專利名稱：一種調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫學(xué)與表觀遺傳學(xué)研究領(lǐng)域，涉及應(yīng)用細(xì)胞因子聯(lián)合DNA去甲基化藥物協(xié)同誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性Y ST細(xì)胞生成的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
γ δ T細(xì)胞具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能，在外周血和淋巴器官中所占比例很小 (1-5%)，以前一直為研究者們忽略。自從Kimzmarm等首次發(fā)現(xiàn)γ δ T細(xì)胞能夠大量擴(kuò)增后，越多越多的學(xué)者開始致力于該類細(xì)胞群體的研究。目前，Y δ T細(xì)胞的體外擴(kuò)增和純化已經(jīng)成為一種常規(guī)技術(shù)；為此，該類細(xì)胞的生物學(xué)功能日漸明確。研究者們已發(fā)現(xiàn)Y δ T細(xì)胞在抗感染和抗腫瘤方面發(fā)揮著舉足輕重的作用，并且其過繼免疫治療已在臨床上得到了廣泛應(yīng)用，很多患者從中受益。調(diào)節(jié)性Y δ T細(xì)胞作為γ δ T細(xì)胞的一種亞群，于 2009年9月由意大利學(xué)者Casetti首次發(fā)現(xiàn)，其免疫表型與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞一樣表達(dá)叉頭蛋白3 (F0XP3)轉(zhuǎn)錄因子，該細(xì)胞表現(xiàn)出了強(qiáng)大的免疫抑制功能，具有潛在的治療自身免疫性疾病、實(shí)體器官移植排斥反應(yīng)和造血干細(xì)胞移植后移植物抗宿主病的作用。但是目前對(duì)調(diào)節(jié)性Y δ T細(xì)胞的其他生物學(xué)特性知之甚少，與該群細(xì)胞相關(guān)的研究更是屈指可數(shù)，考慮與調(diào)節(jié)性Y δ T細(xì)胞在體內(nèi)數(shù)量極少和現(xiàn)有擴(kuò)增方法效率偏低從而不能保證體內(nèi)外研究中所需要的足夠細(xì)胞數(shù)量有關(guān)。不能獲得足夠數(shù)量的調(diào)節(jié)性Y δ T細(xì)胞成為制約其深入研究的瓶頸。因此，如何提高調(diào)節(jié)性Y S T細(xì)胞的誘導(dǎo)效率成為目前迫切需要解決的難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有研究方案中誘導(dǎo)效率偏低的缺點(diǎn)，提供一種調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，涉及提供一種調(diào)節(jié)性Y δ T細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，能為進(jìn)一步明確調(diào)節(jié)性Y δ T細(xì)胞的生物學(xué)特性提供研究平臺(tái)。本發(fā)明通過以下步驟實(shí)現(xiàn)
(1)人單個(gè)核細(xì)胞制備取外周血標(biāo)本，肝素抗凝，應(yīng)用人淋巴細(xì)胞分離液分離制備外周血單個(gè)核細(xì)胞，用含10%胎牛血清完全RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞；
(2)單個(gè)核細(xì)胞分組將所獲得的單個(gè)核細(xì)胞隨機(jī)分為常規(guī)方法誘導(dǎo)組和改進(jìn)方法誘導(dǎo)組常規(guī)方法誘導(dǎo)組為單用細(xì)胞因子和唑睞磷酸誘導(dǎo)，改進(jìn)方法誘導(dǎo)組為細(xì)胞因子、唑睞磷酸聯(lián)合地西他濱協(xié)同誘導(dǎo)，兩組細(xì)胞分別設(shè)置3個(gè)復(fù)孔；
(3)調(diào)節(jié)性γδ T細(xì)胞誘導(dǎo)步驟(1)中所制備的單個(gè)核細(xì)胞接種當(dāng)日按第0天計(jì)算， 兩組細(xì)胞分別在第0天加用唑睞膦酸激活γ δ T細(xì)胞，加用白介素-2(IL-2)、白介素-15 (IL-15)和轉(zhuǎn)化生長因子-β 1 (TGF-β 1)細(xì)胞因子誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性γ δ T細(xì)胞的生成，第1天在改進(jìn)方法誘導(dǎo)組中加入地西他濱，接著兩組細(xì)胞分別于第3、6、9天進(jìn)行半量換液，每次換液時(shí)加入新鮮IL-2、IL-15和TGF-β 1細(xì)胞因子，濃度同前，于第10天分別對(duì)兩組細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)性Y δ T細(xì)胞數(shù)量含量的檢測(cè)；
(4)調(diào)節(jié)性γδ T細(xì)胞數(shù)量含量檢測(cè)收集步驟(3)中的細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè) δ T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性 δ T細(xì)胞數(shù)量含量，以F0XP3和T細(xì)胞受體γ δ (TCR γ δ )雙陽性細(xì)胞作為調(diào)節(jié)性Y δ T細(xì)胞的表型特征，TCR γ δ陽性作為Υ δ T細(xì)胞的表型特征，并根據(jù)以下公式計(jì)算調(diào)節(jié)性、δ T細(xì)胞占總、δ T細(xì)胞的數(shù)量百分含量
調(diào)節(jié)性Y δ T細(xì)胞數(shù)量百分含量(％)= F0XP3和TCR γ δ雙陽性細(xì)胞/ (FOXP3和 TCR γ δ雙陽性細(xì)胞+ F0XP3陰性TCR γ δ單陽性細(xì)胞)X 100 ；
(5)調(diào)節(jié)性γδ T細(xì)胞富集采用免疫磁珠陽性分選(MACS)方法無菌分選TCR γ δ 陽性細(xì)胞群，該群細(xì)胞內(nèi)富含調(diào)節(jié)性Y S T細(xì)胞；
(6)富集后細(xì)胞狀態(tài)和活力檢測(cè)富集后細(xì)胞加用IL-2、IL-15和TGF-β1細(xì)胞因子繼續(xù)培養(yǎng)2天后用倒置相差顯微鏡和臺(tái)盼蘭染色查看細(xì)胞狀態(tài)和活力，以細(xì)胞透亮度好、形態(tài)不規(guī)則和聚集成團(tuán)作為細(xì)胞生長狀態(tài)佳的標(biāo)準(zhǔn)；臺(tái)盼蘭染色觀察細(xì)胞活力時(shí)，死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染，并根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞活力 活細(xì)胞率(％)=活細(xì)胞總數(shù)/ (活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))XlOO
本發(fā)明是通過應(yīng)用細(xì)胞因子聯(lián)合DNA去甲基化藥物地西他濱協(xié)同誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性γ δ T 細(xì)胞的生成和采用MACS陽性分選的富集過程，并在富集后進(jìn)行細(xì)胞生長狀態(tài)及活力檢測(cè)以確保用于下一步實(shí)驗(yàn)。其具有如下特點(diǎn)(1)誘導(dǎo)和富集過程簡(jiǎn)單易行，周期短，成本低廉；(2)誘導(dǎo)效率高，重復(fù)性好；(3)富集后細(xì)胞活力好，富集后細(xì)胞數(shù)量和活力均能保證下一步的體內(nèi)和體外研究，能為明確調(diào)節(jié)性Y δ T細(xì)胞的生物學(xué)特性提供很好的研究平臺(tái)， 具有很好的推廣價(jià)值。


圖1是單用細(xì)胞因子和唑睞磷酸的常規(guī)方法誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性Y δ T細(xì)胞的流式分析圖。圖2是用細(xì)胞因子、唑睞磷酸聯(lián)合DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑地西他濱(0. 5 μ mol/ ml)的改進(jìn)方法誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性Y δ T細(xì)胞的流式分析圖。圖3是改進(jìn)方法誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞在經(jīng)MACS陽性分選富集后的流式分析圖。圖4是改進(jìn)方法誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞在第12天未經(jīng)MACS分選的細(xì)胞生長狀態(tài)圖。圖5是改進(jìn)方法誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)MACS陽性分選后培養(yǎng)2天的細(xì)胞生長狀態(tài)圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞因子均購自美國PeproTech公司，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)用單克隆熒光抗體購自eBioscience公司，唑睞膦酸(商品名擇泰)為諾華制藥有限公司贈(zèng)送，地西他濱 (商品名達(dá)珂)為西安楊森制藥有限公司贈(zèng)送，YS T細(xì)胞MACS分選試劑盒購自德國美天旎生物技術(shù)公司。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)了 5名正常志愿者外周血標(biāo)本，均取得了類似效果。實(shí)施例1:調(diào)節(jié)性Y δ T細(xì)胞的誘導(dǎo)
(1)在15ml離心管中加入7ml淋巴細(xì)胞分離液；
(2)取肝素抗凝靜脈血10ml與等量Hank’ s液充分混勻，用滴管沿管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面，水平離心600gX20分鐘；
(3)離心后見管內(nèi)分為三層，上層為血漿和Hank’s液，下層主要為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞，中層為淋巴細(xì)胞分離液，在上、中層界面處有一以單個(gè)核細(xì)胞為主的白色云霧層狹窄帶；
4(4)用滴管插到云霧層，吸取單個(gè)核細(xì)胞，置入另一15ml離心管中，加入5倍體積的 Hank's液，300gX5分鐘離心，洗滌細(xì)胞2次；
(5)末次離心后，棄上清，加入含有10%胎牛血清和1%雙抗的完全RPMI1640培養(yǎng)液， 重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至4X 106/ml ；
(6)將細(xì)胞接種于M孔板，分為常規(guī)方法誘導(dǎo)組和改進(jìn)方法誘導(dǎo)組，各組分別設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，每孔1ml，各孔于第0天加用細(xì)胞因子和唑睞膦酸，量及終濃度如表1所示；改進(jìn)方法誘導(dǎo)組各孔于第1天加用地西他濱，量如表1所示，終濃度為0. 5 μ mol/L ；接著于第3、6、 9天兩組細(xì)胞各孔均進(jìn)行半量換液，每孔去除0. 5ml培養(yǎng)液，再加入新鮮含10%胎牛血清的 PRMI 1640完全培養(yǎng)液0.5ml，并加入細(xì)胞因子，各孔細(xì)胞因子量見表2。各種細(xì)胞因子儲(chǔ)存濃度IL-2為10000U/ml，IL-15為10 μ g/ml，TGF_3 1為1 μ g/ml ；地西他濱儲(chǔ)存濃度為 lmmol/ml ；唑睞膦酸儲(chǔ)存濃度為56mmol/ml。
權(quán)利要求
1.一種調(diào)節(jié)性Y δ T細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，其特征在于通過以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)人單個(gè)核細(xì)胞制備取外周血標(biāo)本，肝素抗凝，應(yīng)用人淋巴細(xì)胞分離液分離制備外周血單個(gè)核細(xì)胞，用含10%胎牛血清完全RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞；(2)單個(gè)核細(xì)胞分組將所獲得的單個(gè)核細(xì)胞隨機(jī)分為常規(guī)方法誘導(dǎo)組和改進(jìn)方法誘導(dǎo)組，常規(guī)方法誘導(dǎo)組為單用細(xì)胞因子和唑睞磷酸誘導(dǎo)，改進(jìn)方法誘導(dǎo)組為細(xì)胞因子、唑睞磷酸聯(lián)合地西他濱協(xié)同誘導(dǎo)，兩組細(xì)胞分別設(shè)置3個(gè)復(fù)孔；(3)調(diào)節(jié)性γδ T細(xì)胞誘導(dǎo)步驟(1)中所制備的單個(gè)核細(xì)胞接種當(dāng)日按第0天計(jì)算， 兩組細(xì)胞分別在第0天加用唑睞膦酸，加用白介素_2、白介素-15和轉(zhuǎn)化生長因子-β 1細(xì)胞因子，第1天在改進(jìn)方法誘導(dǎo)組中加入地西他濱，接著兩組細(xì)胞分別于第3、6、9天進(jìn)行半量換液，每次換液時(shí)加入新鮮白介素_2、白介素-15和轉(zhuǎn)化生長因子- β 1細(xì)胞因子，于第 10天分別對(duì)兩組細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)性Y δ T細(xì)胞數(shù)量含量的檢測(cè)；(4)調(diào)節(jié)性γδ T細(xì)胞數(shù)量含量檢測(cè)收集步驟(3)中的細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)Y δ T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性γ δ T細(xì)胞數(shù)量含量，以叉頭蛋白3和T細(xì)胞受體γ δ雙陽性細(xì)胞作為調(diào)節(jié)性Y δ T細(xì)胞的表型特征，TCR γ δ陽性作為Υ δ T細(xì)胞的表型特征，并根據(jù)以下公式計(jì)算調(diào)節(jié)性Y δ T細(xì)胞占總γ δ T細(xì)胞的數(shù)量百分含量調(diào)節(jié)性Y δ T細(xì)胞數(shù)量百分含量(％)=叉頭蛋白3和TCR γ δ雙陽性細(xì)胞/ (叉頭蛋白3和TCR γ δ雙陽性細(xì)胞+叉頭蛋白3陰性TCR γ δ單陽性細(xì)胞)X 100 ；(5)調(diào)節(jié)性、δT細(xì)胞富集采用免疫磁珠陽性分選方法無菌分選TCR γ δ陽性細(xì)胞群，該群細(xì)胞內(nèi)富含調(diào)節(jié)性Y S T細(xì)胞；(6)富集后細(xì)胞狀態(tài)和活力檢測(cè)富集后細(xì)胞加用白介素_2、白介素-15和轉(zhuǎn)化生長因子- β 1細(xì)胞因子繼續(xù)培養(yǎng)2天后用倒置相差顯微鏡和臺(tái)盼蘭染色查看細(xì)胞狀態(tài)和活力。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種調(diào)節(jié)性Yδ T細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，其特征在于步驟 (6)以細(xì)胞透亮度好、形態(tài)不規(guī)則和聚集成團(tuán)作為細(xì)胞生長狀態(tài)佳的標(biāo)準(zhǔn)；臺(tái)盼蘭染色觀察細(xì)胞活力時(shí)，死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染，并根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞活力活細(xì)胞率(％)=活細(xì)胞總數(shù)/ (活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))XlOO。
全文摘要
本發(fā)明提供一種調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，涉及調(diào)節(jié)性γδT細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法。本發(fā)明是通過應(yīng)用細(xì)胞因子聯(lián)合DNA去甲基化藥物地西他濱協(xié)同誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性γδT細(xì)胞的生成和采用MACS陽性分選的富集過程，并在富集后進(jìn)行細(xì)胞生長狀態(tài)及活力檢測(cè)以確保用于下一步實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明方法誘導(dǎo)和富集過程簡(jiǎn)單易行，周期短，成本低廉；誘導(dǎo)效率高，重復(fù)性好；富集后細(xì)胞活力好，富集后細(xì)胞數(shù)量和活力均能保證下一步的體內(nèi)和體外研究，能為明確調(diào)節(jié)性γδT細(xì)胞的生物學(xué)特性提供很好的研究平臺(tái)，具有很好的推廣價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N5/0783GK102168067SQ20111003568
公開日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2011年2月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月11日
發(fā)明者吳康妮, 胡永仙, 黃河 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)