本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2016-08-18，申請(qǐng)?zhí)枮?01610687850.2，發(fā)明名稱(chēng)為“一種用于抑制靶基因mrna表達(dá)的寡核酸分子及其成套組合物”的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于抑制kras靶基因mrna表達(dá)的寡核酸分子及其成套組合物。
背景技術(shù)：
：自andrewfire和craigmello等人1998年在線蟲(chóng)(caenorhabditiselegans)中首次發(fā)現(xiàn)rnai現(xiàn)象，tuschl和philsharp等人2001年證實(shí)在哺乳動(dòng)物中也存在rnai之后，關(guān)于rnai的機(jī)制原理、基因功能和臨床應(yīng)用等研究取得了一系列的進(jìn)展。rnai不僅在防御病毒感染，防轉(zhuǎn)座子跳躍等多種機(jī)體保護(hù)機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用(huntvagneretal,2001；tuschl,2001；waterhouseetal,2001；zamore2001)，其相關(guān)產(chǎn)品也是十分有前景的候選藥物。elbashir等人在2001年發(fā)現(xiàn)sirna抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞中特異基因的沉默，研究表明sirna可特異的同序列互補(bǔ)的靶mrna結(jié)合，并使其降解。長(zhǎng)片段的雙鏈rna被dicer酶切割成21-23個(gè)堿基長(zhǎng)度短片段rna，其中兩條鏈中同靶mrna結(jié)合的鏈稱(chēng)為反義鏈或引導(dǎo)鏈，另一條鏈稱(chēng)為正義鏈或過(guò)客鏈。研究發(fā)現(xiàn)體外化學(xué)合成的sirna進(jìn)入細(xì)胞后也同樣發(fā)揮rnai作用，而且有效降低了長(zhǎng)鏈rna引起的免疫反應(yīng)。但由于sirna的有效性受序列特異性，靶細(xì)胞特異性、靶點(diǎn)等多種因素影響，基于現(xiàn)有設(shè)計(jì)原則獲得的sirna并不是每個(gè)都能達(dá)到有效的沉默效果；一般設(shè)計(jì)的sirna約有50％以上具有沉默靶mrna的效果，僅25％的sirna具有75％以上的沉默效果，因此后續(xù)對(duì)設(shè)計(jì)合成的sirna還需要實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證、篩選或優(yōu)化，費(fèi)時(shí)耗力；基于此，一種通用、高效、快速的rnai技術(shù)與產(chǎn)品亟待開(kāi)發(fā)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種抑制或降低kras靶基因表達(dá)的sirna。本發(fā)明提供的sirna，由正義鏈和與其反向互補(bǔ)(完全反向互補(bǔ))的反義鏈組成；所述正義鏈由19-27個(gè)核苷酸組成，且所述正義鏈從5’末端起5-9個(gè)連續(xù)核苷酸和從3’末端起5-9個(gè)連續(xù)核苷酸均進(jìn)行2＇-o-核糖修飾。所述反義鏈與所述靶基因上的區(qū)段反向互補(bǔ)，所述靶基因?yàn)閗ras；所述正義鏈的堿基組成序列選自seqidno.1,seqidno.5,seqidno.7,seqidno.9，seqidno.13；所述反義鏈的堿基組成序列選自seqidno.2,seqidno.6,seqidno.8,seqidno.10，seqidno.14。sirna通過(guò)其反義鏈與靶基因上的靶序列反向互補(bǔ)結(jié)合；在發(fā)明的一些實(shí)施例中,sirna分子中至少包括一個(gè)非天然的核苷酸，如經(jīng)化學(xué)修飾的核苷酸，優(yōu)選在正義鏈或正義區(qū)的化學(xué)修飾。在一些實(shí)施例中，核糖的2＇-o-核糖修飾具體為2＇-o-甲基修飾，2＇-o-氟代修飾，2＇-moe修飾。本發(fā)明的正義鏈修飾可起到：(1)增強(qiáng)sirna分子穩(wěn)定性；(2)減少sirna分子脫靶性；(3)提高sirna分子特異性；(4)減少免疫激活反應(yīng)等作用。上述sirna中，所述正義鏈由24、25或26個(gè)核苷酸組成；或，所述正義鏈從5’末端起6或7或8個(gè)連續(xù)核苷酸和從3’末端起6或7或8個(gè)連續(xù)核苷酸均進(jìn)行2＇-o-核糖修飾。上述sirna中，所述2＇-o-核糖修飾為2＇-o-甲基(2＇-o-me)修飾、2＇-o-氟代修飾、或2＇-moe修飾。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種抑制或降低靶基因表達(dá)的成套sirna。本發(fā)明提供的成套sirna，包括至少5個(gè)上述的sirna。每個(gè)sirna對(duì)應(yīng)同一靶基因的不同靶序列。上述成套sirna中，所述成套sirna由5、6、7、8、9或10個(gè)sirna組成。上述成套sirna中，所述成套sirna中單個(gè)sirna分子的物質(zhì)的量可以是隨機(jī)的，任2個(gè)sirna的物質(zhì)的量比為1:1-1:5；優(yōu)選單個(gè)sirna分子的物質(zhì)的量相等1:1。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供另一種如下1)或2)物質(zhì)。本發(fā)明提供的1)或2)物質(zhì)：1)抑制或降低靶基因表達(dá)的試劑，其為如下a或b：a包括上述的sirna和轉(zhuǎn)染試劑；b包括上述成套sirna和轉(zhuǎn)染試劑；2)抑制或降低靶基因表達(dá)的試劑盒，其包括上述sirna或上述的成套sirna或所述試劑。上述物質(zhì)中，所述成套sirna中所有sirna分子在所述試劑中的總濃度為2-100nm；每個(gè)sirna分子在所述試劑中的濃度均為10-20nm；上述sirna或上述的成套sirna或上述的物質(zhì)在抑制或降低靶基因表達(dá)中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；或上述sirna或上述的成套sirna或上述的物質(zhì)在抑制或降低細(xì)胞中靶基因表達(dá)中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；或上述sirna或上述的成套sirna或上述的物質(zhì)在制備抑制或降低靶基因表達(dá)產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；或上述sirna或上述的成套sirna或上述的物質(zhì)在制備抑制或降低細(xì)胞中靶基因表達(dá)中產(chǎn)品的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；或上述sirna或上述的成套sirna或上述的物質(zhì)在制備預(yù)防或緩解或治療由靶基因表達(dá)引起的疾病中的產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：將抑制或降低靶基因表達(dá)的sirna的正義鏈從5’末端起5-9個(gè)連續(xù)核苷酸和從3’末端起5-9個(gè)連續(xù)核苷酸均進(jìn)行2＇-o-核糖修飾；所述sirna由正義鏈和與其反向互補(bǔ)的反義鏈組成；所述正義鏈由19-27個(gè)核苷酸組成；所述反義鏈與所述靶基因上的區(qū)段反向互補(bǔ)。或所述2＇-o-核糖修飾具體為2＇-o-甲基修飾、2＇-o-氟代修飾、或2＇-moe修飾。本發(fā)明第四個(gè)目的是提供一種產(chǎn)品。本發(fā)明提供的產(chǎn)品，包括上述sirna或上述的成套sirna或上述的物質(zhì)；和/或，所述產(chǎn)品具有如下1)-3)中至少一種功能：1)抑制或降低靶基因表達(dá)；2)抑制或降低細(xì)胞中靶基因表達(dá)；3)預(yù)防或緩解或治療由靶基因表達(dá)引起的疾病。上述中，所述靶基因?yàn)槟[瘤、癌癥、心血管疾病、炎癥、傳染病或罕見(jiàn)病相關(guān)基因；或，所述腫瘤、癌癥、心血管疾病、炎癥、傳染病或罕見(jiàn)病相關(guān)基因具體為kras；所述細(xì)胞具體為脊椎動(dòng)物細(xì)胞、哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞、人類(lèi)細(xì)胞；或，靶基因異常表達(dá)的(表達(dá)水平高于正常受試者)或有基因缺陷的(如染色體異?；蚧蛲蛔?的癌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、炎性細(xì)胞、血液細(xì)胞、白細(xì)胞、腦細(xì)胞、肝細(xì)胞、肺細(xì)胞、腎細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、宮頸細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；或，所述細(xì)胞具體為hela、293t、a549或huvec細(xì)胞；或，所述產(chǎn)品具體為藥物。上述靶基因可以是腫瘤或癌癥相關(guān)基因，優(yōu)選kras基因。上述靶基因?qū)?yīng)的sirna如下：靶基因?yàn)閗ras，其對(duì)應(yīng)的成套sirna為rb-kra-d1、rb-kra-d2、rb-kra-d3、rb-kra-d4、rb-kra-d5、rb-kra-d6、rb-kra-d7中至少6個(gè)。本發(fā)明還包括一種降低細(xì)胞中靶基因表達(dá)的方法，所述方法包括使用上述的混合物，方法包括a)獲得sirna分子或其混合物，所述sirna分子混合物至少包括5,6,7,8,9,10個(gè)sirna；b)將sirna分子混合物遞送進(jìn)細(xì)胞。sirna分子混合物(成套sirna)中本發(fā)明是通過(guò)向細(xì)胞引入sirna分子或其混合物，抑制靶基因的表達(dá)；引入可以為直接引入或間接引入，除使用轉(zhuǎn)染試劑外，其他已知的各種將sirna分子遞送如細(xì)胞的方式都可采用，如注射、載體轉(zhuǎn)染(載體可以是質(zhì)粒或病毒)、電穿孔，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等?！盎パa(bǔ)”是指核堿基之間配對(duì)的能力。本發(fā)明中也可用堿基或堿基長(zhǎng)度來(lái)表示核苷酸或rna分子鏈的長(zhǎng)度。本發(fā)明的sirna分子的耐受錯(cuò)配為至少1-5個(gè)核苷酸，其優(yōu)選耐受位置在單鏈或雙鏈末端，耐受的堿基個(gè)數(shù)受互補(bǔ)區(qū)長(zhǎng)度的影響?！板e(cuò)配”是指核堿基不能配對(duì)。sirna分子混合物優(yōu)選固相合成法獲得，也可通過(guò)轉(zhuǎn)錄法或其他方法合成。本發(fā)明的試劑盒除sirna分子和/或sirna分子混合物外，還可包括緩沖液、標(biāo)記物(標(biāo)記物可以是染料、放射性標(biāo)記物質(zhì)或熒光標(biāo)記物質(zhì)，標(biāo)記的位置可以在反義鏈或正義鏈末端)，轉(zhuǎn)染試劑，容器，試管，退火試劑，對(duì)照sirna(包括nc對(duì)照，n對(duì)照)等；試劑盒中的sirna分子混合物可以按單個(gè)分裝也可組合后放放置在一個(gè)容器中；試劑盒成分可以是凍干粉或溶液。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，單個(gè)的sirna分子穩(wěn)定性好，一方面提升了體外或體內(nèi)抑制試驗(yàn)中對(duì)核酸酶的抗性；另一方面有利于儲(chǔ)存和運(yùn)輸；同時(shí)降低了sirna分子的脫靶效應(yīng)。成套sirna更是一種通用、有效、快速的rnai工具，其優(yōu)勢(shì)在于：(1)能確保60％以上的抑制率，75％以上的sirna分子混合物能達(dá)到75％以上的抑制率，50％以上的sirna分子混合物能達(dá)到85％以上的抑制率，相對(duì)于單個(gè)sirna分子，整體提高了沉默的機(jī)率與沉默的效率；在現(xiàn)有技術(shù)中，一般設(shè)計(jì)的sirna僅有50％的概率能抑制靶基因表達(dá)，僅25％的sirna能達(dá)到75％以上的抑制率。(2)不需特殊設(shè)計(jì)，后續(xù)不需對(duì)sirna進(jìn)行篩選、優(yōu)化，或?qū)ζ湫ЧM(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，省時(shí)省力。(3)解決了在不同細(xì)胞系中、不同轉(zhuǎn)染試劑處理時(shí)，sirna作用不一致的問(wèn)題，可在多個(gè)細(xì)胞系中有效沉默靶基因，且不受轉(zhuǎn)染試劑的影響。(4)增強(qiáng)了單個(gè)sirna分子的基因沉默效果，起到了協(xié)同增效的作用。(5)降低了sirna分子的脫靶效應(yīng)。本發(fā)明中sirna分子混合物可以影響至少50％,55％，60％,65％70％,75％，80％,85％，90％的細(xì)胞中靶基因的表達(dá)，抑制率至少為45％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％。本發(fā)明的sirna分子混合物在不同細(xì)胞系中、不同轉(zhuǎn)染試劑處理時(shí)可以確保至少60％的靶基因抑制效果。本發(fā)明的“抑制”或類(lèi)似表達(dá)可指rna或蛋白水平或相關(guān)生化指標(biāo)的表達(dá)、活性或指標(biāo)相對(duì)陰性對(duì)照的降低。附圖說(shuō)明圖1為sirna體外穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、sirna的制備設(shè)計(jì)的所有單個(gè)sirna均能靶向靶基因的所有轉(zhuǎn)錄本,設(shè)計(jì)方法參照elbashiretal.2002；paddisonetal.2002；reynoldsetal.2004；ui-teietal.2004等人的方法(elbashir,s.m.,harborth,j.,weber,k.,andtuschl,t.2002.analysisofgenefunctioninsomaticmammaliancellsusingsmallinterferingrnas.methods26:199–213；paddison,p.j.,caudy,a.a.,bernstein,e.,hannon,g.j.,andconklin,d.s.2002.shorthairpinrnas(shrnas)inducesequence-specificsilencinginmammaliancells.genes&dev.16:948–958；reynolds,a.,leake,d.,boese,q.,scaringe,s.,marshall,w.s.,andkhvorova,a.2004.rationalsirnadesignforrnainterference.nat.biotechnol.22:326–330；ui-tei,k.,naito,y.,takahashi,f.,haraguchi,t.,ohki-hamazaki,h.,juni,a.,ueda,r.,andsaigo,k.2004.guidelinesfortheselectionofhighlyeffectivesirnasequencesformammalianandchickrnainterference.nucleicacidsres.32:936–948)；為保證sirna的特異性，使用blast(basiclocalalignmentsearchtoo，http://www.ncbi.nlm.gov))分析序列同一性(identity)，選擇與其他序列同一性最小的序列。sirna由25個(gè)核苷酸組成的ss正義鏈和與其反向互補(bǔ)的反義鏈as組成，且為平末端；每個(gè)sirna通過(guò)其反義鏈與所述靶基因上的靶序列反向互補(bǔ)結(jié)合；as鏈和ss鏈完全反向互補(bǔ)，as鏈與靶基因上的靶序列完全反向互補(bǔ)，ss的從5’末端起7個(gè)連續(xù)核苷酸和從3’末端起7個(gè)連續(xù)核苷酸均經(jīng)過(guò)2＇-o-me修飾。靶基因如表1所示，靶基因?qū)?yīng)的sirna具體序列如表2所示。表1為靶基因表2為sirna分子序列表上述表中，ma、mu、mc和mg分別為2＇-o-me修飾后a、2＇-o-me修飾后u、2＇-o-me修飾后c和2＇-o-me修飾后g。實(shí)施例2、sirna細(xì)胞水平抑制試驗(yàn)將實(shí)施例1制備的表2所示的kras靶基因?qū)?yīng)的sirna分別單獨(dú)轉(zhuǎn)染hela細(xì)胞(來(lái)源于atcc)，具體如下：1、lf2k轉(zhuǎn)染100μllf2k轉(zhuǎn)染體系：1μllf2k(invitrogen，11668019)，5μlsirna(終濃度為100nm)和94μlopti-mem細(xì)胞培養(yǎng)基(thermofisherscientific，31985070)。上述sirna分別為實(shí)施例1制備的tp53、birc5、ctnnb1、cops5、stat3、vegfa、kras靶基因?qū)?yīng)的sirna。在細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)hela細(xì)胞，再向每個(gè)孔中加入上述100μl轉(zhuǎn)染體系，轉(zhuǎn)染48h，得到轉(zhuǎn)染不同靶基因?qū)?yīng)sirna的細(xì)胞。2、rt-pcr檢測(cè)抑制率轉(zhuǎn)染48h后，收集轉(zhuǎn)染不同靶基因?qū)?yīng)sirna的細(xì)胞，trizol法提取rna，reversetranscriptionmix反轉(zhuǎn)錄試劑盒用于反轉(zhuǎn)錄(廣州市銳博生物科技有限公司，c10170)，得到轉(zhuǎn)染不同靶基因?qū)?yīng)sirna的細(xì)胞的cdna。以cdna為模板，用表3所示的sirna對(duì)應(yīng)的靶基因的引物對(duì)進(jìn)行rt-pcr擴(kuò)增，以人的看家基因actin作為內(nèi)參基因(forward:5-tcaagatcattgctcctcctgag-3seqidno.15；reverse:5-acatctgctggaaggtggaca-3seqidno.16)，利用real-timepcr試劑盒sybrpremix(2×)(bio-rad750000131)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)。一個(gè)樣品的9個(gè)重復(fù)(每個(gè)單獨(dú)的樣品在轉(zhuǎn)染時(shí)有3個(gè)重復(fù)，在qpcr時(shí)每個(gè)重復(fù)做3個(gè)復(fù)孔)的ct誤差在±0.5，然后用cfx2.1進(jìn)行相對(duì)定量分析。spss19.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件數(shù)據(jù)分析，表中數(shù)據(jù)為其平均值，p值均<0.05。nc陰性對(duì)照組：轉(zhuǎn)染的sirna為無(wú)關(guān)非特異sirna，5'uucuccgaacgugucacgudtdt3'(seqidno.17)5'acgugacacguucggagaadtdt3'；(seqidno.18)n空白對(duì)照組：正常細(xì)胞，無(wú)sirna轉(zhuǎn)染。real-timepcr抑制率計(jì)算方式：抑制率＝nc陰性對(duì)照組mrna相對(duì)表達(dá)水平-sirna組的mrna相對(duì)表達(dá)水平nc陰性對(duì)照組mrna相對(duì)表達(dá)水平nc陰性對(duì)照組mrna的相對(duì)表達(dá)水平為1。表3為引物序列結(jié)果如表4所示，可以看出，針對(duì)kras靶基因，設(shè)計(jì)的sirna均起到了抑制靶基因表達(dá)的作用。表4為hela細(xì)胞中單個(gè)sirna的抑制率比較上述表中的d1-d7分別為針對(duì)kras靶基因的7個(gè)sirna。實(shí)施例3、成套sirna的制備1、設(shè)計(jì)原則成套sirna由5-10個(gè)sirna分子組成；每個(gè)sirna由25個(gè)核苷酸組成的ss正義鏈和與其反向互補(bǔ)的反義鏈as組成，且為平末端；每個(gè)sirna通過(guò)其反義鏈與靶基因上的靶序列互補(bǔ)結(jié)合；as鏈和ss鏈完全反向互補(bǔ)，as鏈與靶基因上的靶序列完全反向互補(bǔ)，ss的從5’末端起7個(gè)連續(xù)核苷酸和從3’末端起7個(gè)連續(xù)核苷酸均經(jīng)過(guò)2＇-o-me修飾。靶基因如表1所示，靶基因?qū)?yīng)的sirna如表2所示。靶基因的成套sirna可以包括5、6、7或10個(gè)sirna，分組情況如表3所示。表5靶基因的成套sirna組成分別將上述成套sirna組rm-2(7個(gè)sirna混合)、rm-3(6個(gè)sirna混合)、中的每個(gè)sirna按照表5所示的分組要求混合，且各個(gè)sirna為等摩爾比混合。實(shí)施例4、成套sirna抑制靶基因表達(dá)的研究下面的實(shí)施例用表5中的成套sirna組rm-2(7個(gè)sirna混合)為例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：一、成套sirna組rm-2與單個(gè)sirna分子對(duì)hela細(xì)胞中靶基因抑制率比較將實(shí)施例3中表5所示的kras靶基因?qū)?yīng)的成套sirna組rm-2分別轉(zhuǎn)染hela細(xì)胞，方法與實(shí)施例2相同，其中，rm-2混合物中所有sirna分子的總濃度為100nm，且每個(gè)sirna分子為等的物質(zhì)的量混合。以轉(zhuǎn)染單個(gè)sirna分子為對(duì)照，其中，單個(gè)sirna分子的濃度為100nm。成套sirna組rm-2抑制率和單個(gè)sirna抑制率結(jié)果如表6所示，可以看出，針對(duì)7個(gè)靶基因，成套sirna組rm-2抑制效果均大于90％；且成套sirna組rm-2與其相同濃度的7個(gè)單個(gè)sirna分子相比，起到了協(xié)同增效的作用。表6hela細(xì)胞中rm-2與單個(gè)sirna的比較基因rm-2d1d2d3d4d5d6d7kras9494909290682672上述表中的d1-d7分別為kras靶基因?qū)?yīng)的7個(gè)sirna,rm-2為每個(gè)靶基因?qū)?yīng)的7個(gè)sirna的混合樣品。二、不同細(xì)胞系中成套sirnarm-2的抑制效果比較將實(shí)施例3中表5所示的kras靶基因?qū)?yīng)的成套sirna組rm-2分別轉(zhuǎn)染4種不同的細(xì)胞系(人胚腎細(xì)胞293t,宮頸癌細(xì)胞hela,非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞a549與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞huvec(均來(lái)源于atcc)接種培養(yǎng)24h后觀察細(xì)胞，狀態(tài)良好開(kāi)始轉(zhuǎn)染。1、轉(zhuǎn)染(1)50μlribofect轉(zhuǎn)染體系，5μlribofecttmcpreagent(廣州市銳博生物科技有限公司，c10511-05)，5μl實(shí)施例3制備的成套sirna組rm-2(所有sirna的總濃度為100nm)和40μlribofecttmcpbuffer(廣州市銳博生物科技有限公司，c10511-05)。(2)100μllf2k轉(zhuǎn)染體系：1μllf2k(invitrogen，11668019)，5μl實(shí)施例3制備的成套sirna組rm-2(所有sirna的總終濃度為100nm)和94μlopti-mem細(xì)胞培養(yǎng)基(thermofisherscientific，31985070)。將4種不同的細(xì)胞系培養(yǎng)板的每個(gè)孔中分別加入上述50μlribofect轉(zhuǎn)染體系或100μllf2k轉(zhuǎn)染體系，轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞，trizol法提取rna，reversetranscriptionmix反轉(zhuǎn)錄試劑盒用于反轉(zhuǎn)錄(廣州市銳博生物科技有限公司，c10170)得到cdna。2、rt-pcr檢測(cè)抑制率方法與實(shí)施例2相同。結(jié)果如表7所示，相對(duì)nc對(duì)照，針對(duì)不同的靶基因，在不同的細(xì)胞系中，使用不同的轉(zhuǎn)染試劑，rm-2混合物均能達(dá)到60％以上的抑制效果。表7不同細(xì)胞系中rm-2的抑制率比較(％)三、hela細(xì)胞中rm-2混合物與通常結(jié)構(gòu)的sirna分子的混合物抑制結(jié)果比較選取sod1、eif4e兩個(gè)靶基因，比較其對(duì)應(yīng)的rm-2混合物與通常結(jié)構(gòu)的sirna分子的混合物在hela細(xì)胞中抑制效果。上述各基因的通常結(jié)構(gòu)sirna的核苷酸序列與實(shí)施例3制備的各基因?qū)?yīng)的rm-2不同的是通常結(jié)構(gòu)sirna中每個(gè)核苷酸均沒(méi)有2′-o-me修飾，長(zhǎng)度為19bp(分別去掉正義鏈5’端的6個(gè)核苷酸和反義鏈3’端的6個(gè)核苷酸),末端有2個(gè)dtdt懸垂，其余均相同。方法與上述一相同，不同的是將實(shí)施例3制備的sod1、eif4e對(duì)應(yīng)的成套sirna組rm-2轉(zhuǎn)染hela細(xì)胞(m)。以轉(zhuǎn)染sod1、eif4e對(duì)應(yīng)的通常結(jié)構(gòu)的sirna分子的混合物為對(duì)照(s)。轉(zhuǎn)染試劑為lf2k。上述轉(zhuǎn)染中，sirna的總濃度為100nm。結(jié)果如表8所示，針2個(gè)靶基因，rm-2結(jié)構(gòu)的混合物的抑制效果優(yōu)于通常結(jié)構(gòu)的sirna分子的混合物。表8hela細(xì)胞中rm-2修飾結(jié)果比較四、不同組的成套sirna轉(zhuǎn)染hela細(xì)胞的抑制效果比較選取sod1、myc這2個(gè)靶基因，比較不同成套sirna組在hela細(xì)胞中抑制效果。方法與上述一相同，不同的是將實(shí)施例3制備的sod1、myc對(duì)應(yīng)的成套sirna組rm-2、rm-3和rm-6分別轉(zhuǎn)染hela細(xì)胞。轉(zhuǎn)染試劑為lf2k。結(jié)果如表9所示，表9不同sirna條數(shù)混合而成的sirnas混合物基因rm-1(5條)rm-3(6條)rm-2(7條)rm-6(10條)sod180828591myc63667480結(jié)果表明，混合物rm-1，rm-3，rm-2，rm-6均能起到高效抑制多種基因的作用。實(shí)施例5、體外穩(wěn)定性測(cè)定將各sirnarb-kra-d1、rb-tp5-d6、rb-eif-d3經(jīng)無(wú)rna酶水稀釋至5μm后加入等體積的新鮮大鼠血清(為上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司產(chǎn)品),然后在37℃孵育6小時(shí)后取樣進(jìn)行電泳觀察不同sirna的完整性。結(jié)果如圖1所示，看出，sirna在血清中穩(wěn)定，預(yù)計(jì)其在體內(nèi)具有更好的效力。其它sirna的穩(wěn)定性測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同，具體圖省略。所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡(jiǎn)潔，未對(duì)上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說(shuō)明書(shū)記載的范圍。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)發(fā)明專(zhuān)利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專(zhuān)利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。序列表<110>廣州市銳博生物科技有限公司<120>用于抑制kras靶基因mrna表達(dá)的寡核酸分子及其成套組合物<130>1<160>20<170>patentinversion3.5<210>1<211>25<212>rna<213>人工序列<220><223><400>1caagagugccuugacgauacagcua25<210>2<211>25<212>rna<213>人工序列<220><223><400>2uagcuguaucgucaaggcacucuug25<210>3<211>25<212>rna<213>人工序列<220><223><400>3gcaggucaagaggaguacagugcaa25<210>4<211>25<212>rna<213>人工序列<220><223><400>4uugcacuguacuccucuugaccugc25<210>5<211>25<212>rna<213>人工序列<220><223><400>5gauuugccuucuagaacaguagaca25<210>6<211>25<212>rna<213>人工序列<220><223><400>6ugucuacuguucuagaaggcaaauc25<210>7<211>25<212>rna<213>人工序列<220><223><400>7ggcucaggacuuagcaagaaguuau25<210>8<211>25<212>rna<213>人工序列<220><223><400>8auaacuucuugcuaaguccugagcc25<210>9<211>25<212>rna<213>人工序列<220><223><400>9ggacuuagcaagaaguuauggaauu25<210>10<211>25<212>rna<213>人工序列<220><223><400>10aauuccauaacuucuugcuaagucc25<210>11<211>25<212>rna<213>人工序列<220><223><400>11ccugguaacaguaauacauuccauu25<210>12<211>25<212>rna<213>人工序列<220><223><400>12aauggaauguauuacuguuaccagg25<210>13<211>25<212>rna<213>人工序列<220><223><400>13cacugcauaggaauuuagaaccuaa25<210>14<211>25<212>rna<213>人工序列<220><223><400>14uuagguucuaaauuccuaugcagug25<210>15<211>23<212>rna<213>人工序列<220><223><400>15tcaagatcattgctcctcctgag23<210>16<211>21<212>rna<213>人工序列<220><223><400>16acatctgctggaaggtggaca21<210>17<211>21<212>rna<213>人工序列<220><223><400>17uucuccgaacgugucacgutt21<210>18<211>21<212>rna<213>人工序列<220><223><400>18acgugacacguucggagaatt21<210>19<211>20<212>rna<213>人工序列<220><223><400>19agagtgccttgacgatacag20<210>20<211>23<212>rna<213>人工序列<220><223><400>20agacaggtttctccatcaattac23當(dāng)前第1頁(yè)12