本發(fā)明涉及使用激酶的基于酶循環(huán)法的新型高靈敏度測定方法及其組合物。
背景技術(shù)：
：酶循環(huán)法是利用酶的作用增加極微量的物質(zhì)的濃度來進行測定的方法。以往，作為輔酶的測定方法，已知有使用兩種脫氫酶的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)循環(huán)法等輔酶的高靈敏度測定法(例如，參見非專利文獻1)。另外，還有人報告了同樣使用兩種激酶來測定腺苷3磷酸(atp)的循環(huán)法(例如，參見專利文獻1)。另一方面，作為對不是輔酶的底物進行測定的酶循環(huán)法，可以舉出使用兩種轉(zhuǎn)移酶進行測定的方法、以及利用一種酶進行測定的方法等。作為使用兩種酶的方法，可以舉出使用轉(zhuǎn)氨酶和多胺氧化酶的方法(例如參見專利文獻2)。該方法是通過使用腐胺轉(zhuǎn)氨酶和多胺氧化酶的酶循環(huán)反應(從腐胺到4-氨基丁醛方向的反應使用多胺氧化酶、反方向的反應使用腐胺轉(zhuǎn)氨酶)對腐胺進行定量的方法，具體地說，將由多胺氧化酶反應生成的過氧化氫通過已知的顯色法進行測定。同樣地，有人報告了使用芐胺轉(zhuǎn)氨酶和芐胺氧化酶的芐胺類的測定方法、以及使用芐胺轉(zhuǎn)氨酶和酪胺氧化酶的酪胺的測定方法(例如參見專利文獻3、4)。另外，作為基于使用一種酶的循環(huán)法的測定方法，已知有使用脫氫酶的方法(例如參見專利文獻5、6)。該方法是在氧化型輔酶nad(p)或其類似物以及還原型輔酶nad(p)或其類似物的存在下利用脫氫酶的可逆反應性進行酶循環(huán)反應，高靈敏度地對脫氫酶的底物進行定量的方法，其被用于在硫代nad和還原型nad的存在下使用3α-羥基類固醇脫氫酶進行的膽汁酸定量、使用葡萄糖-6-磷酸脫氫酶進行的葡萄糖-6-磷酸定量等中。以往，作為以底物為測定對象的使用激酶的測定方法，例如已知有對甘油三脂進行測定的方法等(例如參見非專利文獻2)。另外已知有對肌酐進行測定的方法(例如參見專利文獻7)。該測定法為下述方法：將肌酐在肌酐酰氨基水解酶的作用下轉(zhuǎn)換為肌酸，進一步在atp的存在下利用肌酸激酶轉(zhuǎn)換為肌酸磷酸和腺苷2磷酸(adp)，之后測定該adp，從而對肌酐進行測定?，F(xiàn)有技術(shù)文獻專利文獻專利文獻1：日本特開2006-223163號公報專利文獻2：日本特開平3-180200號公報專利文獻3：日本特開平7-155199號公報專利文獻4：日本特開平7-177898號公報專利文獻5：日本特開平3-224498號公報專利文獻6：日本特開平4-335898號公報專利文獻7：日本特開平9-285297號公報非專利文獻非專利文獻1：生化學実験講座5酵素研究法(上)(生化學實驗講座5酶研究法(上)),社團法人日本生化學會編輯,東京化學同人,1975年,p121-135非專利文獻2：酵素－バイオテクノロジーへ的指針－日本農(nóng)蕓化學會編集(酶-面向生物技術(shù)的指南-日本農(nóng)藝化學會編輯),朝倉出版,1985年,p97-101技術(shù)實現(xiàn)要素：發(fā)明所要解決的課題本發(fā)明的課題在于提供能夠高精度地對激酶正反應底物、其磷酸化物以及用于衍生為前述物質(zhì)的衍生前體物中的至少一種進行測定的方法以及組合物。解決課題的手段在基于酶循環(huán)法的測定法中，由于基于酶反應的信號會隨著所添加的酶量而增加，因而其是能夠適用于通過控制酶量而進行高靈敏度定量的技術(shù)。特別是在對底物進行定量的酶循環(huán)法中，使用激酶的方法目前尚未為人所知，在對底物進行定量的酶循環(huán)法中的測定對象受到限制。另外，在激酶反應中，通常正反應比逆反應優(yōu)先進行這一點是普遍的，在利用逆反應的酶循環(huán)法中應用激酶在技術(shù)上被認為是困難的。另一方面，如上所述，作為使用激酶的底物的測定方法，有使用肌酸激酶對肌酐進行測定的方法等(例如參見專利文獻7)，但激酶只不過被用于向一個方向進行的化學計量轉(zhuǎn)換反應，因此，在測定對象物的濃度低的情況下，不一定得到足夠的靈敏度，需要通過增加被測物量等來進行應對。但是在增加被測物量時，容易受到共存物質(zhì)的影響等，從實用性的方面考慮存在問題。在這樣的情況下，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在激酶中，可催化激酶反應的正反應和逆反應這兩個方向的反應、且在正反應和逆反應中利用具有不同核苷部分的輔酶的激酶具有多種，在將這些激酶用于酶循環(huán)反應中時，能夠出人意料地以高靈敏度測定出激酶正反應底物和/或其磷酸化物或用于衍生為前述物質(zhì)的衍生前體物，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明例如具有以下的構(gòu)成。[1]一種測定方法，其是對激酶的正反應底物、其磷酸化物以及用于衍生為前述物質(zhì)的衍生前體物中的至少一種進行測定的測定方法，該方法包括下述工序：(1)使激酶、激酶的第一核苷酸輔酶和與第一核苷酸輔酶的核苷部分不同的第二核苷酸輔酶與試樣接觸，使下式(1)的循環(huán)反應進行反應的工序，所述激酶在核苷酸輔酶的存在下催化由激酶的正反應底物生成其磷酸化物的正反應及其逆反應，且在正反應和逆反應中利用至少具有各不相同的核苷部分的核苷酸輔酶；在測定對象為衍生前體物的情況下，所述試樣為進行了使衍生前體物定量地衍生為激酶的正反應底物和/或其磷酸化物的處理而得到的試樣；[化1](2)對信號的變化量進行檢測的工序，所述信號的變化量對應于第一核苷酸輔酶、第一核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物、第二核苷酸輔酶以及第二核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物中的至少任一種的變化量；以及(3)基于檢測出的信號的變化量，計算出試樣所含有的激酶的正反應底物、其磷酸化物以及用于衍生為前述物質(zhì)的衍生前體物中的至少一種的量的工序。[1-1]如上述[1]中所述的測定方法，其中，測定對象為激酶的正反應底物和/或其磷酸化物。[1-1-1]如上述[1]或[1-1]中所述的測定方法，其中，測定對象為激酶正反應底物和/或其磷酸化物，測定對象與激酶的組合為表1中記載的任一種組合。[表1]測定對象激酶肌酸和/或其磷酸化物肌酸激酶3-磷酸甘油酸和/或其磷酸化物3-磷酸甘油酸激酶丙酮酸和/或其磷酸化物丙酮酸激酶果糖-6-磷酸和/或其磷酸化物磷酸果糖-1-激酶甘油和/或其磷酸化物甘油激酶己糖和/或其磷酸化物己糖激酶葡萄糖和/或其磷酸化物adp依賴性葡萄糖激酶[1-1-2]如上述[1]至[1-1-1]中任一項所述的測定方法，其中，測定對象為激酶正反應底物和/或其磷酸化物，測定對象與激酶的組合為下述任一種組合。另外，在下文中，按照測定對象：激酶的順序來記載。另外，其磷酸化物是與所記載的激酶正反應底物相對應的磷酸化物。肌酸/其磷酸化物：肌酸激酶(ec2.7.3.2)3-磷酸甘油酸/其磷酸化物：3-磷酸甘油酸激酶(ec2.7.2.3)丙酮酸/其磷酸化物：丙酮酸激酶(ec2.7.1.40)果糖-6-磷酸/其磷酸化物：磷酸果糖-1-激酶(ec2.7.1.11)甘油/其磷酸化物：甘油激酶(ec2.7.1.30)己糖/其磷酸化物：己糖激酶(ec2.7.1.1)葡萄糖/其磷酸化物：adp依賴性葡萄糖激酶(ec1.7.1.147)[1-2]如上述[1]中所述的測定方法，其中，測定對象為衍生前體物，試樣為進行了使衍生前體物定量地衍生為激酶的正反應底物和/或其磷酸化物的處理而得到的試樣；基于檢測出的信號的變化量，計算出衍生前體物的量。[1-2-1]如上述[1]或[1-2]中所述的測定方法，其中，測定對象為衍生前體物，測定對象、激酶、以及激酶的正反應底物和/或其磷酸化物的組合為表2中記載的任一種組合。[表2][1-2-2]如上述[1]、[1-2]和[1-2-1]中任一項所述的測定方法，其中，測定對象為衍生前體物，測定對象、激酶以及激酶正反應底物/其磷酸化物的組合為下述組合中的任一種。另外，在下文中，按照測定對象：激酶：激酶正反應底物的順序來記載。肌酐：肌酸激酶(ec2.7.3.2)：肌酸/其磷酸化物甘油醛-3-磷酸、羥基丙酮磷酸、甘油-3-磷酸、溶血磷脂酸、溶血磷脂酰膽堿、果糖-1,6-雙磷酸、2-磷酸甘油酸、磷酸烯醇式丙酮酸或2,3-雙磷酸甘油酸：3-磷酸甘油酸激酶(ec2.7.2.3)：3-磷酸甘油酸/其磷酸化物葡萄糖-6-磷酸：磷酸果糖-1-激酶(ec2.7.1.11)：磷酸果糖-6-磷酸/其磷酸化物二羥基丙酮磷酸、甘油三脂、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酸、甘油-3-磷酸、溶血磷脂酰甘油或磷脂酰甘油：甘油激酶(ec2.7.1.30)：甘油/其磷酸化物葡萄糖-1-磷酸：adp依賴性葡萄糖激酶(ec2.7.1.147)：葡萄糖/其磷酸化物[1-2-3]如上述[1]、[1-2]和[1-2-2]中任一項所述的測定方法，其中，測定對象是作為衍生前體物的肌酐，激酶為肌酸激酶，激酶的正反應底物為肌酸。[1-2-4]如上述[1]以及[1-2]至[1-2-3]中任一項所述的測定方法，其中，在使衍生前體物定量地衍生為激酶的正反應底物和/或其磷酸化物的處理中，包括以下步驟：在水的存在下使肌酐酰氨基水解酶(ec3.5.2.10)與肌酐接觸。[2]如上述[1]至[1-2-4]中任一項所述的測定方法，其中，上述工序(2)為對信號的變化量進行檢測的工序，該信號的變化量對應于第一核苷酸輔酶的正反應轉(zhuǎn)化物或第二核苷酸輔酶的逆反應轉(zhuǎn)化物的增加量。[3]如上述[1]～[2]中任一項所述的測定方法，其中，第一核苷酸輔酶的核苷部分為腺苷、鳥苷、胸苷、尿苷、胞苷、黃苷、肌苷、脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胸苷、脫氧尿苷、脫氧胞苷、脫氧黃苷以及脫氧肌苷中的任一種，第一核苷酸輔酶與第二核苷酸輔酶的核苷部分各不相同。[4]如上述[1]～[3]中所述的測定方法，其中，第一核苷酸輔酶的核苷部分為腺苷、肌苷、鳥苷或脫氧腺苷，第一核苷酸輔酶與第二核苷酸輔酶的核苷部分各不相同。[5]如上述[1]至[4]中任一項所述的測定方法，其中，第二核苷酸輔酶的核苷部分為腺苷、鳥苷、胸苷、尿苷、胞苷、黃苷、肌苷、脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胸苷、脫氧尿苷、脫氧胞苷、脫氧黃苷和脫氧肌苷中的任一種，第一核苷酸輔酶與第二核苷酸輔酶的核苷部分各不相同。[6]如上述[1]至[5]中任一項所述的測定方法，其中，第二核苷酸輔酶的核苷部分為腺苷、肌苷、鳥苷或脫氧鳥苷，第一核苷酸輔酶與第二核苷酸輔酶的核苷部分各不相同。[7]如上述[1]至[6]中任一項所述的測定方法，其中，第一核苷酸輔酶的核苷部分為腺苷、肌苷、鳥苷或脫氧腺苷，第二核苷酸輔酶的核苷部分為腺苷、肌苷、鳥苷或脫氧鳥苷，并且第一核苷酸輔酶與第二核苷酸輔酶的核苷部分各不相同。[7-1]如上述[1]至[7]中任一項所述的測定方法，其中，第一核苷酸輔酶的核苷部分與第二核苷酸輔酶的核苷部分的組合為：腺苷與肌苷、鳥苷與腺苷、脫氧腺苷與鳥苷、脫氧腺苷與脫氧鳥苷、脫氧腺苷與肌苷、或肌苷與腺苷。[7-2]如上述[1]至[7-1]中任一項所述的測定方法，其中，第一核苷酸輔酶的核苷部分為腺苷，第二核苷酸輔酶的核苷部分為肌苷。[7-3]如上述[1]至[7-3]中任一項所述的測定方法，其中，第一核苷酸輔酶為腺苷3磷酸(atp)，第二核苷酸輔酶為肌苷2磷酸(idp)。[8]如上述[1]至[7-3]中任一項所述的測定方法，其中，在對信號的變化量進行檢測的工序中，使用能夠利用基于正反應的第一核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物但不能利用第二核苷酸輔酶的檢測用酶、或者不能利用第一核苷酸輔酶但能夠利用基于逆反應的第二核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物的檢測用酶，對于與基于正反應的第一核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物或者基于逆反應的第二核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物的增加量相對應的信號的變化量進行檢測。[9]如上述[1]至[8]中任一項所述的測定方法，其中，在對信號的變化量進行檢測的工序中，使用腺苷2磷酸(adp)依賴性葡萄糖激酶(ec2.7.1.147)，在葡萄糖的存在下對于與腺苷2磷酸(adp)的增加量相對應地變化的信號的變化量進行檢測。[10]如上述[1]或[9]中任一項所述的測定方法，其中，在對信號的變化量進行檢測的工序中，使用腺苷2磷酸(adp)依賴性葡萄糖激酶(ec2.7.1.147)，在硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(硫代nadp)、硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(硫代nad)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp)以及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)中的任一種輔酶以及葡萄糖和葡萄糖6磷酸脫氫酶的存在下，對于與腺苷2磷酸(adp)的增加量相對應地變化的信號的變化量進行檢測。[11]如上述[1]和[1-2]至[10]中任一項所述的測定方法，該測定方法的測定對象是作為衍生前體物的肌酐，其包括下述工序。(1)使如下得到的試樣與至少下述成分(a)～(c)接觸，使下式(2)的循環(huán)反應進行反應的工序，所述試樣是進行了在水的存在下使肌酐酰氨基水解酶(ec3.5.2.10)與肌酐接觸、使肌酐定量地衍生為肌酸的處理而得到的試樣，(a)肌酸激酶(ec2.7.3.2)(b)atp(c)idp[化2](2)使用腺苷2磷酸依賴性葡萄糖激酶(ec2.7.1.147)，在硫代nadp、硫代nad、nadp或nad中的任一種輔酶以及葡萄糖和葡萄糖6磷酸脫氫酶的存在下，對于與腺苷2磷酸的增加量相對應的信號的變化量進行檢測的工序，(3)由上述(2)的工序的檢測結(jié)果計算出試樣中的肌酐的量的工序。[12]一種組合物，其是用于對激酶的正反應底物、其磷酸化物以及用于衍生為前述物質(zhì)的衍生前體物中的至少一種進行測定的測定用組合物，在測定對象為衍生前體物的情況下，該組合物在進行了使衍生前體物定量地衍生為激酶正反應底物和/或其磷酸化物的處理后使用，并且該組合物具備下述(a)、(b)和(c)：(a)激酶，所述激酶在核苷酸輔酶的存在下催化由該激酶的正反應底物生成其磷酸化物的正反應及其逆反應，在正反應和逆反應中利用至少具有各不相同的核苷部分的核苷酸輔酶，(b)正反應中的第一核苷酸輔酶，(c)與第一核苷酸輔酶的核苷部分不同的、逆反應中的第二核苷酸輔酶。[12-1]如上述[12]中所述的組合物，其中，測定對象為激酶正反應底物和/或其磷酸化物。[12-1-1]如上述[12]或[12-1]中所述的組合物，其中，測定對象為激酶的正反應底物和/或其磷酸化物，測定對象與激酶的組合為表3中記載的任一種組合。[表3]測定對象激酶肌酸和/或其磷酸化物肌酸激酶3-磷酸甘油酸和/或其磷酸化物3-磷酸甘油酸激酶丙酮酸和/或其磷酸化物丙酮酸激酶果糖-6-磷酸和/或其磷酸化物磷酸果糖-1-激酶甘油和/或其磷酸化物甘油激酶己糖和/或其磷酸化物己糖激酶葡萄糖和/或其磷酸化物adp依賴性葡萄糖激酶[12-1-2]如上述[12]至[12-1-1]中任一項所述的組合物，其中，測定對象為激酶正反應底物和/或其磷酸化物，測定對象與激酶的組合為下述組合中的任一種。另外，在下文中，按照測定對象：激酶的順序來記載。另外，其磷酸化物是與所記載的激酶正反應底物相對應的磷酸化物。肌酸/其磷酸化物：肌酸激酶(ec2.7.3.2)3-磷酸甘油酸/其磷酸化物：3-磷酸甘油酸激酶(ec2.7.2.3)丙酮酸/其磷酸化物：丙酮酸激酶(ec2.7.1.40)果糖-6-磷酸/其磷酸化物：磷酸果糖-1-激酶(ec2.7.1.11)甘油：甘油激酶(ec2.7.1.30)己糖/其磷酸化物：己糖激酶(ec2.7.1.1)葡萄糖/其磷酸化物：adp依賴性葡萄糖激酶(ec2.7.1.147)[12-2]如上述[12]中所述的組合物，其中，測定對象為衍生前體物，該組合物在進行了使該衍生前體物定量地衍生為激酶的正反應底物和/或其磷酸化物的處理后使用。[12-2-1]如上述[12]或[12-2]中所述的組合物，其中，測定對象為衍生前體物，測定對象、激酶、以及激酶的正反應底物和/或其磷酸化物的組合為表4中記載的任一種組合。[表4][12-2-2]如上述[12]、[12-2]和[12-2-1]中任一項所述的組合物，其中，測定對象為衍生前體物，測定對象、激酶以及激酶正反應底物/其磷酸化物的組合為下述組合中的任一種。另外，在下文中，按照測定對象：激酶：激酶正反應底物/其磷酸化物的順序來記載。肌酐：肌酸激酶(ec2.7.3.2)：肌酸/其磷酸化物甘油醛-3-磷酸、羥基丙酮磷酸、甘油-3-磷酸、溶血磷脂酸、溶血磷脂酰膽堿、果糖-1,6-雙磷酸、2-磷酸甘油酸、磷酸烯醇式丙酮酸或2,3-雙磷酸甘油酸：3-磷酸甘油酸激酶(ec2.7.2.3)：3-磷酸甘油酸/其磷酸化物葡萄糖-6-磷酸：磷酸果糖-1-激酶(ec2.7.1.11)：磷酸果糖-6-磷酸/其磷酸化物二羥基丙酮磷酸、甘油三脂、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酸、甘油-3-磷酸、溶血磷脂酰甘油或磷脂酰甘油：甘油激酶(ec2.7.1.30)：甘油/其磷酸化物葡萄糖-1-磷酸：adp依賴性葡萄糖激酶(ec2.7.1.147)：葡萄糖/其磷酸化物[12-2-3]如上述[12]和[12-2]至[12-2-2]中任一項所述的組合物，其中，測定對象是作為衍生前體物的肌酐，激酶為肌酸激酶，上述激酶的正反應底物為肌酸。[12-2-4]如上述[12]、[12-2]至[12-2-3]中任一項所述的組合物，其中，在使衍生前體物定量地衍生為激酶的正反應底物和/或其磷酸化物的處理中，在水的存在下使肌酐酰氨基水解酶(ec3.5.2.10)與肌酐接觸而衍生出肌酸。[13]如上述[12]至[12-2-4]中任一項所述的組合物，其中，第一核苷酸輔酶的核苷部分為腺苷、鳥苷、胸苷、尿苷、胞苷、黃苷、肌苷、脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胸苷、脫氧尿苷、脫氧胞苷、脫氧黃苷和脫氧肌苷中的任一種，第一核苷酸輔酶與第二核苷酸輔酶的核苷部分各不相同。[14]如上述[12]至[13]中任一項所述的組合物，其中，第一核苷酸輔酶的核苷部分為腺苷、肌苷、鳥苷或脫氧腺苷，第一核苷酸輔酶與第二核苷酸輔酶的核苷部分各不相同。[15]如上述[12]至[14]中任一項所述的組合物，其中，第二核苷酸輔酶的核苷部分為腺苷、鳥苷、胸苷、尿苷、胞苷、黃苷、肌苷、脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胸苷、脫氧尿苷、脫氧胞苷、脫氧黃苷和脫氧肌苷中的任一種，第一核苷酸輔酶與第二核苷酸輔酶的核苷部分各不相同。[16]如上述[12]至[15]中任一項所述的組合物，其中，第二核苷酸輔酶的核苷部分為腺苷、肌苷、鳥苷或脫氧鳥苷，第一核苷酸輔酶與第二核苷酸輔酶的核苷部分各不相同。[17]如上述[12]至[16]中任一項所述的組合物，其中，第一核苷酸輔酶的核苷部分為腺苷、肌苷、鳥苷或脫氧腺苷，第二核苷酸輔酶的核苷部分為肌苷、鳥苷、腺苷或脫氧鳥苷，并且第一核苷酸輔酶與第二核苷酸輔酶的核苷部分各不相同。[17-1]如上述[12]至[17]中任一項所述的組合物，其中，第一核苷酸輔酶的核苷部分與第二核苷酸輔酶的核苷部分的組合為：腺苷與肌苷、鳥苷與腺苷、脫氧腺苷與鳥苷、脫氧腺苷與脫氧鳥苷、脫氧腺苷與肌苷、或鳥苷與腺苷。[17-2]如上述[12]至[17-1]中任一項所述的組合物，其中，第一核苷酸輔酶的核苷部分為腺苷，第二核苷酸輔酶的核苷部分為肌苷。[17-3]如上述[12]至[17-2]中任一項所述的組合物，其中，第一核苷酸輔酶為腺苷3磷酸(atp)，第二核苷酸輔酶為肌苷2磷酸(idp)。[18]如上述[12]至[17-3]中任一項所述的組合物，其中，該組合物進一步包含能夠利用基于正反應的第一核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物但不能利用第二核苷酸輔酶的檢測用酶、或者不能利用第一核苷酸輔酶但能夠利用基于逆反應的第二核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物的檢測用酶。[19]如上述[18]中所述的組合物，其中，檢測用酶為腺苷2磷酸(adp)依賴性葡萄糖激酶(ec1.7.1.147)，該組合物進一步包含葡萄糖。[20]如上述[18]中所述的組合物，其中，該組合物進一步包含：硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(硫代nadp)、硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(硫代nad)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp)或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)；以及葡萄糖6磷酸脫氫酶。[21]如上述[12-2]至[20]中任一項所述的組合物，其中，測定對象是作為衍生前體物的肌酐，該組合物在進行了以下處理后使用，所述處理為在水的存在下使肌酐酰氨基水解酶(ec3.5.2.10)與該肌酐接觸、使肌酐定量地衍生為肌酸的處理，該組合物具備：(a)肌酸激酶、(b)腺苷3磷酸(atp)、(c)肌苷2磷酸(idp)、(d)腺苷2磷酸(adp)依賴性葡萄糖激酶(ec2.7.1.147)、(e)葡萄糖、(f)硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(硫代nadp)、硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(硫代nad)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp)或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)、以及(g)葡萄糖6磷酸脫氫酶。[22]一種試劑盒，其包含上述[12]至[21]中任一項所述的組合物。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明，能夠高靈敏度地測定激酶的底物、其磷酸化物以及用于衍生為前述物質(zhì)的衍生前體物中的至少一種。根據(jù)本發(fā)明，能夠高靈敏度地對于難以利用現(xiàn)有的循環(huán)法進行高靈敏度測定的測定對象物質(zhì)、例如果糖-6-磷酸以及肌酐等進行測定。附圖說明圖1是表示使用肌酸激酶的試樣中的肌酸濃度與吸光度變化量的相關(guān)性的曲線圖。圖2是表示使用肌酸激酶、在反應液中包含脫氧肌苷2磷酸(idp)的實施例與在反應液中不包含idp的比較例的試樣中的肌酸濃度與吸光度變化量的相關(guān)性的曲線圖。圖3是表示使用肌酸激酶的試樣中的肌酐濃度與吸光度變化量的相關(guān)性的曲線圖。圖4是表示使用3-磷酸甘油酸激酶的試樣中的3-磷酸甘油酸濃度與吸光度變化量的相關(guān)性的曲線圖。圖5是表示使用磷酸果糖-1-激酶的試樣中的果糖-6-磷酸濃度與吸光度變化量的相關(guān)性的曲線圖。圖6是表示使用甘油激酶的試樣中的甘油濃度與吸光度變化量的相關(guān)性的曲線圖。圖7是表示使用丙酮酸激酶的試樣中的丙酮酸濃度與吸光度變化量的相關(guān)性的曲線圖。圖8是表示使用3-磷酸甘油酸激酶的試樣中的3-磷酸甘油酸濃度與吸光度變化量的相關(guān)性的曲線圖。圖9是表示使用己糖激酶的試樣中的葡萄糖-6-磷酸濃度與吸光度變化量的相關(guān)性的曲線圖。圖10是表示使用腺苷2磷酸(adp)依賴性葡萄糖激酶的試樣中的葡萄糖-6-磷酸濃度與吸光度變化量的相關(guān)性的曲線圖。圖11是表示使用丙酮酸激酶的試樣中的磷酸烯醇式丙酮酸濃度與吸光度變化量的相關(guān)性的曲線圖。圖12是表示使用肌酸激酶的試樣中的肌酐濃度與吸光度變化量的相關(guān)性的曲線圖。具體實施方式下面對本發(fā)明的實施方式(下文中也稱為“本實施方式”)進行具體說明。但是不應理解為下述實施方式對本發(fā)明進行了限定。根據(jù)本公開，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，各種替代實施方式、實施例和操作技術(shù)應該是顯而易見的。應當理解，本發(fā)明涵蓋沒有在這里記載的各種實施方式等。需要說明的是，本說明書中的ec編號(enzymecommissionnumbers，酶學委員會編號)為2014年9月12日目前所確認的編號。本實施方式的方法是對激酶的正反應底物、其磷酸化物以及用于衍生為前述物質(zhì)的衍生前體物中的至少一種進行測定的測定方法，該方法包括下述工序：(1)使激酶、激酶的第一核苷酸輔酶和與第一核苷酸輔酶的核苷部分不同的第二核苷酸輔酶與試樣接觸，使下式(3)的酶循環(huán)反應進行反應的工序，所述激酶在核苷酸輔酶的存在下催化由激酶的正反應底物生成其磷酸化物的正反應及其逆反應，且在正反應和逆反應中利用至少具有各不相同的核苷部分的核苷酸輔酶；在測定對象為衍生前體物的情況下，所述試樣為進行了使衍生前體物定量地衍生為上述激酶的正反應底物和/或其磷酸化物的處理而得到的試樣；[化3](2)對信號的變化量進行檢測的工序，所述信號的變化量對應于第一核苷酸輔酶、第一核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物、第二核苷酸輔酶以及第二核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物中的至少任一種的變化量；以及(3)基于檢測出的信號的變化量，計算出試樣所含有的激酶的正反應底物、其磷酸化物以及用于衍生為前述物質(zhì)的衍生前體物中的至少一種的量的工序。如上述式(3)所示，本實施方式的方法中使用的激酶是能夠在第一核苷酸輔酶的存在下催化由正反應底物生成其磷酸化物的正反應、且在第二核苷酸輔酶的存在下催化由正反應底物的磷酸化物生成正反應底物的逆反應的激酶。在測定對象為衍生前體物的情況下，作為試樣，使用經(jīng)下述處理的試樣，所述處理中，使衍生前體物定量地衍生為激酶的正反應底物和/或其磷酸化物。關(guān)于作為本實施方式的方法的測定對象的激酶的正反應底物及其磷酸化物，只要能夠利用本實施方式的方法進行測定就沒有特別限定，例如可以舉出肌酸、3-磷酸甘油酸、丙酮酸、果糖-6-磷酸、甘油以及它們的磷酸化物。另外，作為用于衍生為前述物質(zhì)的衍生前體物，可以舉出肌酐、甘油醛-3-磷酸、二羥基丙酮磷酸、甘油-3-磷酸、溶血磷脂酸、溶血磷脂酰膽堿、果糖-1,6-雙磷酸、2-磷酸甘油酸、磷酸烯醇式丙酮酸、2,3-雙磷酸甘油酸、葡萄糖-6-磷酸、甘油三脂、磷脂酰膽堿、磷脂酰甘油、溶血磷脂酰甘油以及葡萄糖-1-磷酸等，但并不限定于這些。例如，作為優(yōu)選的衍生前體物，可以舉出肌酐。作為利用本實施方式的方法對于所含有的激酶的正反應底物和/或其磷酸化物或者用于衍生為前述物質(zhì)的衍生前體物的量進行檢査的試樣沒有特別限定，例如為人或動物的生物體試樣，優(yōu)選為人血液，進一步優(yōu)選為人血清。需要說明的是，關(guān)于在試樣中是否包含作為測定對象的激酶的正反應底物和/或其磷酸化物或者用于衍生為前述物質(zhì)的衍生前體物，在實施上述方法之前可以為未知的，通過實施本實施方式的方法來明確試樣中不含有激酶的正反應底物和/或其磷酸化物或者用于衍生為前述物質(zhì)的衍生前體物也是可以的。在本實施方式的方法中，“衍生前體物”是指可衍生為激酶的正反應底物和/或其磷酸化物的物質(zhì)。在直至得到激酶的正反應底物和/或其磷酸化物的反應步驟具有多步的情況下，衍生前體物可以包含其起始物質(zhì)以及中間物質(zhì)中的全部，也可以包含它們中的任一者。在本實施方式的方法中，“定量地衍生為……的處理”是指按照衍生前體物的減少量與作為衍生后物質(zhì)的激酶的正反應底物和/或其磷酸化物的增加量相對應的方式使衍生前體物衍生為激酶的正反應底物和/或其磷酸化物的處理。具體地說，只要為能夠利用本實施方式的方法，基于與第一核苷酸輔酶、第一核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物、第二核苷酸輔酶以及第二核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物中的至少任一種的變化量相對應的信號的變化量，計算出衍生前體物的量的處理即可。作為定量地衍生的處理的示例，使用公知的化學處理即可，但并不限定于此。作為化學處理的示例，可以舉出利用水解、氧化及還原等化學反應進行的處理，但并不限定于此。作為具體例，可以舉出基于酸或堿的水解。作為化學處理以外的示例，例如可以舉出酶處理等。例如，肌酐可以通過在水的存在下與肌酐酰氨基水解酶(肌酐酶)(ec3.5.2.10)接觸而衍生為肌酸。因而，在本實施方式的方法中，在通過使用肌酸激酶作為激酶對肌酸進行測定時，也能夠?qū)ψ鳛榧∷岬难苌绑w物的肌酐進行測定。另外，由于甘油三脂可在脂肪酶(ec3.1.1.3)的作用下衍生為甘油，因而在與甘油激酶的酶循環(huán)反應組合時，能夠進行甘油三脂的測定。此外，溶血卵磷脂通過溶血磷脂酶(ec3.1.1.5)和甘油磷酸膽堿磷酸二酯酶(ec3.1.4.2)的作用而被衍生為膽堿和甘油-3-磷酸。因而，通過將衍生出的甘油-3-磷酸作為底物進行甘油激酶的酶循環(huán)反應來測定甘油-3-磷酸時，也能夠測定溶血卵磷脂。不過，酶的處理并不限定于這些?？梢栽诒緦嵤┓绞降姆椒ㄖ惺褂玫募っ钢灰哂性诤塑账彷o酶的存在下催化由激酶的正反應底物生成其磷酸化物的正反應及其逆反應、且在該正反應和逆反應中可以利用至少具有各不相同的核苷部分的核苷酸輔酶的性質(zhì)就沒有特別限定。此處，本實施方式的方法中的“激酶正反應”是指在激酶所催化的高能量的磷酸轉(zhuǎn)移中，磷酸由核苷酸輔酶轉(zhuǎn)移到正反應底物的方向的反應，而不管所轉(zhuǎn)移的磷酸的個數(shù)為多少。優(yōu)選所轉(zhuǎn)移的磷酸為一個。另外，“激酶逆反應”是指與上述“激酶正反應”反方向的反應。在本實施方式中，在測定對象為激酶的正反應底物和/或其磷酸化物的情況下，作為測定對象與激酶的組合，例如可以舉出下述組合，但并不限定于這些。另外，在以下的例示中，按照測定對象：激酶的順序來記載。另外，其磷酸化物是指與所記載的激酶的正反應底物相對應的磷酸化物。肌酸和/或其磷酸化物：肌酸激酶3-磷酸甘油酸和/或其磷酸化物：3-磷酸甘油酸激酶丙酮酸和/或其磷酸化物：丙酮酸激酶果糖-6-磷酸和/或其磷酸化物：磷酸果糖-1-激酶甘油和/或其磷酸化物：甘油激酶己糖和/或其磷酸化物：己糖激酶葡萄糖和/或其磷酸化物：腺苷2磷酸(adp)依賴性葡萄糖激酶可以優(yōu)選舉出包含由ec編號(enzymecommissionnumbers)限定的激酶的下述組合，但并不限定于這些。肌酸和/或其磷酸化物：肌酸激酶(ec2.7.3.2)3-磷酸甘油酸和/或其磷酸化物：3-磷酸甘油酸激酶(ec2.7.2.3)丙酮酸和/或其磷酸化物：丙酮酸激酶(ec2.7.1.40)果糖-6-磷酸和/或其磷酸化物：磷酸果糖-1-激酶(ec2.7.1.11)甘油和/或其磷酸化物：甘油激酶(ec2.7.1.30)己糖和/或其磷酸化物：己糖激酶(ec2.7.1.1)葡萄糖和/或其磷酸化物：adp依賴性葡萄糖激酶(ec2.7.1.147)測定對象為衍生前體物的情況下，作為測定對象、激酶以及激酶的正反應底物和/或其磷酸化物各自的組合，可以示例出下述組合，但并不限定于這些。需要說明的是，在以下的例示中，按照測定對象：激酶：激酶的正反應底物和/或其磷酸化物的順序來記載。肌酐：肌酸激酶：肌酸和/或其磷酸化物甘油醛-3-磷酸、羥基丙酮磷酸、甘油-3-磷酸、溶血磷脂酸、溶血磷脂酰膽堿、果糖-1,6-雙磷酸、2-磷酸甘油酸、磷酸烯醇式丙酮酸、或2,3-雙磷酸甘油酸：3-磷酸甘油酸激酶：3-磷酸甘油酸和/或其磷酸化物葡萄糖-6-磷酸：磷酸果糖-1-激酶：磷酸果糖-6-磷酸和/或其磷酸化物二羥基丙酮磷酸、甘油三脂、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酸、甘油-3-磷酸、溶血磷脂酰甘油或磷脂酰甘油：甘油激酶：甘油和/或其磷酸化物葡萄糖-1-磷酸：adp依賴性葡萄糖激酶：葡萄糖和/或其磷酸化物可以優(yōu)選舉出包含由ec編號限定的激酶的下述組合，但并不限定于這些。肌酐：肌酸激酶(ec2.7.3.2)：肌酸和/或其磷酸化物甘油醛-3-磷酸、羥基丙酮磷酸、甘油-3-磷酸、溶血磷脂酸、溶血磷脂酰膽堿、果糖-1,6-雙磷酸、2-磷酸甘油酸、磷酸烯醇式丙酮酸或2,3-雙磷酸甘油酸：3-磷酸甘油酸激酶(ec2.7.2.3)：3-磷酸甘油酸和/或其磷酸化物葡萄糖-6-磷酸：磷酸果糖-1-激酶(ec2.7.1.11)：磷酸果糖-6-磷酸和/或其磷酸化物二羥基丙酮磷酸、甘油三脂、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酸、甘油-3-磷酸、溶血磷脂酰甘油或磷脂酰甘油：甘油激酶(ec2.7.1.30)：甘油和/或其磷酸化物葡萄糖-1-磷酸：adp依賴性葡萄糖激酶(ec2.7.1.147)：葡萄糖和/或其磷酸化物作為測定對象、激酶以及激酶的正反應底物和/或其磷酸化物的優(yōu)選組合，可以舉出下述組合。肌酐：肌酸激酶：肌酸和/或其磷酸化物在測定對象為激酶的正反應底物和/或其磷酸化物的情況下，本實施方式的方法的測定對象以及激酶各自的組合除了上述以外還可以利用下述方法來確定。另外，在測定對象為衍生前體物的情況下，測定對象、激酶以及激酶的正反應底物/其磷酸化物各自的組合除了上述以外還可以利用下述方法來確定。在測定對象為激酶的正反應底物和/或其磷酸化物的情況下，首先參考例如酵素ハンドブック(酶手冊)(朝倉書店，1982年)等選擇特定的激酶。在可獲得關(guān)于是否進行逆反應或者針對核苷酸輔酶的特異性的文獻信息的情況下，可參考該文獻信息進行選擇。另外，在得不到文獻信息的情況下，若與公知的高效液相色譜(hplc)法等方法組合，則能夠?qū)嶋H確認這些信息。例如，在沒有關(guān)于逆反應的文獻信息的情況下，關(guān)于是否進行逆反應，可以針對特定的激酶按照常規(guī)方法在逆反應的底物和核苷酸輔酶過量存在的條件下添加激酶進行反應，利用現(xiàn)有的方法對生成物(正反應底物)或核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物進行檢測。例如，在研究甘油激酶的逆反應的情況下，可以過量添加作為逆反應底物的甘油-3-磷酸和adp進行激酶反應，利用已知方法對于所生成的甘油或腺苷3磷酸(atp)進行檢測，但不限定于此。具體地說，在檢測甘油的情況下，可以使用甘油氧化酶以過氧化氫的形式進行檢測。另外，在檢測atp的情況下，可以與hplc法或atp檢測用的已知的酶法進行組合。在確認了逆反應的情況下，若進一步改變反應時的ph對逆反應的最佳ph進行研究，則能夠作為設(shè)定本實施方式的方法的實施條件時的參考。同樣地，在與hplc法組合時，也能夠?qū)τ谡磻?或逆反應的核苷酸輔酶的特異性進行確認。本實施方式的方法中使用的激酶優(yōu)選對于具有在正反應、逆反應中分別起最佳作用的各不相同的核苷部分的核苷酸輔酶具有4％以上、優(yōu)選8％以上的特異性，但并不限定于此。接著選擇與這些激酶組合的正反應底物或其磷酸化物。關(guān)于正反應底物或其磷酸化物的選擇，有時也可根據(jù)針對正反應底物或其磷酸化物的激酶的米氏常數(shù)km進行選擇。例如優(yōu)選米氏常數(shù)km盡可能小。具體地說，更優(yōu)選km值為100mmol/l以下、優(yōu)選為50mmol/l以下，但并不限定于這些。這些激酶的正反應底物和/或其磷酸化物為某種物質(zhì)的水解物或氧化物的情況下，可以將這些衍生前體物作為測定對象。即，這些衍生前體物可以通過公知的化學處理轉(zhuǎn)換為激酶的正反應底物和/或其磷酸化物。此外，若能夠利用代謝譜等對轉(zhuǎn)換為激酶的正反應底物和/或其磷酸化物的代謝通路進行確認、反應的酶類容易獲得時，則也可以將這些衍生前體物作為測定對象。本實施方式的方法中的“核苷酸輔酶”是指作為激酶的輔酶起作用的核苷的磷酸化物。本實施方式的方法中使用的第一核苷酸輔酶和第二核苷酸輔酶是核苷部分彼此不同的核苷酸輔酶。對于本實施方式的方法中使用的核苷酸輔酶的核苷部分的種類沒有特別限定，作為示例，可以舉出腺苷、鳥苷、胸苷、尿苷、胞苷、黃苷、肌苷、脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胸苷、脫氧尿苷、脫氧胞苷、脫氧黃苷以及脫氧肌苷等。另外，這些磷酸化物可以為1磷酸化物，可以為2磷酸化物，也可以為3磷酸化物。作為核苷酸輔酶，例如可以舉出核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸。關(guān)于作為核苷酸輔酶的核糖核苷酸的具體例，可以舉出atp、adp、腺苷酸(amp)、鳥苷3磷酸(gtp)、鳥苷2磷酸(gdp)、鳥苷酸(gmp)、5-甲基尿苷3磷酸(ttp)、5-甲基尿苷2磷酸(tdp)、5-甲基尿苷1磷酸(tmp)、尿苷3磷酸(utp)、尿苷2磷酸(udp)、尿苷1磷酸(ump)、胞苷3磷酸(ctp)、胞苷2磷酸(cdp)、胞苷1磷酸(cmp)、黃苷3磷酸(xtp)、黃苷2磷酸(xdp)、黃苷1磷酸(xmp)、肌苷3磷酸(itp)、肌苷2磷酸(idp)以及肌苷1磷酸(imp)等，但并不限定于這些。另外，關(guān)于作為核苷酸輔酶的脫氧核糖核苷酸的具體例，可以舉出脫氧腺苷3磷酸(datp)、脫氧腺苷2磷酸(dadp)、脫氧腺苷1磷酸(damp)、脫氧鳥苷3磷酸(dgtp)、脫氧鳥苷2磷酸(dgdp)、脫氧鳥苷1磷酸(dgmp)、胸苷3磷酸(dttp)、胸苷2磷酸(dtdp)、胸苷1磷酸(dtmp)、脫氧尿苷3磷酸(dutp)、脫氧尿苷2磷酸(dudp)、脫氧尿苷1磷酸(dump)、脫氧胞苷3磷酸(dctp)、脫氧胞苷2磷酸(dcdp)、脫氧胞苷1磷酸(dcmp)、脫氧黃苷3磷酸(dxtp)、脫氧黃苷2磷酸(dxdp)、脫氧黃苷1磷酸(dxmp)、脫氧肌苷3磷酸(ditp)、脫氧肌苷2磷酸(didp)以及脫氧肌苷1磷酸(dimp)等，但并不限定于這些。優(yōu)選的核苷酸輔酶例如為atp、adp、gtp、gdp、ttp、tdp、utp、udp、ctp、cdp、xtp、xdp、itp、idp、datp、dadp、dgtp、dgdp、dttp、dtdp、dutp、dudp、dctp、dcdp、dxtp、dxdp、ditp以及didp等，但并不限定于這些。根據(jù)情況可以在這些核苷酸酶上鍵合例如具有顯色能力的取代基等。對于在本實施方式的方法中使用的正反應中的第一核苷酸輔酶的核苷部分沒有特別限定，作為示例，可以舉出腺苷、鳥苷、胸苷、尿苷、胞苷、黃苷、肌苷、脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胸苷、脫氧尿苷、脫氧胞苷、脫氧黃苷以及脫氧肌苷等?？梢詢?yōu)選舉出腺苷、肌苷、鳥苷以及脫氧腺苷等?？梢赃M一步優(yōu)選舉出腺苷。另外，它們的磷酸化物可以為1磷酸化物，可以為2磷酸化物，也可以為3磷酸化物，優(yōu)選為3磷酸化物。作為第一核苷酸輔酶的具體例，除了上述的具體例以外，可以進一步優(yōu)選舉出atp、gtp、ttp、utp、ctp、xtp、itp、datp、dgtp、dttp、dutp、dctp、dxtp以及ditp等。對于在本實施方式的方法中使用的逆反應中的第二核苷酸輔酶的核苷部分沒有特別限定，作為示例，可以舉出腺苷、鳥苷、胸苷、尿苷、胞苷、黃苷、肌苷、脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胸苷、脫氧尿苷、脫氧胞苷、脫氧黃苷以及脫氧肌苷等。可以優(yōu)選舉出肌苷、鳥苷、腺苷以及脫氧鳥苷等。進一步優(yōu)選為肌苷。另外，它們的磷酸化物可以為1磷酸化物，可以為2磷酸化物，也可以為3磷酸化物，優(yōu)選為2磷酸化物。作為第二核苷酸輔酶的具體例，除了上述的具體例以外，可以進一步優(yōu)選舉出adp、gdp、tdp、udp、cdp、xdp、idp、dadp、dgdp、dtdp、dudp、dcdp、dxdp以及didp。對于本實施方式的方法中使用的第一核苷酸輔酶和第二核苷酸輔酶的優(yōu)選核苷部分沒有特別限定，例如為腺苷、肌苷、鳥苷或脫氧腺苷等，并且彼此不同。例如，第一核苷酸輔酶的核苷部分與第二核苷酸輔酶的核苷部分的組合為：腺苷與肌苷、鳥苷與腺苷、脫氧腺苷與鳥苷、脫氧腺苷與脫氧鳥苷、脫氧腺苷與肌苷、或者肌苷與腺苷。進一步優(yōu)選第一核苷酸輔酶的核苷部分為腺苷、第二核苷酸輔酶的核苷部分為肌苷。在本實施方式的方法中，“基于正反應的第一核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物”是指，在激酶正反應中，磷酸由第一核苷酸輔酶轉(zhuǎn)移到激酶的正反應底物之后的第一核苷酸輔酶的脫磷酸化物。另外，“基于逆反應的第二核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物”是指，在激酶逆反應中，磷酸由激酶的逆反應底物轉(zhuǎn)移到第二核苷酸輔酶之后的第二核苷酸輔酶的磷酸化物。此處，所轉(zhuǎn)移的磷酸的個數(shù)可以為1個，可以為2個，也可以為3個。優(yōu)選為1個。在本實施方式的方法的工序(1)中，在進行上述式(3)的循環(huán)反應時，例如按下述要點進行。例如準備過量(具體地說為0.1mmol/l以上12mmol/l以下、更優(yōu)選為0.2mmol/l至6mmol/l)的第一和第二核苷酸輔酶，向其中加入20mmol/l以上200mmol/l以下的ph緩沖劑用以維持反應中的ph，制成反應液。反應時的ph適當選擇有效地進行反應的條件即可，通常調(diào)整在ph5.5以上ph8.5以下的中性附近，添加0.5mmol/l以上10mmol/l以下的作為激酶活化劑的氯化鎂等金屬鹽。向其中加入上述激酶，將上述反應液預先加熱到25℃以上42℃以下、更優(yōu)選加熱到37℃附近，添加與第一和第二核苷酸輔酶濃度相比為微量的正反應底物和/或其磷酸化物，即可開始反應。下面對酶的添加量進行說明。在通常的酶循環(huán)反應中，其循環(huán)率依賴于酶量，已知酶針對底物的米氏常數(shù)(km值)越小，越可利用少量的酶量得到更高的靈敏度。因此，作為所加入的酶量的基準，在每1ml反應液中添加正反應底物及其磷酸化物中km值較大一方的km值(mmol/l)的1倍以上、優(yōu)選為2倍以上的酶單元(單位：u)，另外，作為其上限，添加實質(zhì)上能夠添加的量即可。km值也可以利用公知的方法求出。需要說明的是，這些分量為一例，但并不限于這些。下面舉出肌酸激酶(ck)作為激酶的具體例進行說明，但激酶并不限定于此。ck是廣泛存在于動物界的酶，在骨骼肌、心肌以及腦等中的含量豐富。以兔、牛、豬以及雞等為起源的ck有市售品，關(guān)于核苷酸輔酶的特異性的信息可由文獻獲得。例如，有報告指出，在兔肌肉ck的情況下，在設(shè)adp為100％時，idp顯示出29％的相對活性(jbiolchem.,241,3116-3125,1966)。另外，使用例如adp以外的核苷2磷酸，利用將肌酸磷酸作為底物的逆反應生成肌酸，使用肌酐酰胺水解酶(ec3.5.3.3.)以及肌氨酸氧化酶(ec1.5.3.1)由所生成的肌酸產(chǎn)生過氧化氫，通過對該過氧化氫進行定量，能夠容易地確認ck對于adp以外的核苷2磷酸的特異性。例如兔肌肉來源的ck對idp的特異性高，因而在正反應中作為第一核苷酸輔酶可以選擇atp，在逆反應中作為第二核苷酸輔酶可以選擇idp。為了實施本實施方式的方法的循環(huán)反應，可以研究兩種核苷酸輔酶存在下的ph依賴性，適當選擇有效地進行循環(huán)反應的ph。例如在為兔肌肉或人肌肉來源ck的情況下，有時均是ph6以上ph8以下的中性附近的緩沖液為最佳的。并且，可以使adp和idp過量(更具體地說為0.1mmol/l以上12mmol/l以下、優(yōu)選為0.2mmol/l以上6mmol/l以下)存在，添加與adp和idp相比微量的肌酸或肌酸磷酸以及酶ck。關(guān)于酶的添加量，例如，在兔肌肉來源ck的情況下，該酶針對肌酸、肌酸磷酸的km值據(jù)報告分別為16mmol/l、5mmol/l(jbiolchem.210,p65,1954)。按照上文敘述的酶添加量基準，它們相當于16u/ml、32u/ml。從而可添加優(yōu)選為32u/ml以上、作為上限為800u/ml的程度的酶，但并不限定于這些。在本實施方式的方法的工序(2)中，可以對于信號的變化量進行檢測，所述信號的變化量對應于第一核苷酸輔酶、基于正反應的第一核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物、第二核苷酸輔酶以及基于逆反應的第二核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物的變化量中的任一種。另外，信號的變化量可以為第一核苷酸輔酶或第二核苷酸輔酶的減少量，也可以為基于正反應的第一核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物或基于逆反應的第二核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物的增加量。優(yōu)選為基于正反應的第一核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物或基于逆反應的第二核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物的增加量。對變化量進行檢測的方法可以使用公知的hplc法等。在使用hplc法的情況下，可以在添加螯合劑等終止酶反應后，適當?shù)剡x擇反向柱等對基于正反應的第一核苷酸的轉(zhuǎn)化物或基于逆反應的第二核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物進行定量。關(guān)于這些hplc分析法的信息可以簡單地由樹脂制造商處獲取。另外，在本實施方式的方法的工序(2)中，可以使用能夠利用基于正反應的第一核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物但不能利用第二核苷酸輔酶的檢測用酶，對于針對正反應的第一核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物的增加量而變化的信號變化量進行檢測?；蛘呖梢允褂貌荒芾玫谝缓塑账彷o酶但能夠利用基于逆反應的第二核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物的檢測用酶，對于針對基于逆反應的第二核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物的增加量而變化的信號變化量檢測。例如可以舉出下述方法：使用腺苷2磷酸依賴性葡萄糖激酶(adp依賴性葡萄糖激酶、ec2.7.1.147)，在葡萄糖的存在下對于與adp的增加量相對應的信號的變化量進行檢測。對于強烈熾熱球菌(pyrococcusfuriosus)來源的adp依賴性葡萄糖激酶來說，已知作為核苷酸輔酶除了利用adp以外還可以利用cdp，而對于gdp、idp僅有極小的作用。因此，在第一核苷酸輔酶使用atp、第二核苷酸輔酶使用idp或gdp來進行激酶循環(huán)反應時，若共存adp依賴性葡萄糖激酶作為檢測用酶，則能夠特異性地僅檢測出作為基于正反應的第一核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物的adp。這種情況像下文所述那樣得到了實際確認。另外，有報告指出，大腸桿菌來源的甘油激酶僅利用atp作為磷酸供體。因此，例如在將第一核苷酸輔酶使用itp、gtp或ctp；第二核苷酸輔酶使用adp的激酶用于本實施方式的方法的情況下，若使用大腸桿菌來源的甘油激酶作為檢測用酶，則能夠特異性地僅檢測出atp。作為特異性地僅檢測出atp的檢測用酶，除了上述大腸桿菌來源的甘油激酶以外，還可以使用僅對atp特異性的其他激酶，關(guān)于核苷酸輔酶的特異性，可以參考文獻信息適宜地選擇。另外，在屬于酶編號e6的合成酶中，有關(guān)于特異性地僅檢測出atp的酶的多篇報告，因而在檢測反應中也可以使用這些酶作為檢測用酶。例如，有報告指出，大腸桿菌來源的nad合成酶(ec6.3.1.5)不作用于atp以外的核苷酸輔酶。如此，在本實施方式的方法的工序(2)中，可以留意本實施方式的方法中使用的激酶的第一核苷酸輔酶與第二核苷酸輔酶的組合，適當選擇能夠使用的檢測用酶。但是，對輔酶的特異性不僅受到酶來源的影響，而且還可能受到輔酶或酶的添加量等條件的影響。因此，也會有與文獻報告的結(jié)果不同的情況，在選擇時實際確認特異性即可。優(yōu)選使用腺苷2磷酸依賴性葡萄糖激酶(ec2.7.1.147)作為檢測用酶。在使用adp依賴性葡萄糖激酶的情況下，可以利用已知的方法對作為生成物的amp或葡萄糖6磷酸進行定量。關(guān)于葡萄糖-6-磷酸，根據(jù)情況，有時在硫代nadp、硫代nad、nadp以及nad中的任一種輔酶；和葡萄糖及葡萄糖6磷酸脫氫酶的存在下對于與adp的增加量相對應地變化的信號變化量進行檢測。例如，關(guān)于葡萄糖6磷酸，可以在nad(p)的存在下使用葡萄糖6磷酸脫氫酶(g6pdh)，以基于還原型nad(p)的在340nm的吸光度變化量的形式進行測定。另外，也可以不使用nad(p)而使用硫代nad(p)等輔酶類似物。在進行還原型nad(p)的測定時，例如也可以在硝基四唑藍(nitro-nb)、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2h-四唑鈉鹽(wst-1)以及2-(4-碘苯基)-3-(2,4-二硝基苯基)-5-二磺基苯基)-2h-四唑鈉鹽(wst-3)等氫受體的存在下，通過使用作為電子載體的1-甲氧基pms或者利用黃遞酶以甲臜色素的形式進行可視部吸光度的測定來進行定量。這些化合物能夠容易地購得。另外，還可以與熒光試劑或發(fā)光試劑組合來進行檢測?；蛘咭部梢岳檬褂胓6pdh的酶循環(huán)法高靈敏度地對葡萄糖6磷酸進行定量(例如，參見專利文獻7)。對這些變化的信號的變化量進行檢測的工序可以與本實施方式的方法中的循環(huán)反應同時實施、或者也可以分別實施。同樣地，在使用大腸桿菌來源的甘油激酶時，也可以利用已知的方法對作為生成物的甘油-3-磷酸進行定量。需要說明的是，本實施方式的方法可以利用一種激酶來實施，但是循環(huán)反應也可以使用起源不同的、催化同一反應的兩種以上的酶來實施。在本實施方式的方法中，作為對于激酶的正反應底物和/或其磷酸化物或用于衍生為前述物質(zhì)的衍生前體物在試樣中的量進行計算的方法，可以使用公知的方法。例如，在酶循環(huán)反應中，基于正反應的第一核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物和基于逆反應的第二核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物具有隨時間成比例增加的傾向。計算試樣中的被檢物質(zhì)的量時，可以規(guī)定酶循環(huán)反應的反應時間(例如從反應開始后第5分鐘到第7分鐘等)，對照濃度已知的作為基準的物質(zhì)(校準品)，通過對與校準品的轉(zhuǎn)化物相對應的信號的變化量進行測定，來計算出試樣中的被檢物質(zhì)的量。校準品可以使用激酶的正反應底物或其磷酸化物。在具有將衍生前體物導向激酶的正反應底物和/或正反應底物的磷酸化物的一個或兩個以上的工序的情況下，可以在實施將衍生前體物導向激酶的正反應底物和/或正反應底物的磷酸化物的工序之后實施酶循環(huán)反應。另外，在將衍生前體物導向激酶的正反應底物和/或正反應底物的磷酸化物的工序為酶反應的情況下，若過量加入催化衍生反應的酶，則能夠在短時間內(nèi)導向激酶的正反應底物和/或正反應底物的磷酸化物，因而也可以預先含有激酶來實施本實施方式的方法的循環(huán)反應。在這種情況下，可以將衍生反應終止后的一定時間規(guī)定為反應時間。在試樣中混存有正反應底物和其磷酸化物的情況下，在想要對正反應底物或磷酸化物中的僅任一方進行定量時，可以在酶循環(huán)反應之前使用公知的方法進行將非測定對象物轉(zhuǎn)換為另外物質(zhì)之類的處理。另外，本實施方式涉及一種組合物，其是用于對激酶的正反應底物、其磷酸化物以及用于衍生為前述物質(zhì)的衍生前體物中的至少一種進行測定的測定用組合物，該組合物具備下述(a)、(b)和(c)：(a)激酶，所述激酶在核苷酸輔酶的存在下催化由該激酶的正反應底物生成其磷酸化物的正反應及其逆反應，在正反應和逆反應中利用至少具有各不相同的核苷部分的核苷酸輔酶，(b)正反應中的第一核苷酸輔酶，(c)與第一核苷酸輔酶的核苷部分不同的、逆反應中的第二核苷酸輔酶，其中，在測定對象為衍生前體物的情況下，該組合物在進行了使衍生前體物定量地衍生為激酶正反應底物和/或其磷酸化物的處理后使用。關(guān)于本實施方式的組合物的激酶，如上所述，只要具有在核苷酸輔酶的存在下能夠催化由激酶的正反應底物生成其磷酸化物的正反應及其逆反應、在該正反應和逆反應中能夠利用至少具有各不相同的核苷部分的核苷酸輔酶的性質(zhì)，就沒有特別限定。本實施方式的組合物的測定對象為激酶的正反應底物和/或其磷酸化物的情況下，作為測定對象以及激酶各自的組合，可以示例出下述組合，但并不限定于這些。需要說明的是，在以下的例示中，按照測定對象：激酶的順序來記載。另外，其磷酸化物是指與所記載的激酶的正反應底物相對應的磷酸化物。肌酸和/或其磷酸化物：肌酸激酶3-磷酸甘油酸和/或其磷酸化物：3-磷酸甘油酸激酶丙酮酸和/或其磷酸化物：丙酮酸激酶果糖-6-磷酸和/或其磷酸化物：磷酸果糖-1-激酶甘油和/或其磷酸化物：甘油激酶己糖和/或其磷酸化物：己糖激酶葡萄糖和/或其磷酸化物：adp依賴性葡萄糖激酶可以優(yōu)選舉出包含由ec編號限定的下述激酶的下述組合，但并不限定于這些。肌酸和/或其磷酸化物：肌酸激酶(ec2.7.3.2)3-磷酸甘油酸和/或其磷酸化物：3-磷酸甘油酸激酶(ec2.7.2.3)丙酮酸和/或其磷酸化物：丙酮酸激酶(ec2.7.1.40)果糖-6-磷酸和/或其磷酸化物：磷酸果糖-1-激酶(ec2.7.1.11)甘油和/或其磷酸化物：甘油激酶(ec2.7.1.30)己糖和/或其磷酸化物：己糖激酶(ec2.7.1.1)葡萄糖和/或其磷酸化物：adp依賴性葡萄糖激酶(ec2.7.1.147)測定對象為衍生前體物的情況下，作為測定對象、激酶以及激酶的正反應底物和/或其磷酸化物各自的組合，可以示例出下述組合，但并不限定于這些。需要說明的是，在以下的例示中，按照測定對象：激酶：激酶的正反應底物和/或其磷酸化物的順序來記載。肌酐：肌酸激酶：肌酸和/或其磷酸化物甘油醛-3-磷酸、羥基丙酮磷酸、甘油-3-磷酸、溶血磷脂酸、溶血磷脂酰膽堿、果糖-1,6-雙磷酸、2-磷酸甘油酸、磷酸烯醇式丙酮酸或2,3-雙磷酸甘油酸：3-磷酸甘油酸激酶：3-磷酸甘油酸和/或其磷酸化物葡萄糖-6-磷酸：磷酸果糖-1-激酶：磷酸果糖-6-磷酸和/或其磷酸化物二羥基丙酮磷酸、甘油三脂、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酸、甘油-3-磷酸、溶血磷脂酰甘油或磷脂酰甘油：甘油激酶：甘油和/或其磷酸化物葡萄糖-1-磷酸：adp依賴性葡萄糖激酶：葡萄糖和/或其磷酸化物可以優(yōu)選舉出包含由ec編號限定的激酶的下述組合，但并不限定于這些。肌酐：肌酸激酶(ec2.7.3.2)：肌酸和/或其磷酸化物甘油醛-3-磷酸、羥基丙酮磷酸、甘油-3-磷酸、溶血磷脂酸、溶血磷脂酰膽堿、果糖-1,6-雙磷酸、2-磷酸甘油酸、磷酸烯醇式丙酮酸或2,3-雙磷酸甘油酸：3-磷酸甘油酸激酶(ec2.7.2.3)：3-磷酸甘油酸和/或其磷酸化物葡萄糖-6-磷酸：磷酸果糖-1-激酶(ec2.7.1.11)：磷酸果糖-6-磷酸/其磷酸化物二羥基丙酮磷酸、甘油三脂、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酸、甘油-3-磷酸、溶血磷脂酰甘油或磷脂酰甘油：甘油激酶(ec2.7.1.30)：甘油和/或其磷酸化物葡萄糖-1-磷酸：adp依賴性葡萄糖激酶(ec2.7.1.147)：葡萄糖和/或其磷酸化物作為測定對象、激酶以及激酶的正反應底物和/或其磷酸化物的進一步優(yōu)選的組合，可以舉出下述示例。肌酐：肌酸激酶：肌酸和/或其磷酸化物在本實施方式的組合物中，在測定對象為激酶的正反應底物和/或其磷酸化物的情況下，測定對象以及激酶各自的組合可以利用與涉及本實施方式的方法的上述說明相同的方法來確定。另外，在測定對象為衍生前體物的情況下，測定對象、激酶以及激酶的正反應底物和/或其磷酸化物各自的組合也可以利用與涉及本實施方式的方法的上述說明相同的方法來確定。第一核苷酸輔酶和第二核苷酸輔酶是核苷部分不同的核苷酸輔酶。對核苷部分的種類沒有特別限定，作為示例，可以舉出腺苷、鳥苷、胸苷、尿苷、胞苷、黃苷、肌苷、脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胸苷、脫氧尿苷、脫氧胞苷、脫氧黃苷以及脫氧肌苷等。另外，它們的磷酸化物可以為1磷酸化物，可以為2磷酸化物，也可以為3磷酸化物。作為核苷酸輔酶的具體例，可以舉出atp、adp、amp、gtp、gdp、gmp、ttp、tdp、tmp、utp、udp、ump、ctp、cdp、cmp、xtp、xdp、xmp、itp、idp、imp、datp、dadp、damp、dgtp、dgdp、dgmp、dttp、dtdp、dtmp、dutp、dudp、dump、dctp、dcdp、dcmp、dxtp、dxdp、dxmp、ditp、didp以及dimp等，但并不限定于此。優(yōu)選atp、adp、gtp、gdp、ttp、tdp、utp、udp、ctp、cdp、xtp、xdp、itp、idp、datp、dadp、dgtp、dgdp、dttp、dtdp、dutp、dudp、dctp、dcdp、dxtp、dxdp、ditp以及didp等。根據(jù)情況可以在這些核苷酸酶上鍵合例如具有顯色能力的取代基等。作為在本實施方式的組合物中使用的正反應中的第一核苷酸輔酶的核苷部分沒有特別限定，作為示例，可以舉出腺苷、鳥苷、胸苷、尿苷、胞苷、黃苷、肌苷、脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胸苷、脫氧尿苷、脫氧胞苷、脫氧黃苷以及脫氧肌苷等?？梢詢?yōu)選舉出腺苷、肌苷、鳥苷、脫氧腺苷以及脫氧腺苷等?？梢愿鼉?yōu)選舉出腺苷。另外，這些磷酸化物可以為1磷酸化物，可以為2磷酸化物，也可以為3磷酸化物，優(yōu)選為3磷酸化物。作為第一核苷酸輔酶的具體例，除了上述的具體例以外，可以進一步優(yōu)選舉出atp、gtp、ttp、utp、ctp、xtp、itp、datp、dgtp、dttp、dutp、dctp、dxtp以及ditp等。對于在本實施方式的組合物中使用的逆反應中的第二核苷酸輔酶的核苷部分沒有特別限定，作為示例，可以舉出腺苷、鳥苷、胸苷、尿苷、胞苷、黃苷、肌苷、脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胸苷、脫氧尿苷、脫氧胞苷、脫氧黃苷以及脫氧肌苷等?？梢詢?yōu)選舉出肌苷、鳥苷、腺苷以及脫氧鳥苷等。進一步優(yōu)選為肌苷。另外，它們的磷酸化物可以為1磷酸化物，可以為2磷酸化物，也可以為3磷酸化物，優(yōu)選為2磷酸化物。作為第二核苷酸輔酶的具體例，除了上述的具體例以外，可以進一步優(yōu)選舉出adp、gdp、tdp、udp、cdp、xdp、idp、dadp、dgdp、dtdp、dudp、dcdp、dxdp以及didp。在本實施方式的上述組合物中，作為第一核苷酸輔酶與第二核苷酸輔酶的核苷部分的組合，只要相互不同就沒有特別限定，例如為腺苷與肌苷、鳥苷與腺苷、脫氧腺苷與鳥苷、脫氧腺苷與脫氧鳥苷、脫氧腺苷與肌苷、或肌苷與腺苷。優(yōu)選第一核苷酸輔酶的核苷部分為腺苷、第二核苷酸輔酶的核苷部分為肌苷。使用本實施方式的組合物例如能夠?qū)嵤┍緦嵤┓绞降姆椒?，能夠利用循環(huán)法使上述式(3)的反應進行反應。若使用本實施方式的組合物，則能夠?qū)τ谛盘柕淖兓窟M行檢測，所述信號的變化量對應于第一核苷酸輔酶、基于正反應的第一核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物、第二核苷酸輔酶以及基于逆反應的第二核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物中的任一種的變化量。另外，信號的變化量可以為第一核苷酸輔酶或第二核苷酸輔酶的減少量，也可以為基于正反應的第一核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物或基于逆反應的第二核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物的增加量。優(yōu)選的是，信號的變化量為基于正反應的第一核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物或基于逆反應的第二核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物的增加量。對變化量進行檢測的方法可以使用公知的hplc法等。在使用hplc法的情況下，與本實施方式的方法的說明相同。若使用本實施方式的組合物，則能夠計算出試樣中含有的激酶的正反應底物和/或其磷酸化物或者用于衍生為前述物質(zhì)的衍生前體物的量。計算方法與本實施方式的方法的說明相同，可以使用公知的方法。本實施方式的組合物可以任意包含能夠利用基于正反應的第一核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物但不能利用第二核苷酸輔酶的檢測用酶、或者不能利用第一核苷酸輔酶但能夠利用基于逆反應的第二核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物的檢測用酶。作為檢測用酶的示例，可以舉出腺苷2磷酸依賴性葡萄糖激酶(ec2.7.1.147)等，但并不限定于此。進而，除了這些以外，有時還在本實施方式的組合物中添加硫代nadp、硫代nad、nadp或nad中的任一種輔酶；和葡萄糖以及葡萄糖6磷酸脫氫酶。若使用這些，則能夠?qū)τ谂c基于正反應的第一核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物、基于逆反應的第二核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物的增加量相對應的任一種信號的變化量進行檢測、測定。具體內(nèi)容與本實施方式的方法的上述說明相同。本實施方式的組合物可以制成被分成為多個的試劑盒。例如，可以將包含第二核苷酸輔酶的組合物適當?shù)胤峙湓诒环殖啥€或三個以上的試劑盒中。這種情況下，進一步地，可以將包含下述檢測用酶的組合物適當?shù)胤峙湓谏鲜龅亩€或三個以上的試劑盒中，所述檢測用酶是能夠利用例如硫代nadp、硫代nad、nadp或nad以及葡萄糖和基于正反應的第一核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物但不能利用第二核苷酸輔酶的檢測用酶；或者是不能利用第一核苷酸輔酶但能夠利用基于逆反應的第二核苷酸輔酶的轉(zhuǎn)化物的檢測用酶。這些成分均可以重復包含在被各自分開的試劑盒中。在優(yōu)選使用ck的情況下，可以將包含atp、ck以及idp的組合物適當?shù)胤殖啥€試劑盒。進而，可以將nadp、adp依賴性葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶適當?shù)胤峙湓诙€試劑盒中。這些成分均可以重復包含在被各自分開的試劑盒中。下面通過實施例進一步具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受以下示例的限定。(adp-hk的核苷酸特異性的確認)關(guān)于強烈熾熱球菌(pyrococcusfuriosus)來源的adp依賴性己糖激酶(adp-hkpii(t-92)旭化成制藥株式會社)，已經(jīng)確認到，作為核苷-2-磷酸，除了adp以外，idp、gdp無法作為磷酸供體。即，使由adp-hkpii反應生成的葡萄糖在nadp的存在下與葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(g6pdh：東洋紡)共存，在37℃以基于還原型nadp的340nm的吸光度變化的形式進行測定。制備下述組成的反應液。關(guān)于試劑空白，不加入核苷-2-磷酸而加入生理鹽水制成試劑。首先，在反應液中按照1.25u/ml添加adp-hkpii，結(jié)果每1分鐘的吸光度變化在adp、idp、gdp中分別為110.4、-0.2、-0.1(均為吸光度×1000)，在idp和gdp中幾乎未確認到吸光度的變化量。接著，按照80倍量、即在反應液中達到100u/ml的方式添加酶。在adp的情況下，吸光度瞬時超過3000(吸光度×1000)；與此相對，idp、gdp在9分鐘的吸光度的變化量分別為4.8、0.7(吸光度×1000)，確認到adp-hkii實質(zhì)上未將idp和gtp作為磷酸供體。(實施例1在atp、idp共存下是否進行可逆反應的確認)如上所述，已經(jīng)確認到了adp-hkpii實質(zhì)上未將idp作為供氫體，因而作為第一核苷酸輔酶的核苷-3-磷酸選擇atp、作為第二核苷酸輔酶的核苷-2-磷酸選擇idp，研究在兩者的存在下ck反應是否進行。制備下述組成的反應液。將1ml上述反應液加熱到37℃。按照反應液中的濃度為0.05mmol/l加入肌酸磷酸后，按照10u/ml添加ck(兔肌肉來源、東方酵母公司制造)，觀察在37℃是否產(chǎn)生340nm的吸光度變化。其結(jié)果確認到，基于還原型nad生成的吸光度隨著時間而增加。該情況表示，利用ck可連續(xù)地進行下述兩反應。肌酸磷酸+idp→肌酸+itp肌酸+atp→肌酸+adp(實施例2肌酸的定量)制備下述組成的反應液。在1ml上述反應液中，按照100u/ml添加ck(旭化成制藥株式會社制造，hc-ckii，商品目錄no.t-74)。在37℃進行預加熱，添加0mmol/l、0.2mmol/l、0.4mmol/l、1.2mmol/l的肌酸溶液0.05ml，結(jié)果340nm的吸光度隨時間成比例地增加。于是記錄了在340nm從第3分鐘到第5分鐘的吸光度變化量。將結(jié)果示于圖1。由圖1可知，吸光度變化量與試樣中的肌酸濃度成比例。(實施例3兔輔酶組合)制備下述組成的反應液。在上述反應液中，作為核苷-3-磷酸(1mmol/l)與核苷-2-磷酸(4mmol/l)的組合，選擇datp/idp、datp/gdp、datp/dgdp，對于各組合，求出添加0.1mmol/l肌酸0.05ml的情況下的吸光度增加量、與不添加肌酸而添加純凈水的情況下的吸光度增加量之差。盡管5分鐘的吸光度變化量(吸光度×103)分別觀察到了34.6(datp/idp)、11.2(datp/gdp)、8.7(datp/dgdp)這種程度的差異，但在任一組合中均確認到了反應的進行。(實施例4肌酸的測定)制備下述組成的反應液。在1ml上述反應液中，加入0mmol/l、0.01mmol/l、0.02mmol/l、0.03mmol/l、0.05mmol/l的肌酸水溶液0.05ml，于37℃監(jiān)測340nm的吸光度變化。作為比較例，使用由上述反應液中除去了idp的反應液，實施同樣的測定。對于本實施例測定5分鐘的吸光度變化量，對于比較例測定反應開始10分鐘后的吸光度，分別從試劑空白中減去。將兩者的結(jié)果示于圖2。在本實施例中，與比較例相比，吸光度變化量提高約10倍。(實施例5肌酐的定量)制備下述組成的反應液1。另外，制備下述組成的反應液2。在0.75ml的反應液1中分別添加0.01mmol/l、0.02mmol/l、0.03mmol/l、0.05mmol/l肌酐溶液0.05ml，在37℃加熱5分鐘。其后加入0.25ml的反應液2，監(jiān)測400nm的吸光度。測定從反應液2添加后的第2分鐘到第7分鐘的吸光度變化量。其結(jié)果，如圖3所示，吸光度變化量與肌酐濃度相應地定量增加。(實施例63-磷酸甘油酸的定量)制備下述組成的反應液。20u/ml3-磷酸甘油酸激酶(pgk)(sigma公司制造：酵母來源)在1ml上述反應液中，加入0mmol/l、0.0025mmol/l、0.005mmol/l、0.0125mmol/l、0.025mmol/l、0.05mmol/l的3-磷酸甘油酸水溶液0.02ml，在37℃添加3-磷酸甘油酸后，測定從第1分鐘到第6分鐘的340nm的吸光度變化量。將結(jié)果示于圖4。作為比較對象，在從反應液中除去了idp的通常的測定體系的情況下，利用50μmol/l的3-磷酸甘油酸水溶液的吸光度為0.006。若考慮還原型nad的分子吸光系數(shù)，則本實施例中的吸光度變化量是與通常的測定體系相比約為50倍的0.3。(實施例7基于磷酸果糖-1-激酶(pfk)的果糖-6-磷酸的定量)制備下述組成的反應液。在1ml上述反應液中，加入0mmol/l、0.1mmol/l、0.2mmol/l、0.3mmol/l、0.4mmol/l、0.5mmol/l的果糖-6-磷酸溶液0.02ml，在37℃預加熱。對于各反應液，按照30u/ml加入磷酸果糖-1-激酶(旭化成制藥株式會社，t-142：嗜熱脂肪地芽孢桿菌(geobacillusstearothermophilus)來源)，在37℃開始反應。添加磷酸果糖-1-激酶后，測定從第1分鐘到第6分鐘的340nm的吸光度變化量。將結(jié)果示于圖5。如圖5所示，吸光度變化量與果糖-6-磷酸的濃度相應地定量增加。(實施例8基于gk的甘油的定量)制備下述組成的反應液。作為甘油激酶，使用如下微生物來源的酶。將1ml上述反應液預加熱后，加入0mmol/l、0.1mmol/l、0.2mmol/l、0.3mmol/l、0.4mmol/l、0.5mmol/l的甘油溶液0.02ml，在37℃開始反應。添加甘油溶液后，測定從第1分鐘到第6分鐘的340nm的吸光度變化量。接著，將atp置換為脫氧atp，實施同樣的測定。將它們的結(jié)果示于圖6。相比于atp與idp的組合，datp與idp的組合得到了約3倍的靈敏度。(實施例9pkidp添加的效果)使用兔肌肉來源的丙酮酸激酶，制備下述組成的反應液。在1ml的上述反應液中按照0.5mmol/l加入丙酮酸，于37℃監(jiān)測340nm的吸光度。對于1mmol/l的丙酮酸也實施同樣的操作。340nm的吸光度達到反應平衡，顯示出恒定值。接著，向該反應液中進一步加入1mmol/l的idp，結(jié)果吸光度直線增加。添加idp后，測定從第1分鐘到第11分鐘的吸光度變化量，將結(jié)果示于圖7。如圖7所示，確認到了定量性。由該情況確認到產(chǎn)生了丙酮酸激酶(pk)藉由atp和idp的可逆反應。(實施例103-磷酸甘油酸的定量(基于大腸桿菌gk的檢測反應))制備下述組成的反應液。在1ml上述反應液中，加入0mmol/l、0.02mmol/l的3-磷酸甘油酸水溶液0.005ml、0.01ml、0.015ml，在37℃進行反應。添加3-磷酸甘油酸后，測定從第3分鐘到第5分鐘的基于toos與4-氨基安替吡啉的氧化縮合色素的555nm吸光度變化量。在實施例6中，核苷酸輔酶使用atp和idp，但此處選擇gtp與adp的組合。并且，使用大腸桿菌來源的gk對所生成的atp進行定量。將不添加3-磷酸甘油酸水溶液的反應液作為試劑空白，在各吸光度變化量中減去該空白，將所得到的結(jié)果示于圖8。如圖8所示，吸光度變化量與3-磷酸甘油酸的濃度相應地定量增加。(實施例11基于己糖激酶的葡萄糖6磷酸定量)制備下述組成的反應液。測定原理為：在adp、gtp的共存下，使用大腸桿菌來源的甘油激酶，對于由hkiii反應生成的atp進行特異性定量。在1ml上述反應液中，按照反應液中的濃度為1μmol/l、2μmol/l、3μmol/l、4μmol/l、5μmol/l加入葡萄糖-6-磷酸溶液并進行預加熱。接下來，按照反應液中的濃度為1mmol/l加入gtp水溶液，在37度開始反應。添加gtp溶液后，測定從第3分鐘到第8分鐘的555nm吸光度變化量。將減去試劑空白得到的各吸光度變化量的結(jié)果示于圖9。如圖9所示，吸光度變化量與葡萄糖-6-磷酸的濃度相應地定量增加。(實施例12adp依賴性葡萄糖激酶的逆反應)制備下述組成的反應液。作為adp依賴性葡萄糖激酶使用adp-hkpii(旭化成制藥株式會社：t-92)，作為2種核苷酸輔酶選擇cdp和amp。在由本實施例生成的adp的檢測中，首先利用ck將adp轉(zhuǎn)換為atp后，將其利用nad合成酶轉(zhuǎn)換為nad，最終在340nm檢測基于12α-hsdii的還原型nad的生成速度。將1ml反應液分注到石英池中，在37℃加熱后，分別添加0mmol/l、0.2mmol/l、0.4mmol/l、0.6mmol/l、1mmol/l的葡萄糖-6-磷酸溶液0.01ml。在添加了各濃度的葡萄糖-6-磷酸的石英池中分別添加20u的adp-hkpii，測定340nm的吸光度變化量。讀取添加酶后第5分鐘到第7分鐘的吸光度變化量，將葡萄糖-6-磷酸溶液為零的反應液作為空白減去，相對于葡萄糖-6-磷酸溶液的濃度作圖。將結(jié)果示于圖10。如圖10所示，吸光度變化量與葡萄糖-6-磷酸的濃度相應地定量增加。(實施例13基于pk的磷酸烯醇式丙酮酸的定量)制備下述組成的反應液。在1ml上述反應液中，加入0mmol/l、0.02mmol/l、0.04mmol/l、0.08mmol/l、0.1mmol/l、0.2mmol/l的磷酸烯醇式丙酮酸鉀水溶液0.02ml，在37℃預加熱。其后向各反應液中加入10mmol/lidp溶液0.05ml，開始反應。添加idp后，測定從第3分鐘到第8分鐘的340nm吸光度變化量。結(jié)果如圖11所示，吸光度變化量與磷酸烯醇式丙酮酸濃度成比例地定量增加。(實施例14肌酐的定量)利用常規(guī)方法獲取編碼小鼠b型同工酶的dna。在ck(旭化成制藥株式會社制造，商品目錄no.t-74)生產(chǎn)中使用的宿主-載體系統(tǒng)中插入該基因進行克隆化，按照常規(guī)方法獲取ck-b(人來源b型同工酶)。另外，制備下述組成的反應液1。進一步制備下述組成的反應液2。將基于肌酐酰胺水解酶的由肌酐向肌酸轉(zhuǎn)換的反應與ck循環(huán)反應同時實施。在0.75ml的反應液1中加入0.04mmol/l、0.1mmol/l、0.2mmol/l、0.3mmol/l的肌酐水溶液0.05ml，在37℃預加熱3分鐘。接下來加入0.25ml的反應液2，開始反應。對于添加反應液2后第3分鐘到第4分鐘的400nm吸光度變化量進行測定。結(jié)果如圖12所示，吸光度變化量與肌酐濃度相應地定量增加。當前第1頁12