專利名稱：含有微球面陣列的培養(yǎng)皿及其運(yùn)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物納米領(lǐng)域，特別涉及含有微球面陣列的培養(yǎng)皿及其運(yùn)用。
背景技術(shù)：
以細(xì)胞為基礎(chǔ)的生物檢測是近二十年來藥物篩選領(lǐng)域發(fā)展起來的藥用效應(yīng)或毒理效應(yīng)的重要功能篩選手段。在這一篩選體系中，細(xì)胞作為一種生物傳感器被整合到篩選平臺中，既可以作為高通量篩選(high throughput screening, HTS)也可以作為高容量篩選(high content screening, HCS)的檢測手段。較之于生物化學(xué)檢測手段，細(xì)胞篩選方法具有從功能的角度獲取待篩選分子藥用效應(yīng)或毒理效應(yīng)的優(yōu)勢，然而其篩選成本卻顯著地低于動物實(shí)驗(yàn)。在現(xiàn)有的細(xì)胞藥物篩選體系中，細(xì)胞培養(yǎng)通常采用普通平面培養(yǎng)皿。盡管已有的培養(yǎng)基及化學(xué)添加劑已經(jīng)能夠滿足人體內(nèi)絕大多數(shù)細(xì)胞的培養(yǎng)要求，然而采用平面培養(yǎng)皿的培養(yǎng)技術(shù)卻很明顯地忽略了體內(nèi)細(xì)胞生存的微觀環(huán)境物理特性。在體情況下，細(xì)胞生存于三維的細(xì)胞基質(zhì)中，而且這一支撐基質(zhì)具有復(fù)雜的表面拓?fù)湮⒔Y(jié)構(gòu)。體外培養(yǎng)基底與體內(nèi)生存條件的差異導(dǎo)致了培養(yǎng)細(xì)胞功能狀態(tài)較之于體內(nèi)不可避免的差異。對于藥物篩選而言，這可能是篩選通量低下、篩選結(jié)果與后期動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果不符的重要原因。另一方面，通過培養(yǎng)皿基底物理特性，如拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)特征，的設(shè)計(jì)改變篩選細(xì)胞的功能響應(yīng)性，將為提高細(xì)胞藥物篩選效能提供新的技術(shù)途徑。近年來，組織工程與細(xì)胞工程的發(fā)展為藥物篩選技術(shù)的革新提供了新的機(jī)遇。如， 三維培養(yǎng)技術(shù)的建立為在體外模擬體內(nèi)細(xì)胞生存環(huán)境提供了有效的工程化手段。這里最成功的例子可能是三維腫瘤微球被用于體外腫瘤細(xì)胞的多重抗藥性研究。另一方面，培養(yǎng)基底拓?fù)湮⒔Y(jié)構(gòu)與培養(yǎng)細(xì)胞生長行為的關(guān)系已經(jīng)有三十多年的研究歷史。早期的研究大量集中在成纖維細(xì)胞與骨細(xì)胞的研究，其研究結(jié)果已經(jīng)被用于組織工程植入體的構(gòu)建。細(xì)胞培養(yǎng)基底拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)由于影響細(xì)胞的形態(tài)及功能行為，因而是模擬體內(nèi)細(xì)胞微環(huán)境的重要途徑。對于神經(jīng)細(xì)胞、肌細(xì)胞及腺體細(xì)胞等依賴于離子通道功能活動的可興奮細(xì)胞而言，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)環(huán)境因?yàn)橛绊懠?xì)胞的粘附、鋪展及幾何形態(tài)將對離子通道的功能響應(yīng)性可能產(chǎn)生明顯的影響，這在離子通道靶向藥物的篩選中具有重要的應(yīng)用前景。電壓依從式鈣離子通道(voltage dependent calcium channel, VDCC)是細(xì)胞重要的離子通道。由于其參與細(xì)胞的眾多生理過程以及在神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)疾病中的重要作用，VDCC在制藥業(yè)已經(jīng)成為藥物篩選的重要靶效應(yīng)通道。以VDCC為靶效應(yīng)通道的細(xì)胞藥物篩選體系首先要求所采用目標(biāo)細(xì)胞具有VDCC的表達(dá)及相應(yīng)的VDCC功能響應(yīng)性。VDCC 功能響應(yīng)性的強(qiáng)弱或大小直接影響到藥物的篩選效能，如篩選通量以及有關(guān)藥物效應(yīng)和毒性的信息內(nèi)含量。對于以神經(jīng)細(xì)胞為基礎(chǔ)的VDCC靶通道藥物篩選，細(xì)胞的VDCC功能響應(yīng)性低下是制約篩選效能提高的重要因素。引起神經(jīng)細(xì)胞VDCC功能響應(yīng)性低下的因素可能包括(1)所使用神經(jīng)細(xì)胞VDCC表達(dá)水平低下；(2)所采用分化條件不利于神經(jīng)細(xì)胞VDCC 的充分表達(dá)并成熟；(3)細(xì)胞的其他離子通道功能或膜電位水平異常。盡管采用基因工程的方法可以達(dá)到增強(qiáng)VDCC功能響應(yīng)性從而構(gòu)建篩選細(xì)胞的目的，但基因操作過程對于篩選結(jié)果的影響卻值得進(jìn)一步評價(jià)。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供培養(yǎng)皿，該培養(yǎng)皿的基底含球面致密陣列結(jié)構(gòu)，該基底含球面致密陣列結(jié)構(gòu)能支持所培養(yǎng)細(xì)胞的粘附及鋪展，進(jìn)而增強(qiáng)篩選細(xì)胞 VDCC的功能響應(yīng)性。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為
含有微球面陣列的培養(yǎng)皿，包括培養(yǎng)皿本體1和培養(yǎng)皿蓋板2，所述培養(yǎng)皿本體1的基底3設(shè)有至少一個(gè)微球面陣列4，所述微球面陣列4中微球5的直徑為微米或納米級。進(jìn)一步，所述微球面陣列4為球面直徑0. 51-1. 98微米的微球5緊密排列而成，所述微球面陣列4中的兩相鄰微球5的間距小于0. 5微米；
進(jìn)一步，所述微球5為微全球5-A和/或微半球5-B ； 進(jìn)一步，所述微球面陣列4的面積至少大于單個(gè)靶細(xì)胞的面積； 進(jìn)一步，所述微球面陣列4的面積為0. 25cm2 ；
進(jìn)一步，所述培養(yǎng)皿還包括進(jìn)液管7和出液管8，皿蓋板2上設(shè)有連接孔6，所述進(jìn)液管 7和出液管8從連接孔6伸入培養(yǎng)皿內(nèi)；
進(jìn)一步，所述出液管8伸入培養(yǎng)皿內(nèi)的一端與基底3接觸； 進(jìn)一步，培養(yǎng)皿蓋板2上的連接孔設(shè)有密封墊圈9。本發(fā)明的目的之二在于提供一種運(yùn)用含有微球面陣列的培養(yǎng)皿增強(qiáng)細(xì)胞電壓依從式鈣離子通道功能響應(yīng)性的方法，該方法操作簡單，效果明顯。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為
運(yùn)用所述培養(yǎng)皿在增強(qiáng)細(xì)胞電壓依從式鈣離子通道功能響應(yīng)性的方法，具體包括以下步驟
A培養(yǎng)皿的預(yù)處理
用裱襯液對所述的培養(yǎng)皿的基底3進(jìn)行裱襯，得預(yù)處理后的培養(yǎng)皿； B細(xì)胞電壓依從式鈣離子通道功能響應(yīng)性的增強(qiáng)
將具有電壓依從式鈣離子通道表達(dá)的靶細(xì)胞在預(yù)處理后的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至少M(fèi)小時(shí)，并施以去極化刺激得電壓依從式鈣離子通道功能響應(yīng)性增強(qiáng)的靶細(xì)胞。進(jìn)一步，所述培養(yǎng)皿在增強(qiáng)細(xì)胞電壓依從式鈣離子通道功能響應(yīng)性的運(yùn)用，具體包括以下步驟
A培養(yǎng)皿的預(yù)處理
用裱襯液對所述的培養(yǎng)皿的基底3進(jìn)行裱襯，裱襯時(shí)間至少為2小時(shí)，得預(yù)處理后的培養(yǎng)皿；
B細(xì)胞培養(yǎng)
將具有電壓依從式鈣離子通道表達(dá)的神經(jīng)細(xì)胞接種于經(jīng)步驟A預(yù)處理后的培養(yǎng)皿； C細(xì)胞電壓依從式鈣離子通道熒光響應(yīng)性的增強(qiáng)
微球面陣列培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)鈣離子熒光染料染色后，以普通熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、孔板讀數(shù)器或其他鈣離子熒光記錄裝置采集細(xì)胞鈣離子熒光信號，在信號采集過程中施以高鉀去極化刺激，得增強(qiáng)的電壓依從式鈣離子通道熒光響應(yīng)性。
本發(fā)明的有益效果在于本培養(yǎng)皿采用傾斜條件下的分步蝕刻方法制備而成，其微球面直徑為微米或納米級，制備的微球面陣列可以達(dá)到0. 10到0. 25 cm2的大面積范圍，達(dá)到培養(yǎng)皿應(yīng)用的要求，其生產(chǎn)成本低，操作簡單；本培養(yǎng)皿能顯著增加神經(jīng)細(xì)胞VDCCs功能響應(yīng)性含有微球面陣列的培養(yǎng)皿在神經(jīng)干細(xì)胞分化第0天、7天、14天時(shí)，較普通培養(yǎng)皿能顯著提高靶細(xì)胞的VDCC熒光響應(yīng)性；運(yùn)用本培養(yǎng)皿增強(qiáng)細(xì)胞電壓依從式鈣離子通道功能響應(yīng)性的方法為藥物篩選提供了新方法和思路。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，其中
圖1為含有微球面陣列的培養(yǎng)皿本體的示意圖； 圖2為含有微球面陣列的培養(yǎng)皿蓋板的示意圖； 圖3為含有微全球球面陣列的培養(yǎng)皿基底示意圖； 圖4為含有微半球球面陣列的培養(yǎng)皿基底示意圖5為ENStem-A 人神經(jīng)干細(xì)胞在平面聚苯乙烯裱襯基底的培養(yǎng)皿和微全球球面陣列基底培養(yǎng)皿中的掃描電鏡照片。圖示在細(xì)胞接種后第2天(分化第0天)細(xì)胞于平面聚苯乙烯裱襯基底的培養(yǎng)皿(a)、1. 98 μ m微全球球面陣列基底培養(yǎng)皿(b)和0. 51 μ m微全球球面陣列基底培養(yǎng)皿(c)的生長狀況，標(biāo)尺示25 μ m。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例1含有微球面陣列的培養(yǎng)皿的制備一材料準(zhǔn)備
1.35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning，美國)；細(xì)胞培養(yǎng)六孔板(Nest Biotech Co. , Ltd，中
國)
2.直徑為25mm的圓形蓋玻片(上海精輪工業(yè)上玻璃有限公司，中國。或Fisher Scientific,美國)
3.聚苯乙烯微球(BangsLaboratories, Inc.,美國?；騛laddin，中國)，直徑分別為0.51微米和1.98士0.20微米。4. 2. 5%的聚苯乙烯溶液。取普通聚苯乙烯細(xì)胞培養(yǎng)皿一個(gè)，剪碎后稱取聚苯乙烯 2. 5克，加入IOOmL甲苯溶解。溶解后的聚苯乙烯溶液放入深色瓶中避光保存?zhèn)溆谩?. 10. 16%的聚苯乙烯溶液。取普通聚苯乙烯細(xì)胞培養(yǎng)皿一個(gè)，剪碎后稱取聚苯乙烯10. 16克，加入IOOmL甲苯溶解。溶解后的聚苯乙烯溶液放入深色瓶中避光保存?zhèn)溆谩?. 1.7%的聚苯乙烯微球工作懸液
10%的聚苯乙烯微球懸液(供貨濃度)40 μ L蒸餾水200 μ L
混勻后得濃度為1. 7%的微球工作懸液。7.傾斜平臺，自制。8.聚二甲基硅氧燒 ^x)ly(dimethylsiloxane)，PDMS] (Sylgard 184，Dow Corning,美國)
二、含有微球面陣列的培養(yǎng)皿的設(shè)計(jì)及制備 1.含有微球面陣列的培養(yǎng)皿設(shè)計(jì)
本發(fā)明的含有微球面陣列的培養(yǎng)皿本體1，詳見圖1 ；培養(yǎng)皿蓋板2詳見圖2。應(yīng)當(dāng)指出，本設(shè)計(jì)按照普通35mm培養(yǎng)皿進(jìn)行設(shè)計(jì)描述。如改變培養(yǎng)皿及孔板尺寸或具有多個(gè)重復(fù)單元結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)皿孔板(如6孔板、12孔板等)而具備本發(fā)明的權(quán)利保護(hù)特征的培養(yǎng)皿及孔板設(shè)計(jì)依然屬于本專利的權(quán)利保護(hù)范圍。1)含有微球面陣列的培養(yǎng)皿，包括培養(yǎng)皿本體1和培養(yǎng)皿蓋板2，所述培養(yǎng)皿本體 1的基底3設(shè)有至少一個(gè)微球面陣列4，所述微球面陣列4中微球的直徑為微米或納米級， 詳見圖1。2)所述微球面陣列4為球面直徑0. 51-1. 98微米的微球5緊密排列而成，所述微球面陣列4中的兩相鄰微球5的間距小于0. 5微米；
3)所述的含有微球面陣列的培養(yǎng)皿，所述微球面5為微全球5-A和/或微半球5-B ；其中，微全球是指微型的球體，微半球是指微型的半球體。4)所述的含有微球面陣列的培養(yǎng)皿，所述微球面陣列4的面積至少大于單個(gè)靶細(xì)胞的面積；
5)所述的含有微球面陣列的培養(yǎng)皿，所述微球面陣列4的面積為0.25cm2 ；
6)所述的含有微球面陣列的培養(yǎng)皿，所述培養(yǎng)皿還包括進(jìn)液管7和出液管8，所述進(jìn)液管7和出液管8從培養(yǎng)皿板蓋2上的連接孔6伸入培養(yǎng)皿內(nèi)。在不開啟培養(yǎng)皿蓋板的靜置的條件下，采用負(fù)壓作用下可以借助出液管8引流出培養(yǎng)皿本體1的全部液體。在非檢測的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)皿也可以不使用進(jìn)液管和出液管，直接通過揭開培養(yǎng)皿蓋板進(jìn)行換液；
7)所述的含有微球面陣列的培養(yǎng)皿，所述出液管8伸入培養(yǎng)皿內(nèi)的一端與基底3接
觸；
8)所述的含有微球面陣列的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)皿蓋板2上的連接孔設(shè)有密封墊圈9。密封墊圈9固定出液管8及進(jìn)液管7與軟質(zhì)硅膠管的連接。液體引流管及進(jìn)樣管使得在熒光檢測過程中可以在靜置條件下完成液體更換、清洗及加樣，避免了移動培養(yǎng)皿引起被檢測視野變化對熒光檢測的影響。含有微球面陣列的培養(yǎng)皿本體詳見圖1 ； 含有微球面陣列的培養(yǎng)皿蓋板詳見圖2 ； 含有微全球球面陣列的培養(yǎng)皿基底詳見圖3 ； 含有微半球球面陣列的培養(yǎng)皿基底詳見圖4 ； 上述微球面直徑可以為微米級或亞微米級。上述培養(yǎng)皿也可直接設(shè)計(jì)為基底3表面有微球面陣列4的構(gòu)造。2、含有微球面陣列的培養(yǎng)皿的制備步驟
應(yīng)當(dāng)指出，作為優(yōu)先實(shí)施示例，這里以35mm培養(yǎng)皿及六孔板為例描述具有微球面陣列基底的培養(yǎng)皿及孔板的制備過程。以其它尺寸或其他途經(jīng)實(shí)現(xiàn)的微全球球面或微半球球面致密陣列基底培養(yǎng)皿或孔板也在本專利權(quán)限保護(hù)之內(nèi)。現(xiàn)就本部分實(shí)施步驟描述如下。①取35mm培養(yǎng)皿一個(gè)，在培養(yǎng)小室底部中央開出一直徑IOmm的圓形小孔。除培養(yǎng)皿外，其他六孔板、十二或其他孔板均可以實(shí)現(xiàn)。121 25mm圓形蓋玻片，以2. 5%的聚苯乙烯溶液在約6000轉(zhuǎn)/分的條件下旋轉(zhuǎn)涂
層40秒，對蓋玻片進(jìn)行薄型聚苯乙烯裱襯，涂層厚度約0. 1微米。③取25mm圓形蓋玻片，以10. 16%的聚苯乙烯溶液在約2000轉(zhuǎn)/分的條件下旋轉(zhuǎn)
涂層30秒，對蓋玻片進(jìn)行厚型聚苯乙烯裱襯，涂層厚度約5微米。④取步驟②所獲得的經(jīng)薄型聚苯乙烯裱襯的蓋玻片，以分步等離子蝕刻在傾斜角度的條件下制備微球陣列。具體步驟為(a)薄型聚苯乙烯裱襯的蓋玻片以等離子氧蝕刻 60-80秒；(b)將30-50微升濃度為1. 7%的聚苯乙烯微球工作懸液分布于經(jīng)聚苯乙烯涂層的蓋玻片表面；(c)分布有聚苯乙烯微球工作懸液的蓋玻片放置于傾斜平臺，傾斜約10°， 靜置30分鐘顯微鏡下檢查微全球球面陣列形成情況；(d)重復(fù)步驟(b)和(c)，直至形成大片的微全球球面陣列為止；(e)為穩(wěn)定聚苯乙烯微球與涂層表面的粘結(jié)，將上述微全球球面陣列于104°C烘箱中焙干35分鐘。⑤將上述步驟④制備的含微全球球面陣列的蓋玻片嵌入并粘結(jié)于上述步驟①所制備的開孔培養(yǎng)皿或孔板底部，獲得含微全球球面致密陣列基底的培養(yǎng)皿或孔板。為獲得含微全球球面致密陣列基底培養(yǎng)皿或孔板，步驟④和⑤可以先后交換，即可以先粘結(jié)薄型聚苯乙烯裱襯的蓋玻片于開孔的培養(yǎng)皿或孔板底部，構(gòu)成平面聚苯乙烯裱襯基底的培養(yǎng)皿，再在底表面進(jìn)行微全球球面陣列的制備，得含微全球球面致密陣列基底的培養(yǎng)皿。⑥將PDMS預(yù)聚體與固化劑按10 1的比例混合均勻澆注于步驟④所制備的含微全球球面致密陣列的蓋玻片上，真空抽氣30 min,于60°C的加熱板條件下固化2小時(shí)，將固化的PDMS剝離即得到PDMS球面陣列負(fù)模。⑦取步驟③所制備的厚型聚苯乙烯裱襯的蓋玻片，置于103°C的加熱板上，以步驟⑥所制備的PDMS球面陣列負(fù)模在亞玻璃態(tài)溫度條件下進(jìn)行進(jìn)行加壓。20分鐘后，取出厚型聚苯乙烯裱襯的蓋玻片及PDMS球面陣列負(fù)模，室溫冷卻，剝離PDMS球面陣列負(fù)模即得含微半球球面陣列的基底。 將步驟⑦制備的含微半球球面陣列的基底嵌入并粘結(jié)于上述步驟Ip所制備的開孔培養(yǎng)皿或孔板底部，獲得含微半球球面陣列基底的培養(yǎng)皿或孔板。微全球球面陣列基底培養(yǎng)皿和微半球球面陣列基底培養(yǎng)皿均為增強(qiáng)細(xì)胞電壓依從式鈣離子通道功能響應(yīng)性的培養(yǎng)皿。從普通細(xì)胞尺寸(10-20微米)及本發(fā)明的球面直徑尺度(0. 51-1. 98微米)看，只要細(xì)胞培養(yǎng)過程中細(xì)胞不能深入到球面之間間隙的尺寸及球面直徑均可，且微全球球面陣列和微半球球面陣列應(yīng)為相同功能的細(xì)胞培養(yǎng)表面。⑩按圖2以及“含有微球面陣列的培養(yǎng)皿設(shè)計(jì)”部分所描述的結(jié)構(gòu)和尺寸制備培養(yǎng)皿蓋板。⑩步驟⑤和步驟⑥所制備的含微球面陣列的培養(yǎng)皿本體經(jīng)等離子氧蝕刻150秒
7以增加表面粗糙度后即可用于細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞藥物篩選的檢測。該等離子蝕刻步驟也可在步驟④和步驟⑦制備的球面陣列嵌入并粘結(jié)于開孔培養(yǎng)皿及孔板之前進(jìn)行。將制備好的培養(yǎng)皿進(jìn)行消毒殺菌處理后，可用于細(xì)胞培養(yǎng)及檢測。
實(shí)施例2含有微球面陣列的培養(yǎng)皿的增強(qiáng)細(xì)胞電壓依從式鈣離子通道功能響應(yīng)性的
方法
將以上含有微全球球面陣列的培養(yǎng)皿進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及電壓依從式鈣通道功能響應(yīng)性的評價(jià)，證實(shí)本方法的實(shí)施效果。應(yīng)當(dāng)指出，對于微半球球面陣列的培養(yǎng)皿而言，神經(jīng)細(xì)胞感知的拓?fù)湮h(huán)境與微全球球面陣列完全一樣，因?yàn)榧?xì)胞的尺度及生長行為決定了細(xì)胞不可能貼附于微球與微半球的底部從而感知這一部分幾何形態(tài)的差異。發(fā)明者完全有理由推測半球球面致密陣列與微全球球面致密陣列拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)有相同的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)。
一、材料準(zhǔn)備
1.ENStem-A 人神經(jīng)干細(xì)胞(Millipore公司，美國)
2.多聚鳥氨酸(poly-L-ornithinehydrobromide) (Sigma 產(chǎn)品，美國)
3.濃度為40μ g/mL的多聚鳥氨酸裱襯液
取多聚鳥氨酸供貨安培瓶(含多聚鳥氨酸凍干制劑50mg)，加入5mL滅菌蒸餾水，渦旋混勻制成濃度為lOmg/mL的儲備液。上述儲備液分裝為16 μ L/印pendorf管。取上述含 16 μ L多聚鳥氨酸儲備液的印pendorf管，加入4mL的滅菌蒸餾水，渦旋混勻制成濃度為 40 μ g/mL的多聚鳥氨酸裱襯液。4.鼠基底膜層粘連蛋白[來自EHS鼠肉瘤(Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma) ] (Sigma 產(chǎn)品，美國)
5.濃度為5 μ g/mL的鼠基底膜層粘連蛋白裱襯液
將濃度為lmg/mL (供貨濃度)的鼠基底膜層粘連蛋白儲備液分裝為10 μ L/印pendorf 管。取上述含IOy L鼠基底膜層粘連蛋白儲備液的印pendorf管，加入2mL的滅菌蒸餾水， 渦旋混勻制成濃度為5 μ g/mL的鼠基底膜層粘連蛋白裱襯液。6.濃度為200mM的L-谷氨酰胺(Sigma-Aldrich產(chǎn)品，美國)
7.B27添加劑(Invitrogen產(chǎn)品，美國)
8.濃度為10 μ g/mL的重組人白血病抑制因子(recombinant human leukemia inhibitory factor, LIF) (Chemicon 產(chǎn)品，美國)
9.Neurobasal基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Invitrogen產(chǎn)品，美國)
10.堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basicfibroblast growth factor, bFGF) (Sigma-Aldrich 產(chǎn)品，美國)
11.牛血清白蛋白(bovineserum albumine, BSA)(鹽城賽寶生物科技有限公司，中
國)
12.bFGF儲備液
稱取牛血清白蛋白lg，加入IOOmL Neurobasal基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以0. 2微米孔徑濾膜無菌過濾后制得含1%BSA的Neurobasal培養(yǎng)基。取bFGF供貨安培瓶(內(nèi)含25 μ g bFGF凍干制劑)，加入0. 5 mL含1%BSA的Neurobasal培養(yǎng)基，制得濃度為50 μ g/mL的bFGF儲備液。 13.神經(jīng)干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液
濃度為200mM的L-谷氨酰胺0. 5 mL
B27添加劑1. O mL
濃度為 10 μ g/mL 的 LIF50 μ L
濃度為50 μ g/mL的bFGF儲備液20 μ L
以Neurobasal基礎(chǔ)培養(yǎng)基定容至50 mL
上述擴(kuò)增培養(yǎng)液含添加劑的終濃度為L-谷氨酰胺2 mM ；bFGF 20 η g/mL ； LIF 10 ng/mL ；B-27 添加劑 2%。14.神經(jīng)干細(xì)胞分化培養(yǎng)液
濃度為200mM的L-谷氨酰胺0. 5 mL
B27添加劑1. 0 mL
濃度為 10 μ g/mL 的 LIF50 μ L
以Neurobasal基礎(chǔ)培養(yǎng)基定容至50 mL
上述擴(kuò)增培養(yǎng)液含添加劑的終濃度為L-谷氨酰胺2 mM;LIF 10 ng/mL ；B-27添加劑2%。15. 0.2M的二甲胂酸鹽緩沖液(ρΗ7·2) 甲液二甲胂酸鈉4. ^g，加蒸餾水至IOOml 乙液0. 2N鹽酸
取甲液50mL、乙液4. 2mL,以蒸餾水定容至200mL，即得pH為7. 2的0. 2M 二甲胂酸鹽緩沖液。16. 0. IM的二甲胂酸鹽緩沖液(pH7. 2)
取上述0. 2M的二甲胂酸鹽緩沖液50mL，以蒸餾水定容至IOOmL即可。17. 8% 的戊二酸儲備液(Electron Microscopy Sciences 產(chǎn)品，美國)
18.含2%戊二醛的0.IM 二甲胂酸鈉緩沖液(pH 7. 2) 采用如下配方
8%的戊二醛儲備液5 mL
蒸餾水5 mL
0. 2M的二甲胂酸鹽緩沖液 10 mL
19.4%的四氧化鋨儲備液
取四氧化鋨lg，以蒸餾水定容至25mL。20.含1%四氧化鋨的0. IM 二甲胂酸鈉緩沖液(pH 7. 2)
采用如下配方
4%的四氧化鋨儲備液5 mL
蒸餾水5 mL
0. 2M的二甲胂酸鹽緩沖液10 mL
21.梯度脫水用不同濃度的乙醇采用如下配方22.無酚紅Neurobasal基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Invitrogen產(chǎn)品，美國)
23.二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)(濟(jì)南奧泰化工有限公司，中國)
24.Pluronic F-127 (Molecular Probes 產(chǎn)品，美國)
25.胎牛血清(天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司，中國)
26.Calcium Green-I AM (Molecular Probes 產(chǎn)品，美國)
27.Calcium Green-I AM 儲備液
取 Calcium Green-I AM 供貨安培瓶(含 50 μ g Calcium Green-I AM)，加入 39 μ L DMSO渦旋溶解制得濃度為ImM的Calcium Green-I AM儲備液。28. Pluronic F-127 儲備液
稱取Pluronic F-127 0. 2g于1. 5 mL的印pendorf離心管中，加入ImL的DMS0，渦旋溶解制得濃度為20%的Pluronic F-127儲備液。29.高鉀 Neurobasal 儲備液
稱取0. 738g氯化鉀，溶解于20mL的無酚紅Neurobasal基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，制得K+濃度約為500mM的高鉀Neurobasal儲備液。30. Calcium Green-I AM 染色液
取1.5 mL的印pendorf離心管一支，依次加入Calcium Green-I AM儲備液5 μ L、 Pluronic F-127儲備液1 μ L、B27添加劑20 μ L和無酚紅Neurobasal基礎(chǔ)培養(yǎng)基974 μ L，渦旋混勻，制得 ImL Calcium Green-I AM 染色液。Calcium Green-I AM 染色液含 5 μ M Calcium Green-I AM,2% B-27 添加劑和 0· 02% Pluronic F-127。31. Calcium Green-I AM 去酯化孵育液
取1. 5 mL的印pendorf離心管一支，依次加入Pluronic F-127儲備液1 μ L、Β27添加劑20 μ L、胎牛血清30 μ L和無酚紅Neurobasal基礎(chǔ)培養(yǎng)基949 μ L，渦旋混勻，制得 ImL Calcium Green-I AM 去酯化孵育液。Calcium Green-I AM 去酯化孵育液含 2% B-27 添加劑、3%胎牛血清和0. 02% Pluronic F-127。二、神經(jīng)細(xì)胞在培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)
ENStem-A 人神經(jīng)干細(xì)胞購自美國Millipore公司。根據(jù)細(xì)胞供貨商的建議，用于細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)的普通細(xì)胞培養(yǎng)皿以及用于細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)的微全球球面陣列基底培養(yǎng)皿和平面聚苯乙烯裱襯基底的培養(yǎng)皿先后經(jīng)濃度為40 μ g/ml的多聚鳥氨酸裱襯液及濃度為5 μ g/ mL的鼠基底膜層粘連蛋白裱襯液分別裱襯至少2小時(shí)。神經(jīng)干細(xì)胞于35 mm普通培養(yǎng)皿中以神經(jīng)干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液進(jìn)行擴(kuò)增，細(xì)胞隔日換液。在細(xì)胞融合度達(dá)到90-100%時(shí)，以機(jī)械法制成細(xì)胞懸液。將約1.2X IO6細(xì)胞接種于新的培養(yǎng)皿。對于分化實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞被接種于經(jīng)多聚鳥氨酸和鼠基底膜層粘連蛋白分別裱襯的含微全球球面陣列基底培養(yǎng)皿和平面聚苯乙烯裱襯基底的培養(yǎng)皿。在細(xì)胞接種后2天(分化后第O天)，培養(yǎng)液被換成神經(jīng)干細(xì)胞分化培養(yǎng)液。在分化后第0、6、7、11和13進(jìn)行全換液，在分化后第2、4和9天進(jìn)行半換液。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，平面聚苯乙烯裱襯基底的培養(yǎng)皿和微全球球面陣列基底培養(yǎng)皿均可以采用普通培養(yǎng)皿蓋，而勿須采用含有進(jìn)液管和出液管及密封墊圈的特制培養(yǎng)皿蓋板2。 細(xì)胞形態(tài)及生長行為以Nikon ECLIPSE TE300倒置顯微鏡進(jìn)行觀察并以Nikon DlOO數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行顯微攝像。圖5顯示ENMem-A 人神經(jīng)干細(xì)胞于接種后第2天(分化第0天)在平面聚苯乙烯裱襯基底的培養(yǎng)皿(a)、1. 98 μ m微全球球面陣列基底培養(yǎng)皿(b)和0. 51 μ m微全球球面陣列基底培養(yǎng)皿(c)的生長狀況。圖中顯示本發(fā)明的球面陣列型培養(yǎng)皿的陣列區(qū)域與平面基底一樣，能夠支持細(xì)胞的粘附與鋪展。三、含微全球球面陣列的培養(yǎng)皿對神經(jīng)干細(xì)胞VDCCs功能響應(yīng)性的影響
VDCCs功能響應(yīng)性的評價(jià)采用在50 mM高鉀溶液刺激下細(xì)胞鈣離子內(nèi)流的動態(tài)反應(yīng)來評價(jià)。值得指出的是，作為一種優(yōu)先實(shí)施方案以及為更準(zhǔn)確地評價(jià)本發(fā)明含微全球球面陣列基底培養(yǎng)皿的實(shí)施效果，以下實(shí)施方案采用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行。鑒于普通熒光讀數(shù)儀器與激光共聚焦顯微鏡相同的檢測原理，有理由相信采用這類儀器可以取得相同的實(shí)施效果。在神經(jīng)干細(xì)胞分化的第0、7和14天，取出培養(yǎng)細(xì)胞的平面聚苯乙烯裱襯基底的培養(yǎng)皿和含有微全球球面陣列的培養(yǎng)皿，將普通培養(yǎng)皿蓋更換為含有進(jìn)液管和出液管及密封墊圈的特制培養(yǎng)皿蓋板2進(jìn)行以下操作及檢測。平面聚苯乙烯裱襯基底的培養(yǎng)皿與含有微全球球面陣列的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)無酚紅Neurobasal基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗2次，以 Calcium Green-I AM染色液于37°C二氧化碳孵箱中染色1小時(shí)。細(xì)胞以無酚紅Neurobasal 基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗后于ImL Calcium Green-I AM去酯化孵育液中在37°C二氧化碳孵箱再孵育45分鐘進(jìn)行染料去酯化。以488 nm氬激光掃描，以515 nm長通濾片采集激光共聚焦圖像。圖像采集速率為每3秒1幅。在圖像采集過程中從培養(yǎng)皿蓋板2的進(jìn)液管于細(xì)胞孵育液(S卩Calcium Green-I AM去酯化孵育液)中加入100 μ L高鉀Neurobasal儲備液使孵育液K+終濃度為50 mM。VDCCs功能響應(yīng)性表現(xiàn)為在高鉀去極化作用下細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高以及由此導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)Calcium Green-1熒光強(qiáng)度增加。以Calcium Green-1熒光強(qiáng)度對時(shí)間作圖，求得高鉀刺激后Calcium Green-I熒光強(qiáng)度相對于刺激前熒光強(qiáng)度的相對增加幅度為VDCCs的相對響應(yīng)幅度。表一為ENStem-A 人神經(jīng)干細(xì)胞在平面聚苯乙烯裱襯基底的培養(yǎng)皿和含有1. 98 μ m微全球球面陣列的培養(yǎng)皿基底上的VDCCs功能響應(yīng)性。表中VDCCs反應(yīng)性以50mM高鉀溶液刺激下的熒光強(qiáng)度相對增加值為指標(biāo)。細(xì)胞具有反應(yīng)性的判斷依據(jù)是在高鉀溶液刺激下細(xì)胞熒光強(qiáng)度增加15%或以上。按此標(biāo)準(zhǔn)，無論分化前或分化后第7天及第14天，在平面聚苯乙烯裱襯基底的培養(yǎng)皿或1. 98 μ m微全球球面陣列培養(yǎng)皿基底上的細(xì)胞反應(yīng)比率均接近100%。表中所示為細(xì)胞熒光強(qiáng)度相對增加值的平均值。從表中可見，在分化前平面聚苯乙烯裱襯基底的培養(yǎng)皿基底上細(xì)胞熒光強(qiáng)度相對增加值(0.81 士0.53)與含1.98 ym 微全球球面陣列的培養(yǎng)皿基底上的相應(yīng)值(0. 83士0. 79)無顯著性差異(P>0. 2)。在分化的第7天，平面聚苯乙烯裱襯基底的培養(yǎng)皿基底上細(xì)胞的VDCCs功能響應(yīng)性(0. 95士0. 46)較之分化前無明顯增高(P>0. 20)，但含1. 98 μ m微全球球面陣列的培養(yǎng)皿基底上細(xì)胞VDCCs 功能響應(yīng)性(1.20 士 0.48)較之分化前明顯增高(P<0. 01)。在分化第14天，平面聚苯乙烯裱襯基底的培養(yǎng)皿基底上細(xì)胞的VDCCs功能響應(yīng)性(2. 68士 1. 21)增加至分化前的兩倍以上(P<0. 01)，而含1. 98 μ m微全球球面陣列的培養(yǎng)皿基底上細(xì)胞VDCCs功能響應(yīng)性
11(5. 12 士 2. 42)增加至分化前的5倍以上(P<0. 01)。在分化的第7天和第14天，含1. 98 ym 微全球球面陣列的培養(yǎng)皿基底上細(xì)胞VDCCs功能響應(yīng)性較之平面聚苯乙烯裱襯基底的培養(yǎng)皿基底上的相應(yīng)值明顯增高(P<0. 01)。
表一 ENStem-A 人神經(jīng)干細(xì)胞在含1. 98 μ m微全球球面陣列基底和平面聚苯乙烯裱襯基底的培養(yǎng)皿基底上的VDCCs功能響應(yīng)性(50mM高鉀刺激下Calcium Green-I熒光強(qiáng)度增加值)的比較
權(quán)利要求
1.含有微球面陣列的培養(yǎng)皿，包括培養(yǎng)皿本體(1)和培養(yǎng)皿蓋板(2)，其特征在于所述培養(yǎng)皿本體(1)的基底(3 )設(shè)有至少一個(gè)微球面陣列(4 )，所述微球面陣列(4 )中微球(5 ) 的直徑為微米或納米級。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有微球面陣列的培養(yǎng)皿，其特征在于所述微球面陣列(4) 由直徑為0. 51-1. 98微米的微球(5)緊密排列而成，所述微球面陣列(4)中的兩相鄰微球 (5)的間距小于0.5微米。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有微球面陣列的培養(yǎng)皿，其特征在于所述微球(5)為微全球(5-A )和/或微半球(5-B )。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有微球面陣列的培養(yǎng)皿，其特征在于所述微球面陣列(4) 的面積至少大于單個(gè)靶細(xì)胞的面積。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的含有微球面陣列的培養(yǎng)皿，其特征在于所述微球面陣列(4) 的面積為0. 25cm2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含有微球面陣列的培養(yǎng)皿，其特征在于所述培養(yǎng)皿還包括進(jìn)液管(7)和出液管(8)，培養(yǎng)皿板蓋(2)上的設(shè)有連接孔(6)，所述進(jìn)液管(7)和出液管 (8 )從連接孔(6 )伸入培養(yǎng)皿內(nèi)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的含有微球面陣列的培養(yǎng)皿，其特征在于所述出液管(8)伸入培養(yǎng)皿內(nèi)的一端與基底C3)接觸。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的含有微球面陣列的培養(yǎng)皿，其特征在于培養(yǎng)皿蓋板(2)上的連接孔設(shè)有密封墊圈(9)。
9.運(yùn)用權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述培養(yǎng)皿在增強(qiáng)細(xì)胞電壓依從式鈣離子通道功能響應(yīng)性的方法，其特征在于，具體包括以下步驟A培養(yǎng)皿的預(yù)處理用裱襯液對所述的培養(yǎng)皿的基底C3)進(jìn)行裱襯，得預(yù)處理后的培養(yǎng)皿；B細(xì)胞電壓依從式鈣離子通道功能響應(yīng)性的增強(qiáng)將具有電壓依從式鈣離子通道表達(dá)的靶細(xì)胞在預(yù)處理后的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至少M(fèi)小時(shí)，并施以去極化刺激得電壓依從式鈣離子通道功能響應(yīng)性增強(qiáng)的靶細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述運(yùn)用所述培養(yǎng)皿在增強(qiáng)細(xì)胞電壓依從式鈣離子通道功能響應(yīng)性的方法，其特征在于，具體包括以下步驟A培養(yǎng)皿的預(yù)處理用裱襯液對所述的培養(yǎng)皿的基底(3)進(jìn)行裱襯，裱襯時(shí)間至少為2小時(shí)，得預(yù)處理后的培養(yǎng)皿；B細(xì)胞培養(yǎng)將具有電壓依從式鈣離子通道表達(dá)的神經(jīng)細(xì)胞接種于經(jīng)步驟A預(yù)處理后的培養(yǎng)皿；C細(xì)胞電壓依從式鈣離子通道熒光響應(yīng)性的增強(qiáng)微球面陣列培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)鈣離子熒光染料染色后，以普通熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、孔板讀數(shù)器或其他鈣離子熒光記錄裝置采集細(xì)胞鈣離子熒光信號，在信號采集過程中施以高鉀去極化刺激，得增強(qiáng)的電壓依從式鈣離子通道熒光響應(yīng)性。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物納米領(lǐng)域，特別涉及含有微球面陣列的培養(yǎng)皿，包括培養(yǎng)皿本體1和培養(yǎng)皿蓋板2，所述培養(yǎng)皿本體1的基底3表面設(shè)有至少一個(gè)微球面陣列4，所述微球面陣列4中微球5的直徑為微米或納米級；本申請還包括增強(qiáng)細(xì)胞電壓依從式鈣離子通道功能響應(yīng)性的方法，具體包括培養(yǎng)皿的預(yù)處理和細(xì)胞電壓依從式鈣離子通道功能響應(yīng)性的增強(qiáng)兩步驟，本培養(yǎng)皿采用傾斜條件下的分步蝕刻方法制備而成，其微球面陣列為微米或納米級，制備的微球面陣列面積達(dá)到培養(yǎng)皿應(yīng)用的要求，其生產(chǎn)成本低，操作簡單；運(yùn)用本培養(yǎng)皿增強(qiáng)細(xì)胞電壓依從式鈣離子通道功能響應(yīng)性的方法為藥物篩選提供了新方法和思路。
文檔編號C12N5/00GK102174381SQ20111003761
公開日2011年9月7日 申請日期2011年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月14日
發(fā)明者吳澤志, 宋兆全, 廖彥劍, 朱滿根, 林雨, 梁福榮, 金良, 黃豈蘋 申請人:重慶大學(xué)