專利名稱：完整葉綠體長(zhǎng)時(shí)間離體培養(yǎng)方法
完整葉綠體長(zhǎng)時(shí)間離體培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及植物完整葉綠體分離與體外培養(yǎng)的技術(shù)與實(shí)施，包括葉綠體分離與體外培養(yǎng)試劑的配制和所涉及的操作程序。
背景技術(shù)：
葉綠體是植物將太陽(yáng)能轉(zhuǎn)化成化學(xué)能的重要細(xì)胞器，是地球生物維持生存的主要攝取能量的源頭，因此，葉綠體的結(jié)構(gòu)、功能、基因組及基因表達(dá)調(diào)控等都成為生命科學(xué)備受關(guān)注的問(wèn)題，其相關(guān)的基礎(chǔ)理論和應(yīng)用研究與糧食、能源、環(huán)境等人類的生存密切相關(guān)。 處于真核生物細(xì)胞中的葉綠體雖然擁有獨(dú)立的基因組和雙層生物膜包被，但屬于半自主性細(xì)胞器，其發(fā)生、發(fā)育和功能不僅受細(xì)胞核基因組的調(diào)控，還與其它細(xì)胞器相互影響，協(xié)同作用。對(duì)葉綠體突變和遺傳轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化等等的觀察，可以為葉綠體基因組及基因表達(dá)調(diào)控研究提供重要方法。目前，國(guó)際上外源基因?qū)肴~綠體的技術(shù)仍局限于主要的基因槍方法，葉綠體突變體和轉(zhuǎn)化子篩選依然比較困難，這些成為制約葉綠體轉(zhuǎn)化等相關(guān)研究與應(yīng)用發(fā)展進(jìn)程的關(guān)鍵瓶頸，而葉綠體離體操作是一個(gè)重要的突破口，離體葉綠體若能較長(zhǎng)時(shí)間保持完整，將為葉綠體基因工程操作提供便捷和開(kāi)辟新途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供完整葉綠體提取與葉綠體體外長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)相關(guān)試劑及其提取及培養(yǎng)方法。
權(quán)利要求
1.一種完整葉綠體提取相關(guān)試劑，其特征在于該試劑組成包括
2.一種完整葉綠體離體培養(yǎng)相關(guān)試劑，其特征在于該試劑包括下列表明濃度的組成成分 以上試劑溶于無(wú)離子水中，調(diào)pH至6. 2，高壓滅菌后于4°C冰箱保存。
3.一種完整葉綠體長(zhǎng)時(shí)間離體培養(yǎng)方法，其特征在于該方法的具體步驟包括 第1、稱取4°C過(guò)夜的新鮮植物子葉8 10g，剪碎，置于冰上預(yù)冷的研缽中；第2、將權(quán)利要求1所述試劑中的BufferA40ml分兩次加入研缽中，并加入Ig石英砂， 研磨后經(jīng)6層紗布過(guò)濾至50ml離心管中；第3、將第2步中的研磨液于4°C 800g離心6min，棄上清；第4、向第3步中加入預(yù)冷的權(quán)利要求1所述試劑中的BufferB 25ml,然后加入 17. 5ul β -巰基乙醇，懸浮葉綠體；第5、將第4步中的懸浮液于4°C 800g離心8min，棄上清； 第6、向第5步中加入權(quán)利要求1所述試劑中的BufferC I^iil，懸浮葉綠體； 第7、將第6步中的懸浮液于4°C IOOOg離心8min，棄上清，獲得完整葉綠體； 第8、取IOml權(quán)利要求2所述離體培養(yǎng)試劑懸浮第7步獲得的完整葉綠體，置于25V 下避光或弱光培養(yǎng)。
全文摘要
完整葉綠體長(zhǎng)時(shí)間離體培養(yǎng)方法。本發(fā)明分別以黃瓜、煙草和菠菜無(wú)菌苗子葉為材料，以檸檬酸、NaCl、Tris和EDTA為主要成分的葉綠體提取試劑，通過(guò)對(duì)植物材料的研磨、紗布過(guò)濾、差速離心等操作分離較完整的葉綠體(

圖1)；以MnCl2、MgSO4、NaCl、山梨醇等為主要成分的培養(yǎng)試劑，對(duì)離體葉綠體進(jìn)行液體培養(yǎng)。在體外培養(yǎng)長(zhǎng)達(dá)20天左右，葉綠體仍然保持綠色且顯微形態(tài)正常(圖2)，膜結(jié)構(gòu)完整(圖3)。離體培養(yǎng)兩周內(nèi)葉綠體經(jīng)歷分裂增值達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定的數(shù)量(圖4)。對(duì)葉綠體離體轉(zhuǎn)化和外源基因檢測(cè)證明離體長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)的葉綠體內(nèi)DNA沒(méi)有發(fā)生降解(圖5)。本發(fā)明可為葉綠體功能、遺傳轉(zhuǎn)化和細(xì)胞工程等基礎(chǔ)理論與應(yīng)用研究提供便捷和新途徑。
文檔編號(hào)C12N5/04GK102174464SQ20111003886
公開(kāi)日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月16日
發(fā)明者喬明強(qiáng), 張文娟, 張秀明, 徐海津, 王丹, 王勇, 白艷玲 申請(qǐng)人:南開(kāi)大學(xué)