具有抗腫瘤活性的厚殼貽貝多糖類化合物的制備工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種新的厚殼貽貝中所含的多糖類化合物的制備方法，同時，還涉及該糖苷類化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]貽貝是海產(chǎn)雙殼貝類，俗稱青口、海紅，其干制品統(tǒng)稱淡菜，除含有豐富的氨基酸、糖類、蛋白質(zhì)及維生素外，還含有豐富的微量元素一硒。貝類提取物具有抗腫瘤，增加機(jī)體免疫功能，降血脂，抗衰老及抗病毒和抗菌功能；新近報道貽貝具有較高的修復(fù)DNA損傷的作用，故有望研制出抗腫瘤藥物新成分；貽貝足腺細(xì)胞分泌的粘液蛋白含有的貽貝粘著蛋白(屬糖蛋白類)為超強(qiáng)度粘液的研發(fā)等。貽貝不僅有很高的營養(yǎng)價值，還具有很好的藥用和食療功效，又是補(bǔ)腎良藥，藥效明顯。我國沿海所產(chǎn)的食用貽貝主要有紫貽貝、厚殼貽貝和翡翠貽貝等。目前國內(nèi)外研究對貽貝蛋白質(zhì)如過氧化物歧化酶、凝集素等的分離提純及功能進(jìn)行了一定研究，但對于貽貝多糖的研究不多。
[0003]從東海厚殼貽貝中分離純化而來的貽貝多糖具有有明顯的增強(qiáng)機(jī)體免疫力作用及體內(nèi)抗腫瘤等作用。對腫瘤細(xì)胞H0-8910、MCF-7、K562及SMMC-7721均有顯著抑制增殖作用。徐紅麗等采用熱水提取我國東海厚殼貽貝粗多糖，DEAE-Sepharose、Sepharose CL-6B柱層析進(jìn)一步分離純化得到貽貝多糖純品MP-1。用MTT法進(jìn)行體外抗腫瘤活性的研究。結(jié)果表明貽貝多糖純品MP-1主要由葡萄糖組成，對體外多種腫瘤細(xì)胞均有不同程度抑制作用(參見文獻(xiàn):徐紅麗，郭婷婷，郭一峰，張建鵬，馮偉華，焦炳華。貽貝水溶性多糖MP-1的分離純化及體外抗腫瘤活性研究[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2006，27 (9) =998-1001.)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有多糖提取方法脂類干擾以及最終多糖得率不高的缺點，提供一種新的我國東海厚殼貽貝所含的多糖類化合物的制備方法；本發(fā)明的第二目的是提供依據(jù)上述方法制備得到的厚殼貽貝多糖類化合物；本發(fā)明的第三目的是提供該多糖類化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案予以實現(xiàn)。
[0006]本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了厚殼貽貝多糖類化合物的制備方法，該方法包括以下步驟:
[0007]A.粗制品制備
[0008]新鮮貽貝軟體組織勻漿，1%甲醇間歇攪拌浸泡24h去脂，離心取沉淀。加水煮沸5h，抽濾，殘渣重復(fù)加水煮沸3h，抽濾，合并濾液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)50°C減壓濃縮濾液。0.5%活性炭脫色，離心去沉淀。加乙醇至終濃度75%，4°C靜置醇沉過夜。離心收集沉淀，分別用無水乙醇和丙酮洗滌2次，干燥得多糖水提物。多糖水提物溶于水，Sevage法除蛋白，混合液磁力攪拌，分液漏斗靜置分層，棄下層有機(jī)溶劑相。反復(fù)8次，至界面無白色沉淀。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)50°C減壓濃縮上層水相，加三倍體積無水乙醇沉淀過夜，棄上清，冷凍干燥得粗多糖。
[0009]B.精制品制備
[0010]將粗多糖溶于蒸餾水，離心收集上清，不溶物再次熱水浴中溶于蒸餾水，離心棄沉淀，合并兩次上清液，終濃度約0.2g/ml。上DEAE-S印harose F.F XK-50離子交換制備柱，蒸餾水洗脫，自動部分接收器收集洗脫液。苯酚-硫酸法(1:5)跟蹤檢測收集多糖組分，至無糖洗出為止(480nm處測定OD值，繪制洗脫曲線)。真空冷凍干燥濃縮多糖洗脫液，得到多糖提取物半純品。多糖提取物復(fù)溶于蒸懼水，離心棄沉淀，濃度約0.2g/ml,上SepharoseCL-6B凝膠制備柱，蒸餾水洗脫，自動部分接收器收集洗脫液，苯酚-硫酸法跟蹤檢測收集多糖組分，至無糖洗出為止。重復(fù)上Sepharose CL-6B凝膠制備柱,至HPLC檢測呈單一對稱峰。真空冷凍干燥得到多糖精制品。
[0011 ] 除非另有說明，本發(fā)明中所采用的百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。
[0012]本發(fā)明的第二方面，是提供了依據(jù)上述方法制備得到的厚殼貽貝多糖類化合物。
[0013]本發(fā)明的第三方面，是提供了上述的多糖類化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0014]所述的抗腫瘤藥物，其抗腫瘤作用是通過抑制腫瘤細(xì)胞NF-κ B p65基因表達(dá)而起作用的。
[0015]本發(fā)明對所述的貽貝多糖進(jìn)行了體內(nèi)外抗腫瘤活性的檢測，證明本發(fā)明化合物具有良好的抗腫瘤活性。
【具體實施方式】
[0016]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。但下列實施例不應(yīng)看作對本發(fā)明范圍的限制。
[0017]下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0018]下述實施例中的生物材料和主要試劑購自國藥集團(tuán)上海分公司。
[0019]實施例1:從厚殼貽貝中分離純化多糖類化合物
[0020]厚殼貽貝由浙江省嵊泗縣翔遠(yuǎn)水產(chǎn)有限公司提供，采自浙江省嵊泗縣貽貝養(yǎng)殖水域。
[0021]取新鮮貽貝軟體組織700g，組織搗碎機(jī)勻漿，加1L1%甲醇間歇攪拌浸泡24h去脂，5000rpmX 1min離心取沉淀。加水5L,攪拌、煮沸5h,抽濾,殘洛重復(fù)加水煮沸3h,抽濾,合并兩次濾液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)50°C減壓濃縮濾液。0.5%活性炭脫色，5000rpmX 1min離心去沉淀。加乙醇至終濃度75%，4°C靜置醇沉過夜。8000rpmX 1min離心收集沉淀，分別用無水乙醇和丙酮洗滌2次，干燥得多糖水提物。多糖水提物溶于250ml水，Sevage法除蛋白(V樣品:V氯仿:V正丁醇=20:4:1)，混合液磁力攪拌0.5h，分液漏斗靜置分層，棄下層有機(jī)溶劑相(含大量蛋白)。反復(fù)4次，至界面無白色沉淀。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)50°C減壓濃縮上層水相，加三倍體積無水乙醇沉淀過夜，棄上清，冷凍干燥得粗多糖。
[0022]將粗多糖溶于蒸餾水，8000rpmX 1min離心收集上清，不溶物再次熱水浴中溶于蒸餾水，離心棄沉淀，合并兩次上清液，終濃度約0.2g/ml。上DEAE-S印harose F.F XK-50離子交換制備柱，蒸餾水洗脫，自動部分接收器收集洗脫液。苯酚-硫酸法(1:5)跟蹤檢測收集多糖組分