本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種構(gòu)建石榴品種身份證的方法及其應(yīng)用，具體地說，涉及一種利用SSR分子指紋和品種形態(tài)學(xué)特征特性等信息相結(jié)合，構(gòu)建具有查詢功能的石榴SSR指紋網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫。
背景技術(shù)：
石榴(Punica granatum L.)別名安石榴、若榴、丹若、天漿、涂林等，為石榴科(Punicaceae)石榴屬，落葉灌木或小喬木，原產(chǎn)于伊朗、阿富汗和高加索等中亞地區(qū)，在我國已有2000多年的栽培歷史，是中國近年來發(fā)展迅速的優(yōu)良小雜果類果樹之一，目前形成了以新疆葉城、陜西臨潼、河南開封、安徽懷遠(yuǎn)、山東嶧城和云南蒙自等為中心的主要栽培區(qū)域，它以其較高的經(jīng)濟(jì)、營養(yǎng)、醫(yī)藥價值和保健功能，越來越受到消費市場的青睞。但由于異花授粉以及不同地域間的引種和品種交換，導(dǎo)致品種混雜、系譜不清，同物異名或同名異物現(xiàn)象嚴(yán)重。加之長期的無性繁殖和人類的偏好，使石榴基因型趨于單一，造成基因多樣性降低，品種退化等現(xiàn)象。目前，石榴種質(zhì)資源的遠(yuǎn)緣雜交已成為種質(zhì)資源創(chuàng)新的一個重要途徑。因此，明確不同性狀品種的親緣關(guān)系及評價石榴種質(zhì)的遺傳多樣性，對石榴種質(zhì)資源的保護(hù)、高效育種與有效利用具有重要的科學(xué)意義。然而石榴育種工作中沒有一種準(zhǔn)確有效的分子標(biāo)記用于不同性狀品種的親緣關(guān)系及評價石榴種質(zhì)的遺傳多樣性。國內(nèi)外學(xué)者主要用形態(tài)學(xué)方法和分子標(biāo)記技術(shù)對石榴進(jìn)行研究。但形態(tài)學(xué)方法容易受季節(jié)和環(huán)境的影響，鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確。在分子水平上主要利用RAPD、AFLP、SRAP等技術(shù)進(jìn)行石榴品種鑒定，而且多數(shù)集中在對某一地區(qū)的石榴品種進(jìn)行研究，來源范圍較窄，涉及的品種數(shù)量少，不夠系統(tǒng)。因此，利用更穩(wěn)定、更準(zhǔn)確的分子標(biāo)記技術(shù)鑒定石榴品種親緣關(guān)系及評價遺傳多樣性勢在必行。
而且隨著石榴種植面積迅速擴大，苗木品種混雜現(xiàn)象特別嚴(yán)重，給生產(chǎn)造成了極大的混亂。通過進(jìn)行品種鑒定，可以對品種基本信息、品種分子身份證、品種間相似率和身份證核對等進(jìn)行查詢，確保品種的真實性和純度，對優(yōu)異石榴品種或材料實施產(chǎn)權(quán)保護(hù)具有十分重大的意義。同時還可指導(dǎo)雜交石榴品種真實性和純度鑒定，分析親本間遺傳相似性，為雜交石榴新組合的選育提供親本選配的參考。這對加快石榴良種化進(jìn)程，促進(jìn)產(chǎn)業(yè)發(fā)展，維護(hù)育種者和生產(chǎn)者的利益具有重要意義。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種構(gòu)建石榴品種身份證的方法及其應(yīng)用。
本發(fā)明的目的之一在于提供一種基于該SSR位點開發(fā)的一種與石榴品種鑒定及用于擴增該標(biāo)記的引物對。
本發(fā)明的目的之二在于利用毛細(xì)管電泳SSR熒光標(biāo)記分析，獲取石榴品種的指紋信息，將指紋信息與石榴的品種形態(tài)學(xué)特征特性等信息等相結(jié)合，構(gòu)建石榴品種身份證及其在石榴新品種選育工作中的應(yīng)用。
其具體技術(shù)方案為：
一種構(gòu)建石榴品種身份證的方法，包括以下步驟：
步驟1、在苗期摘取不同石榴品種資源的葉片，用于DNA的提??；
采用改良CTAB法提取石榴新鮮葉片的DNA
(1)在65℃水浴中預(yù)熱提前配置好的2×CTAB提取緩沖液(0.1MTris-HCl、0.02M EDTA、1.4M NaCl、2％PVP、2％CTAB)；
(2)在液氮中研磨石榴葉片至粉末狀，轉(zhuǎn)至2.0mL離心管中；
(3)迅速加入2×CTAB提取緩沖液1.0mL，10μlβ-巰基乙醇，混勻，65℃水浴60min，隔10-15min顛倒搖勻一次；
(4)常溫下12000rpm離心5min，吸上清轉(zhuǎn)移至新的2.0mL離心管中；
(5)加入等體積的氯仿/異戊醇，充分混勻5min，放置5min，12000rpm常溫離心10min；
(6)吸上清到新的2.0mL離心管中，用氯仿/異戊醇重復(fù)抽提一次；
(7)離心，吸上清到新的離心管中，加入等體積的異丙醇混勻，-20℃放置2h，沉淀DNA；
(8)10000rpm常溫離心10min；
(9)倒掉異丙醇，用500μl乙醇洗沉淀兩次，吹干后用100μlTE溶解DNA；
(10)加入10mg/mlRNaseA2μl終濃度(200ng/ul)混勻，37℃保溫2h以上；
(11)加入500μlTE，再加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)，輕輕顛倒搖勻2min；
(12)12000rpm常溫離心10min；
(13)吸上清到新的離心管中，加入等體積的異丙醇混勻，-20℃放置2h，沉淀DNA
(14)12000rpm常溫離心10min；
(15)倒掉異丙醇，用500μl乙醇清洗沉淀兩次，吹干后用50μlTE溶解DNA；4℃冰箱中保存；
(16)使用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量。
步驟2、利用該SSR分子標(biāo)記引物對，對提取的DNA進(jìn)行PCR；
用于石榴品種指紋分析的13對SSR核心標(biāo)記引物，由北京閱微生物技術(shù)有限公司合成，并分別用FAM(藍(lán)色)、HEX(綠色)、TAMRA(黃色)、ROX(紅色)4種熒光基團(tuán)修飾上游引物5′端。
步驟3、PCR反應(yīng)體系(15μl)如下：10×Buffer I 1.5μl，2.5mM dNTP 1.2μl，TP-M13(5μM)1μl，特異引物(5μM)1μl，TAKARA HS Taq 0.1μl，DNA1.2μl，加ddH2O補齊至15μl。
步驟4、PCR反應(yīng)程序：(1)引物2363,14870,68159，16262,16942,5347的PCR反應(yīng)程序為95℃5min，94℃30s，56℃30s，35個循環(huán)，然后94℃30s，53℃30s，72℃30s，15個循環(huán)，最后60℃30min，共50個循環(huán)。(2)引物34768，18616,27944,37300,41575，47743，61814的PCR反應(yīng)程序為95℃5min，94℃30s，58℃降到48℃30s，72℃30s，10個循環(huán)，94℃30s，48℃30s，72℃30s，20個循環(huán)，95℃30s，53℃30s，72℃30s，10個循環(huán)，最后60℃30min，共40個循環(huán)。
步驟5、電泳檢測
96孔板中每孔加入分子量內(nèi)標(biāo)和甲酰胺混合液9μl，PCR產(chǎn)物1.0μl，其中該分子量內(nèi)標(biāo)和甲酰胺混合液兩者的體積比為0.5：8.5。將PCR產(chǎn)物稀釋40倍，在96孔板的各孔中分別加入8.5μl去離子甲酰胺、0.5μl LIZ-500分子量內(nèi)標(biāo)和1μl稀釋后的PCR產(chǎn)物，95℃變性3min，于4℃放置10min，4000轉(zhuǎn)min-1離心1min，于ABI3730DNA分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳。預(yù)電泳15kV，3min；2kV電進(jìn)樣10s；電泳15kV；20min。
步驟6、數(shù)據(jù)分析
用Data Collection軟件收集原始數(shù)據(jù)，用Genemapper軟件分析收集的原始數(shù)據(jù)，比較各峰值的位置與其泳道中的LIZ-500分子量內(nèi)標(biāo)，獲得SSR擴增片段的精確分子量bp；將石榴品種的DNA指紋信息編碼，再結(jié)合品種的形態(tài)學(xué)特征特性等信息及可能具有的特異基因信息，構(gòu)建136份不同地區(qū)石榴資源品種的身份證，并利用在線條碼生成器fhttp://barcode.tecit.combarcodege.nerator.aspx？LANG＝zhcn)和二維碼生成軟件Encoder2以條碼表述構(gòu)建的石榴品種身份證。
本發(fā)明所述的構(gòu)建石榴品種身份證的方法在石榴育種過程中的應(yīng)用。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：
本發(fā)明所述方法可簡單快速的獲得不同石榴品種的片段大小，將上述石榴品種身份證，以條形碼或二維碼的形式標(biāo)貼在苗木包裝上，每個品種的號碼是唯一的，這樣既達(dá)到了以最少標(biāo)記區(qū)分品種的目的，同時減少了指紋分析的工作量，確保品種的真實性和純度，對優(yōu)異石榴品種或材料實施產(chǎn)權(quán)保護(hù)具有十分重大的意義。還可實現(xiàn)對品種苗木質(zhì)量的科學(xué)追溯、快速鑒定和規(guī)范管理。同時在不同性狀石榴的選育工作中，顯著降低育種的工作量，縮短育種時間，極大地提高育種效率。還可為雜交石榴品種的真實性和純度鑒定，分析親本間遺傳相似性，為雜交石榴新組合的選育提供親本選配的參考。對加快石榴良種化進(jìn)程，促進(jìn)產(chǎn)業(yè)發(fā)展，維護(hù)育種者和生產(chǎn)者的利益具有重要意義。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施方案對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)路線實現(xiàn)的：
本發(fā)明所提及的SSR引物是從石榴基因組測序得到的7810條SSR序列中逐步篩選出的。首先篩選出60個具有多態(tài)性的SSR熒光標(biāo)記在供試石榴品種中進(jìn)行擴增，依據(jù)擴增產(chǎn)物在毛細(xì)管電泳中的可讀性、多態(tài)性等，最終篩選出13個多態(tài)性較高、擴增穩(wěn)定的SSR標(biāo)記。
本發(fā)明中是利用13對SSR引物，將從全國不同地區(qū)收集的136份石榴資源全部區(qū)分開，擴增該SSR標(biāo)記的引物對如表1：
表1
利用該SSR分子標(biāo)記，通過簡單有效的PCR，毛細(xì)管電泳操作等，實現(xiàn)對不同地區(qū)石榴資源的準(zhǔn)確區(qū)分，成功地將分子標(biāo)記輔助選擇育種技術(shù)應(yīng)用于現(xiàn)實的石榴育種工作中。
本發(fā)明的方法在不同性狀石榴的選育工作中，可以顯著降低石榴育種的工作量，提高親本選擇的準(zhǔn)確性和目的性，縮短育種時間，極大地提高育種效率。
1、首先，在苗期摘取不同石榴品種資源的葉片，用于DNA的提取。
2、利用該SSR分子標(biāo)記引物對，對提取的DNA進(jìn)行PCR分析。
3、PCR反應(yīng)體系如表2所示:
體系(15μl)：
表2
4、PCR反應(yīng)程序：
引物：2363,14870,68159，16262,16942,5347。
表3
引物：34768，18616,27944,37300,41575,47743,61814。
表4
5、電泳檢測
(1)96孔板中每孔加入分子量內(nèi)標(biāo)和甲酰胺混合液(0.5：8.5)9μl，PCR產(chǎn)物1.0μl；
(2)95℃變性3min，上機檢測；
6、數(shù)據(jù)分析
用Data Collection軟件收集原始數(shù)據(jù)，用Genemapper軟件分析收集的原始數(shù)據(jù)，比較各峰值的位置與其泳道中的LIZ-500分子量內(nèi)標(biāo)，獲得SSR擴增片段的精確分子量(bp)。將石榴品種的DNA指紋信息編碼，再結(jié)合品種的形態(tài)學(xué)特征特性及可能具有的特異基因信息，構(gòu)建136份不同地區(qū)石榴資源品種的身份證，并利用在線條碼生成器fhttp://barcode.tecit.combarcodege.nerator.aspx？LANG＝zhcn)和二維碼生成軟件Encoder2以條碼表述構(gòu)建的石榴品種身份證。
本發(fā)明構(gòu)建了具查詢功能的SSR指紋網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，為檢測單位和育種工作者提供了一個便利的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)交換和共享平臺。在不同性狀石榴的選育工作中，可以顯著降低石榴育種的工作量，提高親本選擇的準(zhǔn)確性和目的性，縮短育種時間，極大地提高育種效率。
以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可顯而易見地得到的技術(shù)方案的簡單變化或等效替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
序 列 表
SEQUENCE LISTING（序列表）
<110> 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所
<120> 一種構(gòu)建石榴品種身份證的方法及其應(yīng)用
<160> 26
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agaaatgctg atgattcggg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggggtcgaag ttgcttatca 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccccagtaat cacccatttg 20
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gtggacataa ataattgctg aaga 24
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tggttaggca tgcaagagtg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gagctggtga tttcattggg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tagccccatt ttgctgattc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gtcgcgtgaa attccctaaa 20
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
caatgaaatg aagatgttag caaaa 25
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
agtgtgagaa agcccagctc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gccaggacaa attgacccta 20
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tgtttcttgt gagctgattg g 21
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ccaaaatggt ccttggtttg 20
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gatttcgtgt aacgcacgg 19
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gggtgaatca ggttggcata 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
tcagtgtctg tcgtggcttc 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ttacccacca ccaacaacaa 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
atgctgatga gccaatgaga 20
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tttgaacatc taggtggcat tt 22
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
tcacttatat atcgtctgca accaa 25
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
ctaagtgtgc ggctgagctt 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gcttggaggg caagtcatta 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gagagagaag gggaaatggg 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ctcatcccat gcagagagaa 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
tcttctccac cgcctcttta 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
ctgcctcctc cttccttctt 20