本發(fā)明涉及高通量測(cè)序領(lǐng)域，具體涉及一種引物標(biāo)簽結(jié)合深度測(cè)序法從外周血游離DNA擴(kuò)增癌癥基因的引物組、標(biāo)簽設(shè)計(jì)方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

血漿游離DNA又稱cfDNA(cell free DNA)，是指外周中游離于細(xì)胞外的DNA，cfDNA的來(lái)源既包括正常細(xì)胞，也有異常細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞)或者外源的微生物(如病毒DNA)，具體包括自身正常細(xì)胞代謝的凋亡小體，腫瘤細(xì)胞碎片，外泌體等。

循環(huán)腫瘤DNA(Circulating tumor DNA)ctDNA是指從原發(fā)腫瘤甚至是轉(zhuǎn)移形成的新腫瘤細(xì)胞破裂掉落下來(lái)到循環(huán)外周血中的DNA。ctDNA在臨床醫(yī)學(xué)中具有重要意義，通過(guò)檢測(cè)ctDNA在腫瘤的早期檢測(cè)，腫瘤的靶向治療和后期的疾病監(jiān)控等方面具有重要的臨床價(jià)值。

ctDNA與所有cfDNA一樣是以核小體微單位，以單個(gè)、雙聯(lián)或者三聯(lián)的形式進(jìn)入血液，片段長(zhǎng)度主要在166bp左右(即纏繞在每個(gè)組蛋白上面的DNA的長(zhǎng)度)，并逐步分解，通常半衰期只有2個(gè)小時(shí)。一般10ml外周血中cfDNA含量約在32ng(Newman et al,2016)。

ctDNA含量非常少，以10ml外周血為例，從中可以提取到cfDNA含量約30ng，占總DNA的1％，ctDNA在所有cfDNA中的比例非常少，按1％計(jì)算,只有約300pg，也就是大約45個(gè)細(xì)胞裂解的DNA量，實(shí)際情況下，如果是做早期篩查，ctDNA的含量可能更低到10ml外周血中只有1～2個(gè)細(xì)胞的，所以對(duì)檢測(cè)方法的敏感性要求非常高。

目前用于液體活檢中目標(biāo)基因檢測(cè)的方法主要分為四類：一代測(cè)序(Sanger)，二代高通量測(cè)序(NGS)，數(shù)字液滴PCR(ddPCR)，和ARMS(又稱等位基因特異性PCR)。對(duì)于腫瘤基因的篩查來(lái)說(shuō)，NGS檢測(cè)在同類中的性價(jià)比遠(yuǎn)高過(guò)其他幾種方法。利用高通量測(cè)序技術(shù)來(lái)測(cè)定腫瘤患者中ctDNA片段，根據(jù)分析得到的ctDNA所攜帶的腫瘤基因信息，就能夠全面地反映腫瘤的特征。這一技術(shù)憑借著準(zhǔn)確、靈敏、無(wú)創(chuàng)、高通量、可以以相對(duì)低的成本一次測(cè)上萬(wàn)個(gè)位點(diǎn)，甚至更多等特點(diǎn)，可以從腫瘤防治診斷、治療參考、用藥指導(dǎo)、病情監(jiān)控、復(fù)發(fā)預(yù)警等方面為醫(yī)生及患者提供有效助力。

中國(guó)專利申請(qǐng)(申請(qǐng)?zhí)朇N201410771006.9)公開(kāi)了一種利用囊胚腔液游離DNA檢測(cè)胚胎染色體異常的方法，包括以下步驟：囊胚腔液游離DNA的獲取、囊胚腔液DNA的檢測(cè)、游離DNA全基因組擴(kuò)增、全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物分析、基因組DNA進(jìn)行片段化處理、片段化目的DNA進(jìn)行定量分析和片段大小分析、文庫(kù)構(gòu)建、上機(jī)測(cè)序、生物信息分析。該方法避免了傳統(tǒng)的DNA分析方法只能對(duì)單細(xì)胞基因組的部分區(qū)域進(jìn)行研究的不足，能完整地分析單細(xì)胞基因組的遺傳信息，操作簡(jiǎn)便，省時(shí)高效；同時(shí)，使用囊胚腔液游離DNA作為檢測(cè)樣本，取材方便、安全，導(dǎo)致后期胚胎發(fā)育出現(xiàn)異常的概率小，能保證胚胎在后續(xù)發(fā)育中不會(huì)受到影響。

中國(guó)專利申請(qǐng)(申請(qǐng)?zhí)朇N201610018232.9)公開(kāi)了一種基于大規(guī)模數(shù)據(jù)挖掘的癌癥檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括：DNA提取試劑盒、高通量測(cè)序文庫(kù)制備試劑、基因序列比對(duì)軟件、染色體覆蓋度計(jì)算軟件。其中，所述DNA提取試劑用于提取外周血游離DNA，通過(guò)所述高通量測(cè)序文庫(kù)制備試劑制備高通量測(cè)序文庫(kù)，通過(guò)對(duì)測(cè)序文庫(kù)高通量測(cè)序，利用所述基因序列比對(duì)軟件將測(cè)序數(shù)據(jù)與人類參考基因組作比較，通過(guò)染色體覆蓋度計(jì)算軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析以區(qū)分癌癥和非癌癥病人，具體操作為：通過(guò)計(jì)算每一條染色體測(cè)序覆蓋度，除以總測(cè)序量，來(lái)計(jì)算相對(duì)覆蓋度；健康情況下，人每條染色體均為兩個(gè)拷貝，染色體之間的拷貝數(shù)差異非常小；反之，如果相對(duì)覆蓋度超過(guò)一定的閾值，則判斷為疑似癌癥患者。并進(jìn)一步分析判斷腫瘤類型和可能原發(fā)灶器官。

然而，目前采用NGS方法的主流檢測(cè)過(guò)程(包括中國(guó)專利申請(qǐng)CN201410771006.9、CN201610018232.9中公開(kāi)的技術(shù)方案)均會(huì)涉及到PCR擴(kuò)增和測(cè)序，這兩個(gè)過(guò)程都會(huì)出現(xiàn)一些系統(tǒng)錯(cuò)誤，如illumina Hiseq平臺(tái)的測(cè)序錯(cuò)誤率在0.05％，在普通大量樣本模板檢測(cè)中問(wèn)題并不大，但是，在腫瘤早期篩查中，由于本身模板類就是在萬(wàn)分之一到千分之一的范圍之內(nèi)，這些測(cè)序錯(cuò)誤跟我們的檢測(cè)下線在一個(gè)數(shù)量級(jí)，就會(huì)對(duì)結(jié)果造成非常嚴(yán)重的干擾，其次，由于PCR引入的錯(cuò)誤也無(wú)法進(jìn)行有效識(shí)別。所以目前急需要開(kāi)發(fā)一種新的方法，用于鑒別真正的基因突變和這些系統(tǒng)錯(cuò)誤。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種引物標(biāo)簽結(jié)合深度測(cè)序法從外周血游離DNA擴(kuò)增癌癥基因的引物組、引物標(biāo)簽設(shè)計(jì)方法及應(yīng)用。

第一方面，本發(fā)明提供了一種引物標(biāo)簽結(jié)合深度測(cè)序法從外周血游離DNA擴(kuò)增癌癥基因的引物組。

值得注意的是，本發(fā)明所述的引物組的引物數(shù)量不限，可以是一鐘或多鐘引物。

本發(fā)明所述癌癥為實(shí)體瘤或血液病，具體地，所述的癌癥包括但不限于頭頸部癌癥、消化道癌癥、腦癌、肺癌、生殖系統(tǒng)癌癥、泌尿系統(tǒng)癌癥、皮膚癌、淋巴癌、白血?。黄渲兴鲱^頸部癌癥為口腔癌、鼻咽癌、舌癌或喉癌；所述消化道癌癥為食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌或腸癌；所述生殖系統(tǒng)癌癥為乳腺癌、宮頸癌、子宮癌、前列腺癌或睪丸癌；所述泌尿系統(tǒng)癌癥為膀胱癌或腎癌。

本發(fā)明所述的深度測(cè)序法，可做本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)理解，比如與高通量測(cè)序技術(shù)、NGS等概念在多數(shù)情況下可互換。

本發(fā)明所述的深度測(cè)序法采用的測(cè)序設(shè)備包括但不限于Roche/454、Illumina測(cè)序儀(NextSeq系列，Hiseq系列，MiSeq系列，XTen，以及后續(xù)測(cè)序儀系列)、BGI(華大公司，BGI500系列以及后續(xù)測(cè)序儀)的測(cè)序儀、LifeTech測(cè)序儀器(Ion，Proton以及后續(xù)測(cè)序儀器系列)、PacBio測(cè)序儀器(RSII，Sequel以及后續(xù)測(cè)序儀器)或基于Nanopore的測(cè)序儀器(Genia，Nanopore以及類似的第三代測(cè)序儀)。

第二方面，本發(fā)明提供了一種引物標(biāo)簽結(jié)合深度測(cè)序法從外周血游離DNA擴(kuò)增癌癥基因的標(biāo)簽設(shè)計(jì)方法，包括如下步驟：

1)設(shè)計(jì)引物標(biāo)簽；

2)給模板中的每個(gè)DNA分子都接上引物標(biāo)簽；

3)針對(duì)目標(biāo)癌癥基因設(shè)計(jì)PCR引物或PCR引物組；

4)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，篩選出合格的引物標(biāo)簽。

本發(fā)明提供的從外周血游離DNA中擴(kuò)增癌癥基因的分子標(biāo)簽設(shè)計(jì)的基本原則：通過(guò)給每個(gè)起始樣品模板兩邊加標(biāo)簽的方式，給模板中的每個(gè)DNA分子都貼上分子標(biāo)簽，在經(jīng)過(guò)PCR和測(cè)序以后，可以通過(guò)分子標(biāo)簽將樣本中原始的DNA分子都鑒別分類。由于經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增以后的分子都跟原始模板攜帶同樣的分子標(biāo)簽，所以理論上來(lái)說(shuō)，來(lái)源于同一個(gè)分子標(biāo)簽的某類DNA分子應(yīng)該攜帶相同的序列，如果后期中間的產(chǎn)物在PCR過(guò)程中發(fā)生的突變，就可以通過(guò)標(biāo)簽去除這些突變序列，避免他們干擾最后的測(cè)序結(jié)果。同樣的，測(cè)序錯(cuò)誤也可以通過(guò)這個(gè)方法進(jìn)行鑒別。

第三方面，本發(fā)明提供了一種用于深度測(cè)序法從外周血游離DNA擴(kuò)增癌癥基因的引物標(biāo)簽。

第四方面，本發(fā)明提供了一種如第一方面提供的引物組、如第二方面提供的引物標(biāo)簽設(shè)計(jì)方法、或如第三方面提供了的引物標(biāo)簽在從外周血游離DNA擴(kuò)增癌癥基因中的應(yīng)用、或在高通量測(cè)序中的應(yīng)用。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的四種ctDNA檢測(cè)方法的通量和敏感性分布示意圖。

具體實(shí)施方式

以下所述是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明實(shí)施例中若無(wú)特別說(shuō)明，所用試劑及耗材均為市售商品。

本發(fā)明實(shí)施例中若特別說(shuō)明，測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建參照羅氏、illumina或ABI的高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建說(shuō)明書。

在本發(fā)明第一實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種引物標(biāo)簽結(jié)合深度測(cè)序法從外周血游離DNA擴(kuò)增癌癥基因的引物組。

值得注意的是，本發(fā)明所述的引物組的引物數(shù)量不限，可以是一鐘或多鐘引物。

本發(fā)明所述癌癥為實(shí)體瘤或血液病，具體地，所述的癌癥包括但不限于頭頸部癌癥、消化道癌癥、腦癌、肺癌、生殖系統(tǒng)癌癥、泌尿系統(tǒng)癌癥、皮膚癌、淋巴癌、白血??；其中所述頭頸部癌癥為口腔癌、鼻咽癌、舌癌或喉癌；所述消化道癌癥為食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌或腸癌；所述生殖系統(tǒng)癌癥為乳腺癌、宮頸癌、子宮癌、前列腺癌或睪丸癌；所述泌尿系統(tǒng)癌癥為膀胱癌或腎癌。

本發(fā)明所述的深度測(cè)序法，可做本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)理解，比如與高通量測(cè)序技術(shù)、NGS等概念在多數(shù)情況下可互換。

本發(fā)明所述的深度測(cè)序法采用的測(cè)序設(shè)備包括但不限于Roche/454、Illumina測(cè)序儀(NextSeq系列，Hiseq系列，MiSeq系列，XTen，以及后續(xù)測(cè)序儀系列)、BGI(華大公司，BGI500系列以及后續(xù)測(cè)序儀)的測(cè)序儀、LifeTech測(cè)序儀器(Ion，Proton以及后續(xù)測(cè)序儀器系列)、PacBio測(cè)序儀器(RSII，Sequel以及后續(xù)測(cè)序儀器)或基于Nanopore的測(cè)序儀器(Genia，Nanopore以及類似的第三代測(cè)序儀)。

在本發(fā)明第二實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種引物標(biāo)簽結(jié)合深度測(cè)序法從外周血游離DNA擴(kuò)增癌癥基因的標(biāo)簽設(shè)計(jì)方法，包括如下步驟：

1)設(shè)計(jì)引物標(biāo)簽；

2)給模板中的每個(gè)DNA分子都接上引物標(biāo)簽；

3)針對(duì)目標(biāo)癌癥基因設(shè)計(jì)PCR引物或PCR引物組；

4)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，篩選出合格的引物標(biāo)簽。

本發(fā)明提供的從外周血游離DNA中擴(kuò)增癌癥基因的分子標(biāo)簽設(shè)計(jì)的基本原則：通過(guò)給每個(gè)起始樣品模板兩邊加標(biāo)簽的方式，給模板中的每個(gè)DNA分子都貼上分子標(biāo)簽，在經(jīng)過(guò)PCR和測(cè)序以后，可以通過(guò)分子標(biāo)簽將樣本中原始的DNA分子都鑒別分類。由于經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增以后的分子都跟原始模板攜帶同樣的分子標(biāo)簽，所以理論上來(lái)說(shuō)，來(lái)源于同一個(gè)分子標(biāo)簽的某類DNA分子應(yīng)該攜帶相同的序列，如果后期中間的產(chǎn)物在PCR過(guò)程中發(fā)生的突變，就可以通過(guò)標(biāo)簽去除這些突變序列，避免他們干擾最后的測(cè)序結(jié)果。同樣的，測(cè)序錯(cuò)誤也可以通過(guò)這個(gè)方法進(jìn)行鑒別。

在本發(fā)明第三實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種用于深度測(cè)序法從外周血游離DNA擴(kuò)增癌癥基因的引物標(biāo)簽。

在本發(fā)明第四實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種如第一方面提供的引物組、如第二方面提供的引物標(biāo)簽設(shè)計(jì)方法、或如第三方面提供了的引物標(biāo)簽在從外周血游離DNA擴(kuò)增癌癥基因中的應(yīng)用、或在高通量測(cè)序中的應(yīng)用。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。