作為生物標(biāo)志物的共價(jià)鍵代謝物的制作方法
【專利摘要】一種用于確定動(dòng)物系統(tǒng)生物學(xué)狀態(tài)的方法,其包括測定動(dòng)物樣品中與大分子共價(jià)結(jié)合的小分子(CBSM)水平,并使用所述水平確定動(dòng)物中疾病風(fēng)險(xiǎn)、診斷狀態(tài)和疾病進(jìn)展。一種治療發(fā)展方法,其用于確定共價(jià)結(jié)合分子和其前體的結(jié)構(gòu),并改變導(dǎo)致這種結(jié)合的來源和機(jī)制以降低疾病風(fēng)險(xiǎn)和進(jìn)展。
【專利說明】作為生物標(biāo)志物的共價(jià)鍵代謝物
[0001]本發(fā)明涉及用于疾病及健康狀況的生物標(biāo)志物的識(shí)別和應(yīng)用。
[0002]本發(fā)明是基于以下觀察:正常過程與疾病過程均導(dǎo)致了小分子與大分子的共價(jià)結(jié)合,并且這些結(jié)合形式的小分子構(gòu)成了一類新的用于疾病和治療結(jié)果及治療導(dǎo)向的生物標(biāo)志物,所述標(biāo)志物可利用一系列新技術(shù)獲得并測量。
[0003]在本發(fā)明的一方面,提供了一種確定如人的動(dòng)物疾病狀態(tài)的方法,其包括測定動(dòng)物樣品中與大分子共價(jià)結(jié)合(CBSM)的小分子水平,及比較所述水平與標(biāo)準(zhǔn)值。
[0004]在一實(shí)施方案中,與大分子共價(jià)結(jié)合結(jié)合的小分子來自腸道微生物,其源自代謝過程、環(huán)境化學(xué)損傷或異?;瘜W(xué)環(huán)境,內(nèi)源或外源微生物,或一種或多種上述來源之間的過程的相互作用。
[0005]在另一實(shí)施方案中,所述大分子選自由DNA、RNA、蛋白質(zhì)、碳水化合物復(fù)合物和糖蛋白組成的組中。
[0006]在又一實(shí)施方案中,所述疾病狀態(tài)選自由疾病分類、疾病亞分類、疾病進(jìn)展、疾病的風(fēng)險(xiǎn)因素預(yù)測的發(fā)展、治療規(guī)范、治療結(jié)果的預(yù)測和治療導(dǎo)向的發(fā)展組成的組中。
[0007]本發(fā)明還提供了在如人的動(dòng)物的疾病中的治療性干預(yù)的方法,其包括控制與大分子共價(jià)結(jié)合的小分子的濃度水平。
[0008]在一實(shí)施方案中,所述大分子選自由DNA、RNA、蛋白質(zhì)、碳水化合物復(fù)合物和糖蛋白組成的組中。
[0009]在另一實(shí)施方案中,所述小分子來自腸道微生物,其源自代謝過程、環(huán)境化學(xué)損傷或異?;瘜W(xué)環(huán)境,內(nèi)源或外源微生物,或一種或多種上述來源的過程之間的相互作用。
[0010]在一實(shí)施方案中,所述疾病是情感性疾病,其選自由抑郁癥、精神分裂癥和孤獨(dú)癥組成的組中,退行性疾病,其選自由亨廷頓氏癥、阿爾茨海默病、帕金森癥、輕度認(rèn)知障礙、肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)、德里希(Freidrich)運(yùn)動(dòng)失調(diào)、癌癥、糖尿病和心血管疾病組成的組,或選自代謝或遺傳性疾病的先天性缺陷。
[0011]本發(fā)明還提供了一種干預(yù)方法以在具有患病危險(xiǎn)的如人的動(dòng)物中預(yù)防或減輕疾病,其包括控制動(dòng)物的與大分子共價(jià)結(jié)合的小分子。
[0012]在一實(shí)施方案中,所述危險(xiǎn)是情感性疾病,其選自由抑郁癥、精神分裂癥和孤獨(dú)癥組成的組,退行性疾病,其選自由亨廷頓氏癥、阿爾茨海默病、帕金森癥、輕度認(rèn)知障礙、肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)、德里希(Freidrich)運(yùn)動(dòng)失調(diào)、癌癥、糖尿病和心血管疾病組成的組,或選自代謝或遺傳性疾病的先天性缺陷。
[0013]本發(fā)明還提供了確定與大分子共價(jià)結(jié)合的小分子來源的性質(zhì)的方法,其包括模擬在如人的動(dòng)物中的生化過程創(chuàng)建和分析小分子與大分子的合成組合。
[0014]本發(fā)明還提供了在動(dòng)物中改性基因功能的方法,其包括控制與大分子共價(jià)結(jié)合的小分子的濃度水平,由此增加或減少靶基因的表達(dá)。
[0015]在一實(shí)施方案中,所述大分子選自由DNA、RNA、蛋白質(zhì)、碳水化合物復(fù)合物和糖蛋白組成的組中。
[0016]在另一實(shí)施方案中,所述小分子來自腸道微生物,其源自代謝過程、環(huán)境化學(xué)損傷或異常化學(xué)環(huán)境,內(nèi)源或外源微生物,或一種或多種上述來源的過程之間的相互作用。
[0017]在又一實(shí)施方案中,所述基因與以下疾病相關(guān),情感性疾病,其選自由抑郁癥、精神分裂癥和孤獨(dú)癥組成的組,退行性疾病,其選自由亨廷頓氏癥、阿爾茨海默病、帕金森癥、輕度認(rèn)知障礙、肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)、德里希(Freidrich)運(yùn)動(dòng)失調(diào)、癌癥、糖尿病和心血管疾病組成的組,或選自代謝或遺傳性疾病的先天性缺陷。
[0018]本發(fā)明還提供了發(fā)現(xiàn)治療的方法,其包括:
[0019]識(shí)別一類具有等效基因風(fēng)險(xiǎn)因素的受試者;
[0020]識(shí)別這一類受試者中患病和未患病的亞類;
[0021]鑒定與DNA、RNA和蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合的分子的差異,其區(qū)別類和亞類并影響系統(tǒng)反饋控制的表觀遺傳差異;分離并確定化學(xué)前體來源和共價(jià)結(jié)合區(qū)別物質(zhì)的結(jié)構(gòu);并提供或替換在患病分類中丟失或數(shù)量減少的這種化合物和/或抑制在患病分類中增加或過量的這種化合物。
[0022]在一實(shí)施方案中,所述疾病是神經(jīng)退行性疾病,其選自由亨廷頓氏癥、阿爾茨海默病、帕金森癥、輕度認(rèn)知障礙、肌萎縮側(cè)索硬化癥、德里希(Freidrich)運(yùn)動(dòng)失調(diào)、癌癥、糖尿病和心血管疾病組成的組,情感性疾病,其選自由抑郁癥、精神分裂癥和孤獨(dú)癥組成的組,或選自代謝或遺傳性疾病的先天性缺陷。
[0023]最后本發(fā)明提供了與大分子共價(jià)結(jié)合的小分子,其用于確定疾病風(fēng)險(xiǎn)、診斷狀態(tài)、預(yù)測疾病進(jìn)展和治療的發(fā)展。
[0024]本發(fā)明的進(jìn)一步特征和優(yōu)點(diǎn)將通過以下詳述并結(jié)合附圖示出,其中相同的數(shù)字表示相同的部分,其中:
[0025]圖1示意性地示出了確定生物體或個(gè)體的狀態(tài)、功能和風(fēng)險(xiǎn)的系統(tǒng)生物學(xué)反饋網(wǎng)絡(luò);
[0026]圖2示意性地示出了共價(jià)結(jié)合小分子生物標(biāo)志物的蛋白質(zhì)的制備流程圖及其質(zhì)譜結(jié)構(gòu)鑒定和在人血漿中的位置;
[0027]圖3A和3B是血漿中協(xié)同結(jié)合曲線和共價(jià)結(jié)合曲線的LCECA圖(低擴(kuò)增),其中圖3A示出了從對照受試者CC-17的血漿蛋白顆粒提取的協(xié)同結(jié)合小分子,且圖3B示出了由相同的顆粒用PK消化后獲得的共價(jià)結(jié)合小分子;
[0028]圖4A和4B是分析對照組的LCECA圖,其示出了血漿的PK消化和用于內(nèi)部自動(dòng)切割的PK消化空白對照;
[0029]圖5A-5D示出了比較對照組(CC-17)和HD(CX53)受試者的協(xié)同結(jié)合生物標(biāo)志物的LCECA圖,所述生物標(biāo)志物由乙腈釋放(左側(cè)圖)及PK消化ACN沉淀的顆粒;
[0030]圖6A-6B示出了來自HD和對照組受試者的血漿ACN沉淀的蛋白顆粒完全消化的LCECA圖,其示出了亨廷頓氏病狀態(tài)特征的兩種生物標(biāo)志物;
[0031]圖7A-7B是含有KI CAG 140HD小鼠和野生型小鼠RNA的腦組織提取組分的LCECA圖,其示出了與RNA共價(jià)結(jié)合的小分子中的8點(diǎn)顯著性差異;
[0032]圖8A-8B是含有來自R6/2小鼠和野生型小鼠腦組織的DNA的核組分的圖,其示出了共價(jià)結(jié)合小分子加合物中的7點(diǎn)差異;
[0033]圖9A-C說明了圖2中流程圖過程的實(shí)施(以吲哚3-丙酸(I3PA)為例),來制備共價(jià)結(jié)合小分子的標(biāo)準(zhǔn)品,確定其結(jié)合位點(diǎn)及其在LCECA曲線中的位置;
[0034]圖9A說明了合成的共價(jià)結(jié)合小分子的制備,并示意性地示出了通過創(chuàng)建能與大分子反應(yīng)并共價(jià)結(jié)合的小分子自由基中間體的方法,來創(chuàng)建共價(jià)結(jié)合小分子的標(biāo)準(zhǔn)品的技術(shù);
[0035]圖9B示出了含有氧化I3PA的共價(jià)結(jié)合犬尿酸片段的肽片段的鑒定,并示出了在Fenton反應(yīng)作用下IPA和血管緊張素的合成混合中,其初始氧化產(chǎn)物犬尿酸(KYA)的結(jié)合位點(diǎn)是酪氨酸基團(tuán),且因此在低水平可由LCECA檢測;以及
[0036]圖9C示出了在人受試者中使用合成產(chǎn)生的共價(jià)結(jié)合材料作為標(biāo)準(zhǔn)品鑒定共價(jià)結(jié)合的I3PA,并示出了LCECA曲線的一個(gè)通道的比較,其顯示在HD受試者中合成產(chǎn)生的蛋白質(zhì)/IPA共價(jià)結(jié)合產(chǎn)物在陣列中匹配的峰高于對照組,還示出了在生物標(biāo)志物的條件下,共價(jià)結(jié)合IPA(HD中更高)與協(xié)同結(jié)合IPA(HD中更低)的比例明顯地比任一單獨(dú)區(qū)室更適于作為生物標(biāo)志物。
[0037]圖1中示意性地示出了定義個(gè)體正常運(yùn)作的生化相互作用網(wǎng)絡(luò)。我們的疾病系統(tǒng)生物學(xué)概念來源于該網(wǎng)絡(luò)的暗示。基本上疾病不是癥狀而是該網(wǎng)絡(luò)內(nèi)調(diào)控失敗或反饋失敗。特別是對于晚期發(fā)作的慢性問題-心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、情感障礙、糖尿病、慢性疲勞及其他引發(fā)性免疫系統(tǒng)疾病、癥狀或我們通常所說的隨著時(shí)間,調(diào)控失敗或反饋喪失的結(jié)果的疾病。在疾病控制中,我們試圖集中于尋找生物標(biāo)志物的多參數(shù)技術(shù)的條件下定義這些網(wǎng)絡(luò)。
[0038]生物標(biāo)志物,是指與疾病相關(guān)的那些基因、蛋白質(zhì)、RNA轉(zhuǎn)錄物或小分子,其一般分類為:預(yù)測性生物標(biāo)志物,即示出疾病風(fēng)險(xiǎn)的生物標(biāo)志物;狀態(tài)的生物標(biāo)志物,即劃分疾病的生物標(biāo)志物;進(jìn)展的生物標(biāo)志物,即隨著疾病進(jìn)展的生物標(biāo)志物;及治療結(jié)果的生物標(biāo)志物,即隨著治療干預(yù)改變的生物標(biāo)志物。對于這些定義,我們現(xiàn)在增加暗示治療干預(yù)策略的生物標(biāo)志物。
[0039]對生物標(biāo)志物的研究已經(jīng)幾乎普遍地在具體的“組學(xué)”區(qū)室(圖1中A1-A4)中進(jìn)行-尋找基因、基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄物、蛋白質(zhì)或協(xié)同結(jié)合小分子。很少進(jìn)行“組學(xué)”區(qū)室之間相互作用的技術(shù)和評(píng)價(jià)研發(fā)。由于不希望被理論束縛,我們相信并已證明這些相互作用對提供疾病、治療結(jié)果和治療發(fā)展的生物標(biāo)志物具有顯著作用。本發(fā)明部分地認(rèn)識(shí)到“組學(xué)”相互作用測量的缺失并提出了評(píng)估這種相互作用的技術(shù)和數(shù)據(jù)。
[0040]在生物樣品中,小分子生物標(biāo)志物與大分子緊密地協(xié)同結(jié)合。評(píng)估小分子生物標(biāo)志物(代謝組學(xué))的技術(shù)通常使用萃取方案以去除并濃縮這種協(xié)同結(jié)合材料。然而,酶驅(qū)動(dòng)或正常/異常自由基產(chǎn)物(例如羥基、氧基、或硝基自由基類型或簡單類似反應(yīng))驅(qū)動(dòng)的生物/生化過程將導(dǎo)致這些緊密連接的小分子與諸如蛋白質(zhì)、DNA或RNA的大分子共價(jià)結(jié)合。這種結(jié)合能夠影響基因表達(dá)、酶的功能性和蛋白質(zhì)的折疊/聚集。由于上述過程都是疾病過程和疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)因素,原則上共價(jià)結(jié)合小分子的水平和性質(zhì)及游離小分子的分布和協(xié)同結(jié)合小分子比單基因、轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)或協(xié)同結(jié)合小分子與游離小分子的總體更好地反映了疾病或風(fēng)險(xiǎn)因素過程。
[0041]再次參照圖1,我們已認(rèn)識(shí)到了該作用,并設(shè)計(jì)了評(píng)估反饋鏈接1、2和5的方法,反饋鏈接1、2和5反映了其他反饋過程3、4、6和7及腸道微生物區(qū)室A5。在以下非限制性實(shí)施例中將描述幾種用于評(píng)估的方法和過程。
[0042]實(shí)施例1[0043 ] 過程I涉及與用于血液(血漿、白細(xì)胞、血小板、紅細(xì)胞、裂解細(xì)胞、裂解、全血)及其他體液和組織的蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合的小分子生物標(biāo)志物。
[0044]最簡單的形式是,用來評(píng)估協(xié)同結(jié)合小分子的使用萃取和沉淀血漿和其他組織制備的蛋白質(zhì)顆粒和其他大分子(DNA、RNA、碳水化合物復(fù)合物)將進(jìn)一步化學(xué)消化或酶消化。然后使用代謝組學(xué)技術(shù)諸如電化學(xué)檢測液相色譜(LCECA)、質(zhì)譜(MS)、LCEC/LCMS的并聯(lián)或串聯(lián)組合或核磁共振(NMR)評(píng)估這些制劑的概況。
[0045]這在圖2中樣品制備方法流程圖的左側(cè)圖中示出。圖3A-3B示出了對照組受試者血漿中協(xié)同結(jié)合分子的乙腈萃取組分(上部)和乙腈萃取的蛋白顆粒蛋白酶K消化后(底部)的LCECA圖譜的典型實(shí)施例。無衍生化條件下本實(shí)驗(yàn)中使用的LCECA只響應(yīng)于氨基酸酪氨酸、色氨酸和甲硫氨酸或這些氨基酸的小的二肽。圖中底部的箭頭是顆粒消化后的化合物,其不只是氨基酸或小肽,還表示與消化的蛋白氨基酸片段結(jié)合的其他片段。在生物學(xué)功能方面,這些結(jié)合化合物將在原則上改變這種關(guān)鍵過程,如酶的性能、蛋白質(zhì)聚集、細(xì)胞生長或細(xì)胞死亡。隨后的一種技術(shù)電化學(xué)陣列液相色譜(LCECA)檢測的圖譜,遵照
【申請人】先前的美國專利號(hào)6,194,217和6,210,970,示出了超過1000種響應(yīng),通常為酪氨酸、色氨酸或甲硫氨酸的小的二肽和與大分子共價(jià)結(jié)合的小分子,并響應(yīng)為上述氨基酸的加合物。作為對照實(shí)施例,圖4A-4B示出了通過相同過程進(jìn)行的人血漿及PK空白的消化。
[0046]圖5A-5D和6A-6B示出了在這種類型的制劑中HDvs.對照組的潛在生物標(biāo)志物的示例。值得注意的是,圖5A-5B中示出的對照受試者CCl7和HD受試者CX53提取的協(xié)同結(jié)合材料的LCECA圖譜的片段中,存在3個(gè)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的潛在狀態(tài)生物標(biāo)志物。然而,在圖5C-5D示出來自這些受試者的蛋白顆粒的PK消化圖譜中,生物標(biāo)志物更顯著。此外,在圖5A-6B示出的LCECA圖譜的另一區(qū)域中,存在獨(dú)自完全說明并區(qū)別疾病和對照受試者的兩個(gè)狀態(tài)生物標(biāo)志物。
[0047]該過程可以通過大小或其他方式擴(kuò)展至蛋白質(zhì)的分餾,以確定最容易結(jié)合小分子的特定蛋白質(zhì),并提供更具體的疾病或治療結(jié)果的生物標(biāo)志物或?qū)е轮委煱l(fā)展的生物標(biāo)志物。圖2中樣品制備流程圖的左側(cè)示出了該過程。
[0048]樣品通過層疊膜過濾器,依次從1M-300K、100K-50K-10K分子量阻截膜被采集。當(dāng)處理或分析時(shí)小于1K的組分時(shí),直接反映了游離代謝物或在大分子中與協(xié)同結(jié)合組分平衡的組分。用諸如乙腈甲醇沉淀的標(biāo)準(zhǔn)萃取技術(shù)處理連續(xù)大分子組分,并通過協(xié)同結(jié)合分子的分布作為分子量的函數(shù)依次分析上清液。
[0049]第一組分布數(shù)據(jù)的分析與所有協(xié)同結(jié)合種類的總和相比,對潛在的生物標(biāo)志物提供了更深刻的理解。例如,色氨酸與其初級(jí)代謝產(chǎn)物犬尿氨酸的關(guān)系部分地描述了對抗抑郁藥的反應(yīng)。然而,在300和100K之間的大分子組分中色氨酸與犬尿氨酸的關(guān)系是更高度描述的;AD血漿vs.對照組中吲哚丙酸的減少在100和50K之間的大分子組分中更明顯,且在100至50K組分中游離材料和結(jié)合材料的比例更明顯。
[0050]在蛋白質(zhì)沉淀的情況下獲得了大分子沉淀的第二組數(shù)據(jù),蛋白質(zhì)例如用胰蛋白酶(TP)或蛋白酶k(PK)或β-肽酶或其組合消化,然后通過PK消化的組分通過1K膜或通過TP消化的組分通過30Κ膜,并直接分析濾液。
[0051]通過引入硼摻雜金剛石傳感器作為系列中最后一個(gè)傳感器,可在電化學(xué)陣列中獲得其他潛在標(biāo)志物的分析,且還可使用LCECA和液相色譜-質(zhì)譜(LCMS)并聯(lián)進(jìn)一步分析,參照
【申請人】于2013年3月26日提交的PCT申請?zhí)朠CT/US 13/33918?;旧显谝肱饟诫s金剛石傳感器的EC陣列中不具有特征標(biāo)志或在并聯(lián)LCEC/LCMS并聯(lián)配置中不具有肽的提取質(zhì)譜的任何響應(yīng)都是與氨基酸基團(tuán)共價(jià)結(jié)合的小分子。
[0052]組織DNA、RNA的制備
[0053]雖然可以使用組織和DNA/RNA提取的標(biāo)準(zhǔn)制備方案,但最佳制備方案試圖保護(hù)至少化學(xué)損傷狀態(tài)的大分子。組織的制備方案包括通過以下過程進(jìn)行大分子溶解,所述過程例如在液氮溫度下研磨樣品,或在可接受的基質(zhì)(如蒸餾水或生理鹽水)中反復(fù)凍融之后使用高速“組織錐鉆頭”研磨機(jī),或在合適的基質(zhì)中使用循環(huán)高壓再次破壞。
[0054]實(shí)施例1I
[0055]全血臨床樣品的第二種方法是基于LCECA和并聯(lián)LCMS平臺(tái)分辯并定量比較多重信號(hào)的能力。由系列過濾通過連續(xù)小孔徑從血液分離DNA的過程提供了含有DNA的粗制劑,其可以分裝并按順序分析萃取制劑的一種組分,且直接用HCl裂解第二組分以使DNA破裂為堿基嘌呤和嘧啶并釋放共價(jià)結(jié)合材料作為堿加合物。然后比較兩種組分的圖譜以確定DNA特有的基團(tuán)。
[0056]對于DNA,初步研究優(yōu)選保護(hù)與DNA結(jié)合的組蛋白的方案??赏ㄟ^PK消化選擇性去除組蛋白且如上對消化液進(jìn)行共價(jià)結(jié)合小分子的分析。
[0057]可使用大小分級(jí)方案全部或孤立地評(píng)估RNA組分,以評(píng)估與來自tRNA、mRNA外來體等的組分的結(jié)合。評(píng)估來自組織的大分子組分,以獲得來自上述代謝組的協(xié)同和共價(jià)結(jié)合化合物的各種蛋白質(zhì)的分布。通過沉淀/萃取協(xié)同結(jié)合代謝組評(píng)估DNA和RNA組分,然后用PI內(nèi)切核酸酶或P I內(nèi)切核酸酶之后用AP堿性磷酸酶酶破壞或用鹽酸或其他其他弱酸消化。在這些方案下,例如純化的DNA堿基對為用于鹽酸消化的5 ’單磷酸(P I)、或堿基對(P11AP)、或堿基鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶。如我們在之前的文章中所報(bào)道的,回顧之前文章的全部圖譜是7甲基鳥嘌呤(AnalB1chem.2013May 15 ; 436 (2): 112-20.do1:10.1016/j.ab.201 3.01.035.Epub 2013Feb 12,"A novel method for detecting 7-methyl guanine reveals aberrant methylat1n levels in Huntington disease,,,Thomas B,Matson S , Chopra V, Sun L,Sharma S,Hersch S, Rosas HD,Scherzer C,F(xiàn)errante RjMatson W),在響應(yīng)圖譜中的其他峰以及諸如7甲基鳥嘌呤或8羥基鳥嘌呤的堿基對的直接改性與其他分子直接相關(guān),所述分子與堿基對或堿基對單磷酸鹽或堿基共價(jià)結(jié)合。這些可通過DNA或RNA溶解過程獲得,且代表固有地響應(yīng)傳感器的種類,或響應(yīng)為示出不同色譜分離的堿基對加合物。
[0058]在之前的文章中我們還報(bào)道了從腦組織中分離RNA和DNA的技術(shù),假設(shè)比例變化表示表觀遺傳差異后開發(fā)DNA和RNA中鳥嘌呤和7甲基鳥嘌呤的靶向方法。靶標(biāo)分析的要點(diǎn)是獲得鳥嘌呤和7甲基鳥嘌呤的清楚信號(hào),其描述了在野生型和CAG 140HD小鼠模型中及人死后HD和對照組腦中的表觀遺傳變化。這包括了協(xié)同結(jié)合物的去除和LCECA的大量操作。然而,當(dāng)我們意識(shí)到了“干擾物”作為共價(jià)結(jié)合小分子的潛在重要性時(shí),我們重新分析了整個(gè)色譜結(jié)果。
[0059]圖7A-7B和8A-8B示出了在KI CAG 140小鼠和野生型小鼠RNA中明顯不同的8種其他共價(jià)結(jié)合物(甲醇組分)(圖7A-7B),及在野生型R6/2小鼠DNA中明顯不同的11種其他共價(jià)結(jié)合物(核組分)(圖8A-8B)。這些其他共價(jià)結(jié)合加合物使用多元PLS-DA和一個(gè)測試模型完全區(qū)分了基因改性動(dòng)物和野生型動(dòng)物。還觀察到DNA和RNA中的共價(jià)結(jié)合物區(qū)分了CAG 140晚期發(fā)病HD模型和R6/2初期發(fā)病模型。這暗示HD中的苯酚轉(zhuǎn)化(phenoconvers1n)的時(shí)間與DNA和RNA結(jié)合的特定物相關(guān),其反過來暗示治療干擾以拖延或預(yù)防攜帶HD基因的受試者的癥狀產(chǎn)生。
[0060]由于不希望受理論束縛,認(rèn)為所有這些物質(zhì)都可能涉及DNA和RNA的功能性,從而反映并確定圖1中網(wǎng)絡(luò)的作用。這個(gè)網(wǎng)絡(luò)的功能反過來確定了個(gè)體的疾病結(jié)果。
[0061]實(shí)施例1II
[0062]用于鑒定共價(jià)結(jié)合材料的來源的方法:
[0063]許多小分子共價(jià)結(jié)合大分子的過程包括通過利用羥基硝基類自由基進(jìn)行攻擊創(chuàng)建小分子自由基中間體。我們已制備了帶有如犬尿氨酸或吲哚丙酸的小分子飽和的協(xié)同位點(diǎn)的各種蛋白質(zhì)、RNA和DNA ο使用Fenton反應(yīng)的各種變體,過氧化物/硝酸鹽使這些制劑經(jīng)過自由基攻擊,然后進(jìn)行如上過程。圖4-8示出了許多響應(yīng)的來源的鑒定。我們使用這種方法鑒定PK消化血漿中的物種,作為自由基攻擊吲哚丙酸隨后與蛋白質(zhì)結(jié)合形成的化合物。這個(gè)過程在9A-C中說明。第一,如圖9A示意性地示出的,存在大分子的情況下通過創(chuàng)建小分子的自由基中間體,小分子與大分子(蛋白質(zhì)或肽片段、DNA、RNA等)結(jié)合。在這個(gè)實(shí)例中我們使用傳統(tǒng)的Fenton型反應(yīng)創(chuàng)建自由基。在其他申請中,其他創(chuàng)建自由基中間體的方法,諸如電化學(xué)氧化(即用于羥基吲哚)或紫外線照射(即用于DNA或RNA的非電化學(xué)活性加合物)將是優(yōu)選方法。第二,如圖9B所示,制備的材料經(jīng)濃縮并經(jīng)過質(zhì)譜以確定蛋白質(zhì)或肽中的氨基酸結(jié)合位點(diǎn)及DNA或RNA中的堿基對結(jié)合位點(diǎn)。在這個(gè)實(shí)例中,示出了 I3PA與酪氨酸結(jié)合作為其反應(yīng)中間體犬尿酸的產(chǎn)物。第三,合成標(biāo)準(zhǔn)品是用于特定研究的合適的蛋白質(zhì)制備,在這種情況下評(píng)估人血漿蛋白質(zhì)、人血清蛋白(HSA)。同樣地萃取協(xié)同結(jié)合材料和血漿制劑并用于鑒別人血漿中的共價(jià)結(jié)合物質(zhì)。在這個(gè)實(shí)例中,我們鑒定了對照組中更低水平的協(xié)同結(jié)合I3PA和亨廷頓氏疾病受試者具有較高水平的氧化損傷。
[0064]我們的分析示出了共價(jià)結(jié)合小分子生物標(biāo)志物(CBSM)的強(qiáng)識(shí)別狀態(tài)及動(dòng)物中數(shù)據(jù)預(yù)測進(jìn)展。其他研究的蛋白質(zhì)中CBSM的分布使我們得出結(jié)論,其可預(yù)測抑郁癥和精神分裂癥的治療結(jié)果,亨廷頓氏疾病的表型轉(zhuǎn)變及輕度認(rèn)知障礙轉(zhuǎn)化為阿爾茨海默氏病的時(shí)間。因此相信其適用為在疾病或潛在疾病范圍內(nèi)狀態(tài)、風(fēng)險(xiǎn)、治療監(jiān)測和預(yù)測的生物標(biāo)志物。
[0065]CBSM還可用于治療性干預(yù)和藥物開發(fā)。這樣做的原因是,許多小分子相對強(qiáng)地共價(jià)結(jié)合大分子。是否遺傳的或環(huán)境因素誘導(dǎo)的或遺傳和環(huán)境因素相互作用的早期危險(xiǎn)狀態(tài),如高發(fā)病率的海灣戰(zhàn)爭退伍軍人中的肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥或暴露于殺蟲劑/除草劑的農(nóng)業(yè)工人的帕金森癥導(dǎo)致了這些小分子與例如DNA或關(guān)鍵蛋白質(zhì)的結(jié)合。這種結(jié)合反過來會(huì)影響基因組的作用(表觀遺傳)或酶的功能性。例如,后者作用的可能性是在犬尿氨酸途徑中小分子與酶結(jié)合,影響抑郁癥的發(fā)作或治療結(jié)果。由于不希望受理論束縛,認(rèn)為這種結(jié)合可能是與抑郁癥相關(guān)的路徑中化合物水平不同的原因。理解哪種化合物與大分子結(jié)合提供了設(shè)計(jì)化合物或方法的路線,以在結(jié)合位點(diǎn)用不經(jīng)過自由基或產(chǎn)生共價(jià)結(jié)合的化學(xué)過程的化合物取代。
[0066]可選地理解與DNA共價(jià)結(jié)合的化合物允許化合物的設(shè)計(jì)方法以特異性改變基因組的功能,例如通過表觀遺傳共價(jià)結(jié)合關(guān)閉乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)基因的功能。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種確定動(dòng)物疾病狀態(tài)的方法,其包括測定動(dòng)物樣品中與大分子共價(jià)結(jié)合的小分子水平,及比較所述水平與標(biāo)準(zhǔn)值。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于一種或多種以下特征: (a)其中所述與大分子共價(jià)結(jié)合的小分子來自腸道微生物,其源自代謝過程、環(huán)境化學(xué)損傷或異?;瘜W(xué)環(huán)境,內(nèi)源或外源微生物,或一種或多種上述來源的過程之間的相互作用; (b)其中所述大分子選自由DNA、RNA、蛋白質(zhì)、碳水化合物復(fù)合物和糖蛋白組成的組中; (c)其中所述疾病狀態(tài)選自由疾病分類、疾病亞分類、疾病進(jìn)展、疾病的風(fēng)險(xiǎn)因素預(yù)測的發(fā)展、治療規(guī)范、治療結(jié)果的預(yù)測和治療導(dǎo)向的發(fā)展組成的組中;以及 (d)其中所述動(dòng)物是人。3.—種用于動(dòng)物疾病的治療干預(yù)的方法,其包括控制與大分子共價(jià)結(jié)合的小分子的濃度水平。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法,其特征在于一種或多種以下特征: (a)其中所述大分子選自由DNA、RNA、蛋白質(zhì)、碳水化合物復(fù)合物和糖蛋白組成的組中; (b)其中所述小分子來自腸道微生物,其源自代謝過程、環(huán)境化學(xué)損傷或異常化學(xué)環(huán)境,內(nèi)源或外源微生物,或一種或多種上述來源的過程之間的相互作用; (c)其中所述疾病是情感性疾病,其選自由抑郁癥、精神分裂癥和孤獨(dú)癥組成的組,退行性疾病,其選自由亨廷頓氏癥、阿爾茨海默病、帕金森癥、輕度認(rèn)知障礙、肌萎縮側(cè)索硬化癥、德里希運(yùn)動(dòng)失調(diào)、癌癥、糖尿病和心血管疾病組成的組,或選自代謝或遺傳性疾病的先天性缺陷;以及 (d)其中所述動(dòng)物是人。5.—種在具有患病危險(xiǎn)的動(dòng)物中預(yù)防或改善疾病的干預(yù)方法,其包括控制與大分子共價(jià)結(jié)合的動(dòng)物的小分子。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于一種或多種以下特征: (a)其中所述危險(xiǎn)是情感性疾病,其選自由抑郁癥、精神分裂癥和孤獨(dú)癥組成的組,退行性疾病,其選自由亨廷頓氏癥、阿爾茨海默病、帕金森癥、輕度認(rèn)知障礙、肌萎縮側(cè)索硬化癥、德里希運(yùn)動(dòng)失調(diào)、癌癥、糖尿病和心血管疾病組成的組,或選自代謝或遺傳性疾病的先天性缺陷;以及 (b)其中所述動(dòng)物是人。7.—種確定與大分子共價(jià)結(jié)合的小分子來源的性質(zhì)的方法,其包括在動(dòng)物中用模擬生化過程創(chuàng)建和分析小分子與大分子的合成組合。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法,其中所述動(dòng)物包含人。9.一種在動(dòng)物中改性基因功能的方法,其包括控制與大分子共價(jià)結(jié)合的小分子的濃度水平,由此增加或減少靶基因的表達(dá)。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法,其特征在于一種或多種以下特征: (a)其中所述大分子選自由DNA、RNA、蛋白質(zhì)、碳水化合物復(fù)合物和糖蛋白組成的組中; (b)其中所述小分子來自腸道微生物,其源自代謝過程、環(huán)境化學(xué)損傷或異?;瘜W(xué)環(huán)境,內(nèi)源或外源微生物,或一種或多種上述來源之間的過程的相互作用; (C)其中所述基因與以下疾病相關(guān),情感性疾病,其選自由抑郁癥、精神分裂癥和孤獨(dú)癥組成的組,退行性疾病,其選自由亨廷頓氏癥、阿爾茨海默病、帕金森癥、輕度認(rèn)知障礙、肌萎縮側(cè)索硬化癥、德里希運(yùn)動(dòng)失調(diào)、癌癥、糖尿病和心血管疾病組成的組,或選自代謝或遺傳性疾病的先天性缺陷;以及 (d)其中所述動(dòng)物是人。11.一種治療發(fā)現(xiàn)的方法,其包括: 識(shí)別一類具有等效基因風(fēng)險(xiǎn)因素的受試者; 識(shí)別這一類中患病和未患病的亞類; 鑒定與DNA、RNA和蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合分子中的差異,其區(qū)別分類和亞類并影響系統(tǒng)反饋控制中的表觀遺傳差異; 分離并確定化學(xué)前體來源和共價(jià)結(jié)合鑒別物質(zhì)的結(jié)構(gòu);以及 提供或替換在患病分類中丟失或數(shù)量減少的這種化合物和/或抑制在患病分類中增加或過量的這種化合物。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的發(fā)現(xiàn)的方法,其中所述疾病為: 神經(jīng)退行性疾病,其選自由亨廷頓氏癥、阿爾茨海默病、帕金森癥、輕度認(rèn)知障礙、肌萎縮側(cè)索硬化癥、德里希運(yùn)動(dòng)失調(diào)、癌癥、糖尿病和心血管疾病組成的組,情感性疾病,其選自由抑郁癥、精神分裂癥和孤獨(dú)癥組成的組,或選自代謝或遺傳性疾病的先天性缺陷。13.與大分子共價(jià)結(jié)合的小分子,其用于確定疾病風(fēng)險(xiǎn)、診斷狀態(tài)、預(yù)測疾病進(jìn)展和治療的發(fā)展。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105934520SQ201580006282
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2015年1月30日
【發(fā)明人】韋恩·R·馬特森
【申請人】伊克斯塞拉有限公司