專利名稱：土壤微生物固碳酶提取的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化學(xué)與環(huán)境領(lǐng)域，更具體地講涉及一種土壤1，5 - 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)的提取和測(cè)定的方法。
背景技術(shù)：
我國(guó)面臨極大的溫室氣體減排壓力，增強(qiáng)陸地生態(tài)系統(tǒng)的碳匯功能是重要的溫室氣體減排機(jī)制之一。CO2的生物固定主要是通過(guò)植物和自養(yǎng)微生物進(jìn)行。其中，自養(yǎng)微生物廣泛分布于不同的生態(tài)系統(tǒng)中，它們具有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，可以在多種環(huán)境條件包括火山口，海洋深處，湖泊盆地等植物無(wú)法生存的生境下，參與(X)2的固定。因而，從整個(gè)生物圈的物質(zhì)、能量流來(lái)看，研究微生物固碳的生態(tài)環(huán)境效益最具現(xiàn)實(shí)意義。土壤微生物通過(guò)特殊的生物固碳途徑將大氣CO2轉(zhuǎn)化為有機(jī)碳并合成自身細(xì)胞物質(zhì)(微生物量碳)，進(jìn)入土壤有機(jī)碳的循環(huán)，對(duì)于增加土壤碳固持及減緩全球(X)2濃度升高具有不可忽視的作用。近年來(lái)，我們采用同位素標(biāo)記技術(shù)的研究發(fā)現(xiàn)，土壤微生物的固碳潛力巨大。目前發(fā)現(xiàn)的五條主要生物固碳途徑中，卡爾文循環(huán)是自養(yǎng)生物固定(X)2的主要途徑，其中核酮糖-1，5" 二磷酸梭化酶/加氧酶(RubisCO)是卡爾文循環(huán)中的關(guān)鍵酶，該酶催化卡爾文循環(huán)中的第一步CO2固定反應(yīng)，據(jù)估計(jì)它每年約固定5X IO14千克的C02。目前自然界存在的不同類型1，5_ 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)已被鑒定出來(lái)，按照其結(jié)構(gòu)，催化性能和對(duì)O2的敏感性可分為I -IV。在目前生境條件下，1，5_ 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)I是主要功能者，并普遍存在于高等植物，藻類和原核生物中。1，5 -二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)首先由Wildman和Bormer于1947年從菠菜可溶性蛋白中發(fā)現(xiàn)，并用分光光度法測(cè)定了該酶活性，1971年又發(fā)現(xiàn)該酶具有雙重功能，除羧化作用外，還具有催化1，5-二磷酸核酮糖(RuBP)氧化作用，從此該酶稱為1，5_ 二磷酸核酮糖羧化酶酶 / 加氧酶(Rubulose Bisphosphate Carboxylase, EC4. 1. 1. 39，簡(jiǎn)稱 RubisCO)。 繼Tabtia FR和Kusian B的綜述之后，人們采用分離培養(yǎng)技術(shù)和14C標(biāo)記或者分光光度法測(cè)定了光合細(xì)菌和化能自養(yǎng)細(xì)菌1，5 - 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)活性， 并對(duì)自養(yǎng)微生物1，5_ 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)的結(jié)構(gòu)特性、基因調(diào)節(jié)等方面進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究。然而，由于用傳統(tǒng)的方法只能分離0. 19Γ0. 5%的環(huán)境微生物 (Amann et al. , 1995)，因此從環(huán)境中簡(jiǎn)單提取固碳微生物很難全面了解固碳自養(yǎng)細(xì)菌的多樣性及其1，5 - 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)活性，更加不能得到其在土壤生態(tài)系統(tǒng)中的生活特征和生態(tài)功能的信息。目前，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，通過(guò)設(shè)計(jì)通用PCR引物，對(duì)環(huán)境樣品固碳微生物1，5_ 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)編碼基因進(jìn)行多樣性研究成為可能，Paul在高鹽條件(5 M MgCl2)下的海水與深海盆地的臨界面獲得了細(xì)菌RubisCO的大亞基基因(MM，cbbM)的遺傳信息及其群落結(jié)構(gòu)特征；2003 年Tolli和King在松樹林和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)不同土層深度的土壤中許多屬于1，5 - 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO) I的新基因型，它們僅于兼性化能自養(yǎng)菌有較近的親緣關(guān)系。他們的工作是首次在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中開(kāi)展固碳微生物1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)編碼基因的多樣性研究。然而目前的研究并未涉及環(huán)境樣品中RubisCO 提取及活性測(cè)定方法，尤其是1，5 - 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)活性與環(huán)境微生物固碳能力的關(guān)系更是缺乏系統(tǒng)的研究。因此，發(fā)展高效、通用的土壤1，5_ 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)提取及活性測(cè)定方法對(duì)準(zhǔn)確評(píng)估土壤微生物的固碳潛力具
有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種土壤微生物固碳酶提取的方法(土壤微生物固碳關(guān)鍵酶1，5 - 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)的提取及活性測(cè)定的方法)，該方法操作簡(jiǎn)便、快速，技術(shù)要求相對(duì)較低，測(cè)定結(jié)果精密度和準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，適合于大批量土壤固碳酶1，5 - 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)活性的精確測(cè)定。土壤微生物固碳關(guān)鍵酶1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)提取方法包括樣品前處理、土壤微生物蛋白(1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶RubisCO粗液)的提取及酶活性測(cè)定，一種土壤微生物固碳酶提取的方法，其步驟是
A、土壤樣品的預(yù)處理
(1)稱取5克新鮮土樣(土樣去除植物根系混勻后立即進(jìn)行預(yù)處理，否則所測(cè)得酶活性與真實(shí)值會(huì)有偏差)于50毫升無(wú)菌離心管中；
(2)加5倍體積預(yù)冷的土壤各種離子、無(wú)機(jī)物以及有機(jī)物胞外游離的蛋白去除劑 (TENP緩沖液)渦旋混勻，于室溫(20-25°C，以下相同)10，OOOXg離心10分鐘，收集沉淀， 重復(fù)該步驟兩次；用于去除減少土壤中各種離子、無(wú)機(jī)物以及有機(jī)物，胞外游離的蛋白，特別是減少腐殖酸類物質(zhì)的污染。所述的離子為鈣離子(Ca2+)、鋁離子(A13+)，鎂離子(Mg2+)，鐵離子(Fe2+)， 鎂離子(Mn2+)、鉀離子(K+)。所述的無(wú)機(jī)物為硫酸鋁A12(S04)3，硫酸鎂MgS04，硫化亞鐵FeS，硫酸錳MnS04，碳酸鈣CaC03；堿金屬(Na、K)。所述的有機(jī)物為腐植物質(zhì)，動(dòng)物毛發(fā)和未被微生物降解的植物根系及枯枝落葉。所述的土壤離子去除劑(TENP緩沖緩)為50毫摩爾/升的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液(Tris-HCl )，20毫摩爾/升的乙二胺四乙酸(EDTA)，100毫摩爾/升的氯化鈉，0. 01克/毫升的聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)，pHlO. 0
(3)加5倍體積預(yù)冷的磷酸緩沖液(0.01M，pH 7.4),渦旋混勻，于室溫10，000Xg離心 10分鐘，收集沉淀，重復(fù)該步驟兩次；用于平衡滲透壓、維持離子強(qiáng)度和PH (7. 4)。(4)加5倍體積的無(wú)菌超凈水，渦旋混勻，于室溫10，OOOXg離心10分鐘，收集沉淀；用于洗滌沉淀并主要去除無(wú)機(jī)鹽離子。(5)沉淀通過(guò)冷凍干燥后獲得無(wú)雜質(zhì)的土樣凍干粉，置于-700C備用。土壤微生物蛋白(RubisCO粗液)提取
(1)稱取2.0克上述預(yù)處理后的冷凍干燥樣品于10毫升預(yù)冷無(wú)菌離心管中，加6mL細(xì)胞樣品蛋白提取液，渦旋混勻，每個(gè)樣品3次重復(fù)；
所述的細(xì)胞樣品提取液配比為100毫摩爾/升的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液(Tris-HCl)，1毫摩爾/升的二硫蘇糖醇(DTT)，pH 7. 8，100微升2. 0微克/毫升的蛋白酶抑制劑(P印statin)；
(2)置于冰浴中用超聲波法徹底破碎細(xì)胞(超聲波細(xì)胞破碎儀，占空比50%，輸出功率 600W，破碎時(shí)間20分鐘)；
(3)20000Xg，4°C下離心15分鐘，收集上清液，重復(fù)離心操作一次，確保所有的蛋白液均被收集。加入質(zhì)量比為80%的固體硫酸銨溶解度后，置于4°C振蕩充分混勻，20000Xg， 4°C下離心20分鐘，收集析出的蛋白，加50微升的1，5 - 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶 (RubisCO)溶解液溶解后，獲得土壤微生物蛋白(RubisCO粗液)后，置于0°C保存待用。所述的1，5 - 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)溶解液配比為100毫摩爾 /升PH 7.8的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液(Tris-HCl)和1毫摩爾/升的的二硫蘇糖醇(DTT)。土壤1，5 - 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)酶活性測(cè)定
測(cè)定前將土壤微生物蛋白(RubisCO粗液)提取溶液置于30°C水浴中2(Γ30分鐘以恢復(fù)酶活性，測(cè)定時(shí)環(huán)境溫度保持30°C。每個(gè)樣品酶活性測(cè)定三次，同時(shí)做兩個(gè)陰性對(duì)照，分別為無(wú)反應(yīng)底物1，5_ 二磷酸核酮糖(RuBP)對(duì)照和熱變性細(xì)胞蛋白提取物對(duì)照。1，5_ 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)活性以二磷酸核酮糖羧化酶(RuBPCase)的酶活力大小來(lái)表示。二磷酸核酮糖羧化酶(RuBPCase)的活力測(cè)定的反應(yīng)體系為二磷酸核酮糖羧化酶的活力反應(yīng)體系為75 μ L 5毫摩爾/升的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、75 μ L 50毫摩爾/ 升的三磷酸腺苷、50 μ L的酶提取液、75 μ L 50毫摩爾/升的磷酸肌酸、75 μ L 0. 2毫摩爾/升的碳酸氫鈉、700yL的反應(yīng)介質(zhì)(200毫摩爾/升ρΗ 7.8的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液(Tris-HCl )，2毫摩爾/升的二硫蘇糖醇(DTT)，2毫摩爾/升的氯化鎂)、 IOOuL 150活力單位/毫升的磷酸肌酸激酶、200 μ L 300個(gè)活力單位/毫升的磷酸甘油酸激酶和100 μ L 150個(gè)活力單位/毫升的磷酸甘油醛脫氫酶。測(cè)定前須檢測(cè)所使用的磷酸肌酸激酶、磷酸甘油酸激酶和磷酸甘油醛脫氫酶活性達(dá)到本方法要求才可繼續(xù)下游操作。(1)將配制好的反應(yīng)體系搖勻，倒入比色杯內(nèi)，以蒸餾水為空白，在紫外分光光度計(jì)上340 nm處反應(yīng)體系的吸光度作為零點(diǎn)值。將50微升1，5_ 二磷酸核酮糖(25毫摩爾 /升)加于比色杯內(nèi)，并馬上計(jì)時(shí)，每隔30秒測(cè)一次吸光度，共測(cè)3分鐘。以計(jì)時(shí)起到第1 分鐘內(nèi)吸光度下降的絕對(duì)值計(jì)算酶活力，另外，以相應(yīng)的熱變性細(xì)胞蛋白提取物作對(duì)照。(2)不加1，5_ 二磷酸核酮糖(RuBP)的對(duì)照，對(duì)照的反應(yīng)體系與上述酶反應(yīng)體系完全相同，不同之處只是把酶提取液放在最后加，加后立即計(jì)時(shí)并測(cè)定此反應(yīng)體系在340nm 處的吸光度，記錄前1分鐘內(nèi)吸光度的變化量，計(jì)算酶活力時(shí)應(yīng)減去這一變化量。該步驟可以消除酶提取液中磷酸甘油酸(PGA)，對(duì)酶活力測(cè)定產(chǎn)生的誤差。(3) 二磷酸核酮糖羧化酶(RuBPCase)的酶活力的計(jì)算 (nmol CO2 kg-1 ( 土壤 ^mirT1)= AAXNXC /(6. 22 X 2d At)
式中ΔΑ —反應(yīng)最初Imin內(nèi)340nm處吸光度變化的絕對(duì)值(減去空白和對(duì)照液最初 Imin的變化量)；
酶活力為每分鐘每千克蛋白土壤固定(X)2的納摩爾(nmol)數(shù)； N一稀釋倍數(shù)；
C 一換算系數(shù)，(每千克預(yù)處理后土樣凍干粉所提取的50微升酶液體積當(dāng)量，值為5X102)；
6. 22 一每微摩爾(μ mol)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在340 nm處的吸光系數(shù)； 2 一每固定1摩爾(X)2有2摩爾的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)被氧化； d—比色光程(厘米) kg—1 —每千克預(yù)處理后土樣凍干粉 At—測(cè)定時(shí)間為1分鐘。經(jīng)過(guò)計(jì)算最后得到每千克無(wú)雜質(zhì)土壤中微生物固碳酶的總活性。采用本發(fā)明所提供的方法具有下述突出的特點(diǎn)
1.采用土壤離子去除劑(TENP緩沖緩)和磷酸緩沖液對(duì)土樣進(jìn)行預(yù)處理，減少了土壤中各種離子、無(wú)機(jī)物以及有機(jī)物，胞外游離的蛋白，特別是減少腐殖酸類物質(zhì)的污染。其中土壤離子去除劑(TENP緩沖緩)中含有的PVPP (聚乙烯吡咯烷酮)，有效去除了對(duì)土壤蛋白提取及含量測(cè)定影響較大的腐殖酸類物質(zhì)，因此，測(cè)定的土壤蛋白結(jié)果重復(fù)性，精密度和準(zhǔn)確度高。2.采用超聲波破碎法(占空比50%，輸出功率600瓦特，破碎時(shí)間20分鐘)。提取土壤微生物胞內(nèi)蛋白，不僅蛋白產(chǎn)量高，而且能很好保留土壤中生物活性物質(zhì)如酶活性，相比較常用的土壤蛋白質(zhì)提取方法，提高了 10(Γ200%，如化學(xué)裂解破碎和液氮凍融法。本發(fā)明的土壤微生物蛋白提取可以用于土壤其他活性物質(zhì)的提取和相關(guān)分子生物學(xué)的(功能基因)分析。3.本發(fā)明中1，5 - 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)的酶活性測(cè)定過(guò)程中試劑使用量較常規(guī)方法減半，但測(cè)定的靈敏度相應(yīng)提高，而且無(wú)任何放射性或高毒性物質(zhì)， 具有典型的環(huán)境友好特性。4.本發(fā)明中1，5 - 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)酶活性測(cè)定增加了一個(gè)失活酶陰性對(duì)照，在一定程度上減少了土壤蛋白共提雜質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果的干擾，極大提高了酶活性測(cè)定結(jié)果可靠性。5.本發(fā)明的酶活性測(cè)定操作簡(jiǎn)便、快速，技術(shù)要求相對(duì)較低，適合大批量樣品的分析測(cè)定。6.實(shí)用性廣，適合于旱地土壤、淹水稻田土壤、污泥等環(huán)境樣品中RubisCO酶活性測(cè)定中的應(yīng)用。


圖1為一種光照和遮光培養(yǎng)條件下，土壤微生物固碳關(guān)鍵酶1，5 - 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)酶活性示意圖。圖2為一種土壤固碳量(14C-SOC)與固碳關(guān)鍵酶1，5 - 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)酶活性的相關(guān)關(guān)系示意圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
土壤微生物固碳關(guān)鍵酶1，5_ 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)酶的提取及活性測(cè)定方法，其步驟如下稱取樣品土壤5克于50毫升無(wú)菌離心管中，加入25毫升預(yù)冷的土壤各種離子、無(wú)機(jī)物、以及有機(jī)物胞外游離的蛋白去除劑(TENP緩沖液)，渦旋混勻，然后于室溫10，OOOXg離心10分鐘，收集沉淀。重復(fù)該步驟兩次；然后加入25毫升預(yù)冷的磷酸緩沖液(0. 01摩爾/ 升，pH7. 4)，渦旋混勻，于室溫10，000 X g離心10分鐘，收集沉淀，重復(fù)該步驟兩次；最后加入25毫升的無(wú)菌超凈水，渦旋混勻，于室溫10，OOOXg離心10分鐘，收集沉淀。沉淀即為提取的粗蛋白沉淀物。沉淀通過(guò)冷凍干燥后置于_70°C備用。所述的離子為鈣離子(Ca2+)、鋁離子(A13+)，鎂離子(Mg2+)，鐵離子(Fe2+)， 鎂離子(Mn2+)、鉀離子(K+)。所述的無(wú)機(jī)物為硫酸鋁A12(S04)3，硫酸鎂MgS04，硫化亞鐵FeS，硫酸錳MnS04，碳酸鈣CaC03；堿金屬(Na、K)。所述的有機(jī)物為腐植物質(zhì)(富理酸、胡敏酸、胡敏素)，動(dòng)物毛發(fā)(鼠類、鳥類)和未被微生物降解的植物根系(水稻、小麥、黑麥草、玉米根系、樹木細(xì)根和粗根系)及枯枝落葉 (水稻、小麥、黑麥草、玉米落葉和樹木的落枝)。所述的土壤離子去除劑(TENP緩沖液)配方50毫摩爾/升的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液(Tris-HCl)，20毫摩爾/升的乙二胺四乙酸(EDTA)，100毫摩爾/升的氯化鈉，0. 01克/毫升的聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)，pHlO. 0
土壤微生物蛋白(1，5 - 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)酶液)提取 取粗蛋白沉淀物2. 0克于10毫升的預(yù)冷無(wú)菌離心管中，加入6毫升細(xì)胞樣品蛋白提取液，渦旋混勻，每個(gè)樣品3次重復(fù)；置于冰浴中，用超聲波法徹底破碎細(xì)胞(超聲波細(xì)胞破碎儀，占空比50%，輸出功率600W，破碎時(shí)間20分鐘)；20000 X g，4°C下離心15分鐘，收集上清液，重復(fù)離心操作一次，確保所有的蛋白液均被收集。加入固體硫酸銨至80%溶解度后， 置于4°C振蕩充分混勻，20000 X g，4°C下離心20分鐘，收集析出的蛋白，加50微升的1，5 -二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)溶解液溶解后，溶解液即1，5_ 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)酶液，然后置于0°C保存待用。所述的細(xì)胞樣品提取液配比為100毫摩爾/升的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液(Tris-HCl)，1毫摩爾/升的二硫蘇糖醇(DTT)，pH7. 8，100微升2. 0微克/毫升的蛋白酶抑制劑(P印statin)；
所述的RubisCO溶解液配比為100毫摩爾/升的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液(Tris-HCl) (pH 7. 8)和1毫摩爾/升的二硫蘇糖醇(DTT) 土壤RubisCO酶活性測(cè)定
測(cè)定前將前述置于0°C的1，5 - 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)蛋白溶液置于30°C水浴中20分鐘以恢復(fù)酶活性，測(cè)定時(shí)環(huán)境溫度保持30°C。每個(gè)樣品酶活性測(cè)定三次，同時(shí)做兩個(gè)陰性對(duì)照，分別為無(wú)反應(yīng)底物1，5_ 二磷酸核酮糖(RuBP)對(duì)照和熱變性細(xì)胞蛋白提取物對(duì)照。1，5_ 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)活性以二磷酸核酮糖羧化酶(RuBPCase)的酶活力大小來(lái)表示。二磷酸核酮糖羧化酶的活力反應(yīng)體系為75 μ L 5毫摩爾/升的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、75 μ L 50毫摩爾/升的三磷酸腺苷、50 μ L的酶提取液、75 μ L 50毫摩爾/升的磷酸肌酸、75 UL 0. 2毫摩爾/升的碳酸氫鈉、700μ L的反應(yīng)介質(zhì)(200毫摩爾/升pH 7.8 的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液(Tris-HCl)，2毫摩爾/升的二硫蘇糖醇(DTT)，2毫摩爾/升的氯化鎂)、100 μ L 150活力單位/毫升的磷酸肌酸激酶、200 μ L 300個(gè)活力單位/毫升的磷酸甘油酸激酶和100 μ L 150個(gè)活力單位/毫升的磷酸甘油醛脫氫酶。測(cè)定前須檢測(cè)所使用的磷酸肌酸激酶、磷酸甘油酸激酶和磷酸甘油醛脫氫酶活性達(dá)到本方法要求才可繼續(xù)下游操作。(1)將配制好的反應(yīng)體系搖勻，倒入比色杯內(nèi)，以蒸餾水為空白，在紫外分光光度計(jì)上340nm處反應(yīng)體系的吸光度作為零點(diǎn)值。將50微升1，5_ 二磷酸核酮糖(25毫摩爾/ 升)加于比色杯內(nèi)，并馬上計(jì)時(shí)，每隔30秒測(cè)一次吸光度，共測(cè)3分鐘。以計(jì)時(shí)起到第1分鐘內(nèi)吸光度下降的絕對(duì)值計(jì)算酶活力，另外，以相應(yīng)的熱變性細(xì)胞蛋白提取物作對(duì)照。(2)不加1，5_ 二磷酸核酮糖(RuBP)的對(duì)照，對(duì)照的反應(yīng)體系與上述酶反應(yīng)體系完全相同，不同之處只是把酶提取液放在最后加，加后立即計(jì)時(shí)并測(cè)定此反應(yīng)體系在340nm 處的吸光度，記錄前1分鐘內(nèi)吸光度的變化量，計(jì)算酶活力時(shí)應(yīng)減去這一變化量。該步驟可以消除酶提取液中磷酸甘油酸(PGA)，對(duì)酶活力測(cè)定產(chǎn)生的誤差。(3) 二磷酸核酮糖羧化酶(RuBPCase)的酶活力的計(jì)算 (nmol CO2 kg-1 ( 土壤 ^mirT1)= AAXNXC /(6. 22 X 2d At)
式中ΔΑ —反應(yīng)最初Imin內(nèi)340nm處吸光度變化的絕對(duì)值(減去空白和對(duì)照液最初 Imin的變化量)；
酶活力為每分鐘每千克蛋白土壤固定(X)2的納摩爾(nmol)數(shù)； N一稀釋倍數(shù)；
C 一換算系數(shù)，(每千克預(yù)處理后土樣凍干粉所提取的50微升酶液體積當(dāng)量，值為 5X102)；
6. 22 一每微摩爾(μ mol)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在340 nm處的吸光系數(shù)； 2 一每固定1摩爾(X)2有2摩爾的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)被氧化； d—比色光程(厘米) kg—1 —每千克預(yù)處理后土樣凍干粉 At—測(cè)定時(shí)間為1分鐘實(shí)施例2
采用wC-CO2連續(xù)標(biāo)記技術(shù)，探討光照和遮光對(duì)土壤微生物固碳關(guān)鍵酶1，5 - 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)活性的影響及其與固碳量的關(guān)系
分別選取亞熱帶區(qū)4種典型旱地和稻田土壤，設(shè)置旱土和水稻土的裸土和遮光處理， 每處理重復(fù)4次。應(yīng)用碳同位素(14C)連續(xù)示蹤技術(shù)，通過(guò)室內(nèi)密閉模擬系統(tǒng)，探討土壤微生物固碳關(guān)鍵酶1，5 - 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)活性及其與固碳量(14C-SOC) 的關(guān)系。標(biāo)記培養(yǎng)80d后取樣，采用本發(fā)明的方法測(cè)定土壤微生物固碳關(guān)鍵酶1，5_ 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)活性大小(圖1)及其與土壤固碳量的關(guān)系(RubisCO活性=13. 7*固碳量+69. 9，圖2)。其它實(shí)施步驟與實(shí)施例1相同。
權(quán)利要求
1. 一種土壤微生物固碳酶提取的方法，其步驟是A、土壤樣品的預(yù)處理a、稱取新鮮土樣于無(wú)菌離心管中；b、加5倍體積預(yù)冷的土壤各種離子、無(wú)機(jī)物以及有機(jī)物，胞外游離的蛋白去除劑渦旋混勻，于室溫10，OOOXg離心10分鐘，收集沉淀，重復(fù)該步驟兩次；用于去除減少土壤中各種離子、無(wú)機(jī)物以及有機(jī)物，胞外游離的蛋白；所述的離子為鈣離子、鋁離子、鎂離子、鐵離子、鎂離子、鉀離子；所述的無(wú)機(jī)物為硫酸鋁、硫酸鎂、硫化亞鐵、硫酸錳、碳酸鈣、堿金屬；所述的有機(jī)物為富理酸、胡敏酸、胡敏素、鼠類、鳥類、水稻、小麥、黑麥草、玉米根系、 樹木細(xì)根和粗根系及水稻、小麥、黑麥草、玉米落葉和樹木的落枝；所述的土壤離子去除劑為50毫摩爾/升的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液， 20毫摩爾/升的乙二胺四乙酸，100毫摩爾/升的氯化鈉，0.01克/毫升的聚乙烯吡咯烷酮，ρΗΙΟ.Ο ；c、加5倍體積預(yù)冷的磷酸緩沖液，0.01M, pH 7. 4，渦旋混勻，于室溫10，000 X g離心10 分鐘，收集沉淀，重復(fù)該步驟兩次；用于平衡滲透壓、維持離子強(qiáng)度和PH7. 4 ；d、加5倍體積的無(wú)菌超凈水，渦旋混勻，于室溫10，OOOXg離心10分鐘，收集沉淀；用于洗滌沉淀并主要去除無(wú)機(jī)鹽離子；e、沉淀通過(guò)冷凍干燥后獲得無(wú)雜質(zhì)的土樣凍干粉，置于-70°C備用；B、土壤微生物蛋白提取a、稱取2.0克上述預(yù)處理后的冷凍干燥樣品于10毫升預(yù)冷無(wú)菌離心管中，加6mL細(xì)胞樣品蛋白提取液，渦旋混勻，每個(gè)樣品3次重復(fù)；所述的細(xì)胞樣品提取液配比為100毫摩爾/升的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液，1毫摩爾/升的二硫蘇糖醇，PH 7. 8，100微升2. 0微克/毫升的蛋白酶抑制劑；b、置于冰浴中用超聲波法徹底破碎細(xì)胞；20000Xg，4°C下離心15分鐘，收集上清液，重復(fù)離心操作一次，所有的蛋白液均被收集，加入質(zhì)量比為80%的固體硫酸銨溶解度后，置于4°C振蕩充分混勻，20000Xg，4°C下離心20分鐘，收集析出的蛋白，加50微升的1，5 - 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶溶解液溶解后，獲得土壤微生物蛋白后，置于0°C保存待用；所述的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶溶解液配比為100毫摩爾/升pH 7.8的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液和1毫摩爾/升的的二硫蘇糖醇；C、土壤1，5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶酶活性測(cè)定測(cè)定前將土壤微生物蛋白提取溶液置于30°C水浴中2(Γ30分鐘以恢復(fù)酶活性，測(cè)定時(shí)環(huán)境溫度保持30°C，每個(gè)樣品酶活性測(cè)定三次，同時(shí)做兩個(gè)陰性對(duì)照，分別為無(wú)反應(yīng)底物 1,5- 二磷酸核酮糖對(duì)照和熱變性細(xì)胞蛋白提取物對(duì)照，1,5- 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活性以二磷酸核酮糖羧化酶的酶活力大小來(lái)表示；a、將配制好的反應(yīng)體系搖勻，倒入比色杯內(nèi)，以蒸餾水為空白，在紫外分光光度計(jì)上 340 nm處反應(yīng)體系的吸光度作為零點(diǎn)值，將50微升1，5_ 二磷酸核酮糖加于比色杯內(nèi)，并計(jì)時(shí)，每隔30秒測(cè)一次吸光度，共測(cè)3分鐘，以計(jì)時(shí)起到第1分鐘內(nèi)吸光度下降的絕對(duì)值計(jì)算酶活力；b、不加1，5-二磷酸核酮糖的對(duì)照，對(duì)照的反應(yīng)體系與上述酶反應(yīng)體系完全相同，不同之處只是把酶提取液放在最后加，加后計(jì)時(shí)并測(cè)定此反應(yīng)體系在340nm處的吸光度，記錄前1分鐘內(nèi)吸光度的變化量，計(jì)算酶活力時(shí)應(yīng)減去這一變化量；c、二磷酸核酮糖羧化酶的酶活力的計(jì)算nmol CO2 kg-1 ( 土壤).mirT1 = AAXNXC /(6. 22 X 2d At) 式中ΔΑ —反應(yīng)最初Imin內(nèi)340nm處吸光度變化的絕對(duì)值； N一稀釋倍數(shù)； C一換算系數(shù)；·6. 22 一每微摩爾的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸在340 nm處的吸光系數(shù)； 2 一每固定1摩爾(X)2有2摩爾的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸被氧化； d-比色光程；kg—1 —每千克預(yù)處理后土樣凍干粉； At—測(cè)定時(shí)間為1分鐘。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種土壤微生物固碳酶提取的方法，其特征在于所述的二磷酸核酮糖羧化酶的活力反應(yīng)體系為75 μ L 5毫摩爾/升的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、75 μ L 50毫摩爾/升的三磷酸腺苷、50 μ L的酶提取液、75 μ L 50毫摩爾/升的磷酸肌酸、75 μ L 0. 2毫摩爾/升的碳酸氫鈉、700 μ L的反應(yīng)介質(zhì)200毫摩爾/升ρΗ 7. 8的三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液，2毫摩爾/升的二硫蘇糖醇，2毫摩爾/升的氯化鎂、100 μ L 150活力單位/毫升的磷酸肌酸激酶、200 μ L 300個(gè)活力單位/毫升的磷酸甘油酸激酶和 IOOuL 150個(gè)活力單位/毫升的磷酸甘油醛脫氫酶。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種土壤微生物固碳酶提取的方法，其步驟A把土壤依次加入預(yù)冷的離子去除劑、磷酸緩沖液，混勻后，于室溫離心，收集沉淀；B取A的沉淀物于細(xì)胞樣品蛋白提取液中，渦旋混勻，冰浴中用超聲波法破碎細(xì)胞，離心收集上清液，加入固體硫酸銨至溶解度后，振蕩混勻，離心收集析出的蛋白，加溶解液溶解后，保存；C將B的1，5–二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶蛋白溶液置于水浴中恢復(fù)酶活性，紫外分光光度計(jì)上測(cè)定1，5–二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活性以每千克土壤固定CO2的納摩爾數(shù)數(shù)的酶活力。方法簡(jiǎn)便、快速，測(cè)定結(jié)果重復(fù)性好，適合于大批量土壤微生物固碳關(guān)鍵酶1，5–二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶的提取及活性的測(cè)定。
文檔編號(hào)C12Q1/527GK102174496SQ201110036309
公開(kāi)日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年2月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月11日
發(fā)明者劉守龍, 吳金水, 童成立, 肖和艾, 葛體達(dá), 袁紅朝 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所