專利名稱：從hPS細(xì)胞來源的定形內(nèi)胚層誘導(dǎo)獲得特定內(nèi)胚層的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及控制人多潛能干細(xì)胞包括人胚泡來源的干(hBS)細(xì)胞分化和獲得特定內(nèi)胚層細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
前腸衍生器官胰、肺、甲狀腺、肝、食道和胃起源于定形內(nèi)胚層，內(nèi)胚層為原腸胚形成期間形成的三個胚層之一。特異性轉(zhuǎn)錄因子沿著定形內(nèi)胚層的前部和后部軸(A-P軸) 以特定的方式表達(dá)，定形內(nèi)胚層最終形成原始消化道。Forkhead框Al (FOXAl)和F0XA2 兩者均表達(dá)于整個消化道并且因而對于所有胃腸道來源的器官的發(fā)育是重要的(Ang等人，1993)。在前腸內(nèi)胚層的前面部分中，注定變成肺和甲狀腺的區(qū)域表達(dá)NK2同源框
I(NKX2. I)，而肝發(fā)育自表達(dá)造血表達(dá)的同源框(HHEXl)的區(qū)域。胰和十二指腸起源自表達(dá)胰十二指腸同源框(PDX-I)的前腸內(nèi)胚層的后面部分。消化道內(nèi)胚層的后面部分發(fā)育成為中腸和后腸，中腸和后腸變成小腸和大腸，表達(dá)尾型同源框I (CDXl)和CDX2。成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)家族控制發(fā)育的許多方面，例如細(xì)胞遷移、增殖和分化。至少有四種與具有不同親和力的不同F(xiàn)GF配體結(jié)合的不同酪氨酸激酶受體 (FGFR1-FGFR4)。此外，F(xiàn)GFR1-FGFR3的選擇性剪接產(chǎn)生具有單獨表達(dá)模式和配體特異性的“Illb”和“IIIc”同工型。FGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及沿著A-P軸和在胰分化期間消化道的成型 (patterning)。涉及小鼠胚和雞胚外植體的在先研究已經(jīng)證實FGFl和FGF2由心臟中胚層分泌并且其可被這些因子的外源性加入代替。在胚胎發(fā)生的早期，腹部內(nèi)胚層與心臟中胚層相鄰，而背部內(nèi)胚層與脊索接觸。心臟中胚層對于肝和肺發(fā)育是必需的。特別地，F(xiàn)GF2使多能腹部前腸內(nèi)胚層以濃度依賴性方式成型為肝和肺，而心臟中胚層和FGF的缺失則促進(jìn)胰形成。盡管FGF2的存在對于腹胰發(fā)育不是絕對必需的，但已證實FGF2在背胰形成期間的誘導(dǎo)性作用。背部內(nèi)胚層最初與分泌激活蛋白β B和FGF2的脊索接觸，導(dǎo)致Shh表達(dá)的抑制，這對Pdxl表達(dá)和背胰發(fā)育是必需的。此外，低水平的FGF2誘導(dǎo)培養(yǎng)的小雞背部內(nèi)胚層中Pdxl的表達(dá)。此外，F(xiàn)GF2還暗示對正在發(fā)育的胰中的胰上皮細(xì)胞的增殖具有誘導(dǎo)作用并且在成年鼠β細(xì)胞中與其它FGF共同表達(dá)。I型糖尿病的普遍性增加以及尸體器官供體胰島(cadaveric donor islet)的缺乏使得對于開發(fā)如下方案引發(fā)了極大興趣用于指導(dǎo)人胚泡干細(xì)胞(hBS細(xì)胞)分化成產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞。為更好理解ES細(xì)胞向胰內(nèi)胚層和表達(dá)胰島素的細(xì)胞的細(xì)胞命運特化的分子機(jī)制，需要精細(xì)的培養(yǎng)條件。盡管已公布了大量報道體外從hPS細(xì)胞獲得產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞的分化方案，沒有一種描述了用于分化過程的單個生長因子的特定作用或討論了潛在的分子機(jī)制。此外，還不清楚這些表達(dá)胰島素的細(xì)胞是否代表真正的β細(xì)胞。為理解 hPS細(xì)胞來源的定形內(nèi)胚層轉(zhuǎn)變成Η)Χ1陽性β祖細(xì)胞，我們檢驗了 FGF2的作用。我們的結(jié)果表明在不存在外源性FGF2的情況下，定形內(nèi)胚層分化成以肝細(xì)胞和腸樣細(xì)胞為特征的前腸和中腸內(nèi)胚層。重要的是，外源性加入的FGF2以劑量依賴性方式使 hPS細(xì)胞來源的定形內(nèi)胚層成型。特別地，在對不同濃度FGF2的應(yīng)答中，生成肝的、胰的、腸的和前部前腸祖先。此外，生長因子的逐步加入使我們得以進(jìn)一步剖析調(diào)節(jié)胰特化的分子程序，顯示胰祖先/roxi表達(dá)的誘導(dǎo)依賴于MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中FGF2介導(dǎo)的激活。這是首次將FGF2單獨與hPS細(xì)胞來源的胰內(nèi)胚層的分化相關(guān)聯(lián)；在此之前，用于獲得胰內(nèi)胚層的方法依賴于在生長因子例如FGF成員與視黃酸酯的組合存在下(參見WO 07/127927)或在這些生長因子與另外的培養(yǎng)基補(bǔ)充物例如B27 (W0 09/012428)存在下培養(yǎng)細(xì)胞。此處顯示的數(shù)據(jù)因此將有助于開發(fā)用于誘導(dǎo)hPS細(xì)胞成為前部內(nèi)胚層和后部內(nèi)胚層衍生器官肺、 食道、胃、肝、胰和腸的新的可重現(xiàn)的方案。如上所述，當(dāng)前有關(guān)hPS細(xì)胞分化成胰的認(rèn)識主要包括對小雞、小鼠和有限程度的人細(xì)胞的研究。盡管已經(jīng)報道了 hPS細(xì)胞分化方案，但還不清楚這些表達(dá)胰島素的細(xì)胞是否代表真正的β細(xì)胞，這是由于它們的低胰島素含量和缺乏生理學(xué)上葡萄糖介導(dǎo)的胰島素釋放。各種方案在生長因子組成、濃度和加入時間方面存在差異，這一事實表明有必要精確限定在該分化過程中單個生長因子的特定作用和作用模式，以便提供控制細(xì)胞分化的方法。發(fā)明描述本發(fā)明涉及將特定濃度的FGF2用作關(guān)鍵因子以控制從hPS細(xì)胞來源的定形內(nèi)胚層細(xì)胞分化成特定內(nèi)胚層細(xì)胞。本發(fā)明還提供獲得內(nèi)胚層細(xì)胞的方法，所述方法包括FGFR的使用和MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活。如圖IA所圖示描述的，分化程序可包括一個或多個步驟，例如兩步，其包括第一步，指導(dǎo)向定形內(nèi)胚層的分化，而第二步是指導(dǎo)向特定內(nèi)胚層的進(jìn)一步分化。促進(jìn)分化成定形內(nèi)胚層的第一步可包括在第一步期間更換的不同的生長培養(yǎng)基組合物，如圖IA所圖示描述且如實施例2所例證的。本發(fā)明優(yōu)先涉及從定形內(nèi)胚層細(xì)胞開始的第二步。為指導(dǎo)向特定內(nèi)胚層細(xì)胞的分化，需要大量的條件以確保生長和生存力。此外需要作為生長因子的關(guān)鍵組分以控制分化。在本發(fā)明中，通過使定形內(nèi)胚層細(xì)胞接受不同濃度的成纖維細(xì)胞生長因子FGF2， 將定形內(nèi)胚層細(xì)胞的分化定向成為某些類型的特定內(nèi)胚層細(xì)胞。低濃度的FGF2產(chǎn)生肝內(nèi)胚層細(xì)胞，中等濃度的FGF2產(chǎn)生胰內(nèi)胚層細(xì)胞，而相對高濃度的FGF2產(chǎn)生腸和/或肺內(nèi)胚層細(xì)胞或其混合物。FGF2的濃度是培養(yǎng)基中的濃度且范圍為O. I至500ng/ml。為引導(dǎo)向肝細(xì)胞命運的分化，可按O. l-16ng/ml或O. l-10ng/ml的范圍在培養(yǎng)基中加入FGF2。這導(dǎo)致表達(dá)AFP的肝內(nèi)胚層細(xì)胞的產(chǎn)生，并且一種或多種選自以下的標(biāo)記表達(dá)于肝內(nèi)胚層細(xì)胞F0XA2、白蛋白(ALB)、HNF4A、HNF6 (0NECUT1)、ProxI、CKl7、CK19、Hex、 FABp I、AAT、Cyp7A1、Cyp3A4、Cyp3A7 和 Cyp2B6。通常肝內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)以下標(biāo)記AFP、ALB、 HNF6和HNF4A和/或AFP、HNF4A、Proxl。在本發(fā)明的一方面，F(xiàn)GF2濃度的范圍為4ng/ml 至6ng/ml,例如5ng/ml,且特定內(nèi)胚層細(xì)胞為肝內(nèi)胚層細(xì)胞。通常，肝內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)AFP并且所得到的肝內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)上述標(biāo)記的至少4 種、至少5種、至少6種例如至少7種、至少8種、至少8種、至少9種、至少10種、至少11 種、至少12種或全部。如本文所公開的，通過使定形內(nèi)胚層細(xì)胞接受低濃度的FGF2(0. l_16ng/ml)獲得的肝內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)AFP、ALB、ONECUTI、HNF4A。
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基于形態(tài)學(xué)研究，在僅用激活蛋白A或低濃度例如4ng/mlFGF2處理的培養(yǎng)物中， 清楚觀察到肝細(xì)胞樣細(xì)胞，而在較高濃度例如16-256ng/ml的FGF2卻未觀察到這些細(xì)胞。 此外，隨著FGF2濃度的增加，集落變得更密且出現(xiàn)稠密的簇。如圖I. B)所說明的，表達(dá)白蛋白(ALB)的細(xì)胞的量隨著FGF2濃度的增加而減少。 此外，抗體染色(未顯示)表明ALB和AFP —致的共表達(dá)。與僅用激活蛋白A處理的參考樣品相比，肝細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記ALB、HNF4A和ONECUT隨著FGF濃度增加而下調(diào)。因而本發(fā)明的一方面涉及FGF2控制(即促進(jìn)或抑制)hPS細(xì)胞向肝細(xì)胞命運的分化的用途。為引導(dǎo)DE-細(xì)胞向胰內(nèi)胚層的分化，當(dāng)按16-150ng/ml的范圍,例如64ng/ml加入培養(yǎng)基時，F(xiàn)GF2刺激胰內(nèi)胚層細(xì)胞的形成。得到的胰內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)PDX-I和一種或多種如下標(biāo)記 NGN3、CPAl、S0X9、HNF6、HNFI b、E-鈣黏著蛋白、MNXl、PTFIA 和 NKX6-1。通常胰內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)I3DXl和上述標(biāo)記中的至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、 至少7種、至少8種或全部。從本文的實施例可看出，得到的胰內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)roxi和NKX6-1、和/或TOX1、 S0X9、ONECUTI和 F0XA2。此外，胰內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)至少一種選自胰島素、胰高血糖素、促生長素抑制素、胰多肽和ghrelin的胰激素。為引導(dǎo)定形內(nèi)胚層細(xì)胞向腸和/或肺內(nèi)胚層分化，按150_500ng/ml的范圍向培養(yǎng)基加入FGF2。得到的腸內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)⑶X2和一種或多種如下標(biāo)記⑶Xl、F0XA2、PITX2、 FABp2、TCF4、絨毛蛋白和MNX1。通常，得到的腸內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)⑶Xl和上述標(biāo)記的至少2 種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種或全部。從本文的實施例中顯示得到的腸內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)⑶XI、⑶X2和MNXl。得到的肺內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)一種或多種如下標(biāo)記NKX2-1、SHH、PTCHU FGFlO和 SPRY2。通常，得到的肺內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)上述標(biāo)記的至少2種、至少3種或全部。得到的前部前腸內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)S0X2。當(dāng)FGF2以150_500ng/ml的濃度使用時，預(yù)期主要使用范圍內(nèi)下端濃度獲得腸內(nèi)胚層細(xì)胞，而主要使用范圍內(nèi)上端濃度獲得肺內(nèi)胚層細(xì)胞。還可獲得腸內(nèi)胚層細(xì)胞和肺內(nèi)胚層細(xì)胞的混合物。用于獲得特定內(nèi)胚層細(xì)胞的原材料是定形內(nèi)胚層細(xì)胞。定形內(nèi)胚層細(xì)胞可通過依據(jù)合適方案(參見例如圖IA的前兩列)或?qū)嵤├?處理hPS細(xì)胞而獲得，或定形內(nèi)胚層可通過其它類型的多潛能細(xì)胞系例如iPS細(xì)胞或顯示分化成定形內(nèi)胚層的潛能的細(xì)胞而獲得。定形內(nèi)胚層細(xì)胞的特征為表達(dá)以下標(biāo)記S0X17、F0XA2、CXCR4以及標(biāo)記S0X7的下調(diào)。更具體地，定形內(nèi)胚層細(xì)胞在蛋白質(zhì)水平共表達(dá)S0X17和CXCR4;且顯示 cereberus、Foxa2、GSC、HHEX的基因表達(dá)。在激活蛋白A處理的樣品中0ct_4在第3天被下調(diào)(參照實施例3)。在上述選擇濃度的FGF2存在下，將定形內(nèi)胚層細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)， 以便指導(dǎo)定形內(nèi)胚層細(xì)胞發(fā)育成為特定內(nèi)胚層細(xì)胞，參照上述。更多詳情在本文的實施例中給出。簡言之，定形內(nèi)胚層細(xì)胞的分化通過在含有FGF的合適培養(yǎng)基(例如KO-DMEM培養(yǎng)基)中培養(yǎng)多至20天例如8-12天來誘導(dǎo)，培養(yǎng)基任選含有抗生素(例如青霉素-鏈霉素例如按I %的濃度)、通常存在于培養(yǎng)基中的一種或多種營養(yǎng)物或其它物質(zhì)(例如1%的 Glutamax、I %非必需氨基酸、O. ImM β -巰基乙醇)和knockout血清替代品(例如10-15% 例如12% )。培養(yǎng)基保持新鮮并具有隨時間一致的濃度水平。本發(fā)明的重大方面是發(fā)現(xiàn)了僅FGF2足以誘導(dǎo)胰特異性基因和，其提供了精確而簡單干細(xì)胞分化指南。如圖2所說明的，在所有用FGF2處理的樣品中，PDXU S0X9和NGN3被上調(diào)，下述情況除外當(dāng)僅用4ng/ml FGF2處理樣品時，與對照樣品相比I3DXl保持不變。當(dāng)用64ng/ ml FGF2處理時，NGN3被上調(diào)，但比32ng/ml FGF2和256ng/ml FGF2的程度較低，這可能表明TOX1/NKX6-1和NGN3的表達(dá)之間的負(fù)相關(guān)或可能表明在64ng/ml FGF2下TOX1/NKX6. 1+ 細(xì)胞的存在比表達(dá)更高水平NGN3的細(xì)胞更豐富。在加入約64ng/ml濃度的FGF2樣品中， NKX6-1和roxi兩者顯示峰值表達(dá)。在64ng/ml FGF2的PDXl+集落的免疫熒光染色顯示相應(yīng)的模式，這進(jìn)一步支持這些觀察結(jié)果。此外，明顯的是所有I3DXl+細(xì)胞為S0X9、ONE⑶Tl 和F0X2A陽性，而對于腸標(biāo)記⑶X2和增殖標(biāo)記PH-3，大部分TOXl+細(xì)胞為陰性。一些表達(dá) PDXl和NKX6-1兩者的細(xì)胞可存在于roxi陽性集落內(nèi)。為使得DE細(xì)胞有效分化成特定內(nèi)胚層細(xì)胞，向DE細(xì)胞加入不同濃度的FGF2。為顯示響應(yīng)FGF2濃度的轉(zhuǎn)錄變化，通過RNA分析監(jiān)測表達(dá)模式。如圖3所描述的，該結(jié)果清楚顯示FGF2指導(dǎo)分化，這是因為包括NKX2-1、SHH、PTCHl、SPRY2和FGFlO的肺相關(guān)標(biāo)記以及小腸標(biāo)記⑶X2和MNXl均顯示明顯的上調(diào)并且在256ng/ml FGF2處峰值表達(dá)。與⑶X2 相反，小腸標(biāo)記CDXl在測試范圍內(nèi)仍未受FGF2水平的影響。在256ng/ml FGF2的TOXl陽性群的支持性免疫熒光研究進(jìn)一步顯示所有I3DXl陽性細(xì)胞均為S0X9和ONE⑶Tl陽性，而僅少數(shù)PDXl+細(xì)胞為⑶X2陽性。PDXl+細(xì)胞無一共同表達(dá)NKX6-1或S0X2。此外，S0X2+細(xì)胞為CDX2陰性。此外，當(dāng)在256ng/ml FGF2生長時，免疫熒光雙重染色顯示幾乎所有的⑶X2陽性細(xì)胞共表達(dá)F0XA2，而僅一些⑶X2+細(xì)胞表達(dá)MKI67。如圖4A所描述的，F(xiàn)GF2以劑量依賴性方式影響FGFR(FGF-受體)基因的轉(zhuǎn)錄。從圖4A可明顯看出，在響應(yīng)增加的FGF2濃度中，F(xiàn)GFRl和-3被上調(diào)，而由于增加的FGF2水平，F(xiàn)GFR2和-4顯示相反的機(jī)制，其轉(zhuǎn)錄水平下降。本發(fā)明還提供i)用于制備肝內(nèi)胚層細(xì)胞的方法，所述方法包括將定形內(nèi)胚層細(xì)胞孵育在含有O. I至16ng/ml FGF2的培養(yǎng)基中約6至20天例如6至8天或9至12天，ii) 通過此方法可獲得的肝內(nèi)胚層細(xì)胞和iii)通過此方法獲得并具有本文所限定的特征的肝內(nèi)胚層細(xì)胞。此外，本發(fā)明還提供i)用于制備胰內(nèi)胚層細(xì)胞的方法，所述方法包括在含有16至 150ng/ml FGF2的培養(yǎng)基中將定形內(nèi)胚層細(xì)胞孵育約2至20天例如6至8天，ii)通過此方法可獲得的胰內(nèi)胚層細(xì)胞和iii)通過此方法獲得并具有本文所限定的特征的胰內(nèi)胚層細(xì)胞。此外，本發(fā)明還提供i)用于制備腸和/或肺內(nèi)胚層細(xì)胞的方法，所述方法包括將定形內(nèi)胚層細(xì)胞在含有150至500ng/ml FGF2的培養(yǎng)基中孵育約6至20天例如6至8天，ii)通過此方法可獲得的腸和/或肺內(nèi)胚層細(xì)胞和iii)通過此方法獲得并具有本文所限定的特征的腸和/或肺內(nèi)胚層細(xì)胞。假定，用于制備肝、胰或腸內(nèi)胚層細(xì)胞的方法包括誘導(dǎo)FGFR，值得注意的是FGFR 為 FGFRl、FGFR2、FGFR3 和 / 或 FGFR4。通過向定形內(nèi)胚層細(xì)胞的培養(yǎng)物加入FGF來誘導(dǎo)FGFR。合適的FGF可單獨選自 FGF2或與選自以下的第二 FGF結(jié)合FGF4、FGF7和FGFlO及其任何結(jié)合。申請人進(jìn)行的研究已顯示FGF4、FGF7和FGF10，當(dāng)替代FGF2單獨使用時，都不能夠誘導(dǎo)hPS-來源的定形內(nèi)胚層向PDX-I陽性胰內(nèi)胚層分化。如圖4B和C所述，可想象MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑由FGFR誘
導(dǎo)激活。附圖簡述圖LA)向特定內(nèi)胚層的兩步分化程序的圖示。分化方案分成兩步第一步指導(dǎo)向定形內(nèi)胚層的分化，而第二步指導(dǎo)向特定內(nèi)胚層的分化。B)與僅用激活蛋白A處理的對照樣品相比，肝細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記ALB、HNF4A和0NECUT1隨著增加的FGF2濃度(ng/ml)均被下調(diào)。由于HHEX還在前部前腸內(nèi)胚層中表達(dá)，因此在最高FGF2濃度256ng/ml下，HHEX與其它肝標(biāo)記被下調(diào)的程度不同。在第11天，獲取樣品用于實時PCR分析。數(shù)據(jù)表示為均值表達(dá)+/-SEM(n = 4)。這些圖表示第11天與在對照樣品中檢測到的相比的倍數(shù)增加。對照樣品任意設(shè)置為數(shù)值I。圖2. A) FGF2足以用于誘導(dǎo)胰特異性基因。I3DXl、S0X9和NGN3在所有FGF2處理的樣品中被上調(diào)，下述情況除外當(dāng)僅用4ng/ml FGF2處理時，PDXl與對照樣品相比保持不變。當(dāng)用64ng/ml處理時，NGN3被上調(diào)但程度比32ng/ml和256ng/ml低，這可能表明PDXl/ NKX6-1和NGN3表達(dá)之間的負(fù)相關(guān)，或者可能表明在64ng/ml FGF2下，PDX1/NKX6. 1+細(xì)胞比表達(dá)更高水平NGN3的細(xì)胞存在更加豐富。NKX6-1僅在64ng/ml下被上調(diào)。I3DXl和NKX6-1 在64ng/ml下具有峰值表達(dá)。在所有樣品中均檢測到F0XA2和CPAl并且保持不變。在第 11天，獲取樣品用于實時PCR分析。數(shù)據(jù)表示為均值表達(dá)+/-SEM(η = 4)。這些圖表示第 11天與在對照樣品中檢測到的相比的倍數(shù)增加。對照樣品任意設(shè)置為數(shù)值I。B)用不同F(xiàn)GF2濃度處理的hPS細(xì)胞的定量TOXl免疫熒光染色。僅用激活蛋白 A或4ng/ml FGF2處理的培養(yǎng)物中，不存在I3DXl+細(xì)胞，而在用32、64和256ng/ml FGF2處理的培養(yǎng)物中，總存在I3DXl+細(xì)胞。在64ng/ml處觀察到roxi+細(xì)胞的最高百分比。這通過顯微術(shù)和Imaris成像軟件的使用而評估，如圖2B)中的條柱所定量的。數(shù)據(jù)表示為均值+SEM (n = 7-10)。獲得以下P-值對照對比32ng/ml (P < 0.01),對照對比64ng/ml (P < O. 001)，對照對比 256ng/ml (P < O. 001)，32ng/ml 對比 64ng/ml (P < O. 001)，32ng/ml 對比 256ng/ml (P < O. 01)和 64ng/ml 對比 256ng/ml (P < O. 01)。認(rèn)為 P < O. 05 是顯著的。圖3.肺和腸特異性標(biāo)記的RNA分析。在256ng/ml下前部前腸特異性標(biāo)記S0X2 被顯著上調(diào)，而肺相關(guān)標(biāo)記例如NKX2-1、SHH、PTCHl、SPRY2和FGFlO均在256ng/ml下具有峰值表達(dá)。小腸標(biāo)記⑶Xl保持未受影響，然而另一小腸標(biāo)記⑶X2，和MNXl兩者均在256ng/ ml下被上調(diào)。在第11天獲取樣品用于實時PCR分析。數(shù)據(jù)表示為均值表達(dá)+/-SEM(η = 4)。這些圖表示第11天與在對照樣品中檢測到的相比的倍數(shù)增加。對照樣品任意設(shè)置為數(shù)值I。 圖4. A)在第11天的FGF受體表達(dá)。FGFRl和FGFR3的表達(dá)隨著FGF2濃度升高而被上調(diào)，同時FGFR2和4被下調(diào)。用于實時PCR分析的所有樣品均在第11天獲取。數(shù)據(jù)表示為均值表達(dá)+/_SEM，n = 3-4。這些圖表示第11天與在對照樣品中檢測到的相比的倍數(shù)增加。對照樣品任意設(shè)置為數(shù)值I。B)由FGF2激活的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以及它們相應(yīng)抑制劑的示意圖，用紅色表示。C)體外FGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制減少roxi的表達(dá)。用SU5402 (10 μ M)或MAPK 抑制劑υ 026(10μΜ)拮抗FGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致roxi表達(dá)顯著減少而用PI3K抑制劑 LY294002(12. 5μΜ)處理對TOXl表達(dá)沒有顯著影響。數(shù)據(jù)表示為均值表達(dá)+/_SEM，η = 4-6。這些圖表示第11天與在對照樣品中檢測到的相比的倍數(shù)增加。對照樣品任意設(shè)置為數(shù)值I。D)顯示產(chǎn)生肝、胰和肺所需不同的FGF2閾值示意圖。低FGF2濃度促進(jìn)向肝細(xì)胞樣細(xì)胞(由ALB的表達(dá)表示)的分化，而中等FGF2水平使hPS細(xì)胞來源的前腸內(nèi)胚層分化成胰(由I3DXl的表達(dá)表示)，而高濃度促進(jìn)向肺和腸細(xì)胞的分化(由NKX2-1和CDX2的表達(dá)表示)。圖5.使用4種不同細(xì)胞系在4組獨立實驗中對Η)Χ、ΝΚΧ6-1和ALb的RNA表達(dá)分析。在所有實驗中，與對照(僅AA處理)相比，在FGF2處理的樣品中roxi表達(dá)被上調(diào)，在 256ng/ml處除外，在此處，PDXl表達(dá)被下調(diào)或無表達(dá)。此外，PDXl的峰值表達(dá)總在64ng/ ml處。隨著FGF2濃度升高，NKX6-1表達(dá)也被上調(diào)，然而，在SA121tryp、HUES-4和HUES15 中，在256ng/ml處未被上調(diào)，在第11天在HUES-3和SA181tryp中是這種情況。隨著FGF2 濃度升高，Alb表達(dá)一致地被下調(diào)。上組顯示來自細(xì)胞系SA181tryp、SAl2Itryp的數(shù)據(jù)， 下組HUES-4和HUES15。在第11天，獲取樣品用于實時PCR分析。數(shù)據(jù)表示為均值表達(dá) +/-SEM(n = 2-3)。這些圖表示第11天與在對照樣品中檢測到的相比的倍數(shù)增加。對照樣品任意設(shè)置為數(shù)值I。圖6.用于PCR和基因表達(dá)分析的基因特異性引物列表。圖7.定形內(nèi)胚層、肝內(nèi)胚層、胰內(nèi)胚層和腸內(nèi)胚層細(xì)胞標(biāo)記特征?？s寫AA;激活蛋白A白蛋白(ALB)甲胎蛋白(AFP)尾型同源框2(CDX2)趨化因子(C-X-C基序)受體4 (CXCR4)定形內(nèi)胚層(DE)FBS ;胎牛血清FGF2 ;成纖維細(xì)胞生長因子2成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)Forkhead 框 A2 (F0XA2)造血表達(dá)的同源框(HHEX)肝細(xì)胞核因子4，a (HNF4A)
hBS細(xì)胞；人胚泡來源的干細(xì)胞hPS細(xì)胞；人多潛能干細(xì)胞KO-SR ；knockout 血清替代品胰和十二指腸的同源框I (roxi)運動神經(jīng)元和胰同源框I(MNXl)NK2 同源框 I (NKX2-1)NK6 同源框 I (NKX6-1)音猬同系物(果蠅屬)(SHH)，SRY (性別決定區(qū) Y)-框 9 (S0X9)SRY(性別決定區(qū) Y)-框 17(S0X17)定義本文所用的"人多潛能干細(xì)胞"(hPS)指可來源于任何來源的細(xì)胞，其在適當(dāng)條件下能夠產(chǎn)生不同細(xì)胞類型的人子代，所述細(xì)胞類型為全部3個胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)的衍生物。hPS細(xì)胞在8-12周齡SCID小鼠中可具有形成畸胎瘤的能力和/或在組織培養(yǎng)物中形成全部3個胚層的可識別細(xì)胞的能力。包括在人多潛能干細(xì)胞定義中的有各種類型的胚胎細(xì)胞，包括在文獻(xiàn)中常表示為人胚胎干(hES)細(xì)胞的人胚泡來源的干(hBS) 細(xì)胞(參見例如，Thomson等人(1998),Heins等人·(2004),以及誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞(參見例如 Yu 等人，(2007) Science 318 :5858) ;Takahashi 等人，(2007) Cell 131(5) :861)。 本文描述的各種方法和其它實施方案可需要或利用來自各種來源的hPS細(xì)胞。例如，適合使用的hPS細(xì)胞可從正在發(fā)育的胚胎得到。除此之外或作為選擇，合適的hPS細(xì)胞可從建立的細(xì)胞系和/或誘導(dǎo)的人多潛能干(hiPS)細(xì)胞獲得。本文所用的"hiPS細(xì)胞"指誘導(dǎo)的人多潛能干細(xì)胞。本文所用術(shù)語"胚泡來源的干細(xì)胞"表示為BS細(xì)胞，且將人的形式稱為"hBS細(xì)胞"。在文獻(xiàn)中該細(xì)胞通常稱為胚胎干細(xì)胞，且更具體地為人胚胎干細(xì)胞(hESC)。用于本發(fā)明的多潛能干細(xì)胞因而可以是從胚泡制備的胚胎干細(xì)胞，參見例如WO 03/055992和W 2007/042225，或是市售的hBS細(xì)胞或細(xì)胞系。然而，進(jìn)一步設(shè)想任何的人多潛能干細(xì)胞可用于本發(fā)明，包括分化的成體細(xì)胞，通過用某些轉(zhuǎn)錄因子例如0CT4、S0X2、NANOG和LIN28 處理成體細(xì)胞將分化的成體細(xì)胞重編程為多潛能細(xì)胞，如Yu，等人，2007，Takahashi等人 2007和Yu等人2009中公開的。本文所用的飼養(yǎng)細(xì)胞意欲指單獨或結(jié)合使用的支持細(xì)胞類型。該細(xì)胞類型可進(jìn)一步為人或其它物種來源?？蓮囊韵陆M織獲得飼養(yǎng)細(xì)胞包括胚胎組織、胎兒組織、新生兒組織、幼體組織或成體組織，且進(jìn)一步包括從皮膚包括包皮、臍帶、肌肉、肺、上皮、胎盤、輸卵管、glandula、間質(zhì)或乳房來源的組織。飼養(yǎng)細(xì)胞可來源于屬于人成纖維細(xì)胞、纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞的細(xì)胞類型。可用于獲得飼養(yǎng)細(xì)胞的特定細(xì)胞類型的實例包括胚胎成纖維細(xì)胞、胚外內(nèi)胚層細(xì)胞、胚外中胚層細(xì)胞、胎兒成纖維細(xì)胞和/或纖維細(xì)胞、胎兒肌肉細(xì)胞、胎兒皮膚細(xì)胞、胎兒肺細(xì)胞、胎兒內(nèi)皮細(xì)胞、胎兒上皮細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)細(xì)胞、胎盤成纖維細(xì)胞和/或纖維細(xì)胞、胎盤內(nèi)皮細(xì)胞。本文所用術(shù)語"mEF細(xì)胞"意指小鼠胚胎成纖維細(xì)胞。本文所用術(shù)語"小分子"意指活化優(yōu)選信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的化合物。實施例實施例I人ES細(xì)胞的體外培養(yǎng)如先前所述(Cowan等人,2004 ；Heins 等人,2004)將未分化 hPS (從 D. A. Melton, Howard Hughes Medical Institute (Harvard University, Cambridge, MA) (Cowan 等人， 2004)獲得的膜蛋白酶適應(yīng)的 SA181 和 SA121 (Cellartis, Gothenburg, www. ceilartis. com)、HUES-3 > HUES-4 和 HUES-15)增殖，還可從 http://mcb. harvard, edu/me I ton/hues/ 獲取實驗方案。簡言之，在含有K0-DMEM、10% knockout血清替代品、lOng/ml bFGF、l%非必需氨基酸、1% GlutamaX、l%青霉素-鏈霉素、β-巰基乙醇(所有試劑均來自GIBC0， Invitrogen)和 10% plasmanate (Talecris Biotherapeutics Inc)的 hBS 培養(yǎng)基中將細(xì)胞保持在有絲分裂失活的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF) (Department of Experimental Biomedicine/TCF from Sahlgrenska Academy at the University of Gothenburg, Sweden)上。用0. 05 %胰蛋白酶/EDTA (GIBC0，Invitrogen)將細(xì)胞傳代并以介于I 3 和 I : 6 之間的分傳比重新鋪板。由 Institute of Clinical Genetics, University of Linkoping, Sweden通過標(biāo)準(zhǔn)的G顯帶技術(shù)對細(xì)胞系進(jìn)行核型分析。對于每一分析,評價 15-20個中期。SA121、HUES-4和HUES-15核型分析為正常，而HUES-3 (亞克隆52)已獲得額外的染色體17(82% )并且SA181已獲得額外的染色體12(45% )。實施例2依據(jù)圖IhPS細(xì)胞向定形內(nèi)胚層細(xì)胞和特定內(nèi)胚層細(xì)胞的分化以12，000-24, 000細(xì)胞/cm2的密度接種hPS細(xì)胞并培養(yǎng)至匯合。然后如先前所述使hPS細(xì)胞分化成定形內(nèi)胚層(D' Amour等人，2005)。簡言之，在PBS中洗滌細(xì)胞并且在低血清中(0-0，2% FBS)用含 100ng/ml 激活蛋白 A(R&D systems)和 25ng/ml 無翅型 MMTV 整合位點家族、成員3A(Wnt3a)的RPMI 1640 (GIBC0, Invitrogen)處理三天。在第三天，用PBS洗滌細(xì)胞并在基于KO-DMEM的培養(yǎng)基中以不同濃度(依據(jù)結(jié)果說明為0-256ng/ml)加入人FGF2 (Invitrogen)，所述培養(yǎng)基含有I %青霉素-鏈霉素、I % Glutamax、I %非必需氨基酸、0. ImM β-巰基乙醇和12% knockout血清替代品(所有試劑均來自Invitrogen)。每天更換培養(yǎng)基。不含F(xiàn)GF2的對照培養(yǎng)物平行生長并且每天監(jiān)測細(xì)胞形態(tài)。在每一時間點，對每一獨立實驗取2至4個生物重復(fù)。更具體地，根據(jù)所分析的時間點的數(shù)目，將每一孔分成4-5塊。實施例3特定內(nèi)胚層細(xì)胞的表征FGF抑制測定在第3天在DE誘導(dǎo)后，通過向培養(yǎng)基加入SU5402 (Calbiochem ;10M)、 LY294002 (CelI Signalling technology ; 12.5 μ Μ)和 U1026(Cell Signalling technology ;10 μ M)，進(jìn)行FGF受體抑制測定。用等體積的稀釋劑DMSO處理對照培養(yǎng)物。 每天加入補(bǔ)充有適當(dāng)抑制劑的新鮮培養(yǎng)基。在不同時間點(第9-12天)從單獨的孔中取
2至3個樣品，用于每一獨立實驗的mRNA分析。RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和實時PCR
用GenElute Mammalian 總 RNA試劑盒(Sigma-Aldrich)提取總 RNA。用 NanoDrop ND-1000分光光度計(Nanodrop Technologies)測量總RNA濃度。使用2. 5 μ M隨機(jī)六聚物和2. 5 μ M oligo (dT) (Invitrogen)，按照制造商的說明書，用Superscript III進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。實時PCR 測量在 ABI PRISM 7900HT Sequence Detector System (Applied Biosystems) 上進(jìn)行。使用含有 ΙΟμΙ SuperMix-UDG w/R0X、400nM 的每一引物、O. 125x SYBR Green 1(所有試劑均來自Invitrogen)的20μ1反應(yīng)物?？色@得作為補(bǔ)充數(shù)據(jù)的引物序列(圖 6)。預(yù)期PCR產(chǎn)物的形成通過瓊脂糖凝膠電泳和解鏈曲線分析證實。針對ACTB或RPL7表達(dá)將基因表達(dá)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。作為額外的標(biāo)準(zhǔn)化對照，還針對總RNA濃度將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，這生成相似的數(shù)據(jù)。如(Bustin, 2000 ;Stahlberg等人,2005)所述進(jìn)行實時PCR數(shù)據(jù)分析。hPS細(xì)胞的免疫組織化學(xué)分析在室溫下，將hPS細(xì)胞固定于4%低聚甲醛15分鐘并且在PBS-T (含O. 1% Triton X-100的PBS)中洗滌3次。在室溫下，用含O. 5% Triton X-100的PBS將固定的細(xì)胞透化15分鐘并在補(bǔ)充有5%正常驢血清(Jackson Immunoresearch)的PBS-T中封閉Ih,然后用以下的第一抗體和稀釋度在4°C孵育過夜山羊多克隆抗體(pAb)抗-F0XA-2(Palle Serup 惠贈；Santa Cruz Biotechnology ；1 : 200)、豚鼠 pAb 抗-PDX-1 (Chris Wright ； β CellBiologyConsortium ；1 : 1500)、山羊抗-PDX-1(Chris Wright ； β CellBiologyConsortium ；1 : 1500)、兔 pAb 抗-NKX6. I(β CellBiologyConsortium ； 20 I : 4000)、小鼠抗-CDX-2 (Jonathan Draper 惠贈；Biogenex ； I : 500)、兔 pAb 抗-S0X-9 (Chemicon ; I : 500)、兔抗-HNF-6 (Santa Cruz Biotechnology ；1 : 400)、小鼠 mAb-抗 PH-3 (Cell Signaling technology ；1 : 50)、兔 pAb-抗 MKi67 (Novocastra ; I : 200)、兔抗-S0X2 (Palle Serup 惠贈；Chemicon ; I : 250)、山羊抗-白蛋白(Bethyl laboratories ; I 300)。孵育過夜后，在PBS中將細(xì)胞洗滌3次5分鐘；并在室溫下， 在補(bǔ)充有5%血清的PBS-T中用相應(yīng)的熒光第二抗體(Alexa 488，Cy3和647 Jackson Immunoresearch和Invitrogen ;按照制造商的說明書稀釋)孵育60分鐘。通過4', 6' - 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI) (Sigma-Aldrich ；1 1000)孵育4分鐘使細(xì)胞核可見。 用表面熒光顯微術(shù)(Zeiss Axioplan 2)檢測并分析免疫熒光染色。數(shù)據(jù)分析使用Imaris成像軟件(Bitplane)計算F1DXl陽性細(xì)胞的百分比。對于每一參數(shù)選擇10個隨機(jī)選擇的視野。使用DAPI染色，軟件估計細(xì)胞的總面積。roxi陽性細(xì)胞的面積以同樣的方式計算。最終，通過將roxi陽性細(xì)胞的面積除以DAPI陽性面積，計算roxi陽性細(xì)胞的百分比。實時PCR測量的原始數(shù)據(jù)從SDS 2. 2. I輸出并用Microsoft Excel graph pad分析。通過多變量比較(單向AN0VA)用Bonferroni校正在統(tǒng)計學(xué)上分析所有數(shù)據(jù)。 所有值均表示為均值土平均標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)并且若P < O. 05則認(rèn)為顯著。實施例4低劑量的FGF2促進(jìn)肝細(xì)胞命運而中等濃度的FGF2指導(dǎo)hPS細(xì)胞向胰細(xì)胞命運的分化對于本發(fā)明，檢驗了激活蛋白A/Wnt3a處理的hPS細(xì)胞是否能夠產(chǎn)生前部和后部的前腸內(nèi)胚層兩者，腹胰和背胰分別起源于前部和后部的前腸內(nèi)胚層。事實上，通過評估特有的前腸/中腸標(biāo)記的表達(dá)，我們展示激活蛋白A/Wnt3a處理的hPS細(xì)胞自發(fā)分化成前腸和中腸內(nèi)胚層(

圖1B)。此外，在前腸來源的器官中，肝祖先占優(yōu)勢(圖1B，2A)?？偠灾?， 這些發(fā)現(xiàn)表明前部前腸內(nèi)胚層自發(fā)分化成肝，但前部和后部前腸內(nèi)胚層兩者都不自發(fā)地特化成為腹胰和背胰內(nèi)胚層。為測試FGF2是否能夠指導(dǎo)前腸內(nèi)胚層分化成胰命運，評估了不同F(xiàn)GF2濃度(0、4、16、32、64和256ng/ml)誘導(dǎo)I3DXl表達(dá)的能力。濃度部分地基于小鼠外植體的研究(Deutsch等人，2001)。對5個不同的細(xì)胞系應(yīng)用分化方案(圖1A) :HUES_3 亞克隆52、HUES-4、HUES-15和胰蛋白酶適應(yīng)的SA181和SA121，以避免細(xì)胞系特異性優(yōu)化。 用FGF2濃度(16-256ng/ml)處理的細(xì)胞變得更密且包含更多簇。在用低劑量FGF2 (4ng/ ml)處理的hPS細(xì)胞培養(yǎng)物中觀察到肝細(xì)胞樣細(xì)胞。mRNA分析和免疫熒光染色顯示肝標(biāo)記白蛋白(ALB) ,one cut同源框I (ONE⑶Tl先前被稱為HNF6)、肝細(xì)胞核因子4 a (HNF4A)的劑量依賴性表達(dá)，而HHEX表達(dá)以非劑量依賴性方式僅適度下降(至少在所測試的FGF2濃度范圍內(nèi))。增加的FGF2濃度下調(diào)ALB、ONE⑶Tl和HNF4A的表達(dá)。這也通過ALB染色在蛋白質(zhì)水平得到證實，其中在O和4ng/ml FGF2觀察到大量ALB+細(xì)胞而在256ng/ml FGF2 未觀察到ALB+細(xì)胞(圖1B)。已知多個轉(zhuǎn)錄因子參與胰特化。然而，大部分這些因子還表達(dá)于其它器官中。因此，選擇標(biāo)記的組合以確定分化細(xì)胞的胰命運PDX1、SRY(性別決定區(qū)Y)-框9(S0X9)、 NK6同源框1(^ 6-1)、油1^轉(zhuǎn)錄因子恥111'(^611丨11-3(如吧)、？(《42并且還監(jiān)測了羧肽酶 Al (CPAl)的表達(dá)。在所有樣品中均檢測到后部前腸相關(guān)標(biāo)記的表達(dá)，并且若干胰內(nèi)胚層標(biāo)記包括PDX1、NKX6-1、S0X9和NGN3的表達(dá)以FGF2劑量依賴性方式被上調(diào)。在大多數(shù)實驗中，在第9天已經(jīng)可檢測到低水平的NKX6-1但從第11天以后表達(dá)更加明顯。CPAl和 F0XA2表達(dá)于所有樣品中但不受FGF2處理的影響(圖2A，補(bǔ)充圖I)。胰特異性轉(zhuǎn)錄因子 Ia(PTFlA)是堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，其在早期胰內(nèi)胚層表達(dá)，對胰特異性轉(zhuǎn)錄因子Ia的表達(dá)分析表明其以低mRNA水平表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。由于所有的胰組織來源于Pdxl陽性群并且為證實mRNA數(shù)據(jù)，進(jìn)行roXl染色。我們檢測了用32-256ng/ml FGF2處理的樣品中專有的PDXl+細(xì)胞(圖2B)。與未用FGF2處理的對照細(xì)胞相比，PDXl+細(xì)胞的數(shù)目顯著高于FGF2處理的細(xì)胞(32-256ng/ml)。在用64ng/ ml FGF2(圖2B)處理的培養(yǎng)物中獲得最多數(shù)目的PDXl+細(xì)胞(15-20% )。盡管最高FGF2 濃度的作用在細(xì)胞系之間有差異，但趨勢是一樣的；在256ng/ml FGF2下TOXl表達(dá)降低或無表達(dá)(補(bǔ)充圖I)。由于Pdxl還表達(dá)于后部胃、十二指腸和CNS (僅mRNA轉(zhuǎn)錄物)，另外的胰標(biāo)記的表達(dá)用于證實朝向胰命運的分化。所有roxi+細(xì)胞共表達(dá)F0XA2、ONE⑶Tl和S0X9。盡管大多數(shù)的PDXl+細(xì)胞不共表達(dá)中腸/后腸標(biāo)記⑶X2，但檢測到了一些雙陽性細(xì)胞。roxi和 NKX6-1在小鼠和人的胰上皮共表達(dá)但是不在十二指腸和胃中共表達(dá)(Nelson等人，2007)。 共表達(dá)roxi和NKX6-1的胰祖先僅存在于分別用32ng/ml和64ng/ml FGF2處理的樣品中 (圖2A)。然而，與I3DXl+群相比，NKX6-1+細(xì)胞的數(shù)目相對小。使用5個不同的hPS細(xì)胞系在32-256ng/ml FGF2下TOXl表達(dá)的強(qiáng)烈誘導(dǎo)在多個實驗中再現(xiàn)(補(bǔ)充圖I)。因此，增加的FGF2濃度在以肝細(xì)胞命運為代價的情況下有助于胰細(xì)胞命運(圖2A和補(bǔ)充圖I)。增殖標(biāo)記磷酸-組蛋白-H3 (PH3)的免疫熒光檢測證明僅少數(shù)PDXl+細(xì)胞復(fù)制，表明PDXl+細(xì)胞的出現(xiàn)是分化而不是先前已存在的roxi+細(xì)胞增殖的結(jié)果。實施例5
高劑量的FGF2指導(dǎo)hPS細(xì)胞分化成前部前腸和小腸細(xì)胞隨著肝細(xì)胞標(biāo)記八1^、!1即44和0肥^1'1的表達(dá)伴隨FGF2濃度增加而下降(圖1B)， 前部前腸相關(guān)標(biāo)記SRY(性別決定區(qū)Y)框2(S0X-2)的表達(dá)水平升高，在256ng/ml處觀察到最高水平(圖2A)。一致的是，Sox-2的表達(dá)被限制在E13. 5小鼠胚胎中的前部前腸衍生器官，例如食道、肺和胃(補(bǔ)充圖2)。由于肺和甲狀腺產(chǎn)生于前部前腸內(nèi)胚層的同一區(qū)域， 與這些器官相關(guān)的標(biāo)記的表達(dá)模式通過mRNA分析評估。雖然甲狀腺-特異性標(biāo)記甲狀腺球蛋白(TG)隨著增加的FGF2濃度而被下調(diào)(數(shù)據(jù)未顯示)，但肺和甲狀腺特化的最早標(biāo)記 NKX2-1 (Serls等人，2005)在256ng/ml處被上調(diào)，這表明向肺細(xì)胞類型分化。與肺命運的誘導(dǎo)相關(guān)但不受限于肺命運的誘導(dǎo)的另外的標(biāo)記也被上調(diào)，這些標(biāo)記例如成纖維細(xì)胞生長因子10 (FGFlO)、sprouty同系物2 (果蠅屬)(SPRY2)、音猬同系物(果蠅屬)(SHH)和SHH 受體補(bǔ)綴(patched)同系物I (果蠅屬)(PTCHl)(圖3)。由肺泡II型上皮細(xì)胞和Clara細(xì)胞IOkDa蛋白(CClO)產(chǎn)生的肺表面活性劑蛋白 C(SP-C)不能在mRNA樣品中檢測到，這表明NKX2-1+細(xì)胞代表早期肺祖細(xì)胞。在最高FGF2濃度時(256ng/ml)，中腸/后腸標(biāo)記⑶X2和MNXl的表達(dá)顯著升高， 這表明高濃度的FGF2還誘導(dǎo)腸細(xì)胞類型的形成。CDXl表達(dá)保持不變而未在任何濃度檢測到大腸標(biāo)記⑶X4。⑶X2表達(dá)在蛋白水平得到證實并且在256ng/ml處獲得最多數(shù)目的 ⑶X2+細(xì)胞。重要的是，⑶X2+細(xì)胞共表達(dá)F0XA2，不包括滋養(yǎng)外胚層的形成。為確定增加的CDX2+細(xì)胞數(shù)是由于增殖還是由于中腸內(nèi)胚層再特化所導(dǎo)致，進(jìn)行用增殖標(biāo)記MKI67的雙重染色。大部分CDX2+細(xì)胞對于MKI67抗原為陰性，暗示是再特化而非增殖。盡管許多roXl+細(xì)胞在256ng/ml FGF2下仍然表達(dá)，但無一表達(dá)NKX6-1，這表明從64至256ng/ml增加的FGF2濃度阻滯胰內(nèi)胚層的形成(圖5)。此外，盡管大部分PDXl+ 細(xì)胞是CDX2陰性，但與在64ng/ml相比在256ng/ml觀察到更多的H)X1+/CDX2+細(xì)胞?；贓18.5小鼠胚胎的roxi/⑶X2雙重染色，我們的結(jié)論是roxi+/⑶X2+細(xì)胞代表十二指腸細(xì)胞類型。此外，我們能確認(rèn)在分化的hPS細(xì)胞和在E18. 5小鼠胚胎中，PDXl和⑶X2陽性細(xì)胞均不共表達(dá)S0X2?？傊@些數(shù)據(jù)表明響應(yīng)外源性FGF2的對肝、胰、肺和腸標(biāo)記的劑量依賴性誘導(dǎo)(圖4D)。實施例6ERK1/2促分裂原活化蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對于roXl誘導(dǎo)是必需的FGF通過它們相應(yīng)的FGFR的若干信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑包括磷脂酰肌醇_3激酶(PI3K)和 ERK1/2促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)而活化(圖4B)。在所有樣品中均檢測到FGFR mRNA 表達(dá)。此外，隨著FGF2濃度增加，觀察到FGFRl和3水平升高以及FGFR2和4水平降低的趨勢(圖4A)。為確定FGFR-介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對于向胰內(nèi)胚層的分化是否是必需的，研究了 FGFR酪氨酸激酶抑制劑SU5402、MAPK抑制劑U 1026和PI3K抑制劑LY294002的作用(圖 4C)。用SU5402的處理顯著降低roXl陽性細(xì)胞的數(shù)目，這表明FGF2 (64ng/ml)介導(dǎo)經(jīng)FGFR 的roXl+細(xì)胞誘導(dǎo)。此外，在U1026存在下用FGF2的處理減少I3DXl表達(dá)，這表明經(jīng)FGFR 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的MAPK途徑的激活對于I3DXl的誘導(dǎo)是必需的。與此相反，當(dāng)細(xì)胞在LY294002存在下用FGF2處理時，PDXl表達(dá)保持不變，表明活性PI3K途徑對于roXl的誘導(dǎo)不是必需的。 這些結(jié)果證明在hPS細(xì)胞中的FGF2誘導(dǎo)的roXl表達(dá)依賴于FGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的MAPK途徑下游的特異性活化。
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權(quán)利要求
1.特定濃度的FGF2用于控制來源于hPS細(xì)胞的定形內(nèi)胚層細(xì)胞向特定內(nèi)胚層細(xì)胞的分化的用途。
2.前述權(quán)利要求中任一項的用途，其中所述hPS細(xì)胞是hBS細(xì)胞。
3.權(quán)利要求I的用途，其中培養(yǎng)基中FGF2的濃度小于或等于500ng/ml。
4.前述權(quán)利要求中任一項的用途，其中FGF2的濃度的范圍為約O.I至約16ng/ml并且所述特定內(nèi)胚層細(xì)胞是肝內(nèi)胚層細(xì)胞。
5.前述權(quán)利要求中任一項的用途，其中FGF2的濃度的范圍為4ng/ml至6ng/ml，例如 5ng/ml，并且所述特定內(nèi)胚層細(xì)胞是肝內(nèi)胚層細(xì)胞。
6.權(quán)利要求4-5的用途，其中所述肝內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)AFP和一種或多種下列標(biāo)記 F0XA2、白蛋白(ALB)、HNF4A、HNF6 (ONECUT)、Proxl、CK17、CK19、Hex、FABpl、AAT、Cyp7A1、 Cyp3A4、Cyp2B6、Cyp3A7。
7.權(quán)利要求4-5的用途，其中所述肝內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)下列標(biāo)記ALB、HNF6和HNF4A。
8.權(quán)利要求4-7中任一項的用途，其中所述肝內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)兩種或更多種下列標(biāo)記AFP、HNF4A、Proxl。
9.權(quán)利要求1-3中任一項的用途，其中FGF2的濃度的范圍為約16至約150ng/ml，例如64ng/ml，并且所述特定內(nèi)胚層細(xì)胞是胰內(nèi)胚層細(xì)胞。
10.權(quán)利要求9的用途，其中胰內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)I3DXl和一種或多種下列標(biāo)記NGN3、 CPA1、S0X9、HNF6、HNF1 b、E-鈣黏著蛋白、MNXl、PTFl A 和 NKX6-1。
11.權(quán)利要求9或10的用途，其中所述胰內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)I3DXl和NKX6-1。
12.權(quán)利要求9-11中任一項的用途，其中所述胰內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)下列標(biāo)記S0X9、 ONECUTI、F0XA2。
13.權(quán)利要求9-12中任一項的用途，其中所述胰內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)至少一種選自胰島素、胰高血糖素、促生長素抑制素、胰多肽和ghrelin的胰激素。
14.權(quán)利要求1-3中任一項的用途，其中FGF2的濃度的范圍為約150至約500ng/ml并且所述特定內(nèi)胚層細(xì)胞是腸和/或肺內(nèi)胚層細(xì)胞。
15.權(quán)利要求14的用途，其中所述特定內(nèi)胚層細(xì)胞是表達(dá)⑶X2和一種或多種下列標(biāo)記的腸細(xì)胞CDXI、F0XA2、PITX2、FABp 2、TCF4、絨毛蛋白和 MNXI。
16.權(quán)利要求14或15的用途，其中所述特定內(nèi)胚層細(xì)胞是表達(dá)⑶XI、⑶X2和MNXl的腸內(nèi)胚層細(xì)胞。
17.權(quán)利要求14的用途，其中所述特定內(nèi)胚層細(xì)胞是表達(dá)一種或多種下列標(biāo)記的肺內(nèi)胚層細(xì)胞NKX2-1、SHH、PTCHl 和 SPRY2。
18.前述權(quán)利要求中任一項的用途，其中所述分化包括在含有FGF2的培養(yǎng)基中對定形內(nèi)胚層細(xì)胞的孵育，所述FGF2的濃度適于分化成合乎需要的分別如權(quán)利要求4、9和14所限定的內(nèi)胚層命運。
19.用于制備肝內(nèi)胚層細(xì)胞的方法，所述方法包括將定形內(nèi)胚層細(xì)胞在含有O.I至 16ng/ml FGF2的培養(yǎng)基中孵育約2至20天,例如6至8天或9至12天。
20.通過權(quán)利要求19中限定的方法可獲得的肝內(nèi)胚層細(xì)胞。
21.具有如權(quán)利要求6-8中任一項所限定的特征的權(quán)利要求18的肝內(nèi)胚層細(xì)胞。
22.用于制備胰內(nèi)胚層細(xì)胞的方法，所述方法包括將定形內(nèi)胚層細(xì)胞在含有16至150ng/ml FGF2的培養(yǎng)基中孵育約2至20天，例如6至8天。
23.通過權(quán)利要求22中限定的方法可獲得的胰內(nèi)胚層細(xì)胞.
24.具有如權(quán)利要求10-13中任一項所限定的特征的權(quán)利要求21的胰內(nèi)胚層細(xì)胞。
25.用于制備腸和/或肺內(nèi)胚層細(xì)胞的方法，所述方法包括將定形內(nèi)胚層細(xì)胞在含有 150至500ng/ml FGF2的培養(yǎng)基中孵育約2至20天，例如6至8天。
26.通過權(quán)利要求25中限定的方法可獲得的腸和/或肺內(nèi)胚層細(xì)胞。
27.具有如權(quán)利要求14-17中任一項所限定的特征的權(quán)利要求24的腸和/或肺內(nèi)胚層細(xì)胞。
28.用于制備肝、胰或腸內(nèi)胚層細(xì)胞的方法，所述方法包括誘導(dǎo)FGFR。
29.權(quán)利要求28的方法，其中FGFR是FGFRl、FGFR2、FGFR3和/或FGFR4。
30.權(quán)利要求28或29的方法，其中通過向定形內(nèi)胚層細(xì)胞的培養(yǎng)物加入FGF來誘導(dǎo) FGFR。
31.權(quán)利要求28-30中任一項的方法，其中MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑通過FGFR-誘導(dǎo)激活。
32.用于制備以下細(xì)胞的權(quán)利要求28-31中任一項的方法i)具有如權(quán)利要求6-8中任一項所限定的特征的肝內(nèi)胚層細(xì)胞， )具有如權(quán)利要求10-13中任一項所限定的特征的胰內(nèi)胚層細(xì)胞，或iii)具有如權(quán)利要求15-17中任一項所限定的特征的腸和/或肺細(xì)胞。
33.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述胰內(nèi)胚層細(xì)胞包括表達(dá)增殖標(biāo)記例如 MKI67.PH3.Brdu 的祖細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及控制人多潛能干細(xì)胞包括人胚泡來源的干(hBS)細(xì)胞分化和獲得特定內(nèi)胚層細(xì)胞的方法。特別地，本發(fā)明涉及將特定濃度的FGF2用作關(guān)鍵因子以控制來源于hPS細(xì)胞的定形內(nèi)胚層細(xì)胞分化成特定內(nèi)胚層細(xì)胞。本發(fā)明還提供獲得內(nèi)胚層細(xì)胞的方法，所述方法包括FGFR的使用和MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活。
文檔編號C07K14/50GK102596989SQ201080025037
公開日2012年7月18日 申請日期2010年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月29日
發(fā)明者H·塞姆布, J·阿梅里 申請人:塞拉蒂斯股份有限公司, 諾沃-諾迪斯克有限公司