一種枸杞多糖的分離純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物大分子分離純化技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種枸杞多糖的分離純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]枸杞多糖是由幾種單糖組成的大分子物質(zhì)，分子量在80~120 kDa之間，是枸杞中重要的活性物質(zhì)。枸杞多糖具有良好的保健以及醫(yī)藥價(jià)值，在增強(qiáng)免疫功能、抗衰老、護(hù)肝、降血糖、降血脂、抑制腫瘤生長、對(duì)放療的增敏、化療的增效減毒都具有良好的功能。枸杞多糖憑借其良好的保健藥用價(jià)值，展現(xiàn)出廣闊的商業(yè)價(jià)值。傳統(tǒng)枸杞多糖的提取方法多為水提醇沉法，所得枸杞粗多糖含有蛋白質(zhì)雜質(zhì)，需要除去。植物多糖粗蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)方法有:①Sevage法；②三氯乙酸法；③鞣酸法。傳統(tǒng)的除蛋白法均存在工藝繁瑣，有機(jī)溶劑用量大，物耗能耗大，成本高，易造成多糖活性降低以及有機(jī)溶劑殘留。
[0003]雙水相體系(Aqueous Two-Phase System, ATPS)是一種或幾種物質(zhì)的水溶液以一定濃度混合，在一定條件下形成的互不相溶的兩相水溶液體系。雙水相萃取(AqueousTwo-Phase Extract1n, ATPE)是基于雙水相體系的一種極具前途的新型分離技術(shù)。與傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑萃取相同，雙水相萃取原理也是依據(jù)物質(zhì)在兩相間的選擇性分配。但相比于傳統(tǒng)的溶劑萃取，雙水相萃取可以更有效地分離極性有機(jī)物。同時(shí)，對(duì)于一些具有生物活性或極具價(jià)值的物質(zhì)，該方法避免了大量有機(jī)溶解的使用可能會(huì)造成生物活性物質(zhì)的變性和失活。總而言之，雙水相萃取作為一種新型液液萃取分離技術(shù)，具有操作條件溫和，安全無毒或低毒，工藝簡單，具有良好的生物相容性，可與原有有機(jī)溶劑萃取生產(chǎn)中的其它流程有效結(jié)合等優(yōu)勢(shì)，具有良好的應(yīng)用前景。但現(xiàn)有的雙水相體系大多使用傳統(tǒng)聚合物諸如聚乙二醇等，這類聚合物大多存在著回收分離困難，成本高等缺陷，這就限制了這些聚合物形成的雙水相在工業(yè)化生產(chǎn)中的大規(guī)模應(yīng)用。本方法采用新型溫敏共聚物聚環(huán)氧乙烷-聚環(huán)氧丙烷-聚環(huán)氧乙烷(Ε0Ρ0Ε0)，相較于傳統(tǒng)雙水相中使用的聚合物，本方法中使用的EOPOEO得到了有效的回收再利用，相較于傳統(tǒng)雙水相大大降低了生產(chǎn)成本，同時(shí)更為環(huán)保，這就使得該方法在工業(yè)化大生產(chǎn)中具有良好的應(yīng)用前景。
[0004]傳統(tǒng)枸杞多糖的提取方法多為水提醇沉法，所得枸杞粗多糖會(huì)帶有蛋白質(zhì)、色素、等小分子雜質(zhì)，這直接影響到了產(chǎn)品的質(zhì)量。所以，必須對(duì)枸杞粗多糖進(jìn)行純化。使用E0P0E0-無機(jī)鹽雙水相體系對(duì)枸杞粗多糖進(jìn)行純化，借助多糖與蛋白質(zhì)等雜質(zhì)在兩相間分配的不同，使得枸杞多糖與蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的有效分離。最后，借助透析、醇沉和加熱分相等手段回收產(chǎn)品和原料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服目前枸杞多糖純化工藝流程長、物耗能耗高、污染大的缺陷，提供一種工藝流程更為簡單、成本低廉、綠色環(huán)保的枸杞純多糖的分離純化方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下: 一種枸杞多糖的分離純化方法，其特征在于按照下述步驟進(jìn)行:
(1)按比例將新型溫敏嵌段共聚物聚環(huán)氧乙烷-聚環(huán)氧丙烷-聚環(huán)氧乙烷(EOPOEO)與無機(jī)鹽混合，制備E0P0E0-無機(jī)鹽雙水相體系；
(2)將枸杞粗多糖溶液加入步驟(I)所得的雙水相體系中，振蕩得混合體系，然后靜置分相，將上下相分離；
(3)將步驟(2)得到的下相裝入透析袋(8000-14000Da)中，于蒸餾水中透析24h以除去鹽及其它小分子雜質(zhì)；所得的透析液減壓濃縮，再與95%的乙醇混合均勻，4°C下靜置12h，得到純化枸杞多糖；
(4)將步驟(2)中得到的上相于4°C下靜置過夜以沉淀蛋白質(zhì)，離心取上層清液，然后與0.1lM的氫氧化鈉混合，升溫至70°C分相4h，將下層相分出以回收Ε0Ρ0Ε0。
[0007]步驟(I)中，所述無機(jī)鹽為磷酸二氫鈉，硫酸銨，檸檬酸鈉，磷酸氫二鉀。
[0008]步驟(I)中，所述雙水相體系中無機(jī)鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12-28%，Ε0Ρ0Ε0質(zhì)量分?jǐn)?shù)為
I2-28%ο
[0009]步驟(2)中，所述混合體系中枸f己多糖的濃度為4_8mg/g。
[0010]步驟(2)中，所述靜置分相的溫度為5-35°C，時(shí)間為12h。
[0011]步驟(3)中，所述乙醇的用量為透析液濃縮后濃縮液體積的5倍。
[0012]步驟(4)中，所述0.1lM的氫氧化鈉與上層清液的質(zhì)量比為1:10-10:1。
[0013]本發(fā)明的有益效果為:
(I)在E0P0E0-無機(jī)鹽雙水相體系中，加入枸杞粗多糖，將其中的蛋白質(zhì)等小分子雜質(zhì)萃取到雙水相體系上相，而枸杞多糖分配在下相中?；厥针p水相體系中下相，加醇沉淀得到純化的枸杞多糖。與傳統(tǒng)工藝相比，縮短了工藝流程，減少了有機(jī)溶劑用量，降低了物耗和能耗。
[0014](2) E0P0E0-無機(jī)鹽雙水相體系應(yīng)用于除蛋白過程，與Sevage法、三氯乙酸法、鞣酸法等傳統(tǒng)方法相比，條件溫和，有機(jī)溶劑使用和殘留少，綠色環(huán)保。
[0015](3)本方法雙水相體系中所用溫敏嵌段共聚物Ε0Ρ0Ε0經(jīng)過降溫、加入氫氧化鈉、加熱分相等步驟后，得到了有效的回收。同時(shí)，回收的聚合物被有效地再利用。與傳統(tǒng)雙水相體系相比，本方法解決了成相聚合物難以分離回收的難題，減少了物耗，大大降低了生產(chǎn)成本。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于此。
[0017]實(shí)施例1
(1)將新型溫敏嵌段共聚物聚環(huán)氧乙烷-聚環(huán)氧丙烷-聚環(huán)氧乙烷(Ε0Ρ0Ε0)與磷酸二氫鈉混合，制備E0P0E0-磷酸二氫鈉雙水相體系。雙水相體系中磷酸二氫鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，Ε0Ρ0Ε0質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20% ；
(2)將枸杞粗多糖溶液加入步驟(I)所述的E0P0E0-磷酸二氫鈉雙水相體系中，振蕩混合，使體系中枸杞多糖的濃度為6mg/g，然后于15°C條件下靜置分相12h，將上下層相分離；
(3)將步驟(2)得到的下相裝入透析袋(8000-14000Da)中，于蒸餾水中透析以除去鹽及其它小分子雜質(zhì)。后將所得的透析產(chǎn)物與5倍體積的95%乙醇混合均勻，4°C下靜置12h，得到純化枸杞多糖。多糖的回收率為87.6%，蛋白質(zhì)的殘留率為44.4% ；
(4)將步驟(2)中得到的上相4°C下靜置過夜以沉淀蛋白質(zhì)，離心取上層清液，然后與0.1lM的氫氧化鈉混合(質(zhì)量比為1:9)，升溫至70°C分相4h，將下層相分出以回收EOPOEO，EOPOEO的回收率為94.5%。
[0018]實(shí)施例2
(1)將新型溫敏嵌段共聚物聚環(huán)氧乙烷-聚環(huán)氧丙烷-聚環(huán)氧乙烷(EOPOEO)與磷酸二氫鈉混合，制備EOPOEO-磷酸二氫鈉雙水相體系。雙水相體系中磷酸二氫鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28%，EOPOEO質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20% ；
(2)將枸杞粗多糖溶液加入步驟(I)所述的EOPOEO-磷酸二氫鈉雙水相體系中，振蕩混合，使體系中枸杞多糖的濃度為6mg/g，然后于15°C條件下靜置分相12h，將上下層相分離；
(3)將步驟(2)得到的下相裝入透析袋(8000-14000Da)中，于蒸餾水中透析以除去鹽及其它小分子雜質(zhì)。后將所得的透析產(chǎn)物與5倍體積的95%乙醇混合均勻，4°C下靜置12h，得到純化枸杞多糖。多糖的回收率為84.9%，蛋白質(zhì)的殘留率為6.4% ；
(4)將步驟(2)中得到的上相4°C下靜置過夜以沉淀蛋白質(zhì)，離心取上層清液，然后與0.1IM的氫氧化鈉混合(質(zhì)量比為1:10 )，升溫至700C分相4h，將下層相分出以回收Ε0Ρ0Ε0，EOPOEO的回收率為97.8%。
[0019]實(shí)施例3
(1)將新型溫敏嵌段共聚物聚環(huán)氧乙烷-聚環(huán)氧丙烷-聚環(huán)氧乙烷(EOPOEO)與磷酸二氫鈉混合，制備EOPOEO-磷酸二氫鈉雙水相體系。雙水相體系中磷酸二氫鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24%，EOPOEO質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12% ；
(2)將枸杞粗多糖溶液加入步驟(I)所述的EOPOEO-磷酸二氫鈉雙水相體系中，振蕩混合，使體系中枸杞多糖的濃度為6mg/g，然后于15°C條件下靜置分相12h，將上下層相分離；
(3)將步驟(2)得到的下相裝入透析袋(8000-14000Da)中，于蒸餾水中透析以除去鹽及其它小分子雜質(zhì)。后將所得的透析產(chǎn)物與5倍體積的95%乙醇混合均勻，4°C下靜置12h，得到純化枸杞多糖。多糖的回收率為97.3%，蛋白質(zhì)的殘留率為36.1% ；
(4)將步驟(2)中得到的上相4°C下靜置過夜以沉淀蛋白質(zhì)，離心取上層清液，然后與0.1lM的氫氧化鈉混合(質(zhì)量比為10:1 )，升溫至70°C分相4h，將下層相分出以回收Ε0Ρ0Ε0，EOPOEO的回收率為97.2%。
[0020]實(shí)施例4
(1)將新型溫敏嵌段共聚物聚環(huán)氧乙烷-聚環(huán)氧丙烷-聚環(huán)氧乙烷(EOPOEO)與磷酸二氫鈉混合，制備EOPOEO-磷酸二氫鈉雙水相體系。雙水相體系中磷酸二氫鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24%，EOPOEO質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28% ；
(2)將枸杞粗多糖溶液加入步驟(I)所述的EOPOEO-磷酸二氫鈉雙水相體系中，振蕩混合，使體系中枸杞多糖的濃度為6mg/g，然后于15°C條件下靜置分相12h，將上下層相分離；
(3)將步驟(2)得到的下相裝入透析袋(8000-14000Da)中，于蒸餾水中透析以除去鹽及其它小分子雜質(zhì)。后將所得的透析產(chǎn)物與5倍體積的95%乙醇混合均勻，4°C下靜置12h，得到純化枸杞多糖。多糖的回收率為80.1%，蛋白質(zhì)的殘留率為14.7% ；
(4)將步驟(2)中得到的上相4°C下靜置過夜以沉淀蛋白質(zhì)，離心取上層清液，然后與0.1lM的氫氧化鈉混合(質(zhì)量比為1:9)，升溫至70°C分相4h，將下層相分出以回收EOPOEO，EOPOEO的回收率為93.5%。
[0021]實(shí)施例5
(1)將新型溫敏嵌段共聚物聚環(huán)氧乙烷-聚環(huán)氧丙烷-聚環(huán)氧乙烷(EOPOEO)與磷酸二氫鈉混合，制備EOPOEO-磷酸二氫鈉雙水相體系。雙水相體系中磷酸二氫鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24%，EOPOEO質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20% ；
(2)將2g的20g/L枸杞粗多糖溶液加入步驟(I)所述的EOPOEO-磷酸二氫鈉雙水相體系中，振蕩混合，使體系中枸杞多糖的濃度為4mg/g，然后于15°C條件下靜置分相12h，將上下層相分離；
(3)將步驟(2)得到的下相裝入透析袋(8000-14000Da)中，于蒸餾水中透析以除去鹽及其它小分子雜質(zhì)。后將所得的透析產(chǎn)物與5倍體積的95%乙醇混合均勻，4°C下靜置12h，得到純化枸杞多糖。多糖的回收率為97.1%，蛋白質(zhì)的殘留率為20% ；
(4)將步驟(2)中得到的上相4°C下靜置過夜以沉淀蛋白質(zhì)，離心取上層清液，然后與0.1lM的氫氧化鈉混合(質(zhì)量比為1:9)，升溫至70°C分相4h，將下層相分出以回收Ε0Ρ0Ε0，EOPOEO的回收率為96.4%。
[0022]實(shí)施例6
(1)將新型溫敏嵌段共聚物聚環(huán)氧乙烷-聚環(huán)氧丙烷-聚環(huán)氧乙烷(EOPOEO)與磷酸二氫鈉混合，制備EOPOEO-磷酸二氫鈉雙水相體系。雙水相體系中磷酸二氫鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24%，EOPOEO質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20% ；
(2)將枸杞粗多糖溶液加入步驟(I)所述的EOPOEO-磷酸二氫鈉雙水相體系中，振蕩混合，使體系中枸杞多糖的濃度