專利名稱：一種雙歧桿菌多糖分離純化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種應(yīng)用生物工程技術(shù)從雙歧桿菌菌體中分離純化雙歧桿菌多糖的方法。
背景技術(shù)：
雙歧桿菌(Bifidobacterium)最初由法國科學(xué)家Tissier于1899年從嬰兒糞便中分離得到。在細菌分類學(xué)中雙歧桿菌屬為革蘭氏陽性專性厭氧細菌，典型的菌體形態(tài)應(yīng)呈Y字或V字的分叉桿菌，但大多數(shù)菌體呈多樣形。與其他革蘭氏陽性菌相比，它對營養(yǎng)的要求不十分嚴格，最適PH 6.5 7.0，最適生長溫度371 421。該菌無芽胞、莢膜及鞭毛，無運動性，觸媒、硝酸鹽還原、靛基質(zhì)產(chǎn)生、明膠液化及精氨酸水解均陰性。到目前為止已發(fā)現(xiàn)32種型的雙歧桿菌，除人以外還在馬、牛、豬、雞、魚、甚至蜜蜂等動物體內(nèi)都分離到不同種型的雙歧桿菌，其中有12種是從人體中分離來的，1974年伯杰細菌鑒定手冊第八版正式確定其為雙歧桿菌屬。應(yīng)用于食用益生菌生產(chǎn)的有嬰兒雙歧桿菌(B. infantis)、長雙歧桿菌(B. Ionggums)、短雙歧桿菌(B. breve)、青春雙歧桿菌(B. adolescentis)、兩歧雙歧桿菌(B.bifidum)。作為益生菌它們被廣泛添加在食品、藥品、保健品中，用于人體的防病， 治病。隨著人類對雙歧桿菌認識的深入，應(yīng)用雙歧桿菌自身的生物拮抗作用和免疫作用以抑制腸道有害菌的生長，從而達到防病治病的作用。近年來，人們注意到腸道內(nèi)雙歧桿菌可增強機體免疫監(jiān)視功能，例如通過口服雙歧桿菌可增強各種細胞因子和IgA產(chǎn)生。提高自然殺傷細胞和巨噬細胞活性、提高局部或全身的防御功能，發(fā)揮自身穩(wěn)定調(diào)節(jié)、抗感染、 抗腫瘤、抗突變、抗衰老作用。經(jīng)檢索，關(guān)于雙歧桿菌多糖的分離純化方法目前尚無報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題是提供一種雙歧桿菌多糖的分離純化的方法。本發(fā)明提供雙歧桿菌多糖的分離純化方法，不影響多糖天然的結(jié)構(gòu)，保留了其生物活性，并能作為(如針劑等)藥用原料。本方法的具體步驟是從雙歧桿菌菌體中通過熱水提取有生物活性的粗多糖、去蛋白、除鹽、柱層析純化和冷凍干燥。本發(fā)明具體工藝步驟如下1、雙歧桿菌發(fā)酵其菌體濃縮本發(fā)明所涉及到的雙歧桿菌包括青春型雙歧桿菌、 長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌。將雙歧桿菌種子液接入已經(jīng)滅菌后的每IOOml培養(yǎng)基中含有大豆蛋白胨1-1. 5g，魚胨1-1. 5g，葡萄糖2g，牛肉膏0. 5_2g， 酵母膏0.5-2g，K2HPO4 0.2-0.6g。經(jīng)35_38°C厭氧發(fā)酵后，再經(jīng)離心濃縮即獲得雙歧桿菌菌體濃縮物。2、細胞破壁將該雙歧桿菌菌體濃縮物加蒸餾水或生理鹽水(1 3-1 5)，使用高壓細胞破碎機操作壓力IOOMPa左右以高壓破碎菌體細胞壁。
3、脫脂取破壁粉碎的雙歧桿菌菌體粉末倒入IOOOml燒杯中，加入甲醇，攪拌至完全浸沒，室溫下脫脂Mh。黃褐色上清回收，沉渣再加入甲醇，重復(fù)脫脂一次。4、水提步驟1所得的脫脂后雙歧桿菌菌體粉末按1 6% (g/ml)的料液比加入蒸餾水，室溫下、pH = 7條件下提取2. 5h?；旌衔镉?0ml塑料離心管，以5000rpm，15min 離心，上清45°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓蒸發(fā)，濃縮至原生藥體積的1. 5倍，再逐漸加入預(yù)冷的4倍體積的無水乙醇，4°C冰箱過夜。收集沉淀，即得雙歧桿菌粗多糖。5、去蛋白步驟2所得的雙歧桿菌多糖水提物溶液用有機溶劑以常規(guī)方式去除其蛋白；6、透析步驟3所得的水提物濃縮，離心，棄不溶物，得上清液，用透析袋將上清液在流水中透析48小時，再在去離子水中透析M小時，進一步去除寡糖、無機鹽、色素等小分子雜質(zhì)，收集雙歧桿菌多糖的提取液。7、純化將經(jīng)步驟4透析后的液體濃縮，以DEAE纖維素-52和葡聚糖凝膠層析。a)離子交換色譜柱(DEAE纖維素-52)蒸餾水平衡DEAE纖維素-52 (3. 5 X 40cm)， 上樣量30ml，以0 0. 5mol/L的NaHCO3梯度洗脫，流速為0. 5ml/min,苯酚-硫酸法檢測多糖出峰，繪制洗脫曲線。分離出5個組分，收集后適當濃縮、再透析和冷凍干燥。b)凝膠過濾層析初次純化(S^hadex G_100)將第1、2組分分別上凝膠柱 (3. 5 X 100cm)純化，以0. Imol/LNaCI洗脫，流速為0. 5ml/min，苯酚-硫酸法檢測多糖出峰，繪制洗脫曲線。第1組分經(jīng)kphadex G-100凝膠柱初次純化后，得2個峰，第2峰為所需；第2組分經(jīng)S^hadexG-IOO凝膠柱初次純化后，得2個峰，第1峰為所需。收集所需峰， 濃縮后4°C保存。c)凝膠柱再次純化(Sephadex G-75和Sephadex G-100)第1組分第2峰選擇 Sephadex G-75凝膠柱(1. 6 X 100cm)再次純化，第2組分第1峰選擇kphadex G-100凝膠柱(1. 6 X 100cm)再次純化，均以0. Imol/LNaCI洗脫，流速為0. 3ml/min，苯酚-硫酸法檢測多糖出峰，繪制洗脫曲線。此兩個峰純化后，都經(jīng)高效液相檢測為單一峰。8、冷凍干燥將純化后的兩個峰收集后，對蒸餾水透析2d，45°C條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓蒸發(fā)至適當體積，5000rpm, 30min離心，上清經(jīng)0. 22 μ m濾膜過濾后冷凍干燥，得白色粉末的雙歧桿菌多糖純品，經(jīng)高效液相檢測純度為100%，苯酚-硫酸法檢測中性糖含量達95%以上。本發(fā)明建立雙歧桿菌多糖的分離純化工藝，獲取均一分子量的多糖，成分為甘露糖和半乳糖，具有免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性。對進一步研究其化學(xué)結(jié)構(gòu)和闡明其免疫藥理活性機制有重要意義。


圖1 :多糖經(jīng)DEAE-纖維素52柱層析分離出5個組分圖2 第1峰的凝膠過濾層析圖譜圖3 第1峰經(jīng)凝膠純化后的HPLC圖譜
具體實施例方式實施例1
1、雙歧桿菌發(fā)酵其菌體濃縮本發(fā)明所涉及到的雙歧桿菌包括青春型雙歧桿菌、 長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌。將雙歧桿菌種子液接入已經(jīng)滅菌后的每IOOml培養(yǎng)基中含有大豆蛋白胨1-1. 5g，魚胨1-1. 5g，葡萄糖2g，牛肉膏0. 5_2g， 酵母膏0. 5-2g，K2HPO4O. 2-0. 6g。經(jīng)35_38°C厭氧發(fā)酵后，再經(jīng)離心濃縮即獲得雙歧桿菌菌體濃縮物。2、細胞破壁將該雙歧桿菌菌體濃縮物加蒸餾水或生理鹽水(1 3-1 5)，使用高壓細胞破碎機操作壓力IOOMPa左右以高壓破碎菌體細胞壁。3、脫脂取破壁粉碎的雙歧桿菌菌體粉末到IOOOml燒杯中，加入甲醇，攪拌至完全浸沒，室溫下脫脂Mh。黃褐色上清回收，沉渣再加入甲醇，重復(fù)脫脂一次。4、水提步驟1所得的脫脂后雙歧桿菌菌體粉末按1 6% (g/ml)的料液比加入蒸餾水，室溫下、pH = 7條件下提取2. 5h?；旌衔镉?0ml塑料離心管，以5000rpm，15min 離心，上清45°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓蒸發(fā)，濃縮至原生藥體積的1. 5倍，再逐漸加入預(yù)冷的4倍體積的無水乙醇，4°C冰箱過夜。收集沉淀，即得雙歧桿菌粗多糖。5、去蛋白步驟2所得的雙歧桿菌多糖水提物溶液溶解于雙蒸水，將氯仿按多糖水溶液1/5體積加入，隨之加入氯仿體積1/5的正丁醇，混合物經(jīng)劇烈振搖攪拌后，以 5000rpm，30min離心，除去蛋白。如此重復(fù)除蛋白7 10次。6、透析步驟3所得的水提物濃縮，離心，棄不溶物，得上清液，用透析袋將上清液在流水中透析48小時，再在去離子水中透析M小時，進一步去除寡糖、無機鹽、色素等小分子雜質(zhì)，收集雙歧桿菌多糖的提取液。7、純化將經(jīng)步驟4透析后的液體濃縮，以DEAE纖維素-52和葡聚糖凝膠層析。a)陰離子交換色譜柱(DEAE纖維素-5 蒸餾水平衡DEAE纖維素-52 (3. 5 X 40cm)，上樣量 30ml，以 0 0. 5mol/L 的 NaHCO3 梯度洗脫，流速為 0. 5ml/min, 苯酚-硫酸法檢測多糖出峰，繪制洗脫曲線。分離出5個組分(見圖1)，收集后適當濃縮、 再透析和冷凍干燥。b)凝膠過濾層析純化(S^hadex G-100)將第1組分分別上凝膠柱(3. 5 X 100cm) 純化，以蒸餾水洗脫，流速為0. 5ml/min，苯酚-硫酸法檢測多糖出峰，繪制洗脫曲線(見圖 2)。然后再將上述純化的多糖經(jīng)kphadex G-100凝膠柱(1. 6 X 100cm)純化，以蒸餾水洗脫，流速為0.3ml/min，苯酚-硫酸法檢測多糖出峰，繪制洗脫曲線。8、冷凍干燥將純化后的兩個峰收集后，對蒸餾水透析2d，45°C條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓蒸發(fā)至適當體積，5000rpm, 30min離心，上清經(jīng)0. 22 μ m濾膜過濾后冷凍干燥，得白色粉末的雙歧桿菌多糖純品，經(jīng)高效液相檢測純度為100% (見圖幻，苯酚-硫酸法檢測中性糖含量達95%以上。
權(quán)利要求
1.一種雙歧桿菌多糖的分離純化方法，由下列步驟實現(xiàn)(1)雙歧桿菌發(fā)酵及其菌體濃縮本發(fā)明所涉及到的雙歧桿菌包括青春型雙歧桿菌、 長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌。將雙歧桿菌種子液接入已經(jīng)滅菌后的每IOOml培養(yǎng)基中含有大豆蛋白胨1-1. 5g，魚胨1-1. 5，葡萄糖2g，牛肉膏0. 5_2g，酵母膏0. 5-2g，K2HPO4O. 2-0. 6g。經(jīng)35_38°C厭氧發(fā)酵后，再經(jīng)離心濃縮即獲得雙歧桿菌菌體濃縮物。(2)細胞破壁將該雙歧桿菌菌體濃縮物加蒸餾水或生理鹽水(1 3-1 5)，使用高壓細胞破碎機操作壓力IOOMPa左右以高壓破碎菌體細胞壁。(3)脫脂將破壁粉碎的雙歧桿菌菌體，用有機溶劑以常規(guī)方式脫脂；(4)水提步驟(1)所得的脫脂后雙歧桿菌菌體粉末按1 6% (g/ml)的料液比加入蒸餾水，室溫下浸提20 25小時；以3000 5000rpm離心15 30min，取上清液，得雙歧桿菌多糖水提物溶液；(5)去蛋白步驟(2)所得雙歧桿菌多糖水提物溶液用有機溶劑以常規(guī)方式去除其蛋白；(6)透析步驟C3)所得的水提物濃縮，離心，棄不溶物，得上清液，用透析袋將上清液在流水中透析48小時，再在去離子水中透析M小時，進一步去除寡糖、無機鹽、色素等小分子雜質(zhì)，收集雙歧桿菌多糖的提取液；(7)純化將經(jīng)步驟(4)透析后的液體濃縮，以DEAE纖維素-52和葡聚糖凝膠層析，收集液用苯酚硫酸法檢測，合并多糖峰的收集液，真空冷凍干燥，得層析純雙歧桿菌多糖。
2.權(quán)利要求1說述的雙歧桿菌多糖的分離純化方法，其特征在于雙歧桿菌為青春雙歧桿菌、長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌中的一種或多種。
3.如權(quán)利要求1說述的雙歧桿菌多糖的分離純化方法，其特征是，步驟(1)所述有機溶劑是甲醇。
4.如權(quán)利要求1說述的雙歧桿菌多糖的分離純化方法，其特征是，步驟(2)所述離心速度是5000rpm，離心時間是15min。
5.如權(quán)利要求1說述的雙歧桿菌多糖的分離純化方法，其特征是，步驟(3)所述有機溶劑是氯仿和正丁醇。
6.如權(quán)利要求1說述的雙歧桿菌多糖的分離純化方法，其特征是，步驟(5)所述DEAE 纖維素-52層析柱(3. 5 X 40cm)，上樣量30ml，洗脫液是0 0. 5mol/L的NaHCO30
7.如權(quán)利要求1說述的雙歧桿菌多糖的分離純化方法，其特征是，步驟(5)所述葡聚糖凝膠(SephadexG-100 和 S印hadexG-75)層析柱為 3. 5 X IOOcm 和 1. 6 X IOOcm 兩種規(guī)格，洗脫液是蒸餾水。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雙歧桿菌多糖分離純化的方法，主要由下述步驟組成將雙歧桿菌菌種接種在培養(yǎng)基經(jīng)35-38℃厭氧發(fā)酵后，離心濃縮獲得雙歧桿菌菌體濃縮物；再經(jīng)高壓破碎菌體細胞壁；水提醇沉淀法提取雙歧桿菌多糖成分，陰離子交換層析和凝膠過濾層析反復(fù)色譜純化，真空冷凍干燥雙歧桿菌多糖的提取物，即得雙歧桿菌多糖。利用本發(fā)明制備的雙歧桿菌多糖能夠最大限度分離純化雙歧桿菌多糖，既不影響多糖天然的結(jié)構(gòu)又能保持其原有生物活性，且本發(fā)明的方法設(shè)備及環(huán)境要求低、方法簡便、成本低、靈活實用，利于推廣、開發(fā)和應(yīng)用。
文檔編號C12P19/04GK102181505SQ201110038409
公開日2011年9月14日 申請日期2011年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月31日
發(fā)明者劉佳明, 孫晶 申請人:溫州醫(yī)學(xué)院