專利名稱:一種貽貝肉蛋白抗氧化肽及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及到蛋白抗氧化肽,具體指一種貽貝肉蛋白抗氧化肽及其制備方法。
背景技術(shù):
抗氧化劑是一類可以減弱或者祛除自由基對(duì)人體損害和保護(hù)食品免受氧化損傷變質(zhì)的一類物質(zhì),主要分為天然和化學(xué)合成兩種類型。目前,以丁基羥基茴香醚(BHA)、二丁基羥基甲苯(BHT)和特丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)為代表的化學(xué)合成抗氧化劑由于價(jià)格相對(duì)便宜、抗氧化活性好,從而被廣泛地應(yīng)用到食品工業(yè)中。但是,現(xiàn)有研究表明化學(xué)合成抗氧化劑在不同程度上對(duì)人體的肝臟、腎臟等器官均有不利影響。因此,化學(xué)合成抗氧化劑的應(yīng)用受到了較大影響,部分發(fā)達(dá)國家已限量或禁止使用對(duì)人體有毒副作用的化學(xué)合成抗氧化齊U。因此,尋找高效、安全的天然抗氧化劑替代化學(xué)合成抗氧化劑成為研究熱點(diǎn)。貽貝屬軟體動(dòng)物門、瓣鰓綱、貽貝目、貽貝科,貽貝屬,是海產(chǎn)雙殼貝類,俗稱青口、海紅,素有“海中雞蛋”之稱,其蛋白質(zhì)含有人體需要的纈氨酸、亮氨酸等8種必需氨基酸,且含量遠(yuǎn)高于雞蛋、雞、鴨、魚、蝦和肉類。已有研究表明,貽貝提取物或貽貝肉酶解物具有抗腫瘤、降血脂、抗凝血、降血壓、抗氧化、提高免疫力等活性功能,專利號(hào)為ZL200510110096.8的中國發(fā)明專利公開了一種《厚殼貽貝的提取物、制造方法及其用途》,其是利用厚殼貽貝的提取物在抗流感和抗SARS病毒方面的應(yīng)用;專利號(hào)為ZL200510024391.1的中國發(fā)明專利公開了《一種可提高免疫力功能的厚殼貽貝提取物》,其是關(guān)于厚殼貽貝的提取物在免疫調(diào)節(jié)方面的應(yīng)用;申請(qǐng)?zhí)枮?01010296130.6的中國發(fā)明專利申請(qǐng)公開了一種《抗前列腺癌貽貝酶解提取物的制備方法及應(yīng)用》,其是利用貽貝肉堿性蛋白酶(Alcalase)酶解提取物對(duì)前列腺癌細(xì)胞具有良好的增殖抑制作用。以上專利對(duì)貽貝的精深加工和活性開發(fā)具有重要意義。但是以上專利所提到的活性物質(zhì)多為粗提取物或總酶解物,成分復(fù)雜,質(zhì)量控制難度較大,從而在應(yīng)用中受到多個(gè)方面的限制
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)狀提供一種能夠清除自由基和抑制脂質(zhì)過氧化作用的貽貝肉蛋白抗氧化肽,其可作為藥品、保健食品和食品的安全添加劑。本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種貽貝肉蛋白抗氧化肽的制備方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:該貽貝肉蛋白抗氧化肽,其特征在于該抗氧化肽為五肽化合物,氨基酸序列為YPPAK(Tyr-Pr0-Pr0-Ala-Lys),ES1-MS檢測(cè)給出分子離子峰m/z[M+H]+575.26。上述貽貝肉蛋白抗氧化肽的制備方法,其特征在于包括下述步驟:I)將洗凈、去殼的貽貝肉用高速組織搗碎機(jī)處理成勻漿,然后按照料液比lg:2 4mL加入異丙醇,于30 35°C中脫脂20 24h,然后于2 6 °C、400(T5000rpm離心l(Tl5min除去異丙醇,收集脫脂貽貝肉固形物;
2)所述脫脂貽貝肉固形物按固液比lg:2(T25mL加入濃度為0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液,調(diào)節(jié)PH為6.5 7.5,得到混合液;3)將所述混合液溫度升至55 65°C攪拌預(yù)熱l(Tl5min,以所述脫脂貽貝肉固形物的質(zhì)量為基準(zhǔn)加入2.(Γ4.0%的蛋白酶,在55 65°C酶解2 4h,得到酶解產(chǎn)物;4)將步驟3)所得的酶解產(chǎn)物升溫至95 100°C后恒溫保持ClOmin后,冷卻至2(T25°C,然后離心,得到酶解液;5)將上述酶解液加入0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液,使其濃度為2(T25mg/mL,按照大孔樹脂重量與酶解液體積lg:4(T50mL的比例將酶解液加入到大孔樹脂層析柱中,然后用純度為45 55%的乙醇進(jìn)行洗脫,最后在溫度40°C以下,真空度-0.1MPa以下旋蒸除去乙醇,濃縮液進(jìn)行冷凍干燥,得脫鹽酶解物干粉;6)將上述脫鹽酶解物干粉溶于pH為6.8 7.2的0.04 0.06mol/L的磷酸鹽緩沖液中配成濃度為8 12mg/mL的溶液,于0.Γθ.15MPa的工作壓力和2(T25°C的工作溫度下采用超濾膜進(jìn)行超濾處理,收集分子量小于IkDa部分,得到超濾酶解液,超濾酶解液凍干后,得超濾酶解液凍干粉;7)將上述超濾酶解液凍干粉用pH為6.8 7.2的0.04 0.06mol/L的磷酸鹽緩沖液配成濃度為8 12mg/mL的溶液,加入到陰離子交換樹脂柱,然后分別用水、0.1mol/L、0.5mol/L和1.0mol/L NaCl溶液進(jìn)行洗脫,每5mL洗脫液收集I試管,并根據(jù)每試管洗脫液在280nm下的吸光度繪制洗脫組分曲線圖,其中,DPPH自由基清除活性最高組分為離子交換酶解液,凍干,得干粉;將所述離子交換酶解液凍干粉末用0.05mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0)配成10mg/mL的溶液,加入到凝膠層析柱中,用磷酸鹽緩沖液(0.05mol/L, pH7.0)進(jìn)行洗脫,每5mL洗脫液收集I試管,并根據(jù)每試管洗脫液在280nm下的吸光度繪制洗脫組分曲線圖,其中,DPPH自由基清除活性最高組分為凝膠制備酶解物,凍干,得干粉;將上述凝膠 制備酶解物凍干粉末用0.05mol/L磷酸鹽緩沖液(ρΗ7.0)配成IOmg/HiL的溶液,用反相高效液相色譜進(jìn)行純化,按照280nm下的吸光度曲線和抗氧化活性收集活性最高的多肽,即得高活性抗氧化肽YPPAK(Tyr-Pr0-Pr0-Ala-Lys)。較好的,所述的貽貝肉為紫貽貝肉。較好的,步驟3)中所述的蛋白酶為中性蛋白酶,酶活力> 2.0X105U/g。優(yōu)選所用的大孔樹脂為D101,陰離子交換樹脂為DEAE-52纖維素,所用的凝膠為葡聚糖凝膠G-25 ;所述反相高效液相色譜條件為:進(jìn)樣量20 μ L ;色譜柱為Zorbax C18(250mmX4.6mm,5ym);柱溫為30°C ;流動(dòng)相:A水(含0.1%三氟乙酸)和B乙腈(含0.1%三氟乙酸);梯度洗脫:0 55min乙腈濃度從O至50%,每5min增加5% ;洗脫速度1.0mL/min ;紫外檢測(cè)波長為280nm。與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明所提供的貽貝肉蛋白抗氧化肽對(duì)DPPH自由基(EC502.62mg/mL)、羥基自由基(EC500.228mg/mL)和超氧陰離子自由基(EC500.072mg/mL)具有良好的清除作用;同時(shí),YPPAK亦顯示出良好的脂質(zhì)過氧化抑制作用;YPPAK(Tyr-Pro-Pro-Ala-Lys)對(duì)DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用;同時(shí),YPPAK(Tyr-Pro-Pro-Ala-Lys)亦顯示出良好的脂質(zhì)過氧化抑制作用;YPPAK(Tyr-Pro-Pro-Ala-Lys)可以作為藥品、保健食品和食品的添加劑,且具有安全無毒副作用、抗氧化活性強(qiáng)和易于消化吸收等優(yōu)點(diǎn)。該貽貝肉蛋白抗氧化肽制備工藝科學(xué)合理,選用中性蛋白酶(neutrase )作為酶解用酶經(jīng)濟(jì)實(shí)惠,通過生物酶解法同時(shí)融合大孔樹脂脫鹽、超濾分級(jí)和色譜精制,酶解過程易監(jiān)控,同時(shí)制得的抗氧化肽具有較高的活性。
圖1葡聚糖凝膠G-25制備酶解物的RP-HPLC分析。圖2YPPAK (Tyr-Pro-Pro-Ala-Lys)的質(zhì)譜圖。圖3YPPAK(Tyr-Pro-Pro-Ala-Lys)的 DPPH 自由基清除活性。圖4YPPAK (Tyr-Pro-Pro-Ala-Lys)的羥基自由基清除活性。圖5YPPAK(Tyr-Pro-Pro-Ala-Lys)的超氧陰離子自由基清除活性。圖6YPPAK(Tyr-Pro-Pro-Ala-Lys)的脂質(zhì)過氧化抑制活性。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。貽貝肉蛋白抗氧化肽的制備方法,制備工藝流程如下:貽貝肉一脫脂一酶解一酶解物一大孔樹脂脫鹽一超濾一離子交換層析一凝膠過濾層析一高效液相色譜制備一抗氧化肽。具體步驟為:I)將洗凈、去殼的紫貽貝肉用高速組織搗碎機(jī)將其處理成勻漿,然后按照料液比lg:3mL加入異丙醇于30 35°C脫脂 24h,于4°C、5000rpm離心15min除去異丙醇,收集固形物。2)脫脂貽貝肉固形物按固液比lg:25mL加入0.05mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0),
得混合液;3)將混合液溫度升至60°C攪拌預(yù)熱lOmin,按照脫脂貽貝肉固形物質(zhì)量的3%加入中性蛋白酶(neutrase),酶解溫度為60°C,酶解時(shí)間3h,得酶解產(chǎn)物;4)將步驟3)所得的酶解產(chǎn)物進(jìn)行滅酶處理:①滅酶:酶解產(chǎn)物升溫至9(T95°C,并于此溫度保持IOmin后,冷卻至2(T25°C,然后與5000rpm離心15min,得酶解液;②脫鹽:將酶解液中加入0.05mol/L磷酸鹽緩沖液,使其濃度為20mg/mL,按照大孔樹脂重量與酶解液體積lg:50mL的比例將酶解液加入到大孔樹脂層析柱中,然后用純度為50%的乙醇進(jìn)行洗脫,至洗脫液在280nm下吸光度小于0.05,最后在溫度40°C以下,真空度-0.1MPa以下旋蒸除去洗脫液中的乙醇,剩余溶液冷凍干燥,得脫鹽酶解物干粉;③超濾:將上述脫鹽酶解物干粉溶于0.05mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0)配成濃度為10mg/mL的溶液,于0.Γθ.15MPa的工作壓力和2(T25°C的工作溫度下采用超濾膜進(jìn)行超濾處理,收集分子量小于IkDa部分,得超濾酶解液,將其凍干,得超濾酶解液凍干粉;④陰離子交換層析:將上述超濾酶解液凍干粉用0.05mol/L磷酸鹽緩沖液(PH7.0)配成10mg/mL的溶液,經(jīng)過DEAE-52纖維素陰離子交換樹脂分離,分別用水、
0.1mol/L,0.5mol/L和1.0mol/L NaCl溶液進(jìn)行洗脫,每5mL洗脫液收集I試管,并根據(jù)每試管洗脫液在280nm下的吸光度繪制洗脫組分曲線圖,每一色譜峰為一組分,其中,DPPH自由基清除活性最高組分為離子交換酶解液,將其凍干,得離子交換酶解液凍干粉;
⑤凝膠色譜層析:將上述離子交換酶解液凍干粉用0.05mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0)配成濃度為10mg/mL的溶液,經(jīng)過葡聚糖凝膠G-25柱層析分離,用5倍柱體積磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫,每5mL洗脫液收集I試管,并根據(jù)每試管洗脫液在280nm下的吸光度繪制洗脫組分曲線圖,每一色譜峰為一組分,其中,DPPH自由基清除活性最高組分為凝膠制備酶解物,將其凍干,得凝膠制備酶解物凍干粉。⑥高效液相色譜精制:將上述凝膠制備酶解物凍干粉用0.05mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0)配成濃度為10mg/mL的溶液,用反相高效液相色譜(RP-HPLC)進(jìn)行純化;條件:進(jìn)樣量 20 μ L ;色譜柱為 Zorbax C18 (250mmX4.6mm, 5 μ m ;柱溫為 30°C ;流動(dòng)相:A 水(含 0.1%三氟乙酸)和B乙腈(含0.1%三氟乙酸);梯度洗脫:0-55min乙腈濃度從O至50%,每5min增加5% ;洗脫速度1.0mL/min ;紫外線檢測(cè)波長280nm,根據(jù)280nm下的吸光度曲線和抗氧化活性得I個(gè)高活性抗氧化肽。⑦結(jié)構(gòu)檢測(cè):收集活性最高的I個(gè)抗氧化肽,經(jīng)反相高效液相色譜(RP-HPLC)檢測(cè)為單一峰(圖1),利用蛋白/多肽序列分析儀測(cè)定氨基酸序列為YPPAK (Tyr-Pro-Pro-Ala-Lys),ES1-MS 檢測(cè)給出分子離子峰 m/z [M+H] +575.26 (圖 2)。將制得的貽貝肉蛋白抗氧化肽YPPAK(Tyr-Pro-Pro-Ala-Lys)進(jìn)行DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果見圖3 ;進(jìn)行羥基自由基清除實(shí)驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果見圖4 ;進(jìn)行超氧陰離子自由基清除實(shí)驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果見圖5 ;進(jìn)行脂質(zhì)過氧化抑制實(shí)驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果見圖6。由圖3至圖6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得知=YPPAK(Tyr-Pro-Pro-Ala-Lys)對(duì)DPPH自由基(EC502.62mg/mL)、羥基自由基(EC500.228mg/mL)和超氧陰離子自由基(EC500.072mg/mL)具有良好的清除作用;同時(shí),YPPAK亦`顯示出良好的脂質(zhì)過氧化抑制作用。
權(quán)利要求
1.一種貽貝肉蛋白抗氧化肽,其特征在于該抗氧化肽為五肽化合物,氨基酸序列為YPPAK (Tyr-Pro-Pro-Ala-Lys),ES1-MS 檢測(cè)給出分子離子峰 m/z [M+H]+575.26。
2.如權(quán)利要求1所述的貽貝肉蛋白抗氧化肽的制備方法,其特征在于包括下述步驟: 1)將洗凈、去殼的貽貝肉用高速組織搗碎機(jī)處理成勻漿,然后按照料液比lg:2 4mL加入異丙醇,于30 35°C中脫脂20 24h,然后于2 6°C、400(T5000rpm離心l(Tl5min除去異丙醇,收集脫脂貽貝肉固形物; 2)所述脫脂貽貝肉固形物按固液比lg:2(T25mL加入0.05mol/L磷酸鹽緩沖液,調(diào)節(jié)pH為6.5 7.5,得到混合 液; 3)將所述混合液溫度升至55飛5°C攪拌預(yù)熱l(Tl5min,以所述脫脂貽貝肉固形物的質(zhì)量為基準(zhǔn)加入2.(Γ4.0%的蛋白酶,在55 65°C酶解2 4h,得到酶解產(chǎn)物; 4)將步驟3)所得的酶解產(chǎn)物升溫至95 100°C后恒溫ClOmin后,冷卻至2(T25°C,然后離心,得到酶解液; 5)將上述酶解液加入0.05mol/L磷酸鹽緩沖液,使其濃度為2(T25mg/mL,按照大孔樹脂重量與酶解液體積lg: 4(T50mL的比例將酶解液加入到大孔樹脂層析柱中,然后用純度為45 55%的乙醇進(jìn)行洗脫,最后在溫度40°C以下,真空度-0.1MPa以下旋蒸除去乙醇,濃縮液進(jìn)行冷凍干燥,得脫鹽酶解物干粉; 6)將上述脫鹽酶解物干粉溶于pH為6.8 7.2的0.04 0.06mol/L的磷酸鹽緩沖液中配成濃度為8 12mg/mL的溶液,于0.Γθ.15MPa的工作壓力和2(T25°C的工作溫度下采用超濾膜進(jìn)行超濾處理,收集分子量小于IkDa部分,得到超濾酶解液,超濾酶解液凍干后,得到凍干粉末; 7)將上述凍干粉末用pH為6.8 7.2的0.04 0.06mol/L的磷酸鹽緩沖液配成濃度為8 12mg/mL的溶液,加入到陰離子交換樹脂柱,然后分別用水、0.1mol/L、0.5mol/L和1.0mol/L NaCl溶液進(jìn)行洗脫,每5mL洗脫液收集I試管,并根據(jù)每試管洗脫液在280nm下的吸光度繪制洗脫組分曲線圖,其中,DPPH自由基清除活性最高組分為離子交換酶解液,凍干,得干粉;將所述離子交換酶解液凍干粉末用0.05mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0)配成10mg/mL的溶液,加入到凝膠層析柱中,用磷酸鹽緩沖液(0.05mol/L, pH7.0)進(jìn)行洗脫,每5mL洗脫液收集I試管,并根據(jù)每試管洗脫液在280nm下的吸光度繪制洗脫組分曲線圖,其中,DPPH自由基清除活性最高組分為凝膠制備酶解物,凍干,得干粉; 將上述凝膠制備酶解物凍干粉末用0.05mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0)配成10mg/mL的溶液,用反相高效液相色譜進(jìn)行純化,按照280nm下的吸光度曲線和抗氧化活性收集活性最高的多肽,即得高活性抗氧化肽YPPAK(Tyr-Pr0-Pr0-Ala-Lys)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法,其特征在于步驟I)中所述的貽貝肉為紫貽貝肉。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法,其特征在于步驟3)中所述的蛋白酶為中性蛋白酶,酶活力≥2.0X105U/g。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的層析方法,其特征在于所用的大孔樹脂為D101,陰離子交換樹脂為DEAE-52纖維素,所用的凝膠為葡聚糖凝膠G-25 ;所述反相高效液相色譜條件為:進(jìn)樣量20 μ L ;色譜柱為Zorbax C18 (250_X4.6_,5 μ m);柱溫為30°C ;流動(dòng)相:Α水(含.0.1%三氟乙酸)和B乙腈(含0.1%三氟乙酸);梯度洗脫:(T55min乙腈濃度從O至50%,每5min增加5% ;洗脫速度1.0mL/min ;紫外檢測(cè)波長為280nm。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種貽貝肉蛋白抗氧化肽及其制備方法,其特征在于該抗氧化肽為五肽化合物,氨基酸序列為YPPAK(Tyr-Pro-Pro-Ala-Lys),ESI-MS檢測(cè)給出分子離子峰m/z[M+H]+575.26。制備方法包括步驟勻漿、脫脂、混合、酶解、脫鹽、超濾和層析等步驟。制備得到的高活性抗氧化肽YPPAK(Tyr-Pro-Pro-Ala-Lys)對(duì)DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用;同時(shí),YPPAK(Tyr-Pro-Pro-Ala-Lys)亦顯示出良好的脂質(zhì)過氧化抑制作用。YPPAK(Tyr-Pro-Pro-Ala-Lys)具有安全無毒副作用、抗氧化活性強(qiáng)和易于消化吸收等優(yōu)點(diǎn),可以作為藥品、保健食品或食品添加劑等。
文檔編號(hào)C07K7/06GK103204906SQ201310035469
公開日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2013年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月29日
發(fā)明者王斌, 馬佳卉, 栗麗, 羅紅宇 申請(qǐng)人:浙江海洋學(xué)院