專利名稱：基于引物陣列芯片的dna測(cè)序方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于DNA測(cè)序技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種基于引物陣列芯片的DNA測(cè)序方法。
背景技術(shù)：
目前DNA測(cè)序技術(shù)的研究主要集中在高通量大規(guī)模的測(cè)序技術(shù)方面，迄今為止已經(jīng)發(fā)展了第二代測(cè)序技術(shù)的合成測(cè)序和第三代的單分子測(cè)序技木。但是，以Sanger末端終止測(cè)序法為代表的第一代測(cè)序技術(shù)，仍然在常規(guī)的生物學(xué)研究中有著重要的應(yīng)用。1977年Sanger發(fā)明了具有里程碑意義的末端終止測(cè)序法，同年A. M. Maxam和W. Gilbert發(fā)明了化學(xué)降解法。Sanger法因?yàn)榧群?jiǎn)便又快速，并經(jīng)過(guò)后續(xù)的不斷改良，成為了迄今為止DNA測(cè)序的主流。但是Sanger法需要毛細(xì)管電泳分析，儀器和試劑昂貴，測(cè)序耗時(shí)長(zhǎng)，復(fù)雜結(jié)構(gòu)DNA的測(cè)序容易出套峰或無(wú)信號(hào)。為解決這些問(wèn)題，20世紀(jì)九十年代發(fā)展 了基于探針陣列的雜交測(cè)序技術(shù)(SBH)，然而SBH技術(shù)由錯(cuò)誤率高和穩(wěn)定性低在應(yīng)用上還受到很大的限制，目前SBH技術(shù)主要用于突變的檢測(cè)中。為了克服Sanger法測(cè)序和SBH的缺點(diǎn)，本發(fā)明提出一種基于引物陣列芯片的DNA測(cè)序方法，該方法能夠?qū)崿F(xiàn)操作簡(jiǎn)便、低成本、快速、和準(zhǔn)確地測(cè)序，可以在普通實(shí)驗(yàn)室的小規(guī)?？焖贉y(cè)序中發(fā)揮重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的在于提供一種基于引物陣列芯片的DNA測(cè)序方法，能夠克服傳統(tǒng)探針陣列芯片雜交測(cè)序方法使用探針數(shù)量巨大、成本高、假陽(yáng)性率高的缺點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)操作簡(jiǎn)便、低成本、快速、和準(zhǔn)確地測(cè)定長(zhǎng)片段單鏈或雙鏈DNA序列，而不需要進(jìn)行復(fù)雜的制備單鏈DNA模板過(guò)程，對(duì)于雙鏈DNA的測(cè)序是雙向進(jìn)行的，大大增加了可靠性，不需要特殊的儀器設(shè)備，所涉及的試劑均是分子生物學(xué)常規(guī)的試劑。技術(shù)方案本發(fā)明涉及一種基于引物陣列芯片的DNA測(cè)序方法，其特征在于把ー組序列已知的引物固定在芯片上，然后把4張相同的芯片，分別放入4個(gè)分別含有熒光標(biāo)記的四種不同雙脫氧核苷酸的反應(yīng)體系中，與待測(cè)DNA進(jìn)行退火雜交，使引物延伸I個(gè)核苷酸，檢測(cè)芯片的熒光信號(hào)得到一組由引物末端序列和延伸核苷酸組成的短序列，將彼此重疊的短序列拼接成待測(cè)DNA的完整序列，包括如下步驟步驟I)將ー組序列已知的引物的5’端固定在基片上預(yù)設(shè)的位置排列成引物陣列芯片;步驟2)把4張相同的芯片，分別放入4個(gè)分別含有熒光標(biāo)記的四種不同雙脫氧核苷酸ddATP，ddCTP，ddGTP和ddUTP的反應(yīng)體系中，體系中還含有PCR緩沖液、DNA聚合酶和待測(cè)的雙鏈DNA或單鏈DNA ；步驟3)反應(yīng)體系在PCR儀、芯片雜交儀或者其它可以改變和控制溫度的儀器上，進(jìn)行模板DNA變性溫度、引物與模板DNA結(jié)合溫度、引物延伸溫度的溫度變化過(guò)程，循環(huán)I 10次，使部分與待測(cè)DNA能雜交的引物延伸I個(gè)熒光標(biāo)記核苷酸并終止延伸；
步驟4)把芯片從反應(yīng)體系中取出來(lái)，沖洗后，檢測(cè)芯片的各基點(diǎn)的熒光信號(hào)，得到ー組不同的由引物末端序列和延伸核苷酸組成的短序列，將彼此重疊的短序列拼接成待測(cè)DNA的完整序列。上述方案中，所述的引物3’末端為5 6個(gè)堿基組成的序列，其序列是四種堿基A，T，C，G的全部排列序列的其中ー種；引物中間為3 10個(gè)堿基組成的兼并序列，這些堿基為四種堿基A，T，C，G的混合物；5’端為10 30個(gè)任意堿基組成的序列。上述方案中，所述的3’末端為反向互補(bǔ)序列的引物，它們被固定在基片上相鄰的位置，所述的反向互補(bǔ)序列是指按照A-T、C-G的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，兩條核苷酸序列分別從5’端至3’端、3’端至5’端的堿基順序互補(bǔ)。有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)I、本發(fā)明的測(cè)序方法準(zhǔn)確性高，主要體現(xiàn)在A.在傳統(tǒng)的探針陣列芯片雜交測(cè)序方法中，熒光標(biāo)記是結(jié)合在待測(cè)DNA上的，沖洗芯片時(shí)，很容易被誤洗脫或者殘留，造成假陰性或假陽(yáng)性，所以沖洗芯片的條件要非常嚴(yán)格，很難掌握，而在本發(fā)明的測(cè)序方法中，熒光標(biāo)記是結(jié)合在雙脫氧核苷酸上的，熒光標(biāo)記雙脫氧核苷酸在引物上延伸后，以磷酸ニ酯鍵與引物牢固結(jié)合，引物是固定在芯片上的，所以熒光標(biāo)記很難被洗脫，避免了沖洗造成的假陰性或假陽(yáng)性。B.在傳統(tǒng)的探針陣列芯片雜交測(cè)序方法中，容易發(fā)生堿基錯(cuò)配得到錯(cuò)誤的信號(hào)，而在本發(fā)明的測(cè)序方法中，除了引物3’末端與待測(cè)DNA的雜交，還加上引物延伸I個(gè)核苷酸，延伸通常是很準(zhǔn)確的，因此大大提高了準(zhǔn)確性。C.在本發(fā)明的測(cè)序方法中，采用4塊芯片同時(shí)進(jìn)行測(cè)序，不同芯片相同位點(diǎn)的熒光信號(hào)可以互相印證，大大提高了準(zhǔn)確性。2、本發(fā)明的測(cè)序方法成本低。傳統(tǒng)的探針陣列芯片雜交測(cè)序方法，通常需要8 12聚體核苷酸的探針陣列，需要合成65536 16777216種探針，而本發(fā)明的測(cè)序方法引物3’末端為5 6聚體核苷酸的引物陣列，只需要合成1024 4096種引物,大大降低了芯片的制作成本。3、本發(fā)明的測(cè)序方法不需要復(fù)雜儀器，主要體現(xiàn)在A.在本發(fā)明的測(cè)序方法中，使用的熒光標(biāo)記可以是單色的，而且芯片是低密度的，因此可以使用芯片掃描儀、紫外檢測(cè)儀、熒光顯微鏡等多種儀器檢測(cè)熒光，便于在普通的實(shí)驗(yàn)室推廣使用。B.在本發(fā)明的測(cè)序方法中，由于引物的數(shù)目比較少，所以芯片的面積可以做得比較小，可以放入PCR反應(yīng)管中在普通的PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，而不必使用芯片雜交儀，實(shí)現(xiàn)低成本高通量的測(cè)序。4、本發(fā)明的測(cè)序方法操作簡(jiǎn)單，可以同時(shí)進(jìn)行雙鏈DNA的雙向測(cè)序，不必經(jīng)過(guò)麻煩的單鏈DNA制備過(guò)程。傳統(tǒng)的探針陣列芯片雜交測(cè)序方法，需要先制備單鏈DNA，而本發(fā)明的測(cè)序方法由于每條引物都會(huì)有它的反向互補(bǔ)序列引物，引物延伸是從5’端往3’端方向的，所以通過(guò)對(duì)短序列的拼接和分析，可以判斷每條短序列在雙鏈DNA的哪一條鏈上，可以同時(shí)進(jìn)行雙鏈DNA的雙向測(cè)序。


圖I是本發(fā)明基于引物陣列芯片的DNA測(cè)序方法的示意圖
其中1為基片；2為引物；3為待測(cè)DNA ；4為延伸的熒光標(biāo)記核苷酸
具體實(shí)施方式
實(shí)施例一如圖1，將ー組序列已知的引物的5’端固定在基片上預(yù)設(shè)的位置排列成引物陣列芯片，引物的3’末端為5個(gè)堿基共45 = 1024種所有排列的序列，其中3’末端序列為反向互補(bǔ)的引物，它們被固定在基片上相鄰的位置，引物的中間為5個(gè)堿基的兼并序列，其堿基為四種堿基A, T, C, G的混合物，引物的5’端為10個(gè)堿基A,芯片的面積小于3mmX 5mm,可以放入200ul的PCR反應(yīng)管中。把4張相同的芯片，分別放入4個(gè)分別含有熒光標(biāo)記的四種不同雙脫氧核苷酸(ddATP, ddCTP, ddGTP和ddUTP)的200ul的PCR反應(yīng)管中，反應(yīng)管中還含有PCR緩沖液、DNA聚合酶和待測(cè)雙鏈DNA，待測(cè)雙鏈DNA的制備是通過(guò)常規(guī)PCR擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)無(wú)水こ醇沉淀、75 %こ醇洗滌、干燥、純水溶解得到的。把4個(gè)反應(yīng)管都放入PCR儀，進(jìn)行94°C變性30秒鐘，36°C退火2分鐘，72°C延伸10秒鐘，循環(huán)10次，使部分與待測(cè)DNA能雜交的引物延伸I個(gè)熒光標(biāo)記核苷酸并終止延伸。 把芯片從反應(yīng)管中取出來(lái)，用去離子純水沖洗后，用芯片掃描儀檢測(cè)芯片的各基點(diǎn)的熒光信號(hào)，得到ー組不同的由引物末端序列和延伸核苷酸組成的短序列，通過(guò)對(duì)短序列的拼接和分析，判斷每條短序列在雙鏈DNA的哪一條鏈上，將彼此重疊的短序列拼接成待測(cè)DNA的完整序列。實(shí)施例ニ將ー組序列已知的引物的5’端固定在基片上預(yù)設(shè)的位置排列成引物陣列芯片，弓丨物的3’末端為6個(gè)堿基共46 = 4096種所有排列的序列，其中3’末端序列為反向互補(bǔ)的引物，它們被固定在基片上相鄰的位置，引物的中間為5個(gè)堿基的兼并序列，其堿基為四種堿基A，T，C，G的混合物，引物的5’端為10個(gè)堿基A。把4張相同的芯片，分別加一滴分別含有熒光標(biāo)記的四種不同雙脫氧核苷酸(ddATP, ddCTP，ddGTP和ddUT)、PCR緩沖液、DNA聚合酶和待測(cè)單鏈DNA的反應(yīng)液到芯片的表面上，待測(cè)單鏈DNA的制備是通過(guò)不對(duì)稱PCR擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)無(wú)水こ醇沉淀、75%こ醇洗滌、干燥、純水溶解得到的。把上述4張芯片都放入芯片雜交儀，進(jìn)行94°C變性30秒鐘，36°C退火2分鐘，72°C延伸10秒鐘，循環(huán)10次，使部分與待測(cè)DNA能雜交的引物延伸I個(gè)熒光標(biāo)記核苷酸并終止延伸。把芯片從芯片雜交儀中取出來(lái)，用去離子純水沖洗后，用芯片掃描儀檢測(cè)芯片的各基點(diǎn)的熒光信號(hào)，得到ー組不同的由引物末端序列和延伸核苷酸組成的短序列，通過(guò)對(duì)短序列的拼接和分析,將彼此重疊的短序列拼接成待測(cè)DNA的完整序列。
權(quán)利要求
1.一種基于引物陣列芯片的DNA測(cè)序方法，其特征在于把ー組序列已知的引物固定在芯片上，然后把4張相同的芯片，分別放入4個(gè)分別含有熒光標(biāo)記的四種不同雙脫氧核苷酸的反應(yīng)體系中，與待測(cè)DNA進(jìn)行退火雜交，使引物延伸I個(gè)核苷酸，檢測(cè)芯片的熒光信號(hào)得到一組由引物末端序列和延伸核苷酸組成的短序列，將彼此重疊的短序列拼接成待測(cè)DNA的完整序列，包括如下步驟 步驟I)將ー組序列已知的引物的5’端固定在基片上預(yù)設(shè)的位置排列成引物陣列芯片; 步驟2)把4張相同的芯片，分別放入4個(gè)分別含有熒光標(biāo)記的四種不同雙脫氧核苷酸ddATP，ddCTP，ddGTP和ddUTP的反應(yīng)體系中，體系中還含有PCR緩沖液、DNA聚合酶和待測(cè)的雙鏈DNA或單鏈DNA ； 步驟3)反應(yīng)體系在PCR儀、芯片雜交儀或者其它可以改變和控制溫度的儀器上，進(jìn)行模板DNA變性溫度、引物與模板DNA結(jié)合溫度、引物延伸溫度的溫度變化過(guò)程，循環(huán)I 10次，使部分與待測(cè)DNA能雜交的引物延伸I個(gè)熒光標(biāo)記核苷酸并終止延伸； 步驟4)把芯片從反應(yīng)體系中取出來(lái)，沖洗后，檢測(cè)芯片的各基點(diǎn)的熒光信號(hào)，得到一組不同的由引物末端序列和延伸核苷酸組成的短序列，將彼此重疊的短序列拼接成待測(cè)DNA的完整序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的DNA測(cè)序方法，其特征在于所述的引物3’末端為5 6個(gè)堿基組成的序列，其序列是四種堿基A，T，C，G的全部排列序列的其中ー種；引物中間為3 10個(gè)堿基組成的兼并序列，這些堿基為四種堿基A，T，C，G的混合物；5’端為10 40個(gè)任意堿基組成的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的DNA測(cè)序方法，其中3’末端為反向互補(bǔ)序列的引物，它們被固定在基片上相鄰的位置，所述的反向互補(bǔ)序列是指按照A-T、C-G的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，兩條核苷酸序列分別從5’端至3’端、3’端至5’端的堿基順序互補(bǔ)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于引物陣列芯片的DNA測(cè)序方法，其特征在于把一組序列已知的引物固定在芯片上，然后把4張相同的芯片，分別放入4個(gè)分別含有熒光標(biāo)記的四種不同雙脫氧核苷酸的反應(yīng)體系中，與待測(cè)DNA進(jìn)行退火雜交，使引物延伸1個(gè)核苷酸，檢測(cè)芯片的熒光信號(hào)得到一組由引物末端序列和延伸核苷酸組成的短序列，將彼此重疊的短序列拼接成待測(cè)DNA的完整序列。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102643893SQ20111003899
公開(kāi)日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2011年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月16日
發(fā)明者陳國(guó)燕 申請(qǐng)人:陳國(guó)燕