例來說，用于方法的探針組可含有可區(qū)分序列（例如，染色體21探針 可含有第一序列并且染色體18探針可含有第二序列），并且由于那些探針的環(huán)化而制成的 不同組RCA產(chǎn)物可使用雜交至第一和第二序列的可區(qū)分標(biāo)記寡核巧酸來區(qū)分。
[0067] 在運些實施方案中，所述方法可包括：（a)獲得底物，所述底物包括分布在底物表 面上的第一和第二多個復(fù)合物，其中每個復(fù)合物包括單一 RCA產(chǎn)物和雜交至RCA產(chǎn)物的多個 標(biāo)記寡核巧酸探針，第一和第二多個復(fù)合物可區(qū)分地標(biāo)記，并且第一和第二多個復(fù)合物對 應(yīng)于不同染色體;并且(b)計數(shù)存在于底物的第一區(qū)域中的第一多個RCA產(chǎn)物的數(shù)目并且獨 立地計數(shù)第二多個RCA產(chǎn)物的數(shù)目。在此實施方案中，寡核巧酸可巧光標(biāo)記。適用于本發(fā)明 方法的合適可區(qū)分巧光標(biāo)記對包括切-3和切-5 (Amersham Inc. , Pisca1:away, NJ)、如asar 570和Quasar 670(Biosearch Technology,Novato CA)、Alexafluor555和Alexafluor647 (Molecular Probes,Eugene,OR)、B0DIPY V-1002和BODIPY V1005(Molecular Probes, Eugene,OR)、P0P0-3和T0T0-3(Molecular Probes,Eugene,OR)和P0PR03T0PR03(Molecular Probes,Eugene,OR)。其他合適可區(qū)分可檢測標(biāo)記可見于Kricka等人（Ann Clin Biochem.39:114-29,2002)。
[0068] 在一些實施方案中，樣品可含有基因組DNA的片段，例如，實際上任何生物體的基 因組DNA，包括但不限于植物、動物(例如爬行動物、哺乳動物、昆蟲、蠕蟲、魚等）、組織樣品、 細(xì)菌、真菌(例如酵母）、隧菌體、病毒、尸體組織、考古學(xué)/古代樣品等。在某些實施方案中， 用于所述方法的基因組DNA可來自哺乳動物，其中在某些實施方案中哺乳動物是人。在示例 性實施方案中，基因組樣品可含有來自哺乳動物細(xì)胞，諸如，人、小鼠、大鼠或猴細(xì)胞的基因 組DNA。樣品可從培養(yǎng)細(xì)胞或臨床樣品的細(xì)胞，例如，組織活檢、伊刮物或灌洗物或法醫(yī)學(xué)樣 品的細(xì)胞（即，在犯罪現(xiàn)場收集的樣品的細(xì)胞)制成。在具體實施方案中，核酸樣品可從生物 樣品例如細(xì)胞、組織、體液和糞便中獲得。所關(guān)注的體液包括但不限于血液、血清、血漿、唾 液、粘液、粘疲、腦脊髓液、胸膜液、眼淚、乳腺管流體、淋己、疲、腦脊液、滑液、尿液、羊水和 精液。在具體實施方案中，樣品可從受試者，例如，人獲得。在一些實施方案中，所分析的樣 品可為從血液，例如，懷孕雌性的血液獲得的無細(xì)胞DNA的樣品。在某些實施方案中，基因組 DNA可在片段化之前例如使用全基因組擴增方法來擴增。樣品可含有微生物DNA，例如，來自 病毒或細(xì)菌的基因組的DNA。
[0069] 在任何實施方案中，探針混合物可包括第二組探針，其中第二組探針的探針雜交 至第二染色體中的不同位點并且在雜交至來自第二染色體的DNA片段時，形成含有可連接 相鄰接合處的非共價環(huán)形產(chǎn)物。在此方法中，量化步驟可包括個別地量化對應(yīng)于第一和第 二染色體的滾環(huán)擴增產(chǎn)物分子的數(shù)目，從而提供對應(yīng)于樣品中的第一和第二染色體的DNA 的相對量的估計值。如W上提及，對應(yīng)于第一和第二染色體的RCA產(chǎn)物可通過將可區(qū)分標(biāo)記 寡核巧酸與其雜交并且將其分布在載體例如顯微鏡用載玻片的表面上來個別地量化。
[0070] 所述方法也可用于檢查亞染色體區(qū)域。在運些實施方案中，第一組探針可雜交至 染色體的第一區(qū)域中的不同位點。在運些實施方案中，探針混合物可包括第二組探針，其中 第二組探針的探針雜交至第一染色體中的第二區(qū)域中的不同位點并且在雜交至來自第二 染色體的DNA片段時，形成含有可連接相鄰接合處的非共價環(huán)形產(chǎn)物。在此方法中，量化步 驟可包括個別地量化對應(yīng)于第一染色體的第一和第二區(qū)域的滾環(huán)擴增產(chǎn)物分子的數(shù)目，從 而提供對應(yīng)于樣品中的染色體的第一和第二區(qū)域的DNA的相對量的估計值。如W上提及，對 應(yīng)于第一和第二染色體的RCA產(chǎn)物可通過將可區(qū)分標(biāo)記寡核巧酸與其雜交并且將其分布在 載體例如顯微鏡用載玻片的表面上來個別地量化。
[0071] 對于非侵入性出生前測試實施方案，祀標(biāo)片段可來自例如人染色體21、13或18,但 是可檢查其他染色體異常(例如，其他=體性，或具體區(qū)域的缺失或插入）?？截悢?shù)變化是對 應(yīng)于在某些染色體上缺失或擴增的相對較大基因組區(qū)域的基因組DNA的改變。CNV可由基因 組重排諸如缺失、復(fù)制、倒轉(zhuǎn)和易位導(dǎo)致?？截悢?shù)變化已經(jīng)與各種形式的癌癥(Cappuzzo F， Hirsch,等人（2005)97(9) :643-655)神經(jīng)病癥（Sebat J.，等人（2007)Science 316(5823): 445-9,包括自閉癥（Sebat, J.，等人（2007)Science 316(5823) :445-9)，和精神分裂癥St Clair D(2008).ScMzophr Bull 35(1) :9-12相關(guān)聯(lián)。檢測特定細(xì)胞群體中的所關(guān)注染色 體或其一部分的拷貝數(shù)變體可為識別疾病或病癥的遺傳診斷或預(yù)后指標(biāo)的強有力工具。在 一些實施方案中，第一染色體是染色體21并且第二染色體選自染色體13和染色體18。
[0072] 在任何實施方案中，每個非共價環(huán)形產(chǎn)物包括來自樣品的DNA片段。在圖3和4示出 的實行方案中，用于所述方法的探針可包括:i.頭部序列和尾部序列，其中頭部和尾部序列 在第一寡核巧酸分子的末端;和ii .夾持序列，其依序包括:與頭部序列互補的上游側(cè)接序 列；與祀標(biāo)片段互補的祀標(biāo)互補序列;和與尾部序列互補的下游側(cè)接序列。在運些實施方案 中，在非共價環(huán)形產(chǎn)物中，祀標(biāo)片段的末端可連接地相鄰于第一寡核巧酸分子中的頭部和 尾部序列的末端。在運些實施方案中，夾持序列可在第一寡核巧酸分子中?；蛘?，夾持序列 可在第二寡核巧酸分子中。
[0073] 在一些實施方案中，所述方法包括使樣品與一組至少50種(例如，至少100種、至少 200種、至少500種、至少1，000種、至少2,000種或至少5,000種)所述探針雜交，其中所述探 針祀向相同染色體(例如，人染色體21、13或18)上的不同片段，并且其中所述方法產(chǎn)生包括 祀標(biāo)片段的多個環(huán)狀產(chǎn)物。所產(chǎn)生的環(huán)狀產(chǎn)物的數(shù)目可例如通過使用RCA將其擴增并且計 數(shù)RCA產(chǎn)物的數(shù)目來量化，如上所述。
【附圖說明】
[0074] 熟練技術(shù)人員將理解，W下所述附圖僅出于說明目的。運些附圖并非想要W任何 方式來限制本教導(dǎo)的范圍。
[0075] 圖1示意性地示出本發(fā)明方法的一個實施方案，其中所關(guān)注的DNA祀標(biāo)物質(zhì)與多個 標(biāo)記線性探針接觸并且檢測來自結(jié)合標(biāo)記的累積信號。
[0076] 圖2示意性地示出本發(fā)明方法的一個實施方案，其中所關(guān)注的DNA祀標(biāo)物質(zhì)與通過 滾環(huán)擴增來克隆擴增的多個環(huán)化探針接觸并且檢測擴增產(chǎn)物的累積信號。
[0077] 圖3示出包括結(jié)合至其祀標(biāo)片段的環(huán)化骨架寡核巧酸的探針。探針W兩種形式A和 B示出。
[0078] 圖4示出具有結(jié)合祀標(biāo)片段的環(huán)化單一寡核巧酸探針。
[0079] 圖5示出具有結(jié)合祀標(biāo)片段的由祀向寡核巧酸和環(huán)狀骨架寡核巧酸組成的環(huán)化雙 環(huán)探針。
[0080] 圖6示出具有結(jié)合祀標(biāo)片段的由祀向寡核巧酸和線性骨架寡核巧酸組成的線性環(huán) 狀探針。
[0081] 圖7示出具有結(jié)合祀標(biāo)片段的包括兩個骨架寡核巧酸的線性探針。
[0082] 圖8示出可藉W計數(shù)RCA產(chǎn)物的方法。
[0083] 圖9是展示本文所述方法的特異性的凝膠圖像。
[0084] 圖10是展示本文所述方法的精確度的圖表。
[0085] 圖11圖A示出載玻片表面上的標(biāo)記RCA產(chǎn)物的圖像；圖B示出可如何通過計數(shù)個別 RCA產(chǎn)物來精確地確定來自不同染色體的片段的比率。
[0086] 詳述
[0087] 祀標(biāo)序列的多重識別
[0088] 待檢測或量化的核酸物質(zhì)包括多個祀標(biāo)序列。運些祀標(biāo)序列彼此不同。因此，其代 表核酸上的空間不同位置，但是其可重疊。給定核酸物質(zhì)內(nèi)的祀標(biāo)序列可重疊、不重疊，或 可為重疊和不重疊祀標(biāo)序列的混合物。優(yōu)選地祀標(biāo)序列不重疊。事實上，核酸物質(zhì)的一組祀 標(biāo)序列代表用于檢測同一核酸物質(zhì)的不同表位。
[0089] 通常在核酸中存在至少10種、至少100種、至少1，000種或至少10,000種不同祀標(biāo) 序列，并且運些序列中的每一種可探測。
[0090] 探針的合適濃度可基于樣品中的核酸物質(zhì)的濃度(或預(yù)期濃度)來確定。如在實施 例中示出，探針可W每個探針I(yè)OpM的濃度添加至樣品。當(dāng)樣品與多個探針(例如一組探針） 接觸時，個別探針的濃度可為lOpM。優(yōu)選地，探針在超過待檢測或量化的所關(guān)注核酸物質(zhì)的 預(yù)期濃度的濃度下使用。使用過量探針確保存在于樣品中的祀標(biāo)序列的所有拷貝得W識 另IJ。運最大程度地增強檢測的靈敏度。另外，當(dāng)方法設(shè)及量化時，確保檢測來自一組探針的 連接產(chǎn)物或累積信號與樣品中的祀標(biāo)序列的數(shù)量成比例。
[0091] 當(dāng)一種核酸物質(zhì)相對于另一種核酸物質(zhì)量化時，祀標(biāo)序列是對所述核酸物質(zhì)有特 異性的，即，未發(fā)現(xiàn)于另一種核酸物質(zhì)中，并且優(yōu)選地未發(fā)現(xiàn)于可存在于樣品中的任何其他 核酸物質(zhì)中。
[0092] 在許多診斷和其他應(yīng)用中，核酸物質(zhì)是染色體或染色體基因座，例如，人染色體或 染色體基因座。因此，每個祀標(biāo)序列片段可為對生物體的基因組的運一種染色體有特異性 的。換句話說，它只可發(fā)現(xiàn)于基因組的一種染色體中并且未發(fā)現(xiàn)于此基因組的其他染色體 中。通常，本發(fā)明方法用于分析人基因組，在此情況下祀標(biāo)序列可為對一種人染色體有特異 性的片段，即，發(fā)現(xiàn)于運種染色體中并且未發(fā)現(xiàn)于其他人染色體中。舉例來說，祀標(biāo)序列可 為對染色體21有特異性的。祀標(biāo)序列可為對染色體的一個基因座有特異性的。因此，其可在 運個染色體基因座中發(fā)現(xiàn)并且未發(fā)現(xiàn)于同一染色體的其他基因座中或同一基因組的其他 染色體中。舉例來說，祀標(biāo)序列可為對人染色體的一個基因座有特異性的。
[0093] 樣品中的給定核酸物質(zhì)可包括一些變化性，例如樣品可包括不同個體的染色體， 諸如從含有母體DNA和胎兒DNA的母體血液獲得的核酸。在此處，所關(guān)注物質(zhì)可為具體染色 體，但是不論來自胎兒或母體，檢測運種染色體的所有拷貝是便利的。因此，所關(guān)注物質(zhì)可 為一種染色體或染色體基因座，并且祀標(biāo)序列在染色體或染色體基因座的母體和胎兒拷貝 中發(fā)現(xiàn)于運種染色體或基因座中。
[0094] 核酸物質(zhì)可為片段化的。祀標(biāo)序列可為核酸物質(zhì)的片段的序列，即，祀標(biāo)片段。 [00M]優(yōu)選地，祀標(biāo)序列是其序列預(yù)先界定的片段。包括末端的整個片段的序列可為已 知的。預(yù)先界定序列的已知片段可通過核酸物質(zhì)的特定，而非隨機，片段化來產(chǎn)生。具體片 段化方法包括用限制酶消化、PCR(例如，多重PCR)，和序列引導(dǎo)片段末端界定的其他方法， 包括其他酶、核酶或運些技術(shù)的組合。
[0096] 優(yōu)選片段化方法是用限制性核酸內(nèi)切酶或兩種或更多種限制性核酸內(nèi)切酶的組 合來消化。因此，樣品可為核酸的限制酶消化物并且祀標(biāo)序列可為限制片段。
[0097] 各種特定核酸裂解酶是已知的并且任何合適酶可用于本發(fā)明方法中，包括在特定 核酸序列內(nèi)的預(yù)先界定位置處裂解的酶，或在特定核酸識別序列之后或之前裂解的核酸內(nèi) 切酶和切口酶(側(cè)切酶）。催化核酸，諸如核酶，也可用于DNA片段化。酶可裂解雙鏈核酸W產(chǎn) 生純圓末端或粘性末端，或可裂解單一核酸鏈。各種類型限制酶是已知的，包括I型、II型、 III型、IV型和V型。合適酶或酶的組合可根據(jù)需要選擇用于本發(fā)明方法。舉例來說，樣品中 的核酸(例如IOng的DNA)可用相應(yīng)相容限制酶緩沖液中的限制酶(例如1U)來消化。反應(yīng)可 在合適條件下解育(例如37°C歷時1小時），隨后酶去活(例如在80°C下20分鐘）。
[0098] 另一種提供片段化核酸的便利方法是使用引物來從核酸物質(zhì)擴增特定線性序列。 可使用多重PCR，用多個特定引物對處理核酸W擴增多個特定片段。在此情況下，祀標(biāo)序列 的末端對應(yīng)于引物對的序列。
[0099] 核酸樣品可W任何合適方式提供，例如W來自患者的生物組織或流體的樣品形 式。樣品可為血液樣品、全血、血漿或血清、組織樣品，例如福爾馬林固定石蠟包埋組織樣 品，或可為從血液或組織提取的核酸樣品。
[0100] 樣品可為含有核酸的任何樣品。包含于樣品中的核酸可為DNA和/或RNA。樣品可為 復(fù)合物，例如來自完整生物體、組織或細(xì)胞群體的全基因組DNA或cDNA，或其部分。在運方 面，它可為例如核酸分離程序或細(xì)胞溶解程序的直接產(chǎn)物，或它可W某種方式來進(jìn)一步分 級或純化，例如它可含有核酸，所述核酸已經(jīng)W某種方式部分或完全分離，或W任何方式處 理，例如經(jīng)由RNA來產(chǎn)生cDNA。樣品可來自任何真核或原核或病毒來源，例如可為微生物(例 如細(xì)菌或真菌）、植物或動物。因此，例如，待檢測或量化的核酸物質(zhì)可為微生物DNA。優(yōu)選地 樣品來自人，例如，人基因組DNA。樣品可為來自動物的組織或血液樣品，其中待檢測的核酸 是微生物，例如，細(xì)菌、病毒或真菌的核酸。對于許多診斷和其他應(yīng)用，樣品是片段化染色體 (例如，人染色體或微生物染色體)的樣品。對于關(guān)于非侵入性出生前診斷的方法，樣品來源 于孕婦的血液并且包括胎兒DNA。在其他實例中，待檢測或量化的核酸是腫瘤相關(guān)DNA。
[0101] 樣品中的給定核酸物質(zhì)可包括一些變化性，例如樣品可包括不同個體的染色體， 諸如從含有母體DNA和胎兒DNA的母體血液獲得的核酸。在此處，所關(guān)注物質(zhì)可為具體染色 體，但是不論來自胎兒或母體，檢測運種染色體的所有拷貝是便利的。因此，所關(guān)注物質(zhì)可 為一種染色體或染色體基因座，并且祀標(biāo)序列在染色體或染色體基因座的母體和胎兒拷貝 中從運種染色體或基因座獲得。
[0102] 本發(fā)明方法可在體外對于樣品執(zhí)行。因此，方法總體上不包括在體內(nèi)對于人類或 動物身體執(zhí)行的診斷或通過手術(shù)或療法來治療人類或動物身體的方法。然而，體外診斷方 法的結(jié)果可用于為隨后治療患者提供信息。
[0103] 使祀標(biāo)核酸變性
[0104] 探針經(jīng)由雜交W至少部分單鏈形式來識別并結(jié)合至祀標(biāo)序列。對于探針的一些設(shè) 計，祀標(biāo)序列應(yīng)為完全單鏈，尤其雜交至全長祀標(biāo)序列的那些探針。對于其他探針，例如，雜 交至祀標(biāo)序列的唯一區(qū)域的探針，只需要部分單鏈祀標(biāo)核酸。因此，應(yīng)提供合適條件來使祀 標(biāo)序列的結(jié)合位點暴露于探針，取決于所使用的探針的類型。
[0105] 如果樣品中的祀標(biāo)序列還不是單鏈或至少部分單鏈，應(yīng)提供條件W使單鏈祀標(biāo)序 列與其互補核酸鏈分離。運類條件可為變性條件或在一些情況下用外切核酸酶處理。
[0106] 變性條件可為將祀標(biāo)序列與其互補序列分離的足夠高溫度。變性條件可為在95°C 下解育歷時合適時間，例如10分鐘?；蛘呖蓤?zhí)行化學(xué)變性。
[0107] 互補性和雜交
[0108] 探針與其祀標(biāo)序列之間的特異性結(jié)合是本發(fā)明方法的重要特征。探針優(yōu)選地包括 識別祀標(biāo)序列的單一祀標(biāo)互補序列。然而，如例如掛鎖探針和選擇子探針例示，探針可包括 與祀標(biāo)序列的不同區(qū)域互補的多個序列。
[0109] 如果探針包括作為祀標(biāo)序列或祀標(biāo)序列區(qū)域的精確互補序列的祀標(biāo)互補序列，W 使得在探針與祀標(biāo)序列之間存在完全雜交，那么獲得對于祀標(biāo)序列的最大特異性。然而，此 并非在所有情況下是必需的，并且例如當(dāng)不論存在于樣品中的確切等位基因為何，需要檢 測祀標(biāo)序列時，可接受較小程度的錯配，W允許檢測展現(xiàn)等位基因變化的序列?；蛘?，可對 于變體序列來設(shè)計多個探針。運可實現(xiàn)不同等位基因或突變的檢測和辨別。設(shè)想大部分探 針具有對于其祀標(biāo)序列的完全互補性，但是一些探針可結(jié)合具有輕微錯配的祀標(biāo)。
[0110] 在一些實施方案中，用于本發(fā)明方法的探針各自包括祀標(biāo)互補序列，所述序列具 有與祀標(biāo)序列或祀標(biāo)序列區(qū)域少于5個堿基對錯配。祀標(biāo)序列或區(qū)域與祀標(biāo)互補序列之間 可任選地存在一個、兩個、=個或四個堿基對錯配。錯配可為從一個序列中缺失相應(yīng)堿基的 點，W使得互補序列在錯配點處形成環(huán)，或可在非互補核巧酸存在于一個序列中并且因此 未與另一個序列的相應(yīng)位置處的堿基配對時發(fā)生。當(dāng)存在不正確的堿基配對，即，A或T與C 或G配對時，氨鍵合不出現(xiàn)于兩個鏈的堿基之間，但是由于在錯配附近的核巧酸之間的堿基 配對，因此雜交仍然在祀標(biāo)序列與祀向寡核巧酸的祀標(biāo)互補序列之間發(fā)生。錯配可為擺動 堿基。擺動堿基通常對應(yīng)于與祀標(biāo)片段中的已知遺傳性變異位置配對的祀標(biāo)互補序列位 置。探針可通過在擺動堿基位置的特定合成周期期間添加一個或多個雙脫氧核巧酸來合 成。對于傳統(tǒng)寡核巧酸合成來說，通常是運種情況?；蛘呖僧a(chǎn)生多個單獨探針，一個探針針 對每個遺傳性變型。如果探針使用基于微陣列的合成來合成，通常是運種情況。擺動堿基可 對應(yīng)于密碼子之間的單一核巧酸差異，其中不同密碼子編碼相同氨基酸。
[0111] 通常，與較短祀標(biāo)互補序列相比，用于雜交較長祀標(biāo)序列或其區(qū)域的較長祀標(biāo)互 補序列可耐受較高數(shù)目的錯配。祀標(biāo)互補序列可例如具有與祀標(biāo)序列或其區(qū)域至多8個中1 個、9個中1個或10個中1個堿基對錯配。任何運些錯配應(yīng)限于祀標(biāo)互補序列和祀標(biāo)序列或區(qū) 域的內(nèi)部區(qū)域，W使得其不抑制連接或例如通過限制酶消化的序列特異性祀標(biāo)片段化。因 此，優(yōu)選地在終端6至8個核巧酸中，優(yōu)選地在祀標(biāo)序列的每個末端的終端10個核巧酸中，存 在祀標(biāo)序列與祀標(biāo)互補序列之間的完全互補。
[0112] 優(yōu)選地，探針包括與祀標(biāo)序列相同長度的單一祀標(biāo)互補序列。因此，全長祀標(biāo)序列 由祀標(biāo)互補序列結(jié)合。祀標(biāo)序列雜交至祀向寡核巧酸代表兩個核酸分子之間的單一結(jié)合事 件，與結(jié)合至祀標(biāo)分子的兩個末端或祀標(biāo)的兩個非相鄰區(qū)域的探針形成對比。
[0113] 祀標(biāo)互補序列可具有至少10個核巧酸的長度，例如至少15個核巧酸。它可多達(dá)20、 25、30、35或40個核巧酸長。優(yōu)選范圍包括10-20個核巧酸、10-30個核巧酸，和10-40個核巧 酸。運些相對短祀標(biāo)互補序列適合于結(jié)合相應(yīng)地短祀標(biāo)序列。短序列有助于雙重連接反應(yīng) 的特異性，因為DNA連接酶對于堿基對錯配敏感并且優(yōu)先連接完全匹配的序列。當(dāng)錯配存在 于結(jié)合至雙鏈序列的DNA連接酶的足跡中時，序列可能無法連接，從而提供額外校對步驟， 確保優(yōu)先于不同但是類似序列的序列來檢測祀標(biāo)序列的較高特異性。DNA連接酶通常在切 口的每一側(cè)具有6至8個堿基的足跡。因此，如果祀標(biāo)序列是20個堿基，那么12至16個堿基由 連接酶特異性涵蓋。
[0114] 探針雜交排斥尤其在雜交序列的中屯、部分的錯配，而連接排斥祀標(biāo)末端的錯配。 運種情況共同產(chǎn)生高度特異性檢測。
[0115] 如在本文中別處更詳細(xì)地描述，探針優(yōu)選地包括：
[0116] 祀向寡核巧酸，其比祀標(biāo)序列更長并且含有內(nèi)部祀標(biāo)互補序列，W使得祀向寡核 巧酸與祀標(biāo)序列之間的雜交形成位于祀向寡核巧酸的上游和下游側(cè)接序列之間的雙鏈序 列，和
[0117] 分別具有自由5'和3'末端的頭部和尾部序列，其中頭部和尾部序列分別與上游和 下游側(cè)接序列互補。
[0118] 當(dāng)將核酸物質(zhì)片段化并且祀標(biāo)序列是界定序列的片段時，運些探針尤其適合于使 用。祀向寡核巧酸比祀標(biāo)序列更長，因為它包括側(cè)接序列W及祀標(biāo)互補序列。上游側(cè)接區(qū)域 是祀向寡核巧酸中的祀標(biāo)互補序列的上游或5'。下游側(cè)接區(qū)域是祀向寡核巧酸中的祀標(biāo)互 補序列的下游或3'。因此，祀標(biāo)互補序列在祀向寡核巧酸內(nèi)部并且不包括祀向寡核巧酸的 末端，因為它由上游和下游側(cè)接序列來側(cè)接。
[0119] 通過祀標(biāo)序列與祀標(biāo)互補序列的雜交所產(chǎn)生的雙鏈序列可被認(rèn)為是混合雙鏈序 列，因為它是祀標(biāo)與探針的混合物。典型地雙鏈序列采用雙螺旋構(gòu)象，其中祀標(biāo)序列是一個 鏈并且祀向寡核巧酸是雙螺旋的另一個鏈?；旌想p鏈序列由祀向寡核巧酸的上游和下游側(cè) 接序列側(cè)接，所述側(cè)接序列進(jìn)而雜交至頭部和尾部序列W產(chǎn)生雙鏈序列。另外，運些序列通 常采取雙鏈核酸的正常雙螺旋構(gòu)象。
[0120] 上游和下游側(cè)接序列優(yōu)選地彼此不同，即，優(yōu)選地具有不同序列。優(yōu)選地，頭部序 列與上游側(cè)接序列但是不與下游側(cè)接序列互補，并且尾部序列與下游側(cè)接序列但是不與上 游側(cè)接序列互補。運確保頭部和尾部序列只分別雜交至上游和下游側(cè)接序列。
[0121] 頭部序列通常與上游側(cè)接序列相同長度。尾部序列通常與下游側(cè)接序列相同長 度。
[0122] 側(cè)接序列的正常長度在10與40個核巧酸之間，例如10-20個或10-30個核巧酸。側(cè) 接序列可為彼此相同長度。一個或兩個側(cè)接序列可與祀標(biāo)互補序列相同長度。因此，上游 和/或下游側(cè)接序列可具有至少10個核巧酸，例如至少15個核巧酸的長度。它可多達(dá)20、25、 30、35或40個核巧酸長。
[0123] 優(yōu)選地，頭部序列是上游序列的互補序列。優(yōu)選地，尾部序列是下游序列的互補序 列。序列的完全匹配對于探針的最優(yōu)結(jié)合是合乎需要的W使得頭部和尾部序列正確定位W 便連接至祀標(biāo)序列。然而，任選地，可在頭部序列與上游側(cè)接序列之間，和/或在尾部序列與 下游側(cè)接序列之間存在一個、兩個=個或四個堿基對錯配。優(yōu)選地，存在少于5個堿基對錯 配。
[0124] 除了祀標(biāo)互補序列W外，探針通常應(yīng)不與祀標(biāo)序列或可存在于樣品中的其他核酸 互補。運避免探針不必要地雜交至除了祀標(biāo)W外的核酸。因此，如果探針用于結(jié)合人基因組 DNA的序列，那么探針可被設(shè)計成使得除了祀標(biāo)互補序列W外的序列不與人基因組DNA互 補，W使得探針只雜交至祀標(biāo)序列并且不雜交至樣品中的其他核酸。
[0125] 探針可包括一或多個定制序列。定制序列不與探針的其他區(qū)域或祀標(biāo)序列互補， 換句話說它在退火條件下不雜交至探針的其他區(qū)域(在定制序列外部)或祀標(biāo)序列。定制序 列可用于檢測，例如作為條形碼或標(biāo)記來識別屬于一組的探針，如本文中別處描述。
[01%] 產(chǎn)生連接產(chǎn)物
[0127] 在用于退火和連接的條件下，探針雜交至其祀標(biāo)序列并且連接W產(chǎn)生連接產(chǎn)物。 每個探針的雜交導(dǎo)致產(chǎn)生連接產(chǎn)物。因此，連接產(chǎn)物的產(chǎn)生取決于探針與其祀標(biāo)序列的特 異性雜交。
[0128] 連接產(chǎn)物可包括或由探針核酸或祀標(biāo)核酸組成，或可包括探針和祀標(biāo)核酸。連接 產(chǎn)物包括通過核酸的5 '末端連接至核酸的3 '末端所形成的連接接合處。當(dāng)多個核酸連接在 一起時，可存在兩個連接接合處。
[0129] 所形成的連接產(chǎn)物的類型取決于所使用的探針的類型。連接產(chǎn)物可為核酸環(huán)或可 為線性核酸分子。
[0130] 形成環(huán)形連接產(chǎn)物的探針的實例是掛鎖探針。各種類型的掛鎖探針是已知的，例 如標(biāo)準(zhǔn)、間隙填充、分子倒轉(zhuǎn)探針(MIP)。掛鎖探針是在末端具有祀標(biāo)互補序列并且在其之 間具有非祀標(biāo)互補序列的線性寡核巧酸。在用于退火和連接的條件下，祀標(biāo)互補序列頭部 對尾部地放在一起W便雜交至祀標(biāo)序列的相鄰區(qū)域并且連接形成核酸環(huán)。因此，探針通過 雜交至祀標(biāo)序列來環(huán)化，并且連接產(chǎn)物是探針核酸環(huán)。環(huán)形連接產(chǎn)物通常含有其中線性探 針的5'和3'末端連接在一起的一個連接接合處。包含變化的橋連寡核巧酸和間隙填充探針 是已知的。探針可含有探針骨架中的裂解位點，從而允許環(huán)化連接產(chǎn)物裂解W形成線性產(chǎn) 物，然后其可擴增并檢測(MIP)。
[0131] 優(yōu)選地，探針雜交至祀標(biāo)序列將探針的寡核巧酸定位W便連接至祀標(biāo)序列。相應(yīng) 地，祀標(biāo)序列可并入連接產(chǎn)物中。運是超過探針諸如掛鎖探針的優(yōu)勢，因為它允許通過將連 接產(chǎn)物測序來驗證祀標(biāo)序列。優(yōu)選地，探針連接至其祀標(biāo)序列的每個末端，從而在祀標(biāo)序列 的每個末端形成連接接合處。在運些方法中，待檢測或量化的核酸物質(zhì)優(yōu)選地片段化W產(chǎn) 生對應(yīng)于祀標(biāo)序列的祀標(biāo)片段。然后，祀標(biāo)片段的末端可連接至探針的末端，從而將祀標(biāo)序 列捕獲于連接產(chǎn)物內(nèi)。在運些情況下，祀標(biāo)片段在高度特異性反應(yīng)中在兩個末端處連接。由 于祀標(biāo)片段通常是核酸的特異性片段化的產(chǎn)物，因此運些末端通常具有特異性、預(yù)先確定 的序列。在連接步驟中，運些末端通過與序列相關(guān)地分別連接至頭部和尾部序列來特異性 檢測。優(yōu)選地，祀標(biāo)片段結(jié)合至探針產(chǎn)生兩個完全匹配的可連接接合處，一個在祀標(biāo)片段的 3'末端與頭部序列的5'末端之間并且一個在祀標(biāo)片段的5'末端與尾部序列的3'末端之間。
[0132] 核酸的5'末端連接至核酸的3'末端可在兩個末端與互補序列的相鄰核巧酸堿基 配對時發(fā)生。相應(yīng)末端核巧酸與相鄰核巧酸的堿基配對形成在兩個末端之間含有切口的核 酸鏈。兩個末端的連接可通過DNA連接酶來催化。因此，提供用于連接的條件通常包括提供 DNA連接酶和反應(yīng)條件，在所述反應(yīng)條件下DNA連接酶將兩個末端連接W形成連續(xù)核酸鏈， 從而封閉切口。許多連接酶可購得，諸如Ampligase巧picentre)，其合適條件是添加IU酶并 且在55 °C下在連接酶緩沖液中解育1小時。
[0133] 產(chǎn)生并入祀標(biāo)序列的連接產(chǎn)物的探針的實例是選擇子探針。運些探針是具有與祀 標(biāo)序列的末端互補的一個或兩個突出末端的雙鏈選擇子構(gòu)建體，所述探針雜交至祀標(biāo)序列 并且連接至祀標(biāo)序列的每個末端，形成含有探針核酸和祀標(biāo)序列的環(huán)形或線性連接產(chǎn)物。 在用于退火和連接的條件下，選擇子的末端序列雜交至片段的末端序列并且連接至選擇 子。當(dāng)探針包括各自具有突出末端的一對選擇子構(gòu)建體時，每個突出末端可連接至祀標(biāo)片 段的一個末端W使得連接產(chǎn)物是在兩個探針序列之間包括祀標(biāo)序列的線性核酸。當(dāng)探針包 括具有兩個突出末端的單一選擇子構(gòu)建體時，它可連接至祀標(biāo)片段的每個末端W使得連接 產(chǎn)物是包括祀標(biāo)序列和探針核酸的環(huán)形核酸。在兩種情況下，連接產(chǎn)物包括兩個連接接合 處。
[0134] 合適探針的許多其他實例在本文中別處描述。
[0135] 在一些實施方案中，本發(fā)明方法可使用包括W下的探針：
[0136] 祀向寡核巧酸，其比所述祀標(biāo)片段更長并且含有內(nèi)部祀標(biāo)互補序列，W使得所述 祀向寡核巧酸與所述祀標(biāo)片段之間的雜交形成位于所述祀向寡核巧酸的上游和下游側(cè)接 序列之間的雙鏈序列，和
[0137] 分別具有自由5'和3'末端的頭部和尾部序列，其中頭部和尾部序列分別與上游和 下游側(cè)接序列互補，其中
[0138] 在用于退火和連接的條件下，頭部和尾部序列雜交至側(cè)接序列，并且祀標(biāo)片段，如 果存在，雜交至祀標(biāo)互補序列，從而將祀標(biāo)片段的末端與頭部序列的5'末端和尾部序列的 3'末端并置定位，其中祀標(biāo)片段的3'末端連接至頭部序列的5'末端W形成第一連接接合 處，并且祀標(biāo)片段的5'末端連接至尾部序列的3'末端W形成第二連接接合處，從而產(chǎn)生雙 重連接產(chǎn)物，所述產(chǎn)物包括包含頭部和尾部序列和祀標(biāo)片段的連續(xù)核酸鏈。
[0139] 在運些探針中，由于祀標(biāo)互補序列定位于側(cè)接序列之間，因此祀向寡核巧酸充當(dāng) 祀標(biāo)片段連接至頭部和尾部序列的模板。在祀標(biāo)片段存在下的退火條件下，頭部和尾部序 列雜交至側(cè)接序列，從而界定頭部序列的5'末端與尾部序列的3'末端之間的間隙。祀標(biāo)片 段雜交至間隙中的祀標(biāo)互補序列。因此，頭部和尾部序列和祀標(biāo)片段雜交至祀向寡核巧酸 將祀標(biāo)片段的3 '末端與頭部序列的5 '末端并置定位，并且將祀標(biāo)片段的5 '末端與尾部序列 的3'末端并置定位。
[0140] 將兩個末端并置定位提供DNA連接酶將末端連接在一起的底物。優(yōu)選地，頭部序列 的5'末端和祀標(biāo)片段的3'末端雜交至祀向寡核巧酸的相鄰核巧酸，并且尾部序列的3'末端 和祀標(biāo)片段的5'末端雜交至祀向寡核巧酸的相鄰核巧酸。因此，上游側(cè)接序列可直接相鄰 于祀標(biāo)互補序列，而沒有插入核巧酸。類似地，下游側(cè)接序列可直接相鄰于祀標(biāo)互補序列， 而沒有插入核巧酸。相鄰3 '和5 '末端可通過DNA連接酶來直接連接，所述連接酶密封其之間 的切口 W形成連續(xù)核酸鏈。
[0141] 雙重連接產(chǎn)物，即，將頭部序列和尾部序列連接至祀標(biāo)片段的產(chǎn)物是連續(xù)核酸鏈。 它在它不含有切口或間隙的意義上是連續(xù)的，因此鏈中的所有核巧酸共價接合。
[0142] 探針可被設(shè)計成使得包含頭部和尾部序列和祀標(biāo)片段的連續(xù)核酸鏈?zhǔn)呛怂岘h(huán)。術(shù) 語環(huán)在此是指作為封閉環(huán)，而沒有自由末端的鏈的拓?fù)鋵W(xué)。
[0143] 在祀標(biāo)片段存在下的退火條件下，頭部和尾部序列雜交至側(cè)接序列，從而界定頭 部序列的5'末端與尾部序列的3'末端之間的間隙。祀標(biāo)片段雜交至間隙中的祀標(biāo)互補序 列，從而將祀標(biāo)片段的末端與頭部序列的5'末端和尾部序列的3'末端并置定位，并且完成 包括祀標(biāo)片段和頭部和尾部序列的核酸環(huán)。
[0144] 形成環(huán)的核酸分子使其末端并置。末端的連接產(chǎn)生包括至少頭部和尾部序列和祀 標(biāo)片段的連續(xù)環(huán)形核酸鏈。
[0145] 形成核酸環(huán)的探針包括其中頭部和尾部序列提供于單一核酸分子上的探針。舉例 來說，除了祀向寡核巧酸W外，探針可包括在其5'末端3'末端分別具有頭部和尾部序列的 骨架寡核巧酸，其中在退火條件下，骨架寡核巧酸的頭部和尾部序列反式結(jié)合至祀向寡核 巧酸的側(cè)接序列。骨架寡核巧酸可包括頭部與尾部序列之間的定制序列。圖3示出運類探針 的實施方案。或者，骨架寡核巧酸的頭部和尾部序列可相鄰，在其之間沒有定制序列。
[0146] 在另一個實例中，頭部和尾部序列可在祀向寡核巧酸的末端并且在退火條件下順 式結(jié)合至側(cè)接序列。祀向寡核巧酸可在祀向寡核巧酸與頭部和/或尾部序列之間包括定制 序列。圖4示出運類探針的實施方案。
[0147] 形成核酸環(huán)的探針也包括其中頭部和尾部序列提供于不同核酸分子上的探針。在 運些情況下，在退火條件下形成的核酸環(huán)包括至少=個核酸分子-祀標(biāo)片段、頭部序列和尾 部序列。核酸分子的末端全部是并置的，如W前提及。在運些情況下，需要超過兩個連接反 應(yīng)來形成連續(xù)環(huán)形核酸鏈。實例是當(dāng)尾部序列是祀向寡核巧酸的3'末端時，并且探針包括 在其5'末端具有頭部序列的骨架寡核巧酸。在退火條件下，尾部序列順式結(jié)合至祀向寡核 巧酸的下游側(cè)接序列，并且骨架寡核巧酸的頭部序列反式結(jié)合至祀向寡核巧酸的上游側(cè)接 序列。順式結(jié)合是指結(jié)合在同一核酸分子上發(fā)生，即，單一核酸鏈形成=維結(jié)構(gòu)，其中不同 區(qū)域放在一起并且雜交。反式結(jié)合是指結(jié)合在不同核酸分子之間發(fā)生。任選地，骨架寡核巧 酸包括一對倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列，其在退火條件下形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，從而將骨架寡核巧酸的3 '末端 與祀向寡核巧酸的5'末端并置定位。在兩個末端之間存在切口。此類型的探針在圖5中示 出。當(dāng)提供用于連接的條件時，祀向寡核巧酸的5'末端連接至骨架寡核巧酸的3'末端。雙重 連接產(chǎn)物是包括祀向寡核巧酸、祀標(biāo)片段和骨架寡核巧酸的核酸環(huán)。或者，當(dāng)在祀向寡核巧 酸的5'末端與骨架寡核巧酸的3'末端之間存在間隙，圖5所示探針未通過連接來環(huán)化-替代 地包含頭部和尾部序列和祀標(biāo)片段的連續(xù)核酸鏈?zhǔn)蔷€性核酸鏈。
[0148] 探針可替代地W相反定向來布置W使得頭部序列在祀向寡核巧酸的5'末端并且 探針包括在其3'末端具有尾部序列的骨架寡核巧酸。在此情況下，在退火條件下頭部序列 順式結(jié)合至祀向寡核巧酸的上游側(cè)接序列，并且骨架寡核巧酸的尾部序列反式結(jié)合至祀向 寡核巧酸的下游側(cè)接序列。另外，骨架寡核巧酸可包括一對倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列，其在退火條件下 形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，W將骨架寡核巧酸的5'末端與祀向寡核巧酸的3'末端并置定位。然后，祀向 寡核巧酸的3'末端連接至骨架寡核巧酸的5'末端W使得雙重連接產(chǎn)物是包括祀向寡核巧 酸、祀標(biāo)片段和骨架寡核巧酸的核酸環(huán)?；蛘撸鏦上提及，退火可將骨架寡核巧酸的5'末 端定位于祀向寡核巧酸的3'末端附近但是通過一或多個核巧酸的間隙分隔開。運時，連接 產(chǎn)物是包括頭部和尾部序列和祀標(biāo)片段的連續(xù)線性核酸鏈。
[0149] 骨架寡核巧酸可包括倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列之間的定制序列，W使得在退火條件下骨架寡 核巧酸形成發(fā)夾環(huán)，如圖5示出。
[0150] 如提及，探針可被設(shè)計成使得包含頭部和尾部序列和祀標(biāo)片段的連續(xù)核酸鏈?zhǔn)蔷€ 性核酸鏈。在祀標(biāo)片段存在下的退火條件下，頭部和尾部序列雜交至側(cè)接序列，從而界定頭 部序列的5'末端與尾部序列的3'末端之間的間隙。祀標(biāo)片段雜交至間隙中的祀標(biāo)互補序 列，從而將祀標(biāo)片段的末端與頭部序列的5'末端和尾部序列的3'末端并置定位，并且完成 包括祀標(biāo)片段和頭部和尾部序列的核酸鏈。形成鏈的核酸分子使其末端并置。術(shù)語并置已 經(jīng)在別處論述。在待連接的末端之間存在切口。末端的連接產(chǎn)生包括至少頭部和尾部序列 和祀標(biāo)片段的連續(xù)核酸鏈。
[0151] 探針可包括在其3'末端具有尾部序列的祀向寡核巧酸和在其5'末端具有頭部序 列的線性骨架寡核巧酸。在退火條件下，尾部序列順式結(jié)合至祀向寡核巧酸的下游側(cè)接序 列，并且骨架寡核巧酸的頭部序列反式結(jié)合至祀向寡核巧酸的上游側(cè)接序列。祀向寡核巧 酸可包括下游側(cè)接序列與尾部序列之間的，定制序列W使得在退火條件下祀向寡核巧酸形 成發(fā)夾環(huán)。在退火條件下形成的線性核酸鏈包括骨架寡核巧酸、祀標(biāo)片段和祀向寡核巧酸。 圖6示出此布置。
[0152] 探針可同樣地W相反定向來布置，其中頭部序列在祀向寡核巧酸的5'末端并且探 針包括在其3'末端具有尾部序列的骨架寡核巧酸。在此情況下，頭部序列順式結(jié)合至祀向 寡核巧酸的上游側(cè)接序列，并且骨架寡核巧酸的尾部序列反式結(jié)合至祀向寡核巧酸的下游 側(cè)接序列。
[0153] 形成作為連接產(chǎn)物的線性核酸鏈的另一種形式的探針是包括在分開骨架寡核巧 酸上的頭部和尾部序列的探針。運類探針可包括包含具有自由5'末端的頭部序列的骨架寡 核巧酸，和包含具有自由3'末端的尾部序列的骨架寡核巧酸，其中在退火條件下頭部和尾 部序列反式結(jié)合至祀向寡核巧酸的側(cè)接序列。一個或兩個骨架寡核巧酸可進(jìn)一步包括定制 序列。圖7示出此類型的探針。
[0154] 優(yōu)選地，呈其未連接形式的探針的寡核巧酸是線性的。因此，優(yōu)選地祀向寡核巧酸 是線性核酸分子。對于包括一或多個骨架寡核巧酸的探針，運些骨架寡核巧酸也優(yōu)選地是 線性的。運允許便利地在連接與未連接探針之間區(qū)分，其中DNA環(huán)只由于探針的環(huán)化實施方 案的成功連接而形成。線性核酸分子未通過滾環(huán)復(fù)制來擴增。
[0155] 產(chǎn)物的擴增
[0156] 本發(fā)明方法中的信號檢測取決于在祀標(biāo)識別之后通過正確反應(yīng)的探針或從正確 反應(yīng)的探針來產(chǎn)生的信號，其使用序列特異性雜交和酶催化來產(chǎn)生特異性產(chǎn)物，從所述產(chǎn) 物獲得信號。本發(fā)明方法使用檢測所關(guān)注核酸物質(zhì)祀標(biāo)分子上的多個基因座作為信號擴增 步驟，并且因此使得能夠在不需要擴增反應(yīng)探針產(chǎn)物的情況下產(chǎn)生并檢測信號?？色@得信 號并且可在不擴增連接產(chǎn)物的情況下檢測累積信號。然而，任選地，來自多重產(chǎn)物的信號可 通過傳統(tǒng)信號擴增步驟來擴增。
[0157] 方法可包括在檢測之前富集連接產(chǎn)物。產(chǎn)物可通過擴增和/或固相化學(xué)來富集。環(huán) 形核酸產(chǎn)物可通過用外切核酸酶(例如，A外切核酸酶)處理樣品W消化線性核酸產(chǎn)物來選 擇性富集。通常，在保護(hù)連接產(chǎn)物W避免外切核酸酶降級時，外切核酸酶降級可用于富集連 接產(chǎn)物。然后，在設(shè)及聚合的任何后續(xù)步驟之前，例如在滾環(huán)擴增之前，應(yīng)將核酸外切酶滅 活(例如通過加熱）。如實施例2示出，可添加IU核酸外切酶W移除未反應(yīng)探針和片段。合適 條件是在37°C下在相應(yīng)外切核酸酶緩沖液中解育1小時，隨后在80°C下酶滅活20分鐘。當(dāng)使 用捕獲/檢測方法時，連接產(chǎn)物可通過經(jīng)由捕獲部分將產(chǎn)物捕獲于固相上來富集。如實施例 1示出，含有線性連接產(chǎn)物的溶液可與200ml最終體積的化iS-肥1 (抑7.5 )、3.5mM抓TA和 0.07 % Tween-20中的IOml M-280鏈霉抗生物素蛋白涂布磁性珠粒（Invi trogen)混合，并且 在室溫下解育15分鐘。解育之后，珠粒使用環(huán)形磁鐵來收集并且將上清液移除。富集連接產(chǎn) 物的其他方法包括對連接產(chǎn)物的特定大小進(jìn)行選擇。
[0158] 連接產(chǎn)物可通過克隆擴增來擴增。合適擴增技術(shù)包括滾環(huán)擴增（參見下文）、橋式 PCRUdessi C,等人，Nucleic Acids Res.20000ct 15;28(20):E87)、乳液PCR(乳液中的數(shù) 字PCR由Dressman等人，Proc 化tl Acad Sci U S A.2003Jul 22; 100(15) :8817-22.化油 2003Jul 11 描述）和數(shù)字PCR(Vogelstein&Kinzler，Proc 化tl Acad Sci U S A.1999Aug 3 ; 96 ( 16) :9236-41 )。凝膠中的克隆局部擴增由Mi tra&Church, Nuclei C Acids Res. 1999December 15; 27(24): e34描述。本發(fā)明方法的實施方案可包括擴增連接產(chǎn)物并且 獲得作為來自擴增產(chǎn)物的個別信號的組合的累積信號。優(yōu)選地，連接產(chǎn)物跨越連接接合處 擴增或?qū)τ陔p重連接產(chǎn)物來說，跨越兩個連接接合處擴增。
[0159] 當(dāng)連接產(chǎn)物是核酸環(huán)時，擴增可包括提供用于核酸環(huán)的滾環(huán)復(fù)制的條件，并且檢 測滾環(huán)復(fù)制的產(chǎn)物。滾環(huán)復(fù)制描述于US 5,854,033(Lizardi)和Fire&Xu,P;roc化tlAcad Sci U S A. 1995年5月9日；92(10) :4641-5中。滾環(huán)復(fù)制是使用鏈移位DNA聚合酶來擴增環(huán) 形核酸分子，由此產(chǎn)生含有擴增序列的串聯(lián)重復(fù)序列的較大DNA分子。DM聚合酶在進(jìn)行所 需長時間的進(jìn)行性滾環(huán)聚合反應(yīng)中催化引物延伸和鏈位移。它導(dǎo)致與單循環(huán)PCR復(fù)制和其 中每個循環(huán)限于祀標(biāo)序列拷貝數(shù)目加倍的其他擴增技術(shù)相比，環(huán)化探針序列的擴增高幾個 數(shù)量級。額外擴增可使用鏈位移反應(yīng)的級聯(lián)來獲得。滾環(huán)復(fù)制可為超支化滾環(huán)復(fù)制。超支化 RCA由Lizardi等人，化t Genet. 1998化1; 19(3) :225-32描述。滾環(huán)復(fù)制的條件在實施例中 示出，例如與IU的pM29聚合酶(New England Biolabs)-起解育可在37°C下添加于相應(yīng) phi 29緩沖液和核巧酸(dNTP)中歷時1小時。
[0160] 檢測
[0161] 連接產(chǎn)物可個別地可檢測，W使得個別信號可從由于每個祀標(biāo)序列由其相應(yīng)探針 識別所產(chǎn)生的連接產(chǎn)物獲得。然而，在本發(fā)明方法中，連接產(chǎn)物不必個別地檢測。來自連接 產(chǎn)物的個別信號合并成累積信號并且檢測累積信號。
[0162] 信號的類型和檢測方法可適當(dāng)?shù)鼗谔结樀念愋蛠磉x擇，或探針可被設(shè)計成實現(xiàn) 所需信號類型和檢測方法。所述方法不限于具體信號類型或信號檢測手段-實際上，方法可 通過將來自多個探針的個別信號轉(zhuǎn)化成單一累積可檢測信號的任何方法來執(zhí)行，從而經(jīng)由 探測步驟的多重處理性質(zhì)來擴增個別信號。
[0163] 通常，檢測來自連接產(chǎn)物的信號取決于探針結(jié)合至其祀標(biāo)序列之后的每一種產(chǎn)物 的形成，由此指示是否祀標(biāo)序列存在于樣品中。因此，信號可特別地從包括連接接合處的產(chǎn) 物獲得或?qū)τ陔p重連接產(chǎn)物來說，從包括兩個連接接合處的產(chǎn)物獲得。個別信號可從每個 連接接合處獲得，所述連接接合處由于探針雜交至每個祀標(biāo)序列而導(dǎo)致形成。因此，例如， 當(dāng)一組探針包括識別所關(guān)注物質(zhì)的10種祀標(biāo)序列的10種不同探針時，存在包括連接接合處 的10種連接產(chǎn)物，并且可檢測累積信號，所述信號是來自10種連接產(chǎn)物的個別信號的組合。 當(dāng)然，在此實施例中分子探針、祀標(biāo)序列和連接產(chǎn)物的實際數(shù)可高于10,因為在樣品中通常 存在每一種祀標(biāo)序列的多個拷貝并且樣品與每一種探針的多個拷貝接觸。
[0164] 由一組探針產(chǎn)生的連接產(chǎn)物可產(chǎn)生運一組特有的個別信號，并且不同于從由不同 組的探針產(chǎn)生的連接產(chǎn)物所獲得的信號，從而允許區(qū)分并個別地量化來自每一組探針的累 積信號。舉例來說，一組內(nèi)的探針可共有運一組共同的定制序列并且不同于其他組中的探 針的定制序列，從而允許方便地識別來自每一組的探針。每一組探針可含有用于結(jié)合對核 酸物質(zhì)有特異性的多個祀標(biāo)序列的至少500、600、700、800、900或至少1，000種不同探針。舉 例來說，方法可使用分別針對染色體21、13和18中的每一種的1，000種不同祀向寡核巧酸， 和=組不同探針，每一組用唯一的定制序列來標(biāo)記，一個定制序列針對每一種染色體。如果 需要，編碼特定等位基因和或基因座的基元可在高多重處理中并入定制序列中。
[0165] 可確定樣品中的兩種或更多種染色體的相對數(shù)量，方法是檢測來自兩組或更多組 探針中的每一組的雙重連接產(chǎn)物的累積信號，每一組識別對一種染色體有特異性的祀標(biāo)序 列，并且量化不同累積信號。
[0166] 獲得來自連接產(chǎn)物的信號的便利方法是提供擴增條件并且測試擴增產(chǎn)物的存在。 一些擴增方法是可能的，諸如NASPA、LAMP、T7擴增、PCR或當(dāng)連接產(chǎn)物是環(huán)時，滾環(huán)復(fù)制。獲 得信號可設(shè)及跨越連接接合處來擴增并且檢測來自擴增產(chǎn)物的信號（例如，通過PCR或，對 于探針的環(huán)化實施方案，滾環(huán)復(fù)制），或?qū)⑦B續(xù)核酸鏈在一個末端捕獲并且檢測其另一個末 端。信號可使用核酸的任何常規(guī)檢測系統(tǒng)從擴增或非擴增連接產(chǎn)物獲得，諸如檢測巧光標(biāo) 記、酶聯(lián)檢測系統(tǒng)、抗體介導(dǎo)標(biāo)記檢測和檢測放射性標(biāo)記。優(yōu)選地，滾環(huán)擴增產(chǎn)物通過將經(jīng) 過標(biāo)記的檢測寡核巧酸雜交至RCA產(chǎn)物中的基元，例如探針的定制序列中的基元來檢測。因 為連接產(chǎn)物的量與存在于樣品中的祀標(biāo)序列的量成正比，所W定量測量可靠地代表樣品中 的祀標(biāo)序列的量。此方法的主要優(yōu)勢是可操縱連接步驟W獲得等位基因辨別，DNA復(fù)制步驟 是等溫的，并且信號是嚴(yán)格定量的，因為擴增反應(yīng)是線性的并且由高度進(jìn)行性酶來催化。用 于DNA聚合酶反應(yīng)的引物寡核巧酸可對于所有一組探針或?qū)τ诜磻?yīng)混合物中的多組探針來 說是相同的。
[0167] 信號檢測的一個實例使用捕獲/標(biāo)記技術(shù)。在運里，所述連接產(chǎn)物包括連接接合處 的一側(cè)上的捕獲部分和連接接合處的另一側(cè)上的標(biāo)記，并且所述方法包括通過經(jīng)由捕獲部 分將連接產(chǎn)物捕獲于底物上，洗涂底物并且保持包括底物和所捕獲連接產(chǎn)物的所捕獲部 分，并且檢測所捕獲部分中的連接產(chǎn)物上的標(biāo)記而獲得來自連接產(chǎn)物的信號。當(dāng)連接產(chǎn)物 是線性時，運類方法尤其合適，W使得捕獲產(chǎn)物的一個末端并且檢測另一個末端。然而，當(dāng) 連接產(chǎn)物是環(huán)形時，通過包括裂解環(huán)W將它轉(zhuǎn)化成線性產(chǎn)物的步驟，也可使用所述方法。信 號可從異質(zhì)標(biāo)記或探針的序列，例如，定制序列來得到。
[0168] 可使用巧光信號，例如通過用不同巧光標(biāo)記來標(biāo)記第一和第二組的探針。因此，方 法可包括將樣品中的核酸與第一組探針和第二組探針接觸并且檢測第一和第二累積信號， 其中
[0169] 第一累積信號是由第一組探針產(chǎn)生的連接產(chǎn)物發(fā)射的第一波長下的巧光，并且其 中
[0170] 第二累積信號是由第二組探針產(chǎn)生的連接產(chǎn)物發(fā)射的第二波長下的巧光。
[0171] 在一些運些實施方案中，將由第一和第二組探針產(chǎn)生的連接產(chǎn)物的滾環(huán)復(fù)制的產(chǎn) 物可區(qū)分標(biāo)記。
[0172] 捕獲/檢測方法尤其便利地用于包括分開核酸分子(例如分開核酸分子上的頭部 和尾部序列）的探針。然后，連接產(chǎn)物含有單一核酸分子(連接產(chǎn)物）中的兩種分子的序列 (例如頭部和尾部序列），而未連接探針不含有所述序列。因此，可從連接產(chǎn)物獲得信號，方 法是通過捕獲含有一種序列（例如頭部序列）的核酸分子，洗涂W移除未連接探針核酸，然 后檢測捕獲部分中的另一種序列（例如尾部序列）的存在。檢測對于連接探針具有特異性， 因為在未連接探針中，兩個序列只通過核酸之間的雜交來連接并且通過洗涂來分離，而連 接探針含有連續(xù)核酸鏈中的連接接合處的每一側(cè)上的兩個序列，即，共價接合。
[0173] 如提及，探針可修飾W帶有捕獲部分。捕獲部分可允許連接至固體底物諸如珠粒。 合適捕獲部分是生物素，其與鏈霉抗生物素蛋白配對，從而允許修飾探針核酸在用鏈霉抗 生物素蛋白涂布的固體底物上分離。可便利地在探針與樣品組合之前，為探針提供捕獲部 分?；蛘撸东@部分可在連接步驟之后引入。
[0174] 當(dāng)探針包括含有頭部或尾部序列的骨架寡核巧酸，和分別含有尾部或頭部的分開 核酸（祀向寡核巧酸或第二骨架寡核巧酸）時，運些核酸分子中的任何一個可帶有捕獲部 分，例如可生物素化。
[0175] 當(dāng)探針的一個核酸分子帶有捕獲部分時，其他核酸分子可帶有標(biāo)記。可通過檢測 定制序列來將核酸序列本身作為標(biāo)記來使用，所述定制序列識別待檢測的核酸分子，例如 存在于所有一組探針中但是不存在于另一組探針中?；パa寡核巧酸可用于檢測。或者核酸 可帶有異質(zhì)標(biāo)記諸如巧光團。異質(zhì)標(biāo)記并非核酸本身的一部分?？墒褂玫钠渌麡?biāo)記包括量 子點、生物發(fā)光、信號產(chǎn)生酶級聯(lián)如酪胺信號擴增和放射性部分。然后，所述方法可包括相 應(yīng)地檢測標(biāo)記的存在，例如，檢測巧光、檢測量子點、檢測生物發(fā)光、檢測信號產(chǎn)生酶或檢測 放射性。
[0176] 舉例來說，獲得來自連接產(chǎn)物的信號可包括經(jīng)由捕獲部分將探針的骨架寡核巧酸 捕獲于底物上，洗涂底物W移除未連接探針并且保持包括底物和所捕獲骨架寡核巧酸的所 捕獲部分，并且從所捕獲部分中的雙重連接產(chǎn)物獲得信號。當(dāng)雙重連接產(chǎn)物帶有標(biāo)記時，此 可包括檢測所捕獲部分中的標(biāo)記。
[0177] 捕獲部分可為具有與鏈親和素底物的親和力的生物素分子。其他合適親和力標(biāo)簽 包括具有與固定金屬離子諸如鉆、儀、銅的親和力的多組氨酸標(biāo)簽，其可用于純化含有組氨 酸的序列，例如，骨架寡核巧酸。因此，捕獲部分可為待捕獲的序列，例如化S-標(biāo)簽序列的一 部分，或它可為并非核酸本身的一部分的異種部分。
[0178] 合適固體底物是珠粒，例如磁性珠粒W促進(jìn)使用磁鐵來富集所捕獲產(chǎn)物。底物可 用捕獲部分的結(jié)合成員來涂布，例如鏈霉抗生物素蛋白涂布磁性珠?？膳c生物素化探針一 起使用。
[0179] 量化
[0180] 量化確定樣品中的核酸物質(zhì)的量。在一些情況下，此量可確定并且與已知對照比 較，從而能夠確定樣品中的核酸的絕對或相對量。在其他情況下，可例如同時探測樣品內(nèi)的 多種核酸物質(zhì)。運使得一種核酸物質(zhì)能夠用作參考，將不同核酸物質(zhì)相對于彼此來量化，例 如確定與染色體1相比，樣品含有更多染色體21。
[0181] 數(shù)量可表達(dá)為濃度或量(例如，摩爾或質(zhì)量），兩種單位是可互換的，其中濃度是核 酸的量除W樣品的體積。
[0182] 探針
[0183] 探針的實例和其特征已經(jīng)在上文所述。一些進(jìn)一步特征和實例在本文中描述。
[0184] 探針核酸優(yōu)選地是DNA。然而，它可為另一種天然發(fā)生或非天然發(fā)生的核酸。DNA的 標(biāo)準(zhǔn)堿基是A、T、C和G，但是所述方法的探針核酸可任選地包括非標(biāo)準(zhǔn)核巧酸。
[0185] 通常，用于本發(fā)明方法的探針可包括祀向寡核巧酸和頭部和尾部序列。頭部和尾 部序列可為祀向寡核巧酸的一部分，或其中一種或兩種可在不同核酸分子上。任選地，探針 包括祀向寡核巧酸、包括頭部序列的骨架寡核巧酸和包括尾部序列的骨架寡核巧酸。因此， 探針可在其未連接形式下包括一個、兩個或=個核酸分子。
[0186] 優(yōu)選地，探針用于雜交至祀標(biāo)序列，所述祀標(biāo)序列是從待量化或識別的核酸物質(zhì) 所產(chǎn)生的界定序列的片段。運些祀標(biāo)序列可被稱為祀標(biāo)片段。
[0187] 祀向寡核巧酸比祀標(biāo)片段更長并且含有內(nèi)部祀標(biāo)互補序列，W使得祀向寡核巧酸 與祀標(biāo)片段之間的雜交形成位于祀向寡核巧酸的上游和下游側(cè)接序列之間的雙鏈序列。頭 部和尾部序列分別具有自由5'和3'末端，并且分別與上游和下游側(cè)接序列互補。在祀標(biāo)片 段存在下的退火條件下，頭部和尾部序列雜交至側(cè)接序列，從而界定頭部序列的5'末端與 尾部序列的3'末端之間的間隙，其中祀標(biāo)片段雜交至間隙中的祀標(biāo)互補序列，從而將祀標(biāo) 片段的末端與頭部序列的5'末端和尾部序列的3'末端并置定位。
[0188] 此類型的探針可用于在包括W下步驟的方法中檢測核酸物質(zhì)：
[0189] (i)提供其中核酸物質(zhì)被片段化成祀標(biāo)片段的樣品，
[0190] (ii)提供祀標(biāo)片段成為單鏈的變性條件
[0191] (iii)使樣品與一組探針接觸，其中每個探針特異性識別待檢測的核酸物質(zhì)內(nèi)的 不同祀標(biāo)序列，其中祀標(biāo)序列是祀標(biāo)片段的序列，并且其中每個探針包括
[0192] 祀向寡核巧酸，其比所述祀標(biāo)片段更長并且含有內(nèi)部祀標(biāo)互補序列，W使得所述 祀向寡核巧酸與所述祀標(biāo)片段之間的雜交形成位于所述祀向寡核巧酸的上游和下游側(cè)接 序列之間的雙鏈序列，和
[0193] 分別具有自由5'和3'末端的頭部和尾部序列，其中頭部和尾部序列分別與上游和 下游側(cè)接序列互補，
[0194] (iv)提供頭部和尾部序列雜交至側(cè)接序列的退火條件，并且祀標(biāo)片段，如果存在， 雜交至探針的祀標(biāo)互補序列，從而將祀標(biāo)片段的末端與頭部序列的5'末端和尾部序列的3' 末端并置定位
[01%] (V)提供用于連接的條件W使得如果祀標(biāo)片段存在，祀標(biāo)片段的3'末端連接至頭 部序列的5'末端W形成第一連接接合處，并且祀標(biāo)片段的5'末端連接至尾部序列的3'末端 W形成第二連接接合處，從而產(chǎn)生雙重連接產(chǎn)物，所述產(chǎn)物包括包含頭部和尾部序列和祀 標(biāo)片段的連續(xù)核酸鏈，并且
[0196] (Vi)檢測作為來自所有產(chǎn)物的個別信號的組合的累積信號，
[0197] 其中檢測到信號指示樣品中的核酸物質(zhì)的存在。
[0198] 核酸物質(zhì)可通過包括W下步驟的方法來量化
[0199] (i)提供其中核酸物質(zhì)被片段化成祀標(biāo)片段的樣品
[0200] (ii)提供祀標(biāo)片段成為單鏈的變性條件
[0201] (iii)使樣品與一組探針接觸，其中每個探針特異性識別待量化的核酸物質(zhì)的不 同祀標(biāo)序列，其中每個探針包括
[0202] 祀向寡核巧酸，其比所述祀標(biāo)片段更長并且含有內(nèi)部祀標(biāo)互補序列，W使得所述 祀向寡核巧酸與所述祀標(biāo)片段之間的雜交形成位于所述祀向寡核巧酸的上游和下游側(cè)接 序列之間的雙鏈序列，和
[0203] 分別具有自由5 '和3 '末端的頭部和尾部序列，其中頭部和尾部序列分別與上游和 下游側(cè)接序列互補，
[0204] (iv)提供頭部和尾部序列雜交至側(cè)接序列的退火條件，并且祀標(biāo)片段，如果存在， 雜交至探針的祀標(biāo)互補序列，從而將祀標(biāo)片段的末端與頭部序列的5'末端和尾部序列的3' 末端并置定位
[0205] (V)提供用于連接的條件W使得如果祀標(biāo)片段存在，祀標(biāo)片段的3'末端連接至頭 部序列的5'末端W形成第一連接接合處，并且祀標(biāo)片段的5'末端連接至尾部序列的3'末端 W形成第二連接接合處，從而產(chǎn)生雙重連接產(chǎn)物，所述產(chǎn)物包括包含頭部和尾部序列和祀 標(biāo)片段的連續(xù)核酸鏈，
[0206] (Vi)檢測作為來自所有連接產(chǎn)物的個別信號的組合的累積信號，W及
[0207] (Vii)量化累積信號W確定信號水平，其中信號水平與樣品中的核酸物質(zhì)的數(shù)量 成比例，W及
[020引由此確定樣品中的核酸物質(zhì)的數(shù)量。
[0209] 所述方法可用于相對于樣品中的第二核酸物質(zhì)來量化第一核酸物質(zhì)。因此，所述 方法可包括
[0210] (i)提供其中第一和第二核酸物質(zhì)被片段化成祀標(biāo)片段的樣品
[0211] (ii)提供祀標(biāo)片段成為單鏈的變性條件
[0212] (iii)使樣品與第一組探針和第二組探針接觸，其中第一組探針特異性識別第一 核酸物質(zhì)的不同祀標(biāo)序列并且其中第二組探針特異性識別第二核酸物質(zhì)的不同祀標(biāo)序列， 其中每個探針包括
[0213] 祀向寡核巧酸，其比所述祀標(biāo)片段更長并且含有內(nèi)部祀標(biāo)互補序列，W使得所述 祀向寡核巧酸與所述祀標(biāo)片段之間的雜交形成位于所述祀向寡核巧酸的上游和下游側(cè)接 序列之間的雙鏈序列，和
[0214] 分別具有自由5'和3'末端的頭部和尾部序列，其中頭部和尾部序列分別與上游和 下游側(cè)接序列互補，
[0215] (iv)提供頭部和尾部序列雜交至側(cè)接序列的退火條件，并且祀標(biāo)片段，如果存在， 雜交至探針的祀標(biāo)互補序列，從而將祀標(biāo)片段的末端與頭部序列的5'末端和尾部序列的3' 末端并置定位
[0216] (V)提供用于連接的條件W使得如果祀標(biāo)片段存在，祀標(biāo)片段的3'末端連接至頭 部序列的5'末端W形成第一連接接合處，并且祀標(biāo)片段的5'末端連接至尾部序列的3'末端 W形成第二連接接合處，從而產(chǎn)生雙重連接產(chǎn)物，所述產(chǎn)物包括包含頭部和尾部序列和祀 標(biāo)片段的連續(xù)核酸鏈，
[0217] (Vi)檢測作為來自由第一組探針?biāo)a(chǎn)生的連接產(chǎn)物的個別信號的組合的第一累 積信號，并且將其量化W確定第一信號水平，其中第一信號水平與樣品中的第一核酸物質(zhì) 的數(shù)量成比例，
[0218] (Vii)檢測作為來自由第二組探針?biāo)a(chǎn)生的連接產(chǎn)物的個別信號的組合的第二累 積信號，并且將其量化W確定第二信號水平，其中第二信號水平與樣品中的第二核酸物質(zhì) 的數(shù)量成比例，W及
[0219] (Viii)比較第一和第二信號水平，從而確定樣品中的第一和第二核酸物質(zhì)的相對 數(shù)量。
[0220] 探針可被設(shè)計成使得間隙中的祀標(biāo)片段的雜交完成核酸環(huán)，所述環(huán)包括祀標(biāo)片段 和頭部和尾部序列。
[0221] 探針的頭部和/或尾部序列優(yōu)選地接合至定制序列，所述定制序列不與探針的其 他區(qū)域或祀標(biāo)片段互補。
[0222] 在一些實施方案中探針，單一核酸分子包括頭部和尾部序列。
[0223] 頭部和尾部序列可與祀向寡核巧酸分開W使得其反式結(jié)合至側(cè)接序列。舉例來 說，頭部和尾部序列可分別在骨架寡核巧酸的5 '和3 '末端。定制序列可包含于骨架寡核巧 酸的頭部與尾部序列之間。運類探針的實例在圖3中示出?；蛘?，骨架寡核巧酸的頭部和尾 部序列可相鄰，沒有插入核巧酸序列。在運類情況下，祀向寡核巧酸的側(cè)接序列沿著全長骨 架寡核巧酸雜交并且可將其環(huán)化。
[0224] 探針可被設(shè)計成使得頭部序列是祀向寡核巧酸的5'末端和/或尾部序列是祀向寡 核巧酸的3'末端，W使得間隙中的祀標(biāo)片段的雜交完成包括祀標(biāo)片段、頭部和尾部序列、祀 標(biāo)互補序列和側(cè)接序列的核酸鏈。頭部和尾部序列可在祀向寡核巧酸的末端并且順式結(jié)合 至側(cè)接序列。運類探針的實例在圖4中示出。在此形式的探針中，頭部和尾部序列和祀標(biāo)互 補序列全部變得與祀標(biāo)片段一起環(huán)化。定制序列可定位于寡核巧酸的環(huán)中。探針核酸相對 較長但是具有將寡核巧酸結(jié)構(gòu)連結(jié)至一個分子的優(yōu)勢，所述分子預(yù)先組裝并且不需要雜交 不同探針核酸分子。
[0225] 探針也可被設(shè)計成具有骨架寡核巧酸，所述寡核巧酸是與祀向寡核巧酸分開的分 子核酸。尾部序列可為祀向寡核巧酸的3'末端并且頭部序列是骨架寡核巧酸的5'末端?；?者頭部序列可為祀向寡核巧酸的5'末端并且尾部序列是骨架寡核巧酸的3'末端。定制序列 可引入祀向寡核巧酸中W例如提環(huán)頭部或尾部序列與側(cè)接序列之間的供。使用此探針方法 的優(yōu)勢是檢測序列可引入環(huán)中并且與祀標(biāo)互補序列相關(guān)聯(lián)，從而可有利于多重處理方法， 尤其使用較高重數(shù)檢測方案的較高多重處理。骨架寡核巧酸可進(jìn)一步包括定制序列。通過 在兩個寡核巧酸中提供探針，探針核酸分子比單一寡核巧酸形式短但是保持相同功能。
[0226] 探針的另一種設(shè)計將頭部和尾部序列提供于兩個骨架寡核巧酸上。因此，探針包 括
[0227] 祀向寡核巧酸，其比祀標(biāo)片段更長并且含有內(nèi)部祀標(biāo)互補序列，W使得祀向寡核 巧酸與祀標(biāo)片段之間的雜交形成位于祀向寡核巧酸的上游和下游側(cè)接序列之間的雙鏈序 列，
[0228] 包含具有自由5 '末端的頭部序列的骨架寡核巧酸，和
[0229] 包含具有自由3 '末端的尾部序列的骨架寡核巧酸，
[0230] 其中頭部和尾部寡核巧酸序列分別與上游和下游側(cè)接序列互補。
[0231] -個骨架寡核巧酸可帶有捕獲部分，在此情況下另一個骨架寡核巧酸用于檢測并 且可帶有異質(zhì)標(biāo)記。一個或兩個骨架寡核巧酸可進(jìn)一步包括定制序列。替代地或另外，祀向 寡核巧酸可包括定制序列。
[0232] 在祀標(biāo)片段存在下的退火條件下，頭部和尾部序列雜交至側(cè)接序列，從而界定頭 部序列的5'末端與尾部序列的3'末端之間的間隙，其中祀標(biāo)片段雜交至間隙中的祀標(biāo)互補 序列，從而將祀標(biāo)片段的末端與頭部序列的5'末端和尾部序列的3'末端并置定位。間隙中 的祀標(biāo)片段的雜交完成包括祀標(biāo)片段和頭部和尾部序列的核酸鏈。所述鏈帶有捕獲部分和 標(biāo)記，允許使用本文中別處描述的捕獲/檢測方法來檢測。
[0233] 數(shù)字核型分析和非侵入性出生前診斷
[0234] 本發(fā)明方法的一些實行方案在試圖精確量化祀標(biāo)DNA的領(lǐng)域中提供特別優(yōu)勢。運 包括許多基于核酸的診斷技術(shù)。一種運類領(lǐng)域是分析來自患者的生物樣品（例如，血液）中 的癌癥DNA。另一種運類領(lǐng)域是通過分析無細(xì)胞DNA的非侵入性出生前診斷(NIPT)。
[0235] 使用NIPT的難題是必須計數(shù)大量特定基因組片段W便獲得診斷染色體異倍體性 所需要的統(tǒng)計置信度。由于胎兒DNA與母體DNA混合，構(gòu)成孕婦的血液中的遺傳物質(zhì)的4- 30%，因此觀察胎兒DNA中的染色體異倍體性需要非常精確的測量。
[0236] 本發(fā)明方法可用于分析母體血液樣品中的自由環(huán)化胎兒DNA。通過使用針對一個 染色體的不同片段的多個探針和針對第二染色體的不同片段的多個探針，所述方法使得樣 品中的兩個染色體的相對數(shù)量的不平衡能夠W較高置信度來確定。運允許診斷胎兒DNA的 染色體異倍體性諸如S體性，甚至相對于母體DNA的較高背景。
[0237] 本發(fā)明方法可用于例如測試來自懷孕女性的母體血液樣品W針對診斷染色體異 常諸如S體性來檢測胎兒核酸，針對腫瘤DNA來測試患者樣品W診斷或監(jiān)測患者的腫瘤的 存在。其他用途包括針對微生物核酸的存在來測試材料樣品，其中檢測到微生物核酸指示 材料被微生物感染，所述微生物可為感染媒介物諸如細(xì)菌、病毒或真菌。樣品可為來自患者 的組織或血液樣品。
[0238] -般來說，通過使用數(shù)百或數(shù)千個不同探針，本發(fā)明方法的一些實行方案可通過 檢測數(shù)百或數(shù)千個特定核酸片段來獲得高精度，從而在一系列診斷應(yīng)用中提供優(yōu)勢。檢測 來自與具體疾病相關(guān)聯(lián)的染色體或染色體基因座的許多DNA片段使得運種染色體或基因座 的量能夠相對于對照染色體或基因座來測量，W使得可靠地檢測樣品中的甚至輕微差異。
[0239] 通過分析短祀標(biāo)片段，母體血液中的較大比例的高度片段化無細(xì)胞DNA可W高效 率來分析。運是至關(guān)重要的，因為可在母體血液中獲得非常少量的無細(xì)胞DNA。
[0240] 在從個體獲得的核酸樣品中相對于第二染色體或染色體基因座來量化第一染色 體或染色體基因座的方法可包括
[0241] 使樣品與第一組探針和第二組探針接觸，其中第一組探針各自特異性識別第一染 色體或染色體基因座內(nèi)的不同祀標(biāo)序列并且其中第二組探針各自特異性識別第二染色體 或染色體基因座內(nèi)的不同祀標(biāo)序列，
[0242] 提供使得第一和第二染色體或染色體基因座中的祀標(biāo)序列變成至少部分單鏈的 條件，
[0243] 提供用于退火和連接的條件，在所述條件下探針雜交至其祀標(biāo)序列并且產(chǎn)生連接 產(chǎn)物，
[0244] 檢測作為來自由第一組探針?biāo)a(chǎn)生的連接產(chǎn)物的個別信號的組合的第一累積信 號，并且將其量化W確定第一信號水平，其中第一信號水平與樣品中的第一染色體或染色 體基因座的數(shù)量成比例，
[0245] 檢測作為來自由第二組探針?biāo)a(chǎn)生的連接產(chǎn)物的個別信號的組合的第二累積信 號，并且將其量化W確定第二信號水平，其中第二信號水平與樣品中的第二染色體或染色 體基因座的數(shù)量成比例，W及
[0246] 比較第一和第二信號水平，從而確定樣品中的第一和第二染色體或第一和第二染 色體基因座的相對數(shù)量。
[0247] 所述方法可用于診斷胎兒中的異倍體性(例如=體性），其中核酸樣品是從母體血 液獲得的樣品并且含有與母體DNA混合的無細(xì)胞胎兒DNA，并且其中第一和第二信號水平的 不等比率指示異倍體性(例如=體性）。 實施例
[0248] 提供W下實施例W展現(xiàn)并且進(jìn)一步闡明本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案和方面，并且 不應(yīng)理解為限制其范圍。
[0249] 實施例1
[0250] 此實例示出使用本發(fā)明方法來檢測并量化母體血液中的自由環(huán)化胎兒DNA。
[0251] 血液樣品從懷孕母親收集并且自由環(huán)化DNA從血漿提取。然后，DNA與祀向特異性 DNA探針反應(yīng)，所述探針特異性地與來源于經(jīng)受分析和量化的染色體的DNA片段反應(yīng)。在此 實施例中，我們示出使用所謂"Lotus探針"來祀向并且與來自染色體21和參考染色體的特 定片段反應(yīng)。然而，可替代地使用祀向特定DNA片段的其他基于探針的技術(shù)，諸如掛鎖探針/ 分子倒轉(zhuǎn)探針(MIP )、選擇子探針、寡核巧酸連接探針。
[0252]提供祀向兩個染色體中的每一個的多個片段的Lotus探針。在祀標(biāo)識別后，探針與 其相應(yīng)片段一起產(chǎn)生連接產(chǎn)物，所述產(chǎn)物使一個末端用巧光標(biāo)記并且另一個末端用生物素 標(biāo)記。連接產(chǎn)物用兩個不同巧光團標(biāo)記，每個巧光團代表所祀向的個別染色體。方案可示出 為：
[025引1)將IOng的DNA用相應(yīng)相容限制酶緩沖液中的1單位限制酶消化。反應(yīng)在37C下解 育化，隨后在80°C下酶去活20min。
[0254] 2)在95°C下將DNA片段變性至單鏈片段歷時IOmin并且與探針和連接酶混合W形 成線性連接產(chǎn)物。探針池W IOpM個別濃度與IU的Ampligase化picentre) -起添加并且在55 °C下在連接酶緩沖液中解育化。
[0255] 3)將連接產(chǎn)物捕獲于磁性鏈霉抗生物素蛋白珠粒上。為了移除未反應(yīng)探針和片 段，溶液與200ml最終體積的IYis-HCl (pH 7.5)、3.5mM 抓TA和0.07 % Tween-20中的 IOml M-280鏈霉抗生物素蛋白涂布磁性珠粒（Invitrogen)混合，并且在室溫下解育15分鐘。解育 之后，珠粒使用環(huán)形磁鐵來收集并且將上清液移除。
[0256] 4)將其余珠粒結(jié)合探針檢測并量化。測量兩個標(biāo)記中的每一個的總巧光強度并且 測量兩個顏色之間的相對強度。
[0257] 5)在出生前診斷的情況下，最終結(jié)果基于巧光的相對數(shù)量。簡化實施例;如果1000 個基因組等效物和母體血液中的10%所有自由環(huán)化DNA來自于胎兒，并且1000個染色體21 祀向探針用于產(chǎn)生總巧光，那么正常樣品將產(chǎn)生1，〇〇〇,〇〇〇個巧光團的信號，而=體性21胎 兒的樣品將產(chǎn)生對應(yīng)于1，050,000個巧光團的信號。另外，為了獲得較高統(tǒng)計精度，如果 1000個探針祀向未經(jīng)受異倍體性的"正常"區(qū)域，并且用第二巧光團標(biāo)記，可測量相對數(shù)量。 [0巧引實施例2
[0259] 在W下實施例中，Lotus探針祀向兩個染色體中的每一個的多個片段。在祀標(biāo)識別 后，探針與其相應(yīng)片段一起產(chǎn)生環(huán)化連接產(chǎn)物。環(huán)化連接產(chǎn)物含有可用于隨后標(biāo)記的兩個 序列基元中的任何一個，每個序列基元對應(yīng)于所祀向的兩個染色體中的任何一個。方案可 示出為：
[0260] 1)將IOng的DNA用相應(yīng)相容限制酶緩沖液中的1單位限制酶消化。反應(yīng)在37C下解 育化，隨后在80°C下酶去活20min。
[0261] 2)在95°C下將DNA片段變性至單鏈片段歷時IOmin并且與探針和連接酶混合W形 成環(huán)。探針池W IOpM個別濃度與IU的Ampligase巧picentre) -起添加并且在55°C下在連接 酶緩沖液中解育Ih。
[0262] 3)添加IU核酸外切酶W移除未反應(yīng)探針和片段。IU的A外切核酸酶化picentre)在 37°C下在相應(yīng)外切核酸酶緩沖液中添加化，隨后在80°C下酶滅活20min。
[0%3] 4)其余環(huán)通過滾環(huán)擴增RCA來復(fù)制。IU的地i29聚合酶(New England Biolabs)在 37°C下添加于相應(yīng)地i29緩沖液和核巧酸(dNTP)中歷時化。將各自用兩個不同巧光團標(biāo)記 的與RCA產(chǎn)物互補的探針添加至RCA混合物。所得標(biāo)記RCA產(chǎn)物個別地計數(shù)并且在兩種顏色 之間測量RCA產(chǎn)物的相對數(shù)量。
[0264] 5)在出生前診斷的情況下，最終結(jié)果基于巧光的相對數(shù)量。簡化實施例;如果1000 個基因組等效物和母體血液中的10%所有自由環(huán)化DNA來自于胎兒，并且1000個染色體21 祀向探針用于產(chǎn)生總巧光，那么正常樣品將產(chǎn)生1，〇〇〇,〇〇〇個巧光團的信號，而=體性21胎 兒的樣品將產(chǎn)生對應(yīng)于1，050,000個巧光團的信號。另外，為了獲得較高統(tǒng)計精度，如果 1000個探針祀向未經(jīng)受異倍體性的"正常"區(qū)域，并且用第二巧光團標(biāo)記，可測量相對數(shù)量。
[0265] 實施例3 [026引材料和方法
[0267] 樣品制備:將IOml血液從每個受試者收集至無細(xì)胞DNA試管（S化eck，Omaha，肥） 中。通過雙重離屯、方案從血液中分離血漿（1600g歷時lOmin，隨后在首次旋出之后進(jìn)行試管 轉(zhuǎn)移之后16 OOOg歷時IOmin)。根據(jù)制造商方案，CfDNA通過Qiagen CCf核酸試劑盒 (Qiagen ,HiIden ,Germany)來分離。所得DNA在50ul緩沖液（Qiagen試劑盒的一部分）中洗 脫。
[0268] 探索和骨架設(shè)計:本文描述的多重探針技術(shù)使得能夠特異性和同時擴增數(shù)千個染 色體片段。探針被設(shè)計成捕獲染色體21、18和13中的每一種的2500-5000個片段(祀標(biāo)）。祀 標(biāo)被選擇為具有基因組中的唯一序列，均一 AT/GC組成，不包括已知多態(tài)性也不包括祀標(biāo)序 列中的CNV，并且大小在18-3加P之間。祀向來自每個染色體13和18的2500個片段的探針與 祀向來自染色體21的片段的5000個探針合并W產(chǎn)生單一寡核巧酸探針池。
[0269] 示例性探針序列/'礦代表祀標(biāo)互補序列:ATGTGACCCTTCCGTCTGTTGAGTTAGGCCNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCGTGCCTTGTCATTCGGGAGCACTAACTGCTG(SEQ ID NO:1)
[0270] 具有與探針末端互補的頭部和尾部序列的骨架被設(shè)計成包括用于測序和數(shù)字計 數(shù)的序列基元。兩種骨架用于結(jié)果部分概述的實驗中；一種骨架與祀向染色體13和18的探 針互補：（/5I%os/CGCACACGATTAAGGTCCAGTCACAGGCAGAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTG TNNNNNNNNNNGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATTTCATGCTGCTAACGGTCGAGTCGGACAGGTGGCTCCA CTAAATAGACGCA);沈Q ID N0:2,并且一種骨架祀向染色體21: (/5I%os/GGCCTAACTCAACAGAC GGAAGGGTCACATAGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTNNNNNNNNNNGTGTAGATCTCGGTGGTCGCC GTATCATTTCATGCTGCTAACGGTCGAGCAGTTAGTGCTCCCGAATGACAAGGCACGA；SEQ ID NO:3)〇
[0271] 生物化學(xué)探針方案：50ul的純化CfDNA在37C下用55ul總體積的Ix肥B4緩沖液 (New !England Biolabs)和Ix BSA中的抓 MseI(化W !England Biolabs)消化30min，隨后在 65C下熱滅活20min。然后，消化DNA與探針和骨架的連接混合物混合。55ul的消化DNA與探針 (1口1/探針）、骨架(各自60碰）、1義連接緩沖液化9；[。6]1化6)、1001]的4111911旨日36化9；[。6]1付6)、 1 mM NAD和SmM Mg2+混合至70U1的總體積。首先在9 5C下將消化片段變性為單鏈DNA歷時 5min，隨后在55C下進(jìn)行雜交并且連接16h。連接混合物然后用核酸外切酶處理W移除任何 其余線性DNA分子。連接反應(yīng)物在37C下與75ul合計總體積的20U的ExoI (肥B)和抓的ExoIII (肥B)和IxBSA混合60min，隨后在65C下熱滅活lOmin。
[0272] 分析:對于測序分析，核酸外切酶處理的環(huán)根據(jù)制造商方案用與Illumina測序儀 器互補的測序引物來擴增并且隨后裝載于111皿ina Miseq儀器上。
[0273] 對于數(shù)字分析，核酸外切酶處理的反應(yīng)物經(jīng)受滾環(huán)擴增反應(yīng)(RCA) W產(chǎn)生所述環(huán) 的多聯(lián)體拷貝的離散DNA祀標(biāo)。37，5ul核酸外切酶處理環(huán)與50ul總體積的4mM DTT、3U的 phi29聚合酶(肥B)、0，luM引物、ImM dNTP混合物(肥B)和Ix BSA混合，并且在37C下解育比， 隨后在65C下熱滅活lOmin。然后，RCA反應(yīng)物用與骨架序列互補的巧光標(biāo)記寡核巧酸標(biāo)記。 50111的1?〔4產(chǎn)物與100111總體積的0，1%1'*661120(51旨111曰）、511]\1標(biāo)記寡核巧酸和^85〔 (Sigma)混合。標(biāo)記RCA產(chǎn)物最后沉積于W聚賴氨酸（Sigma)涂布的顯微鏡用載玻片上并且 在巧光顯微鏡中計數(shù)。
[0274] ^
[0275] 本文描述的探針法在Illumina測序和數(shù)字計數(shù)系統(tǒng)中展示。為了證明探針法的性 能，具有S體性21的DNA樣品在不同濃度下與來自正常血漿樣品（3-5ml血漿)提取的DNA混 合。然后，將樣品經(jīng)受探針法并且通過測序來評估。
[0276] 結(jié)果在圖8中示出，IOOng細(xì)胞系DNA經(jīng)受如上所述的方案。10,000探針在池中混合 W特異性環(huán)化來自染色體13、18和21的10,000個相應(yīng)染色體片段。然后，10,000個所得環(huán)用 Illumina相應(yīng)PCR引物來擴增并且在測序之前在凝膠上分析。泳道1對應(yīng)于DNA梯帶，泳道2 是消化之后的DNA樣品，并且泳道3是具有10,000個擴增片段的PCR產(chǎn)物。
[0277] 對于圖9示出的結(jié)果，12個正常血漿樣品在不同濃度下與帶有具有S體性21的DNA 的樣品并行地分析。將DNA提取并且經(jīng)由IOK多重處理探針方案來處理并且最后在Illumina 測序器上測序。使用提供99%特異性的置信區(qū)間，陽性樣品基于估計正態(tài)分布W90%靈敏 度來檢測。 腳引進(jìn)一步陳述
[0279 ] W下條款代表本發(fā)明的方面并且是說明書的一部分。
[0280] 1. -種檢測樣品中的核酸物質(zhì)的方法，其包括
[0281] 使所述樣品與一組探針接觸，其中每個探針特異性識別待檢測的所述核酸物質(zhì)內(nèi) 的不同祀標(biāo)序列，
[0282] 提供使得所述核酸物質(zhì)中的所述祀標(biāo)序列變成至少部分單鏈的條件，
[0283] 提供用于退火和連接的條件，在所述條件下所述探針雜交至其祀標(biāo)序列并且產(chǎn)生 連接產(chǎn)物，每個連接產(chǎn)物包括連接接合處，W及
[0284] 檢測作為來自所有連接產(chǎn)物的個別信號的組合的累積信號，
[0285] 其中檢測到所述信號指示所述樣品中的所述核酸物質(zhì)的存在。
[0286] 2. -種量化樣品中的核酸物質(zhì)的方法，其包括
[0287] 使所述樣品與一組探針接觸，其中每個探針特異性識別待量化的所述核酸物質(zhì)內(nèi) 的不同祀標(biāo)序列，
[0288] 提供使得所述核酸物質(zhì)中的所述祀標(biāo)序列變成至少部分單鏈的條件，
[0289] 提供用于退火和連接的條件，在所述條件下所述探針雜交至其祀標(biāo)序列并且產(chǎn)生 連接產(chǎn)物，每個連接產(chǎn)物包括連接接合處，W及
[0290] 檢測作為來自所有連接產(chǎn)物的個別信號的組合的累積信號，
[0291] 量化所述累積信號W確定信號水平，其中所述信號水平與所述樣品中的所述核酸 物質(zhì)的數(shù)量成比例，W及
[0292] 由此確定所述樣品中的所述核酸物質(zhì)的數(shù)量。
[0293] 3.-種相對于樣品中的第二核酸物質(zhì)來量化第一核酸物質(zhì)的方法，其包括
[0294] 使所述樣品與第一組探針和第二組探針接觸，其中所述第一組的所述探針各自特 異性識別所述第一核酸物質(zhì)內(nèi)的不同祀標(biāo)序列并且其中所述第二組的所述探針各自特異 性識別所述第二核酸物質(zhì)內(nèi)的不同祀標(biāo)序列，
[0295] 提供使得所述第一和第二核酸物質(zhì)中的所述祀標(biāo)序列變成至少部分單鏈的條件，
[0296] 提供用于退火和連接的條件，在所述條件下所述探針雜交至其祀標(biāo)序列并且產(chǎn)生 連接產(chǎn)物，每個連接產(chǎn)物包括連接接合處，
[0297] 檢測作為來自由所述第一組探針?biāo)a(chǎn)生的所述連接產(chǎn)物的個別信號的組合的第 一累積信號，并且將其量化W確定第一信號水平，其中所述第一信號水平與所述樣品中的 所述第一核酸物質(zhì)的數(shù)量成比例，
[0298] 檢測作為來自由所述第二組探針?biāo)a(chǎn)生的所述連接產(chǎn)物的個別信號的組合的第 二累積信號，并且將其量化W確定第二信號水平，其中所述第二信號水平與所述樣品中的 所述第二核酸物質(zhì)的數(shù)量成比例，W及
[0299] 比較所述第一和第二信號水平，從而確定所述樣品中的所述第一和第二核酸物質(zhì) 的相對數(shù)量。
[0300] 4.如前述條款中任一項所述的方法，其中所述祀標(biāo)序列是不重疊的。
[0301] 5.如前述條款中任一項所述的方法，其中所述探針組包括各自特異性識別不同祀 標(biāo)序列的至少10個探針。
[0302] 6.如條款5所述的方法，其中所述探針組包括各自特異性識別不同祀標(biāo)序列的至 少100個探針。
[0303] 7.如條款6所述的方法，其中所述探針組包括各自特異性識別不同祀標(biāo)序列的至 少1，000個探針。
[0304] 8.如條款7所述的方法，其中所述探針組包括各自特異性識別不同祀標(biāo)序列的至 少10,000個探針。
[0305] 9.如前述條款中任一項所述的方法，其包括擴增所述連接產(chǎn)物并且獲得作為來自 所述擴增產(chǎn)物的個別信號的組合的累積信號。
[0306] 10.如條款9所述的方法，其中所述擴增是克隆擴增。
[0307] 11.如條款9或條款10所述的方法，其包括跨越所述連接接合處來擴增所述連接產(chǎn) 物。
[0308] 12.如前述條款中任一項所述的方法，其中所述連接產(chǎn)物是雙重連接產(chǎn)物，所述產(chǎn) 物各自包括第一和第二連接接合處。
[0309] 13.如條款12所述的方法，其中所述方法包括跨越所述第一和第二連接接合處來 擴增所述連接產(chǎn)物。
[0310] 14.如條款1至8中任一項所述的方法，其包括在不擴增所述連接產(chǎn)物的情況下獲 得作為來自所述連接產(chǎn)物的個別信號的組合的累積信號。
[031。 15.如條款1至13中任一項所述的方法，其中所述連接產(chǎn)物是核酸環(huán)。
[0312] 16.如條款15所述的方法，其包括提供用于所述核酸環(huán)的滾環(huán)復(fù)制的條件，并且檢 測滾環(huán)復(fù)制的所述產(chǎn)物。
[0313] 17.如條款16所述的方法，其中所述滾環(huán)復(fù)制是超支化滾環(huán)復(fù)制。
[0314] 18.如條款1至14中任一項所述的方法，其中所述連接產(chǎn)物是線性核酸。
[0315] 19.如條款18所述的方法，其中所述連接產(chǎn)物包括連接接合處的一側(cè)上的捕獲部 分和所述連接接合處的另一側(cè)上的標(biāo)記，并且所述方法包括通過經(jīng)由所述捕獲部分將所述 連接產(chǎn)物捕獲于底物上，洗涂所述底物并且保持包括所述底物和所捕獲連接產(chǎn)物的所捕獲 部分，并且檢測所捕獲部分中的所述連接產(chǎn)物上的所述標(biāo)記而獲得來自所述連接產(chǎn)物的信 號。
[0316] 20.如前述條款中任一項所述的方法，其中所述信號是巧光。
[0317] 21.如條款20所述的方法，其包括將所述樣品中的所述核酸與第一組探針和第二 組探針接觸并且檢測第一和第二累積信號，其中
[0318] 所述第一累積信號是由所述第一組探針產(chǎn)生的連接產(chǎn)物發(fā)射的第一波長下的巧 光，并且其中
[0319] 所述第二累積信號是由所述第二組探針產(chǎn)生的連接產(chǎn)物發(fā)射的第二波長下的巧 光。
[0320] 22.如前述條款中任一項所述的方法，其中將所述探針連接W產(chǎn)生所述連接產(chǎn)物。
[0321] 23.如條款22所述的方法，其中將所述探針與所述祀標(biāo)序列連接W產(chǎn)生所述連接 產(chǎn)物。
[0322] 24.如前述條款中任一項所述的方法，其中所述連接產(chǎn)物是包含所述祀標(biāo)序列的 核酸環(huán)。
[0323] 25.如前述條款中任一項所述的方法，其中所述核酸物質(zhì)是片段化的。
[0324] 26.如條款25所述的方法，其中所述祀標(biāo)序列是所述核酸物質(zhì)的片段的序列。
[0325] 27.如條款25或條款26所述的方法，其中所述樣品是核酸的限制酶消化物并且所 述祀標(biāo)序列是限制片段。
[0326] 28.如條款25至27中任一項所述的方法，其中所述探針連接至所述祀標(biāo)序列的每 個末端。
[0327] 29.如條款28所述的方法，其中所述探針各自包括
[0328] 祀向寡核巧酸，其比所述祀標(biāo)片段更長并且含有內(nèi)部祀標(biāo)互補序列，W使得所述 祀向寡核巧酸與所述祀標(biāo)片段之間的雜交形成位于所述祀向寡核巧酸的上游和下游側(cè)接 序列之間的雙鏈序列，和
[0329] 分別具有自由5 '和3 '末端的頭部和尾部序列，其中所述頭部和尾部序列分別與所 述上游和下游側(cè)接序列互補，其中
[0330] 在用于退火和連接的條件下，所述頭部和尾部序列雜交至所述側(cè)接序列，并且所 述祀標(biāo)片段，如果存在，雜交至所述祀標(biāo)互補序列，從而將所述祀標(biāo)片段的所述末端與所述 頭部序列的所述5 '末端和所述尾部序列的所述3 '末端并置定位，其中所述祀標(biāo)片段的所述 3'末端連接至所述頭部序列的所述5'末端W形成第一連接接合處，并且所述祀標(biāo)片段的所 述5 '末端連接至所述尾部序列的所述3 '末端W形成第二連接接合處，從而產(chǎn)生雙重連接產(chǎn) 物，所述產(chǎn)物包括包含所述頭部和尾部序列和所述祀標(biāo)片段的連續(xù)核酸鏈。
[0331] 30.如條款29所述的方法，其中所述片段化核酸樣品是限制酶消化物并且所述祀 標(biāo)片段是限制片段。
[0332] 31.如條款28或條款29所述的方法，其中檢測所述雙重連接產(chǎn)物的步驟包括提供 跨越所述連續(xù)核酸鏈的所述第一和第二連接接合處來擴增的條件，并且檢測是否存在擴增 產(chǎn)物。
[0333] 32.如條款29至31中任一項所述的方法，其中包含所述頭部和尾部序列和所述祀 標(biāo)片段的所述連續(xù)核酸鏈?zhǔn)呛怂岘h(huán)。
[0334] 33.如條款32所述的方法，其中檢測所述雙重連接產(chǎn)物的步驟包括提供用于滾環(huán) 復(fù)制的條件并且檢測是否存在滾環(huán)復(fù)制的產(chǎn)物。
[0335] 34.如條款33所述的方法，其中所述滾環(huán)復(fù)制是超支化滾環(huán)復(fù)制。
[0336] 35.如條款32至34中任一項所述的方法，其中所述探針在一個核酸分子上包括所 述頭部和尾部序列。
[0337] 36.如條款35所述的方法，其中所述探針包括在其5 '末端3 '末端分別具有所述頭 部和尾部序列的骨架寡核巧酸，其中在所述退火條件下，所述骨架寡核巧酸的所述頭部和 尾部序列反式結(jié)合至所述祀向寡核巧酸的所述側(cè)接序列。
[0338] 37.如條款36所述的方法，其中所述骨架寡核巧酸包括所述頭部與尾部序列之間 的定制序列，其中所述定制序列不與所述探針的其他區(qū)域或所述祀標(biāo)片段互補。
[0339] 38.如條款36所述的方法，其中所述骨架寡核巧酸的所述頭部和尾部序列是相鄰 的。
[0340] 39.如條款32至35中任一項所述的方法，其中所述頭部和尾部序列在所述祀向寡 核巧酸的末端處并且在所述退火條件下順式結(jié)合至所述側(cè)接序列。
[0341] 40.如條款39所述的方法，其中所述祀向寡核巧酸包括所述祀向寡核巧酸與所述 頭部和/或尾部序列之間的定制序列，其中所述定制序列不與所述探針的其他區(qū)域或所述 祀標(biāo)片段互補。
[0342] 41.如條款29至34中任一項所述的方法，其中所述尾部序列在所述祀向寡核巧酸 的所述3 '末端，并且所述探針包括在其5 '末端具有所述頭部序列的骨架寡核巧酸，
[0343] 其中在所述退火條件下，所述尾部序列順式結(jié)合至所述祀向寡核巧酸的所述下游 側(cè)接序列，并且所述骨架寡核巧酸的所述頭部序列反式結(jié)合至所述祀向寡核巧酸的所述上 游側(cè)接序列。
[0344] 42.如條款41所述的方法，其中所述骨架寡核巧酸包括一對倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列，其中
[0345] 在所述退火條件下所述倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，從而將所述骨架寡核巧酸的 所述3 '末端與所述祀向寡核巧酸的所述5 '末端并置定位，并且其中
[0346] 在用于連接的所述條件下，所述祀向寡核巧酸的所述5'末端連接至所述骨架寡核 巧酸的所述3'末端W使得所述雙重連接產(chǎn)物是包括所述祀向寡核巧酸、所述祀標(biāo)片段和所 述骨架寡核巧酸的核酸環(huán)。
[0347] 43.如條款29至34中任一項所述的方法，其中所述頭部序列在所述祀向寡核巧酸 的所述5 '末端，并且所述探針包括在其3 '末端具有所述尾部序列的骨架寡核巧酸，
[0348] 其中在所述退火條件下所述頭部序列順式結(jié)合至所述祀向寡核巧酸的所述上游 側(cè)接序列，并且所述骨架寡核巧酸的所述尾部序列反式結(jié)合至所述祀向寡核巧酸的所述下 游側(cè)接序列。
[0349] 44.如條款43所述的方法，其中所述骨架寡核巧酸包括一對倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列，其中
[0350] 在所述退火條件下所述倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，從而將所述骨架寡核巧酸的 所述5 '末端與所述祀向寡核巧酸的所述3 '末端并置定位，并且其中
[0351] 在用于連接的所述條件下，所述祀向寡核巧酸的所述3'末端連接至所述骨架寡核 巧酸的所述5'末端W使得所述雙重連接產(chǎn)物是包括所述祀向寡核巧酸、所述祀標(biāo)片段和所 述骨架寡核巧酸的核酸環(huán)。
[0352] 45.如條款41至44中任一項所述的方法，其中所述骨架寡核巧酸包括所述倒轉(zhuǎn)重 復(fù)序列之間的定制序列，W使得在所述退火條件下所述骨架寡核巧酸形成發(fā)夾環(huán)。
[0353] 46.如條款29至33中任一項所述的方法，其中包含所述頭部和尾部序列和所述祀 標(biāo)片段的所述連續(xù)核酸鏈?zhǔn)蔷€性核酸鏈。
[0354] 47.如條款46所述的方法，其中所述尾部序列在所述祀向寡核巧酸的所述3 '末端， 并且所述探針包括在其5 '末端具有所述頭部序列的骨架寡核巧酸，
[0355] 其中在所述退火條件下，所述尾部序列順式結(jié)合至所述祀向寡核巧酸的所述下游 側(cè)接序列，并且所述骨架寡核巧酸的所述頭部序列反式結(jié)合至所述祀向寡核巧酸的所述上 游側(cè)接序列。
[0356] 48.如條款41、42或47中任一項所述的方法，其中所述祀向寡核巧酸包括所述下游 側(cè)接序列與所述尾部序列之間的定制序列，W使得在所述退火條件下所述祀向寡核巧酸形 成發(fā)夾環(huán)。
[0357] 49.如條款46所述的方法，其中所述頭部序列在所述祀向寡核巧酸的所述5 '末端， 并且所述探針包括在其3 '末端具有所述尾部序列的骨架寡核巧酸，
[0358] 其中在所述退火條件下所述頭部序列順式結(jié)合至所述祀向寡核巧酸的所述上游 側(cè)接序列，并且所述骨架寡核巧酸的所述尾部序列反式結(jié)合至所述祀向寡核巧酸的所述下 游側(cè)接序列。
[0359] 50.如條款43、44或49中任一項所述的方法，其中所述祀向寡核巧酸包括所述頭部 序列與所述上游側(cè)接序列之間的定制序列，W使得在所述退火條件下所述祀向寡核巧酸形 成發(fā)夾環(huán)。
[0360] 51.如條款41至45或47至50中任一項所述的方法，其中所述骨架寡核巧酸帶有捕 獲部分。
[0361] 52.如條款46所述的方法，其中所述探針包括包含具有自由5'末端的頭部序列的 骨架寡核巧酸，和包含具有自由3 '末端的尾部序列的骨架寡核巧酸，其中在所述退火條件 下所述頭部和尾部序列反式結(jié)合至所述祀向寡核巧酸的所述側(cè)接序列。
[0362] 53.如條款52所述的方法，其中一個或兩個骨架寡核巧酸進(jìn)一步包括定制序列，其 中所述定制序列不與所述探針的其他區(qū)域或所述祀標(biāo)片段互補。
[0363] 54.如條款52或條款53所述的方法，其中所述骨架寡核巧酸中的一個帶有捕獲部 分。
[0364] 55.如條款54所述的方法，其中另一個骨架寡核巧酸帶有異質(zhì)標(biāo)記。
[0365] 56.如條款55所述的方法，其中所述標(biāo)記是巧光團。
[0366] 57.如條款51或條款54至56中任一項所述的方法，其中檢測是否存在所述雙重連 接產(chǎn)物的步驟包括經(jīng)由所述捕獲部分將所述骨架寡核巧酸捕獲于底物上，洗涂所述底物W 移除未連接探針并且保持包括所述底物和所捕獲骨架寡核巧酸的所捕獲部分，并且測試所 捕獲部分中的所述雙重連接產(chǎn)物的存在。
[0367] 58.如條款55或條款56所述的方法，其中檢測是否存在所述雙重連接產(chǎn)物的步驟 包括經(jīng)由所述捕獲部分將所述骨架寡核巧酸捕獲于底物上，洗涂所述底物W移除未連接探 針并且保持包括所述底物和所捕獲骨架寡核巧酸的所捕獲部分，并且測試所捕獲部分中的 所述標(biāo)記的存在。
[0368] 59.如條款51或條款54至58中任一項所述的方法，其中所述捕獲部分是生物素。
[0369] 60.如條款29至59中任一項所述的方法，其中所述祀標(biāo)互補序列具有10至30個核 巧酸的長度。
[0370] 61.如條款29至60中任一項所述的方法，其中所述祀標(biāo)互補序列具有與所述祀標(biāo) 片段少于5個堿基對錯配。
[0371] 62.如條款61所述的方法，其中所述祀標(biāo)互補序列是所述祀標(biāo)片段的精確互補序 列。
[0372] 63.如條款29至條款62中任一項所述的方法，其中所述側(cè)接序列各自具有10至30 個核巧酸的長度。
[0373] 64.如條款29至63中任一項所述的方法，其中所述上游和下游側(cè)接序列彼此不同。
[0374] 65.如條款29至條款64中任一項所述的方法，其中所述頭部序列具有與所述上游 側(cè)接序列少于5個堿基對錯配并且所述尾部序列具有與所述下游側(cè)接序列少于5個堿基對 錯配。
[0375] 66.如條款65所述的方法，其中所述頭部序列是所述上游側(cè)接序列的精確互補序 列并且所述尾部序列是所述下游側(cè)接序列的精確互補序列。
[0376] 67.如條款29至66中任一項所述的方法，其中所述祀向寡核巧酸是線性的。
[0377] 68.如條款29至條款67中任一項所述的方法，其中所述樣品是片段化人染色體樣 品。
[0378] 69.如條款68所述的方法，其中所述核酸物質(zhì)是染色體并且所述祀標(biāo)序列是對運 個染色體有特異性的人基因組片段。
[0379] 70.如條款68所述的方法，其中所述核酸物質(zhì)是染色體基因座并且所述祀標(biāo)片段 是對所述人基因組的運個基因座有特異性的。
[0380] 71.如前述條款中任一項所述的方法，其中所述探針核酸是DNA。
[0381] 72.如條款68或條款69所述的方法，其中所述方法包括使片段化染色體樣品與用 于結(jié)合染色體的多個片段的一組探針接觸，其中所述組中的每個探針用于結(jié)合對運個染色 體有特異性的不同祀標(biāo)片段。
[0382] 73.如條款72所述的方法，其中所述探針共有共同定制序列。
[0383] 74.如前述條款中任一項所述的方法，其中所述方法包括使片段化染色體樣品與 用于結(jié)合兩個或更多個染色體的多個片段的兩組或更多組探針接觸，所述探針組包括：
[0384] 用于結(jié)合對第一染色體有特異性的多個祀標(biāo)片段的第一組探針，和
[0385] 用于結(jié)合對第二染色體有特異性的多個祀標(biāo)片段的第二組探針，和任選地
[0386] 用于結(jié)合對一或多個其他染色體有特異性的多個祀標(biāo)片段的一或多個其他探針 組。
[0387] 75.如條款74所述的方法，其中每個探針組包括用于結(jié)合對所述染色體有特異性 的多個祀標(biāo)片段的至少500個不同探針。
[0388] 76.如條款74或條款75所述的方法，其中一組內(nèi)的所述探針共有定制序列，所述定 制序列是運個組共同的并且不同于其他組中的探針的定制序列。
[0389] 77.如條款76所述的方法，其包括通過檢測并量化來自每一組探針的所述雙重連 接產(chǎn)物中的所述定制序列的累積信號來確定所述樣品中的所述兩個或更多個染色體的相 對數(shù)量。
[0390] 78.如條款72至77中任一項所述的方法，其中所述一個或多個染色體是人染色體。
[0391] 79.如條款28所述的方法，其中所述探針包括雙鏈選擇子構(gòu)建體，每個個別選擇子 包括與所述祀標(biāo)片段的所述末端互補的一個或兩個突出末端序列，其中
[0392] 在用于退火和連接的所述條件下，所述選擇子的所述末端序列雜交至所述片段的 所述末端序列并且連接至所述選擇子。
[0393] 80.如條款22所述的方法，其中所述探針是掛鎖探針，每個探針包括線性寡核巧 酸，所述線性寡核巧酸在末端具有祀標(biāo)互補序列并且在所述祀標(biāo)互補序列之間具有非祀標(biāo) 互補序列，其中
[0394] 在用于退火和連接的所述條件下，所述祀標(biāo)互補序列頭部對尾部地放在一起W便 雜交至所述祀標(biāo)序列的相鄰區(qū)域并且連接形成核酸環(huán)。
[03M] 81.如前述條款中任一項所述的方法，其中所述核酸物質(zhì)是染色體或染色體基因 座。
[0396] 82.如前述條款中任一項所述的方法，其中所述樣品是血液或組織樣品。
[0397] 83.如條款82所述的方法，其中所述樣品含有來自孕婦的血液的胎兒和母體DNA的 混合物。
[0398] 84.如條款81或條款82所述的方法，其中待檢測或量化的所述核酸物質(zhì)是腫瘤相 關(guān) DNA。
[0399] 85.如條款81或條款82所述的方法，其中待檢測或量化的所述核酸物質(zhì)是微生物 DNA。
[0400] 86.-種在從個體獲得的核酸樣品中相對于第二染色體或染色體基因座來量化第 一染色體或染色體基因座的方法，其包括
[0401] 使所述樣品與第一組探針和第二組探針接觸，其中所述第一組的所述探針各自特 異性識別所述第一染色體或染色體基因座內(nèi)的不同祀標(biāo)序列并且其中所述第二組的所述 探針各自特異性識別所述第二染色體或染色體基因座內(nèi)的不同祀標(biāo)序列，
[0402] 提供使得所述第一和第二染色體或染色體基因座中的所述祀標(biāo)序列變成至少部 分單鏈的條件，
[0403] 提供用于退火和連接的條件，在所述條件下所述探針雜交至其祀標(biāo)序列并且產(chǎn)生 連接產(chǎn)物，
[0404] 檢測作為來自由所述第一組探針?biāo)a(chǎn)生的所述連接產(chǎn)物的個別信號的組合的第 一累積信號，并且將其量化W確定第一信號水平，其中所述第一信號水平與所述樣品中的 所述第一染色體或染色體基因座的數(shù)量成比例，
[0405] 檢測作為來自由所述第二組探針?biāo)a(chǎn)生的所述連接產(chǎn)物的個別信號的組合的第 二累積信號，并且將其量化W確定第二信號水平，其中所述第二信號水平與所述樣品中的 所述第二染色體或染色體基因座的數(shù)量成比例，W及
[0406] 比較所述第一和第二信號水平，從而確定所述樣品中的所述第一和第二染色體或 第一和第二染色體基因座的相對數(shù)量。
[0407] 87.如條款83或條款86所述的方法，其用于診斷胎兒的=體性，其中所述核酸樣品 是從所述母親的血液獲得的無細(xì)胞胎兒DNA樣品，并且其中所述第一和第二信號水平的不 等比率指示=體性。
[0408] 88. -種用于結(jié)合單鏈祀標(biāo)核酸片段的核酸探針，其中所述探針包括
[0409] 祀向寡核巧酸，其比所述祀標(biāo)片段更長并且含有內(nèi)部祀標(biāo)互補序列，W使得所述 祀向寡核巧酸與所述祀標(biāo)片段之間的雜交形成位于所述祀向寡核巧酸的上游和下游側(cè)接 序列之間的雙鏈序列，和
[0410] 分別具有自由5'和3'末端的頭部和尾部序列，其中所述頭部和尾部序列分別與所 述上游和下游側(cè)接序列互補
[0411] W使得在所述祀標(biāo)片段存在下的退火條件下，所述頭部和尾部序列雜交至所述側(cè) 接序列，從而界定所述頭部序列的所述5 '末端與所述尾部序列的所述3 '末端之間的間隙， 其中所述祀標(biāo)片段雜交至所述間隙中的所述祀標(biāo)互補序列，從而將所述祀標(biāo)片段的所述末 端與所述頭部序列的所述5 '末端和所述尾部序列的所述3 '末端并置定位，并且其中
[0412] 所述間隙中的所述祀標(biāo)片段的雜交完成核酸環(huán)，所述環(huán)包括所述祀標(biāo)片段和所述 頭部和尾部序列。
[0413] 89.如條款88所述的核酸探針，其中所述頭部和/或尾部序列接合至定制序列，其 中所述定制序列不與所述探針的其他區(qū)域或所述祀標(biāo)片段互補。
[0414] 90.如條款88或條款89所述的核酸探針，其中單一核酸分子包括所述頭部和尾部 序列。
[0415] 91.如條款88或條款89所述的探針，其中所述頭部和尾部序列與所述祀向寡核巧 酸分開并且反式結(jié)合至所述側(cè)接序列。
[0416] 92.如條款91所述的探針，其中所述頭部和尾部序列分別在骨架寡核巧酸的5'和 3 '末端。
[0417] 93.如條款92所述的探針，其中所述骨架寡核巧酸包括所述頭部與尾部序列之間 的定制序列，其中所述定制序列不與所述探針的其他區(qū)域或所述祀標(biāo)片段互補。
[0418] 94.如條款92所述的探針，其中所述骨架寡核巧酸的所述頭部和尾部序列是相鄰 的。95. -種用于結(jié)合單鏈祀標(biāo)核酸片段的核酸探針，其中所述探針包括
[0419] 祀向寡核巧酸，其比所述祀標(biāo)片段更長并且含有內(nèi)部祀標(biāo)互補序列，W使得所述 祀向寡核巧酸與所述祀標(biāo)片段之間的雜交形成位于所述祀向寡核巧酸的上游和下游側(cè)接 序列之間的雙鏈序列，和
[0420] 分別具有自由5 '和3 '末端的頭部和尾部序列，其中所述頭部和尾部序列分別與所 述上游和下游側(cè)接序列互補
[0421] W使得在所述祀標(biāo)片段存在下的退火條件下，所述頭部和尾部序列雜交至所述側(cè) 接序列，從而界定所述頭部序列的所述5 '末端與所述尾部序列的所述3 '末端之間的間隙， 其中所述祀標(biāo)片段雜交至所述間隙中的所述祀標(biāo)互補序列，從而將所述祀標(biāo)片段的所述末 端與所述頭部序列的所述5 '末端和所述尾部序列的所述3 '末端并置定位，并且其中
[0422] 所述頭部序列是所述祀向寡核巧酸的5'末端和/或所述尾部序列是所述祀向寡核 巧酸的3'末端，W使得所述間隙中的所述祀標(biāo)片段的雜交完成包括所述祀標(biāo)片段、所述頭 部和尾部序列、所述祀標(biāo)互補序列和所述側(cè)接序列的核酸鏈。
[0423] 96.如條款88或條款95所述的探針，其中所述頭部和尾部序列在所述祀向寡核巧 酸的末端并且順式結(jié)合至所述側(cè)接序列。
[0424] 97.如條款88或條款95所述的探針，其中所述尾部序列是所述祀向寡核巧酸的3' 末端并且所述頭部序列是與所述祀向寡核巧酸分開的骨架寡核巧酸的5'末端。
[0425] 98.如條款88或條款95所述的探針，其中所述頭部序列是所述祀向寡核巧酸的5' 末端并且所述尾部序列是與所述祀向寡核巧酸分開的骨架寡核巧酸的3'末端。
[0426] 99.如條款97或條款98所述的探針，其中所述骨架寡核巧酸進(jìn)一步包括定制序列， 其中所述定制序列不與所述探針的其他區(qū)域或所述祀標(biāo)片段互補。
[0427] 100. -種用于結(jié)合單鏈祀標(biāo)核酸片段的核酸探針，其中所述探針包括
[0428] 祀向寡核巧酸，其比所述祀標(biāo)片段更長并且含有內(nèi)部祀標(biāo)互補序列，W使得所述 祀向寡核巧酸與所述祀標(biāo)片段之間的雜交形成位于所述祀向寡核巧酸的上游和下游側(cè)接 序列之間的雙鏈序列，
[0429] 包含具有自由5 '末端的頭部序列的骨架寡核巧酸，和
[0430] 包含具有自由3 '末端的尾部序列的骨架寡核巧酸，
[0431] 其中所述頭部和尾部寡核巧酸序列分別與所述上游和下游側(cè)接序列互補，并且其 中
[0432] -個骨架寡核巧酸帶有捕獲部分并且另一個骨架寡核巧酸帶有異質(zhì)標(biāo)記，
[0433] W使得在所述祀標(biāo)片段存在下的退火條件下，所述頭部和尾部序列雜交至所述側(cè) 接序列，從而界定所述頭部序列的所述5 '末端與所述尾部序列的所述3 '末端之間的間隙， 其中所述祀標(biāo)片段雜交至所述間隙中的所述祀標(biāo)互補序列，從而將所述祀標(biāo)片段的所述末 端與所述頭部序列的所述5 '末端和所述尾部序列的所述3 '末端并置定位，并且其中
[0434] 所述間隙中的所述祀標(biāo)片段的雜交完成包括所述祀標(biāo)片段和所述頭部和尾部序 列的核酸鏈，其中所述鏈帶有所述捕獲部分和所述標(biāo)記。
[0435] 101.如條款100所述的探針，其中所述捕獲部分是生物素。
[0436] 102.如條款100或條款101所述的探針，其中所述標(biāo)記是巧光團。
[0437] 103.如條款100至102中任一項所述的探針，其中一個或兩個骨架寡核巧酸進(jìn)一步 包括定制序列，其中所述定制序列不與所述探針的其他區(qū)域或所述祀標(biāo)片段互補。
[0438] 104.如條款88至103中任一項所述的探針，其中所述祀向寡核巧酸進(jìn)一步包括不 與所述探針的其他區(qū)域或所述祀標(biāo)片段互補的定制序列。
[0439] 105.如條款88至條款104中任一項所述的探針，其中所述祀標(biāo)互補序列具有10至 30個核巧酸的長度。
[0440] 106.如條款88至105中任一項所述的探針，其中所述祀標(biāo)互補序列具有與所述祀 標(biāo)片段少于5個堿基對錯配。
[0441] 107.如條款106所述的探針，其中所述祀標(biāo)互補序列是所述祀標(biāo)片段的精確互補 序列。
[0442] 108.如條款88至107中任一項所述的探針，其中所述側(cè)接序列各自具有10至30個 核巧酸的長度。
[0443] 109.如條款88至108中任一項所述的探針，其中所述祀向寡核巧酸的所述上游和 下游側(cè)接序列彼此不同。
[0444] 110.如條款88至109中任一項所述的探針，其中所述頭部序列具有與所述上游側(cè) 接序列少于5個堿基對錯配并且所述尾部序列具有與所述下游側(cè)接序列少于5個堿基對錯 配。
[0445] 111.如條款110所述的探針，其中所述頭部和尾部序列是所述側(cè)接序列的精確互 補序列。
[0446] 112.如條款88至111中任一項所述的探針，其中所述祀向寡核巧酸是線性的。
[0447] 113.如條款88至112中任一項所述的探針，其中所述祀標(biāo)片段是限制性核酸內(nèi)切 酶片段。
[044引114.如條款88至113中任一項所述的探針，其中所述祀標(biāo)片段是人基因組片段。
[0449] 115.如條款114所述的探針，其中所述祀標(biāo)片段是對染色體有特異性的人基因組 片段。
[0450] 116.如條款115所述的探針，其中所述祀標(biāo)片段是對所述人基因組的一個基因座 所有特異性的。
[0451 ] 117.如條款88至116中任一項所述的探針，其中所述探針核酸是DNA。
[0452] 118.用于結(jié)合單鏈祀標(biāo)核酸片段的一組探針，其包括如條款88至117中任一項所 述的多個探針，所述探針具有用于結(jié)合多個不同祀標(biāo)片段的多個不同祀標(biāo)互補序列。
[0453] 119.如條款118所述的一組探針，其用于結(jié)合人染色體的多個片段，其中所述組中 的每個探針用于結(jié)合對運個染色體有特異性的不同祀標(biāo)片段。
[0454] 120.如條款119所述的一組探針，其中所述探針共有共同定制序列。
[0455] 121.用于結(jié)合兩個或更多個人染色體的不同片段的探針組，其包括：
[0456] 用于結(jié)合對第一染色體有特異性的多個祀標(biāo)片段的第一組探針，和
[0457] 用于結(jié)合對第二染色體有特異性的多個祀標(biāo)片段的第二組探針，和任選地
[0458] 用于結(jié)合對一或多個其他染色體有特異性的多個祀標(biāo)片段的一或多個其他探針 組。
[0459] 122.如條款121所述的探針組，其中一組內(nèi)的所述探針共有定制序列，所述定制序 列是運個組共同的并且不同于其他組中的探針的定制序列。
[0460] 123.-種試劑盒，其包括一或多個容器中的溶液中的如條款118至122中任一項所 述的一組或多組探針。
[0461 ] 124.如條款88至117中任一項所述的探針、如條款118至122中任一項所述的一組 或多組探針，或如條款123所述的試劑盒的用途，其用于針對核酸物質(zhì)的存在來測試樣品。
[0462] 125.-組探針用于針對從核酸物質(zhì)獲得的祀標(biāo)片段的存在來測試樣品的用途，
[0463] 其中所述組的每個探針包括祀向寡核巧酸，所述祀向寡核巧酸含有作為祀標(biāo)片段 的精確互補序列的序列，和頭部和尾部寡核巧酸序列，所述頭部和尾部寡核巧酸序列相鄰 于所述祀向寡核巧酸上的所述祀標(biāo)片段來雜交，
[0464] 其中所述祀標(biāo)片段與所述探針之間的雜交充當(dāng)所述祀標(biāo)片段連接至所述頭部和 尾部序列的模板。
[0465] 實施方案提供樣品分析方法，其包括：
[0466] a)將包括片段化DNA的樣品與包括第一組探針的探針混合物雜交，其中所述第一 組探針的探針：
[0467] i.雜交至第一染色體中的不同位點;并且
[0468] ii .在雜交至來自所述第一染色體的DNA片段時，形成含有可連接相鄰接合處的非 共價環(huán)形產(chǎn)物；
[0469] b)將所述可連接相鄰接合處連接在一起W產(chǎn)生多個共價環(huán)形連接產(chǎn)物；
[0470] C)通過滾環(huán)擴增(RCA)來擴增所述共價環(huán)形連接產(chǎn)物W產(chǎn)生多個RCA產(chǎn)物分子； [0471 ] d)標(biāo)記所述RCA產(chǎn)物分子；W及
[0472] e)量化在步驟d)中產(chǎn)生的標(biāo)記RCA產(chǎn)物分子的數(shù)目，從而提供對應(yīng)于所述樣品中 的第一染色體的DNA的量的估計值。
[0473] 在任何實施方案中，所述第一染色體可為染色體21、13或18。
[0474] 在任何實施方案中，探針混合物可包括第二組探針，其中第二組探針的探針雜交 至第二染色體中的不同位點并且在雜交至來自第二染色體的DNA片段時，形成含有可連接 相鄰接合處的非共價環(huán)形產(chǎn)物;并且步驟e)包括個別地量化對應(yīng)于所述第一和第二染色體 的滾環(huán)擴增產(chǎn)物分子的數(shù)目，從而提供對應(yīng)于所述樣品中的第一和第二染色體的DNA的相 對量的估計值。
[0475] 在一些實施方案中，第一組探針雜交至第一染色體的第一區(qū)域中的不同位點。在 運些實施方案中，探針混合物可包括第二組探針，其中第二組探針的探針雜交至第一染色 體中的第二區(qū)域中的不同位點并且在雜交至來自第二染色體的DNA片段時，形成含有可連 接相鄰接合處的非共價環(huán)形產(chǎn)物;并且步驟e)包括個別地量化對應(yīng)于第一染色體的第一和 第二區(qū)域的滾環(huán)擴增產(chǎn)物分子的數(shù)目，從而提供對應(yīng)于所述樣品中的第一染色體的第一和 第二區(qū)域的DNA的相對量的估計值。
[0476] 在任何實施方案中，第一染色體是染色體21并且第二染色體選自染色體13和染色 體18。
[0477] 在任何實施方案中，每個非共價環(huán)形產(chǎn)物包括來自樣品的DNA片段。在運些實施方 案中，步驟a)的探針可包括：
[0478] i.頭部序列和尾部序列，其中頭部和尾部序列在第一寡核巧酸分子的末端;和 [04巧]ii.夾持序列，其依序包括：
[0480] 與頭部序列互補的上游側(cè)接序列；
[0481] 與祀標(biāo)片段互補的祀標(biāo)互補序列;和
[0482] 與尾部序列互補的下游側(cè)接序列；
[0483] 并且在非共價環(huán)形產(chǎn)物中，祀標(biāo)片段的末端可連接地相鄰于第一寡核巧酸分子中 的頭部和尾部序列的末端。
[0484] 在運些實施方案中，夾持序列可在第一寡核巧酸分子中?；蛘?，夾持序列可在第二 寡核巧酸分子中。
[0485] 在任何實施方案中，所述樣品可用限制酶來消化。
[0486] 在任何實施方案中，所述樣品包括基因組DNA，例如，從血液分離的無細(xì)胞DNA。
[0487] 在任何實施方案中，樣品可包括從懷孕人的血液分離的無細(xì)胞DNA。
[0488] 在任何實施方案中，染色體可從組織活檢分離。
[0489] 在任何實施方案中，染色體可為微生物染色體。
[0490] 在任何實施方案中，量化步驟可通過W下步驟來進(jìn)行:將在步驟C)中產(chǎn)生的個別 滾環(huán)擴增產(chǎn)物分子彼此分離，并且計數(shù)界定區(qū)域或體積中的個別滾環(huán)擴增產(chǎn)物分子的數(shù) 目。
[0491 ]在運些實施方案中，量化步驟可通過W下來進(jìn)行：
[0492] i.將經(jīng)標(biāo)記寡核巧酸雜交至RCA產(chǎn)物分子，其中經(jīng)標(biāo)記寡核巧酸雜交至在RCA產(chǎn)物 中重復(fù)的序列，從而產(chǎn)生多個復(fù)合物，其各自包括單一RCA產(chǎn)物和雜交至RCA產(chǎn)物的多個經(jīng) 標(biāo)記寡核巧酸;并且
[0493] ii.計數(shù)經(jīng)標(biāo)記復(fù)合物的數(shù)目。
[0494] 在運些實施方案中，量化步驟可通過W下來進(jìn)行：
[04M] (a)獲得底物，其包括分布在底物表面上的經(jīng)標(biāo)記復(fù)合物；W及
[0496] (b)計數(shù)存在于底物的第一區(qū)域中的RCA產(chǎn)物的數(shù)目。
[0497] 在運些實施方案中，所述方法可包括：
[0498] (a)獲得底物，所述底物包括分布在底物表面上的第一和第二多個復(fù)合物，其中每 個復(fù)合物包括單一 RCA產(chǎn)物和雜交至RCA產(chǎn)物的多個標(biāo)記寡核巧酸探針，第一和第二多個復(fù) 合物可區(qū)分地標(biāo)記，并且第一和第二多個復(fù)合物對應(yīng)于不同染色體；W及
[0499] (b)計數(shù)存在于底物的第一區(qū)域中的第一多個RCA產(chǎn)物的數(shù)目并且獨立地計數(shù)第 二多個RCA產(chǎn)物的數(shù)目。在此實施方案中，寡核巧酸可巧光標(biāo)記。
[0500] 在運些實施方案中，第一組探針可包括至少50個探針。
【主權(quán)項】
1. 一種相對于樣品中的第二染色體或染色體基因座來量化第一染色體或染色體基因 座的方法，其包括 使所述樣品與第一組探針和第二組探針接觸，其中所述第一組的所述探針各自特異性 識別所述第一染色體或染色體基因座內(nèi)的不同靶標(biāo)序列并且其中所述第二組的所述探針 各自特異性識別所述第二染色體或染色體基因座內(nèi)的不同靶標(biāo)序列， 提供使得所述第一和第二染色體或染色體基因座中的所述靶標(biāo)序列變成至少部分單 鏈的條件， 提供用于退火和連接的條件，在所述條件下所述探針雜交至其靶標(biāo)序列并且產(chǎn)生連接 產(chǎn)物，每個連接產(chǎn)物是包括連接接合處的核酸環(huán)， 提供用于所述核酸環(huán)的滾環(huán)復(fù)制的條件， 檢測第一累積信號，所述第一累積信號是來自由所述第一組探針產(chǎn)生的所述連接產(chǎn)物 的所述滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物的個別信號組合，并且將所述第一累積信號量化以確定第一信號水 平，其中所述第一信號水平與所述樣品中的所述第一染色體或染色體基因座的數(shù)量成比 例， 檢測第二累積信號，所述第二累積信號是來自由所述第二組探針產(chǎn)生的所述連接產(chǎn)物 的所述滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物的個別信號組合，并且將所述第二累積信號量化以確定第二信號水 平，其中所述第二信號水平與所述樣品中的所述第二染色體或染色體基因座的數(shù)量成比 例，以及 比較所述第一和第二信號水平，從而確定所述樣品中的所述第一和第二核酸物質(zhì)的相 對數(shù)量。2. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述靶標(biāo)序列是不重疊的。3. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述探針組包括各自特異性識別不同靶 標(biāo)序列的至少10個探針。4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述探針組包括各自特異性識別不同靶標(biāo)序列的至 少100個探針。5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述探針組包括各自特異性識別不同靶標(biāo)序列的至 少1，000個探針。6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述探針組包括各自特異性識別不同靶標(biāo)序列的至 少10,000個探針。7. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述連接產(chǎn)物是雙重連接產(chǎn)物，其各自 包括第一和第二連接接合處。8. 如權(quán)利要求1至7中任一項所述的方法，其中所述滾環(huán)復(fù)制是超支化滾環(huán)復(fù)制。9. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述信號是熒光。10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其包括將所述樣品中的所述核酸與第一組探針和第二組 探針接觸并且檢測第一和第二累積信號，其中所述第一累積信號是由所述第一組探針產(chǎn)生 的連接產(chǎn)物的所述滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物發(fā)射的第一波長下的熒光，并且其中 所述第二累積信號是由所述第二組探針產(chǎn)生的連接產(chǎn)物的所述滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物發(fā)射的 第二波長下的焚光。11. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中將所述探針連接以產(chǎn)生所述環(huán)形連接 產(chǎn)物。12. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中將所述探針與所述靶標(biāo)序列連接以產(chǎn)生所述環(huán)形 連接產(chǎn)物。13. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述連接產(chǎn)物是包括所述靶標(biāo)序列的 核酸環(huán)。14. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述染色體或染色體基因座是片段化 染色體或染色體基因座。15. 如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述靶標(biāo)序列是所述染色體或染色體基因座的片 段的序列。16. 如權(quán)利要求14或權(quán)利要求15所述的方法，其中所述樣品是核酸的限制酶消化物并 且所述靶標(biāo)序列是限制片段。17. 如權(quán)利要求13至16中任一項所述的方法，其中所述探針連接至所述靶標(biāo)序列的每 個末端。18. 如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述探針各自包括 靶向寡核苷酸，其比所述靶標(biāo)片段更長并且含有內(nèi)部靶標(biāo)互補序列，以使得所述靶向 寡核苷酸與所述靶標(biāo)片段之間的雜交形成位于所述靶向寡核苷酸的上游和下游側(cè)接序列 之間的雙鏈序列，和 分別具有自由5'和3'末端的頭部和尾部序列，其中所述頭部和尾部序列分別與所述上 游和下游側(cè)接序列互補，其中 在用于退火和連接的所述條件下，所述頭部和尾部序列雜交至所述側(cè)接序列，并且所 述靶標(biāo)片段，如果存在，雜交至所述靶標(biāo)互補序列，從而將所述靶標(biāo)片段的所述末端與所述 頭部序列的所述5 '末端和所述尾部序列的所述3 '末端并置定位，其中所述靶標(biāo)片段的所述 3'末端連接至所述頭部序列的所述5'末端以形成第一連接接合處，并且所述靶標(biāo)片段的所 述5 '末端連接至所述尾部序列的所述3 '末端以形成第二連接接合處，從而產(chǎn)生雙重連接產(chǎn) 物，所述產(chǎn)物包括包含所述頭部和尾部序列和所述靶標(biāo)片段的連續(xù)核酸鏈，其中所述連續(xù) 鏈?zhǔn)黔h(huán)。19. 如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述探針包括雙鏈選擇子構(gòu)建體，每個個別選擇子 包括與所述靶標(biāo)片段的所述末端互補的一個或兩個突出末端序列，其中 在用于退火和連接的所述條件下，所述選擇子的所述末端序列雜交至所述片段的所述 末端序列并且連接至所述選擇子。20. 如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述探針是掛鎖探針，每個探針包括線性寡核苷 酸，所述線性寡核苷酸在末端具有靶標(biāo)互補序列并且在所述靶標(biāo)互補序列之間具有非靶標(biāo) 互補序列，其中 在用于退火和連接的所述條件下，所述靶標(biāo)互補序列頭部對尾部地放在一起以便雜交 至所述靶標(biāo)序列的相鄰區(qū)域并且連接形成核酸環(huán)。21. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述樣品是血液或組織樣品。22. 如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述樣品含有來自孕婦血液的胎兒和母體DNA的混 合物。23. 如權(quán)利要求21所述的方法，其中待檢測或量化的所述染色體或染色體基因座是腫 瘤相關(guān)DNA。24.如前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中待檢測或量化的所述核酸物質(zhì)是微生物 DNA0
【文檔編號】C12N15/11GK105934523SQ201480070068
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2014年11月26日
【發(fā)明人】C·O·F·達(dá)爾, J·O·埃瑞克森
【申請人】瓦納迪斯診斷公司