專利名稱：一株聯(lián)產(chǎn)li–f類抗生素和鄰苯二甲酸二丁酯的多粘類芽孢桿菌菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵和生物分離領(lǐng)域，涉及一種聯(lián)產(chǎn)LI-F類抗生素(即LI-F 抗菌脂肽，目前無(wú)中文名稱，總共包括12種組分，其中分子量883、897、947、961四種也可以叫Furscidins即殺鐮孢菌素)和鄰苯二甲酸二丁酯的多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)菌株。利用多粘類芽孢桿菌生產(chǎn)的LI-F類抗生素適用于生物防治、食品加工和農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮等。
背景技術(shù)：
食品發(fā)酵工業(yè)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及醫(yī)藥工業(yè)長(zhǎng)期面臨以下一些問(wèn)題食品的微生物污染，植物病蟲害，日益嚴(yán)重的致病菌抗藥性。傳統(tǒng)的解決方法(化學(xué)防腐劑、化學(xué)農(nóng)藥、抗生素)雖然可以暫時(shí)緩解矛盾，然而隨著檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步以及環(huán)保意識(shí)的提高，人們開始注意到上述化學(xué)藥劑的潛在危害。開發(fā)高效、安全無(wú)毒、性能穩(wěn)定、廣譜的天然防腐劑已經(jīng)成為當(dāng)前食品、醫(yī)藥、植物抗病基因工程領(lǐng)域的研究和應(yīng)用熱點(diǎn)，將具有更廣闊的發(fā)展空間?；诳萍嫉倪M(jìn)步，檢測(cè)手段的完善以及人類對(duì)生態(tài)環(huán)境意識(shí)的提高，低毒、高效、 選擇性強(qiáng)、殘留時(shí)間短、對(duì)環(huán)境污染小的微生物天然防腐劑和生防試劑的研究和開發(fā)日益引起國(guó)內(nèi)外專家學(xué)者的關(guān)注。微生物是地球上分布最為廣泛的一大類生物，它無(wú)處不在，是一個(gè)豐富的資源寶庫(kù)。細(xì)菌又作為自然界中分布最廣泛的一類微生物，以其繁殖速度快、適應(yīng)能力強(qiáng)、易于人工培養(yǎng)等優(yōu)勢(shì)，倍受微生物工作者越來(lái)越多的關(guān)注。從微生物中提取抗菌物質(zhì)成本低、周期短、操作簡(jiǎn)單方便、容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，而且微生物分泌的抗菌物質(zhì)抑菌譜較寬，熱穩(wěn)定性較好，適用PH范圍廣，使用過(guò)程不易產(chǎn)生抗性菌和交叉拈抗性，因此可以發(fā)揮更大的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。多粘類芽孢桿菌(Paenikicillus polymyxa)是一種產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌， 原名多粘芽孢桿菌(Bacillus polymyxa)，以形態(tài)學(xué)為分類基礎(chǔ)，早期研究將其歸入芽孢桿菌屬。多粘類芽孢桿菌細(xì)胞呈桿狀，革蘭氏染色陽(yáng)性、陰性或可變，接觸酶陽(yáng)性，氧化酶反應(yīng)可變，厭氧條件下所測(cè)定的大多數(shù)菌株固定氮。多粘類芽孢桿菌是少數(shù)能夠產(chǎn)生具有臨床應(yīng)用價(jià)值的抗生素的細(xì)菌之一，由它產(chǎn)生的多粘菌素B (polymyxins B, PMB)和多粘菌素 E(colistin)已在臨床上用于抗細(xì)菌感染。其中的某些菌株也是重要的植物生防細(xì)菌和植物根際促生菌(plant growth promoting rhizobacteria, PGPR)，并且在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域已得到廣泛的應(yīng)用。此外，多粘類芽孢桿菌及其代謝產(chǎn)物在工礦業(yè)及廢水處理方面也有應(yīng)用。由于其誘人的應(yīng)用前景，美國(guó)環(huán)保署(EPA)將它列為可商業(yè)上應(yīng)用的微生物之一，我國(guó)農(nóng)業(yè)部也將其列為免做安全鑒定的一級(jí)菌種。研究表明，多粘類芽孢桿菌能產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，其中包括肽類、蛋白質(zhì)類、核苷類、吡嗪類和酚類等，能夠防治多種植物病害。多粘類芽孢桿菌的不同菌株之間可能產(chǎn)生同種的抗菌物質(zhì)，而同一菌株也可能同時(shí)產(chǎn)生多種不同抗菌物質(zhì)。多粘類芽孢桿菌在生物防治、食品加工和農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮等方面非常具有應(yīng)用潛力，但是要實(shí)現(xiàn)商業(yè)化，還必須加強(qiáng)
4高產(chǎn)菌株的選育、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化、制劑研制等方面的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是針對(duì)上述技術(shù)問(wèn)題提供一種聯(lián)產(chǎn)LI-F類抗生素和鄰苯二甲酸二丁酯的I^aenibacillus poIymyxa菌株以及該菌株的用途。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供利用上述菌株進(jìn)行LI-F類抗菌脂肽和鄰苯二甲酸二丁酯的微生物發(fā)酵和分離鑒定方法。本發(fā)明的目的通過(guò)下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一株聯(lián)產(chǎn)LI-F類抗生素和鄰苯二甲酸二丁酯的多粘類芽孢桿菌菌株，該菌株為多粘類芽孢桿菌(Paenikicillus polymyxa) JSa_9，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC No. 4314。所述的多粘類芽孢桿菌菌株在制備抗生素方面的應(yīng)用，特別是該菌株在聯(lián)產(chǎn)LI-F 類抗生素和鄰苯二甲酸二丁酯方面的應(yīng)用。利用CGMCC No. 4314菌株進(jìn)行LI-F類抗生素和鄰苯二甲酸二丁酯的微生物發(fā)酵和分離鑒定方法，包括下列步驟a.將保藏號(hào)為CGMCC No. 4314的多粘類芽孢桿菌JSa_9進(jìn)行培養(yǎng)，得到抗菌物質(zhì)發(fā)酵液；b.抗菌物質(zhì)發(fā)酵液離心，收集上清液，萃取，將有機(jī)相進(jìn)行納濾，得抗菌提取物；c.抗菌提取物通過(guò)HPLC分離純化LI-F類抗生素及鄰苯二甲酸二丁酯；d.對(duì)分離純化的物質(zhì)進(jìn)行鑒定。進(jìn)一步，所述的方法包括下列步驟a.多粘類芽孢桿菌JSa-9產(chǎn)LI-F類抗生素和鄰苯二甲酸二丁酯的發(fā)酵將多粘類芽孢桿菌JSa-9接種于試管斜面營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)MhJf 菌種活化；再將試管斜面活化的多粘類芽孢桿菌JSa-9菌種接種于LB液體培養(yǎng)基，30°C、 ISOrpm培養(yǎng)20 Mh，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，制成濃度為IO7 108cfu/l的種子液；將多粘類芽孢桿菌JSa-9種子液以10%濃度接種于Landy發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C和150rpm條件下培養(yǎng) 72h，得到抗菌物質(zhì)發(fā)酵液；b.多粘類芽孢桿菌JSa-9產(chǎn)LI-F類抗生素和鄰苯二甲酸二丁酯的分離①發(fā)酵液在12. OOOg下離心20min除去菌體，然后用與上清液相同體積的乙酸乙酯以萃取法抽提兩次后，將有機(jī)相經(jīng)過(guò)l-2nm的納濾膜，即為獲得的抗菌提取物；②多粘類芽孢桿菌JSa-9產(chǎn)抗菌物質(zhì)高效液相色譜分析(HPLC):將多粘類芽孢桿菌JSa-9抗菌提取物采用RP-C18柱(4. 6mmΦ X 250mm)進(jìn)行HPLC分離純化LI-F類抗生素和鄰苯二甲酸二丁酯；洗脫液為含3. Smmol三氟乙酸的水和乙腈溶液(三氟乙酸和乙腈為MERK公司產(chǎn)品)，梯度洗脫條件為0 20min，乙腈10 40% ；20 30min，乙腈40 60%；30 40min，乙腈60 70%；流速為0. 5ml/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm ；鄰苯二甲酸二丁酯標(biāo)準(zhǔn)樣品(美國(guó)SIGMA公司)也在相同條件下進(jìn)行HPLC層析；LI-F類抗生素和鄰苯二甲酸二丁酯的HPLC洗脫保留時(shí)間分別約為25 30和52min ；c.多粘類芽孢桿菌JSa-9產(chǎn)抗菌物質(zhì)的鑒定多粘類芽孢桿菌JSa-9抗菌提取物經(jīng)HPLC分離后，各抗菌組分再利用電
5噴霧電離、誘導(dǎo)石並撞角軍離質(zhì)譜(Electrospray ionization mass spectrometry/ collision-induceddissociation, ESI-MS/CID)測(cè)定其分子量和鑒定其結(jié)構(gòu)。所述的方法，其中步驟b中高效液相色譜儀為美國(guó)AGILENT llOOseries，配備DVD 檢測(cè)器。所述的方法，其中步驟c中在質(zhì)譜分析前對(duì)環(huán)脂肽樣品采用弱堿性NaOH在 40°C條件下處理24h水解成直鏈；ESI-MS/CID采用配備了電噴霧離子源的LCQDECA XPPLUS Thermo Finnigan 液質(zhì)聯(lián)用(LS-MS)設(shè)備(Thermo Corporation，USA)，采用 MS 柱(2. 6πιπιΦΧ250πιπι，2μπι)進(jìn)行分析，HPLC條件中流動(dòng)相成分和比例與多粘類芽孢桿菌 JSa-9產(chǎn)抗菌物質(zhì)的分離步驟相同，流速為2μ Ι/min ；電噴霧源操作電壓為5kV，操作溫度為300°C，操作壓力為20abr。本發(fā)明利用多粘類芽孢桿菌生產(chǎn)抗菌物質(zhì)，其特征為該抗菌物質(zhì)包括LI-F類抗生素和鄰苯二甲酸二丁酯，來(lái)自多粘類芽孢桿菌 (paenibacillus polymyxa) JSa_9，經(jīng)過(guò)ESI-MS鑒定兩者的分子量，前者分別為883，897， 911，947和961Da;后者為278Da。LI-F類抗生素是一系列環(huán)形抗菌脂肽類化合物的總稱， 共有12種組分。本發(fā)明鑒定出的五種LI-F類抗生素分別為L(zhǎng)I-F04a、LI_F04b、LI_F03a、 LI-F03b 和 LI-F05b。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明首次提供了一種聯(lián)產(chǎn)LI-F類抗生素和鄰苯二甲酸二丁酯的 Paenibacilluspolymyxa菌株。多粘類芽孢桿菌產(chǎn)LI-F類抗生素對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、 真菌和酵母菌具有很高的抑菌活性。鄰苯二甲酸二丁酯是首次在I^aenibacillus polymyxa 中發(fā)現(xiàn)，是聚氯乙烯最常用的增塑劑，具有殺菌活性。本發(fā)明采用的I^enibacillus polymyxa是被美國(guó)環(huán)保署列為可商業(yè)上應(yīng)用的微生物菌種之一，我國(guó)農(nóng)業(yè)部也將其列為免做安全鑒定的一級(jí)菌種，并在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域已得到廣泛的應(yīng)用。I^aenibacillus polymyxa抗菌脂肽LI-F類抗生素屬于微生物天然抗菌肽，對(duì)人類健康和食品安全性高，不會(huì)導(dǎo)致對(duì)環(huán)境的污染，可用于生物防治、食品加工和農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮等。


圖IPaenikiciIlus polymyxa J&1-9產(chǎn)LI-F類抗菌肽以及鄰苯二甲酸二丁酯標(biāo)樣的ESI-MS圖。圖 2Paenibacillus polymyxa JSa-9 產(chǎn) LI-F 類抗菌肽 m/z 883. 82 作為前導(dǎo)子的 CID圖譜及其分子結(jié)構(gòu)與離子碎片分析圖。圖 3Paenibacillus polymyxa JSa-9 產(chǎn) LI-F 類抗菌肽結(jié)構(gòu)通式。圖 4Paenibacillus polymyxa JSa_9 產(chǎn) m/z 278. 89 物質(zhì)與鄰苯二甲酸二丁酯標(biāo)樣的CID圖譜。圖5菌株JSa-9的革蘭氏染色。圖6J&-9菌株16S rRNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖。生物材料保藏信息本發(fā)明提供的該菌株為多粘類芽孢桿菌(Paenikicillus polymyxa) JSa_9，已保
6藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(縮寫CGMCCJia 北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏號(hào)為CGMCC No. 4314，保藏日期為2010 年11月08日。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。實(shí)施例1 廣譜抗菌活性I^aenibacillus polymyxa JSa-9的篩選與鑒定1.材料與方法1. 1分離樣品來(lái)源分離樣品為土壤，采樣地點(diǎn)包括江蘇省南京市紫金山下田園、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品院后菜地和北苑食堂外田地，以及江西省臨川市、德興市和黑龍江省齊齊哈爾市郊區(qū)菜地等六處。1. 2 試齊[JTE 緩沖液；溶菌酶(10mg/ml) ；SDS (10 % ) ；RNase 溶液(lmg/ml)(購(gòu)自天津 H&YBio. Co. Ltd) ；NaAc (3M),蛋白 g| K(20mg/ml), 10XPCR buffer, dNTP, fDl primer, rPlprimer (由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)公司提供)；Taq酶，DNA Mark (購(gòu)自北京清華天為生物技術(shù)公司)。1. 3供試菌株試驗(yàn)中采用的抗菌活性檢測(cè)指示菌蠟樣芽孢桿菌(Baci 1 Ius cereus ASl. 1846)、藤黃微球菌(Micrococcus luteus CMCC 28001)、大腸桿菌(Escherichia coli ASl. 487)、熒光假單胞菌(Pseudomouas fluorescens ASl. 1802)、黑曲霉(Aspergillus niger AS 3. 350)、點(diǎn)青霉(Penicllium notatum AS 3. 4356)，來(lái)源于中國(guó)普通微生物菌種保藏中心。1. 4培養(yǎng)基1. 4. 1菌株分離培養(yǎng)用培養(yǎng)基LB 培養(yǎng)基胰蛋白胨 10. 0g，酵母膏 5. 0g、NaCl 10. 0g、蒸餾水 1000ml ;pH7. 0、 121°C、20min滅菌備用，固體培養(yǎng)基另加15 20g的瓊脂。1.4. 2指示菌用培養(yǎng)基(1)營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(細(xì)菌用)(沈萍等，1999)牛肉膏3. 0g，蛋白胨 10. 0g，NaCl 5. 0g，蒸餾水 1000ml，瓊脂 20g，pH 7. 0 7. 2。(2) PDA培養(yǎng)基(真菌用)(沈萍等，1999)馬鈴薯200g(切片水煮30min，過(guò)濾取汁)，葡萄糖20. Og,蒸餾水1000ml，瓊脂 20g，pH 自然。1.4.3菌株鑒定用培養(yǎng)基在菌株鑒定中所用到的營(yíng)養(yǎng)瓊脂半固體培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基、糖發(fā)酵培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基、檸檬酸鹽培養(yǎng)基、醋酸鉛培養(yǎng)基等的配制均參照東秀珠等的《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》配制。1. 5主要儀器磁力加熱攪拌器，超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司)，PH計(jì)(美國(guó)Orion公司)，高壓蒸氣滅菌鍋(北京發(fā)恩科貿(mào)有限公司)，恒溫干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，高速冷凍離心機(jī)(centrifuge 5804R, Eppendorf 公司)，電子天平(BS-200S，Sartorius公司)，HYG-A全溫?fù)u瓶柜(太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)；PCR 儀(PTC-100 ，MJ Research 公司)。1. 6抗菌活性菌株的分離篩選1.6. 1 土壤樣品的采集選擇無(wú)人為干擾、有機(jī)質(zhì)含量豐富、水分適宜的土壤區(qū)域采樣，采樣時(shí)按照多點(diǎn)取樣(不同地點(diǎn)、不同土層深度)方法，去除表層土樣，利用簡(jiǎn)易打孔器向下打取5 IOcm土層，并將上下土樣充分混勻，然后取幾十克裝入無(wú)菌牛皮袋中，并在袋上注明采集地點(diǎn)、日期、土樣號(hào)和植被狀況，迅速送回實(shí)驗(yàn)室立即進(jìn)行分離或4°C保存?zhèn)溆谩?. 6. 2 土壤芽孢桿菌的分離將采來(lái)的土樣陰干、研磨后，稱取10g，放入250ml盛有90ml生理鹽水及玻璃珠的三角瓶中，在搖床上劇烈振蕩IOmin后于80°C水浴中加熱20min，殺滅不產(chǎn)芽孢的細(xì)菌和其他菌類氣采用土壤稀釋分離法依次制得ιο-2、ιο-3、ιο-4、ιο-5、 (Γ6、ιο-7 土壤稀釋液，再分別取各梯度稀釋液0. Iml涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板上。倒置于30°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。挑取單菌落，鏡檢，將已純化的菌株保存于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面4°C冰箱內(nèi)備用。1. 6. 3指示菌的準(zhǔn)備與培養(yǎng)條件指示細(xì)菌培養(yǎng)于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，采用37°C培養(yǎng)Mh;真菌培養(yǎng)于PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3 7天。各指示菌在接種前，用無(wú)菌生理鹽水調(diào)整菌體濃度至OD6tltlnm = 0. 5。 抗菌活性菌株的初篩選擇蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌和黑曲霉三種指示菌，而復(fù)篩中指示菌包括蠟樣芽孢桿菌、藤黃微球菌、大腸桿菌、黑曲霉以及點(diǎn)青霉五種。1.6.4抗菌活性菌株的初篩將分離得到的芽孢桿菌分別劃線于LB固體培養(yǎng)基平板上，30°C培養(yǎng)3 后，以無(wú)菌打孔器于生長(zhǎng)菌落旁取出5mm直徑的瓊脂塊，貼放于含有蠟樣芽孢桿菌、藤黃微球菌、大腸桿菌和黑曲霉的指示平板表面，于特定溫度下培養(yǎng)后測(cè)定抑菌圈大小。1.6.5抗菌活性菌株的復(fù)篩將經(jīng)初篩有抗菌活性的菌株于80ml LB液體培養(yǎng)基中，30°C、180r/min搖床培養(yǎng) 36h。發(fā)酵培養(yǎng)液于IOOOOg離心20min，上清液經(jīng)0. 45 μ m孔徑的細(xì)菌濾器過(guò)濾，采用瓊脂孔擴(kuò)散法(100ml牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中混入30ml指示菌菌液，傾倒平板待其冷卻后， 用6. 8mm直徑的無(wú)菌打孔器打取平板上的瓊脂塊，取濾液50 μ 1注入瓊脂孔中，指示細(xì)菌和真菌于相應(yīng)的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)后，通過(guò)游標(biāo)卡尺測(cè)其抑菌圈的直徑，以抑菌圈的直徑表示發(fā)酵液的抗菌活性)測(cè)定發(fā)酵液的抗菌活性。1.7目標(biāo)菌株的鑒定方法1.7. 1形態(tài)特征觀察取在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上30°C培養(yǎng)Mh的菌株平板中的插片，置載玻片上在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，鞭毛及芽孢的有無(wú)和著生情況。1.7.2培養(yǎng)特征觀察將實(shí)驗(yàn)菌株接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)Mh，觀察其表觀特征，包括菌株的形狀和大小，邊緣、表面隆起形狀，透明度，菌落及培養(yǎng)基的顏色等。1.7.3生理生化特征研究參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》(東秀珠等，2001)對(duì)JSa-9菌株進(jìn)行革蘭氏染色以及生理生化特性鑒定。(1)生長(zhǎng)溫度的測(cè)定將目標(biāo)菌株接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基中，置于4°C冰箱和15°C、20°C、25°C、 30°C、37°C、40°C的恒溫培養(yǎng)箱以及45°C、50°C、60°C的水浴中培養(yǎng)，每隔12h與未接種的對(duì)照管對(duì)比，目測(cè)菌株的生長(zhǎng)情況，確定菌株生長(zhǎng)的最低及最高溫度。(2)耐酸堿度的測(cè)定將目標(biāo)菌株接種于pH 值為 3,3. 5、4、4· 5、5、5· 5、6、6· 5、7、7· 5、8、8. 5、9、9· 5、10
的營(yíng)養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基中，3o°c培養(yǎng)，每隔1 與未接種的對(duì)照管對(duì)比，目測(cè)菌株的生長(zhǎng)情況。(3)需氧性及運(yùn)動(dòng)性的測(cè)定取活化Mh的目標(biāo)菌株穿刺接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂半固體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)3天后觀察生長(zhǎng)狀況。(4)耐鹽性試驗(yàn)將目標(biāo)菌株接種于加入NaCl至終濃度為0%、2%、5%、7%、10%的營(yíng)養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)，在第3天和第7天各觀察一次，與未接種的對(duì)照管對(duì)比，目測(cè)生長(zhǎng)情況。(5)檸檬酸鹽利用在適用于芽孢菌的培養(yǎng)基(NaCllg,MgSO4 ·7Η20 :0. 2g,NH4H2PO4 :0. 5g，檸檬酸鈉 2g，蒸餾水1000ml, 0. 04%酚紅液:20ml)斜面上劃線接種，30°C培養(yǎng)3 7d。培養(yǎng)基為堿性(指示劑藍(lán)色或桃紅色)者為陽(yáng)性，否則為陰性。(6)接觸酶試驗(yàn)將目標(biāo)菌株接種于牛肉膏蛋白胨斜面上30°C培養(yǎng)Mh，以鉬絲接種環(huán)取一環(huán)涂抹于已滴有3%的H2A的玻片上，觀察氣泡的產(chǎn)生，有氣泡者為陽(yáng)性，否則為陰性。(7)淀粉水解試驗(yàn)將大腸桿菌(陽(yáng)性對(duì)照)以及目標(biāo)菌株分別在淀粉培養(yǎng)基的平板上劃線接種，將培養(yǎng)皿倒置，放入37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Mh。打開皿蓋，加入少量盧哥氏碘液于平皿中， 輕輕旋轉(zhuǎn)平板，使碘液均勻鋪滿整個(gè)平板，觀察菌苔周圍是否有透明圈出現(xiàn)。(8)糖、醇類發(fā)酵試驗(yàn)將目標(biāo)菌株以及大腸桿菌分別接種于葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基、蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基、甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基、阿拉伯糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，以不接種的培養(yǎng)基為對(duì)照，37°C 培養(yǎng)M 48h，觀察各試管的顏色變化以及德漢氏小管中有無(wú)氣泡產(chǎn)生。(9)硝酸鹽還原試驗(yàn)取目標(biāo)菌接種于硝酸鹽還原測(cè)定培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)24 48h，用Griess試劑測(cè)定。如培養(yǎng)液變?yōu)榧t色表示亞硝酸鹽存在，為陽(yáng)性。(10)甲基紅試驗(yàn)取目標(biāo)菌接種于甲基紅測(cè)定培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)M 48h，用甲基紅試劑測(cè)定。如培養(yǎng)液變?yōu)榧t色表示甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)，黃色則為陰性。(Il)V-P 試驗(yàn)取目標(biāo)菌接種于甲基紅測(cè)定培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)M 48h，去等量的40%氫氧化鈉相混，加少許肌酸，IOmin后如培養(yǎng)液出現(xiàn)紅色，即為試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)，有時(shí)需要放置更長(zhǎng)時(shí)間才出現(xiàn)紅色。1. 7. 4基于16S rRNA基因的分子生物學(xué)鑒定(1)細(xì)菌總DNA的制備吸取IOml 280C 160r · mirT1培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌培養(yǎng)液，5000r · mirT1離心IOmin, 沉淀用TE洗滌后，再次離心，菌體重懸于TE溶液，加入50mg · ml—1溶菌酶溶液8 μ 1， 37°C保溫 20min,加入 RNase (IOmg .ι Γ1) 10 μ 1，至終濃度為 25 μ g .mr1,然后加入 10 % SDS 溶液 0. 51111，371保溫301^11，加入蛋白酶1((2011^ -πιΓ1) 10 μ L，至終濃度為 50 μ g ^1^,37^ 保溫60 90min，加入等體積的苯酚氯仿異戊醇05 24 1)，混勻，8000r .mirT1離心5min，取上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中，如此2 3次，將上清液中加入0. 1倍體積的醋酸鈉和2倍體積的冷凍的無(wú)水乙醇，旋轉(zhuǎn)離心管，出現(xiàn)沉淀物DNA，70%乙醇洗滌一次，室溫下干燥，加入0. 5ml TE或雙蒸水溶解DNA作為PCR模板待用。(2) 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定采用原核生物16S rRNA擴(kuò)增的通用引物用于16S rRNA基因的PCR反應(yīng)的引物為一對(duì)通用引物(由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成)正向引物fD1 5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，反向引物rP 1 5，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，PCR反應(yīng)體系IOXPCR buffer5μ 1IOmmol ‘ F1MgCl23μ 12· Ομπ ο · ΓΜΝΤΡ4μ 1IOymol ‘ F'fDl3μ 1IOymol ‘ Γ'γΡΙ3μ 11. 0 μ mol · F1DNA 模板1 μ 15U · μ r1Taq DNA 聚合酶(TaKaRa)1 μ 1ddH2030 μ 1_總反應(yīng)體積50 μ 1PCR反應(yīng)程序94 °C 5min
94 °C 40 sη}- 34cycles 52°C 50 s J72 °C 2min72 °C IOminPCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄結(jié)果。PCR產(chǎn)物通過(guò)電泳，利用TaKaRa公司Gel Extraction Kit試劑盒割膠回收純化。送至上海生工測(cè)序。測(cè)序結(jié)果利用Blast在非重復(fù)的GENBANK+EMBI+PDB基因庫(kù)中進(jìn)行同源性比較，并將其鑒定到種。(3)繪制系統(tǒng)發(fā)育樹將所測(cè)得的16S rRNA序列經(jīng)過(guò)校對(duì)后與NCBI上的GeneBank序列數(shù)據(jù)庫(kù)中的已有序列進(jìn)行Blast分析，根據(jù)序列同源性從高到低的次序選取模式菌株的序列，采用 Bioedit7. 0和Treedrawing軟件用Neighbor-Joining法構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，以確定該菌株的分類地位。2結(jié)果與分析2. 1抗菌活性菌株的分離篩選從不同來(lái)源的六份土壤樣品中分離到共119株芽孢桿菌菌株，采用瓊脂塊法對(duì)蠟樣芽孢桿菌(G+)、E.Coil(G_)、黑曲霉的抑菌活性進(jìn)行測(cè)定，從中有36株具有抗菌活性。用搖瓶法復(fù)篩后發(fā)現(xiàn)，有9株菌株的抗菌譜較廣、抗菌活性較高，即JSa-6、JSa-9、JSa-47, JSb-Il、幾c-6、幾c-16、HLJ-25、JXa-16、JXb-2(結(jié)果見表 1-1)。其中 JSa_9、JSa-48、JSb_2、 HLJ-6四株菌對(duì)三種指示細(xì)菌均有明顯抑制作用，而對(duì)兩種指示真菌均具有抑菌活性的菌株只有JSa-9、JSa-47、JSb-Il三株，其中JSa_9在9株抗菌活性菌株中抗菌譜最廣，不僅對(duì)革蘭氏陽(yáng)性及陰性細(xì)菌有明顯的抑制作用，對(duì)真菌黑曲霉、點(diǎn)青霉也有抑菌活性，但對(duì)點(diǎn)青霉的抑制作用相對(duì)較弱。將JSa-9菌株送CGMCC保藏，保藏號(hào)為CGMCC No. 4314。2. 2JSa-9菌株的培養(yǎng)特征及生理生化鑒定2. 2.1菌體形態(tài)特征菌體呈短桿狀，染色均勻、革蘭氏染色陽(yáng)性(見圖5)，具有運(yùn)動(dòng)性，可形成卵圓形芽孢，芽孢孢囊膨大，中生至次端生。2. 2. 2菌落特征JSa-9菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后呈淡黃色菌落，表面光滑，粘稠，微凸起，邊緣整齊，直徑0. 3 0. 5mm，不產(chǎn)色素。2. 2. 3J&1-9菌株的生理生化特征菌株革蘭氏染色呈陽(yáng)性；兼性厭氧生長(zhǎng)；其最適生長(zhǎng)溫度為30°C，最低生長(zhǎng)溫度為15°C，40°C以上不能生長(zhǎng)；5% NaCl條件下不生長(zhǎng)；V-P試驗(yàn)陽(yáng)性；能水解淀粉，接觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陽(yáng)性；噴哚試驗(yàn)陰性；甲基紅試驗(yàn)陰性；不產(chǎn)H2S ；不利用檸檬酸鹽；能利用L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露醇、D-葡萄糖和乳糖，同時(shí)能產(chǎn)生氣體(見表1-2)。綜合以上培養(yǎng)特征及生理生化特性，并根據(jù)東秀珠等的《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，初步將JSa-9菌株鑒定為浸麻類芽孢桿菌(Paenikicillus macerans)或多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)。2. 3J&1-9菌株的分子生物學(xué)鑒定2. 3. IPCR 產(chǎn)物擴(kuò)增以JSa-9總DNA為模板，利用16S rRNA基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約為1. 5kb 的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖6。2. 3. 2測(cè)序結(jié)果
取PCR產(chǎn)物40 μ 1，由上海生工生物技術(shù)公司完成16S rRNA基因的測(cè)序工作。測(cè)序結(jié)果如下(共計(jì)1430bp)。此序列已在GenBank中登錄，其登錄號(hào)為EU8^855。2. 3. 3BLAST同源性搜索比較結(jié)果將所得到的16S rRNA基因序列，在www. ncbi. nlm. nlh. gov網(wǎng)站中使用 BLASTN2. 211 [MAY-05-2005]在 GenBank+EMBL+DDBJ+PDB 基因庫(kù)中進(jìn)行同源性搜索，所得結(jié)果中同相似性最高的前14個(gè)菌株比較結(jié)果如表1-3，從表1-3可見與JSa-9相似度最高的前14株菌均為多粘類芽孢桿菌，而且相似性均達(dá)到99%。因此，綜合生理生化試驗(yàn)以及16S rRNA同源性比較結(jié)果可以把該菌歸為多粘類芽孢桿菌(Paenikicillus polymyxa) 0表1-1搖瓶法測(cè)定抗菌活性菌株的抗菌效果
菌株 Strain來(lái)源 Origin抑菌圈直徑(mm) Inhibition zone(diameter, mm)大腸 E. coli藤黃微球 Μ. Iuteus蠟樣 B. cereus點(diǎn)青霉 P. notatum黑曲霉 A. nigerJSa-9江蘇省南京市紫金山11.88±0.513.96±0.211.98±0.38.85±0.212.86±0.1JSa-36江蘇省南京市紫金山8.36±0.3NI7.38±0.5NI8.48±0.5JSa-47江蘇省南京市紫金山11.93±0.4NI10.07±0.19.05±0.28.13±0.50148] JSa-48江蘇省南京市紫金山8.13±0.510.25±0.613.97±0.5NI10.32±0.2JSb-2江蘇省南京農(nóng)業(yè)大學(xué)12.95±0.110.97±0.38.32±0.3NI7.42±0.5JSb-Il江蘇省南京農(nóng)業(yè)大學(xué)12.30±0.3NI10.80±0.28.66±0.57.23±0.3HLJ-6黑龍江省齊齊哈爾市8.39±0.39.99±0.69.56±0.4NINIJXa-2江西省德興市郊區(qū)10.02±0.1NI9.33±0.27.53±0.4NIJXb-3江西省臨川市郊區(qū)9.18±0.39.13±0.3NINI7.66±0.3注“NI”表示無(wú)抑制作用，“ 士，，表示一式三份測(cè)量后的標(biāo)準(zhǔn)偏差。表1-2菌株JSa-9的生理生化特征
權(quán)利要求
1.一株聯(lián)產(chǎn)LI-F類抗生素和鄰苯二甲酸二丁酯的多粘類芽孢桿菌菌株，該菌株為多粘類芽孢桿菌(Paenikicillus polymyxa) JSa_9，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC No. 4314。
2.權(quán)利要求1所述的多粘類芽孢桿菌菌株在制備抗生素方面的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于該菌株在聯(lián)產(chǎn)LI-F類抗生素和鄰苯二甲酸二丁酯方面的應(yīng)用。
4.利用權(quán)利要求1所述菌株進(jìn)行LI-F類抗生素和鄰苯二甲酸二丁酯的微生物發(fā)酵和分離鑒定方法，其特征在于包括下列步驟a.將保藏號(hào)為CGMCCNo. 4314的多粘類芽孢桿菌JSa-9進(jìn)行培養(yǎng)，得到抗菌物質(zhì)發(fā)酵液；b.抗菌物質(zhì)發(fā)酵液離心，收集上清液，萃取，將有機(jī)相進(jìn)行納濾，得抗菌提取物；c.抗菌提取物通過(guò)HPLC分離純化LI-F類抗生素及鄰苯二甲酸二丁酯；d.對(duì)分離純化的物質(zhì)進(jìn)行鑒定。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于包括下列步驟a.多粘類芽孢桿菌JSa-9產(chǎn)LI-F類抗生素和鄰苯二甲酸二丁酯的發(fā)酵將多粘類芽孢桿菌JSa-9接種于試管斜面營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)Mh，將菌種活化；再將試管斜面活化的多粘類芽孢桿菌JSa-9菌種接種于LB液體培養(yǎng)基，30°C、ISOrpm 培養(yǎng)20 Mh，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，制成濃度為IO7 108cfu/l的種子液；將多粘類芽孢桿菌 JSa-9種子液以10%濃度接種于Landy發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C和150rpm條件下培養(yǎng)72h， 得到抗菌物質(zhì)發(fā)酵液；b.多粘類芽孢桿菌JSa-9產(chǎn)LI-F類抗生素和鄰苯二甲酸二丁酯的分離①發(fā)酵液在12.OOOg下離心20min除去菌體，然后用與上清液相同體積的乙酸乙酯以萃取法抽提兩次后，將有機(jī)相經(jīng)過(guò)l_2nm的納濾膜，即為獲得的抗菌提取物；②多粘類芽孢桿菌JSa-9產(chǎn)抗菌物質(zhì)高效液相色譜分析(HPLC)將多粘類芽孢桿菌 JSa-9抗菌提取物采用RP-C18柱進(jìn)行HPLC分離純化LI-F類抗生素和鄰苯二甲酸二丁酯；洗脫液為含3. Smmol三氟乙酸的水和乙腈溶液，梯度洗脫條件為0 20min，乙腈10 40%; 20 30min，乙腈40 60% ;30 40min，乙腈60 70% ；流速為0. 5ml/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)為 210nm ；鄰苯二甲酸二丁酯標(biāo)準(zhǔn)樣品也在相同條件下進(jìn)行HPLC層析；LI-F類抗生素和鄰苯二甲酸二丁酯的HPLC洗脫保留時(shí)間分別約為25 30和52min ；c.多粘類芽孢桿菌JSa-9產(chǎn)抗菌物質(zhì)的鑒定多粘類芽孢桿菌JSa-9抗菌提取物經(jīng)HPLC分離后，各抗菌組分再利用電噴霧電離、誘導(dǎo)石並撞角軍離質(zhì)譜(Electrospray ionization mass spectrometry/ collision-induceddissociation, ESI-MS/CID)測(cè)定其分子量和鑒定其結(jié)構(gòu)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于步驟b中高效液相色譜儀為美國(guó)AGILENT llOOseries，配備DVD檢測(cè)器。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于步驟c中在質(zhì)譜分析前對(duì)環(huán)脂肽樣品采用弱堿性NaOH在40°C條件下處理24h水解成直鏈；ESI-MS/CID采用配備了電噴霧離子源的 LCQDECA XP PLUS Thermo Finnigan 液質(zhì)聯(lián)用(LS-MS)設(shè)備(ThermoCorporation，USA)，采用MS柱進(jìn)行分析，HPLC條件中流動(dòng)相成分和比例與多粘類芽孢桿菌JSa-9產(chǎn)抗菌物質(zhì)的分離步驟相同，流速為2μ 1/min ；電噴霧源操作電壓為5kV，操作溫度為300°C，操作壓力為 20abr。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵和生物分離領(lǐng)域，公開了一株聯(lián)產(chǎn)LI-F類抗生素和鄰苯二甲酸二丁酯的多粘類芽孢桿菌菌株及其應(yīng)用。該菌株為多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)JSa-9，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC No.4314。該菌株能聯(lián)產(chǎn)LI-F類抗生素和鄰苯二甲酸二丁酯，可用于制備抗生素，可開發(fā)成為新型的天然食品防腐劑及生防試劑，廣泛應(yīng)用于水果和蔬菜等食品加工和防腐保鮮，對(duì)于延長(zhǎng)食品保質(zhì)期和減少農(nóng)作物病蟲害等具有十分重要的價(jià)值。
文檔編號(hào)C12P7/62GK102168053SQ20111003698
公開日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2011年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月13日
發(fā)明者別小妹, 呂鳳霞, 鄧陽(yáng), 陸兆新 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)