專利名稱:對(duì)生物學(xué)樣品中的sith-1抗體進(jìn)行檢測(cè)的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及對(duì)生物學(xué)樣品中的HHV-6潛伏感染中間階段轉(zhuǎn)錄物所編碼的小蛋白質(zhì)(Small protein encoded by the Intermediate stage Transcript of HHV-6)(SITH-1) 抗體定性和/或定量地進(jìn)行檢測(cè)的方法。通過本發(fā)明的方法,針對(duì)尤其是在生物學(xué)樣品中微量存在、通常難以檢測(cè)的SITH-I蛋白的抗體,也能夠進(jìn)行檢測(cè)。
背景技術(shù):
在皰疹病毒科的病毒中,核心蛋白的周圍具有分子量80 150 X IO6道爾頓的雙鏈線狀DNA,該DNA包裹在由162個(gè)殼微粒(capsomere)形成的直徑約IOOnm的20面體衣殼(capsid)中而形成核衣殼(nucleocapsid),該核衣殼被包膜包裹而形成整體為約150 200nm大小的病毒。皰疹病毒幾乎可以在所有的哺乳動(dòng)物和兩棲類中找到,特別是將以人為宿主的皰疹病毒科的病毒,稱為人皰疹病毒(HHV:human herpesvirus)。HHV各自分類為 α (單純皰疹病毒、水痘/帶狀皰疹病毒等)、β (巨細(xì)胞病毒等)以及Y (EB病毒等)亞科。這樣的皰疹病毒以“潛伏感染(latent infection) ”為特征。所謂“潛伏感染”, 是指病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)不產(chǎn)生具有感染性的病毒顆粒而持續(xù)存在的感染狀態(tài),在此潛伏感染中,病毒基因及輔助該病毒基因存在的基因產(chǎn)物被保留在宿主細(xì)胞內(nèi)。已知顯示潛伏感染的皰疹病毒,當(dāng)宿主出現(xiàn)某種原因(例如衰老、健康狀態(tài)不佳(包括疲勞))時(shí),重新開始產(chǎn)生病毒顆粒,大量的病毒被復(fù)制(再活化)。S卩,皰疹病毒具有如下特異性的性質(zhì)如果宿主沒有異常則保持潛伏感染狀態(tài),一旦宿主的身體發(fā)生異常,皰疹病毒察覺到宿主的危機(jī),則為了尋找其他的健康宿主而再活化。為了對(duì)這樣的皰疹科的病毒的生態(tài)進(jìn)行討論,對(duì)病毒的潛伏感染/再活化的理解是不可或缺的。但是,在皰疹病毒中,關(guān)于潛伏感染的知識(shí)多的只有屬于Y-皰疹病毒的EB 病毒,對(duì)于其他則有很多不明之處。尤其是,對(duì)于與皰疹病毒的潛伏感染相關(guān)的因子,實(shí)際情況是除了本發(fā)明人等中的部分人員在之前明確的知識(shí)之外,沒有獲得其他的信息。例如,在非專利文獻(xiàn)1中, 揭示了 HHV-6在末梢血中的分化度較高的巨噬細(xì)胞中潛伏感染,從而明確了在宿主中的 HHV-6的潛伏感染部位。此外,在非專利文獻(xiàn)2中,記載著HHV-6在初次感染時(shí)以非常高的比例向腦內(nèi)轉(zhuǎn)移,并產(chǎn)生持續(xù)感染/潛伏感染。在非專利文獻(xiàn)3中,揭示了在HHV-6的潛伏感染時(shí)表達(dá)的基因(潛伏感染基因),給出了如下啟示該基因具有控制病毒的潛伏感染和再活化的功能。在非專利文獻(xiàn)4中,揭示了在HHV-6的潛伏感染狀態(tài)中,存在比較穩(wěn)定且基因表達(dá)活躍的狀態(tài),即“中間階段intermediate stage”,會(huì)大量表達(dá)潛伏感染基因和由該基因編碼的蛋白質(zhì)(潛伏感染基因蛋白質(zhì))。并且,在非專利文獻(xiàn)5中,記載了在慢性疲勞綜合癥患者的血清中存在對(duì)在中間階段表達(dá)亢進(jìn)的潛伏感染基因蛋白質(zhì)的抗體。
非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn) 1 :Kondo. K 等人,Ltatent human herpesvirus 6 infection of human monocytes/macrophages, J Gen Virol 72:1401-1408,1991非專利文獻(xiàn) 2 :Kondo. K 等人,Association of human herpesvirus 6infection of the central nervous system with recurrence of febrile convul sions.JInfect Dis 167 :1197-1200,1993非專利文獻(xiàn) 3 :Kondo. K 等人’ Identification of human herpesvirus 6latency-associated transcripts. , J Virol. 76 :4145-4151,2002非專利文獻(xiàn)4 =Kondo K 等人,Recognition of a Novel Stage of Beta-Herpesvirus Latency in Human Herpesvirus 6. , J Virol. 77 :2258-2264,2003非專利文獻(xiàn)5 :近藤一博著,《皰疹病毒感染與疲勞》,病毒,第55卷第1號(hào),p9-18, 200
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題本發(fā)明人等中的部分人員對(duì)在HHV-6潛伏感染中特異性基因活躍表達(dá)的中間階段(intermediate stage)中表達(dá)的新基因,以及由該新基因編碼的新蛋白質(zhì) (SITH)-1 (Small protein encoded by the Intermediate Transcript of HHV-6)進(jìn)行了鑒定。并且,對(duì)這些基因和由該基因編碼的蛋白質(zhì)SITH-I的功能進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)了如下新事實(shí)(i)和(ii),并進(jìn)行了專利申請(qǐng)(PCT/JP2008/67300) (i) SITH-1蛋白具有使細(xì)胞內(nèi)鈣濃度上升的功能,(ii)在情緒障礙患者中顯著地檢測(cè)出這些抗SITH-I蛋白抗體的同時(shí),在健康人中則幾乎檢測(cè)不出來。如上所述,示出了通過對(duì)來源于人體的生物學(xué)樣品中所含有的抗SITH-I蛋白抗體進(jìn)行檢測(cè),能夠應(yīng)用于精神障礙等的診斷中。在這里,以表達(dá)了 SITH-I蛋白的細(xì)胞作為抗原,通過通常進(jìn)行的熒光抗體法測(cè)定了針對(duì)所述SITH-I蛋白的血清抗體效價(jià)。本發(fā)明人等通過繼續(xù)研究,發(fā)現(xiàn)在熒光抗體法中存在如下問題需要制作SITH-I表達(dá)哺乳類細(xì)胞、需要制作顯微鏡用標(biāo)本、需要較多的勞力、人血清中針對(duì)SITH-I蛋白的的抗體效價(jià)低、檢測(cè)工作需要熟練的技術(shù),因SITH-I 蛋白不穩(wěn)定需要謹(jǐn)慎處理等。此外,在熒光抗體法中,為了與血清樣本反應(yīng)后在顯微鏡下目測(cè)判斷熒光,操作繁雜,不適合多個(gè)樣本同時(shí)處理。并且,因血清樣本的不同非特異性結(jié)合會(huì)成為問題,經(jīng)常有難于測(cè)定的情況?;诒景l(fā)明人等的這樣的新認(rèn)識(shí),本發(fā)明的目的在于,提供如下方法簡(jiǎn)便并且定性和/或定量地對(duì)生物學(xué)樣品中的抗SITH-I蛋白抗體進(jìn)行檢測(cè)的方法。本發(fā)明特別是以提供如下方法為目的在抑制背景信號(hào)的同時(shí),簡(jiǎn)便并且定性和 /或定量地對(duì)生物學(xué)樣品中的抗SITH-I蛋白抗體進(jìn)行檢測(cè)/測(cè)定的方法。解決問題的方法本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)了 SITH-I蛋白與擔(dān)載體結(jié)合的體系對(duì)于抗體的檢測(cè)是有效的, 從而想到了本發(fā)明。特別是,在該體系中,為了檢測(cè)在生物學(xué)樣品中微量存在的抗SITH-I蛋白抗體,如何處理背景信號(hào)成為問題,因此進(jìn)一步做了使該背景信號(hào)降低的努力。具體而言,通過向生物學(xué)樣品中添加細(xì)胞破碎提取液而成功降低了非特異性結(jié)合。此外,在利用生物素-生物素結(jié)合性蛋白之間的結(jié)合使SITH-I蛋白固定化在擔(dān)載體上時(shí),在生物學(xué)樣品中,添加細(xì)胞破碎提取液和生物素結(jié)合性蛋白,降低非特異性結(jié)合的效果更顯著。或此時(shí),通過添加下述細(xì)胞破碎提取液來代替添加生物素結(jié)合性蛋白,該細(xì)胞破碎提取液是由通過基因工程技術(shù)表達(dá)了生物素結(jié)合性蛋白的細(xì)胞所制備的的細(xì)胞破碎提取液,也獲得了同樣的效果。本發(fā)明基于以上知識(shí),提供了 在將SITH-I蛋白固定化在擔(dān)載體的體系中,減少了非特異性結(jié)合、靈敏度更高的對(duì)抗SITH-I蛋白抗體進(jìn)行檢測(cè)的方法。雖不局限于此,但本發(fā)明包括如下實(shí)施方式[實(shí)施方式1]用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中的由HHV-6潛伏感染中間階段轉(zhuǎn)錄物編碼的小蛋白質(zhì)(Small protein encoded by the Intermediate stage Transcript of HHV-6)的 (SITH-I)抗體的方法,該方法包括1)準(zhǔn)備 SITH-I 蛋白;2)使工序1)準(zhǔn)備的SITH-I蛋白與擔(dān)載體結(jié)合;3)使生物學(xué)樣品與工序2)制作的結(jié)合有SITH-I蛋白的擔(dān)載體接觸,檢測(cè)SITH-I 蛋白抗體。[實(shí)施方式2]實(shí)施方式1所述的方法,其中,SITH-I蛋白選自以下的組(a)具有SEQ ID NO=I的氨基酸序列的蛋白質(zhì);(b)具有SEQ ID NO=I的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列,并且具有使細(xì)胞內(nèi)鈣濃度上升的活性的蛋白質(zhì);(c)具有與SEQ ID NO 1的氨基酸序列的同一性至少為80%的氨基酸序列,并且具有使細(xì)胞內(nèi)鈣濃度上升的活性的蛋白質(zhì);(d)具有由SEQ ID NO 2的堿基序列所構(gòu)成的核酸編碼的氨基酸序列的蛋白質(zhì);(e)具有由SEQ ID NO 2的堿基序列中缺失、取代、插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)核苷酸而得到的堿基序列所構(gòu)成的核酸編碼的氨基酸序列,并且具有使細(xì)胞內(nèi)鈣濃度上升的活性的蛋白質(zhì);(f)具有由與SEQ ID NO :2的堿基序列的同一性至少為80%的核酸序列所構(gòu)成的核酸編碼的氨基酸序列,并且具有使細(xì)胞內(nèi)鈣濃度上升的活性的蛋白質(zhì);以及(g)由與SEQ ID NO 2的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列所構(gòu)成的核酸在嚴(yán)格雜交條件下雜交的核酸編碼,并且具有使細(xì)胞內(nèi)鈣濃度上升的活性的蛋白質(zhì)。[實(shí)施方式3]實(shí)施方式1或2所述的檢測(cè)方法,其特征在于在實(shí)施方式1的工序3)中,將(a)生物學(xué)樣品,以及(b)由與用于表達(dá)工序1)的SITH-I蛋白的宿主細(xì)胞相同種的細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液混合后添加至由工序2)制作的結(jié)合有SITH-I蛋白的擔(dān)載體中。[實(shí)施方式4]
實(shí)施方式1至3中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法,其特征在于在實(shí)施方式1的工序2)中,利用生物素-生物素結(jié)合性蛋白之間的結(jié)合,使 SITH-I蛋白與擔(dān)載體結(jié)合。[實(shí)施方式5]實(shí)施方式4所述的檢測(cè)方法,其特征在于在實(shí)施方式1的工序3)中,將(a)生物學(xué)樣品;以及 (b-i)細(xì)胞破碎提取液和生物素結(jié)合性蛋白,所述細(xì)胞破碎提取液由與用于表達(dá)工序1)或2)的SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素結(jié)合性蛋白的宿主細(xì)胞同種的細(xì)胞制備,或(b-ii)由下述細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液,所述細(xì)胞是在與用于表達(dá)工序1)或 2)的SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素結(jié)合性蛋白的宿主細(xì)胞相同種的細(xì)胞中通過基因工程技術(shù)表達(dá)了生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的細(xì)胞;混合后添加至由工序2)制作的結(jié)合有SITH-I蛋白的擔(dān)載體中。[實(shí)施方式6]實(shí)施方式3至5中任一項(xiàng)所述的方法,其特征在于在實(shí)施方式3的工序3(b)或?qū)嵤┓绞?的工序3 (b-i)中,添加由含任意載體的細(xì)胞提取的細(xì)胞破碎提取液作為細(xì)胞破碎提取液。[實(shí)施方式7]實(shí)施方式4至6中任一項(xiàng)所述的方法,其中,生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)是tamavidin或其變體。[實(shí)施方式8]實(shí)施方式1至6中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法,其中,生物學(xué)樣品選自血液、血清、腦脊髓液、唾液、咽喉拭子、汗、尿、淚、淋巴液、精液、 腹水以及母乳。[實(shí)施方式9]用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中的由HHV-6潛伏感染中間階段轉(zhuǎn)錄物編碼的小蛋白質(zhì) (SITH-I)的抗體的擔(dān)載體,其是結(jié)合有所述SITH-I蛋白的擔(dān)載體。[實(shí)施方式10]實(shí)施方式9所述的擔(dān)載體,其特征在于通過生物素-生物素結(jié)合性蛋白之間的結(jié)合,SITH-I蛋白與擔(dān)載體結(jié)合。[實(shí)施方式11]用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中的由HHV-6潛伏感染中間階段轉(zhuǎn)錄物編碼的小蛋白質(zhì) (SITH-I)的抗體的試劑盒,其包括A)結(jié)合有所述SITH-I蛋白的擔(dān)載體;以及,B)用于稀釋生物學(xué)樣品的試劑,其含有由與用于表達(dá)A)的SITH-I蛋白的宿主細(xì)胞相同種的細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液。[實(shí)施方式12]實(shí)施方式11所述的試劑盒,其中,
A)的擔(dān)載體是通過生物素-生物素結(jié)合性蛋白之間的結(jié)合與SITH-I蛋白結(jié)合的擔(dān)載體;并且,B)的試劑是用于稀釋生物學(xué)樣品的包含下述i)或ii)的試劑,i)細(xì)胞破碎提取液和生物素結(jié)合性蛋白,所述細(xì)胞破碎提取液由與用于表達(dá)A) 的SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素結(jié)合性蛋白的宿主細(xì)胞同種的細(xì)胞制備,或ii)由下述細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液,所述細(xì)胞是在與用于表達(dá)工序A)的 SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素結(jié)合性蛋白的宿主細(xì)胞相同種的細(xì)胞中通過基因工程技術(shù)表達(dá)了生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的細(xì)胞。[實(shí)施方式13]用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中的由HHV-6潛伏感染中間階段轉(zhuǎn)錄物編碼的小蛋白質(zhì) (SITH-I)的抗體的試劑盒,其包括A)所述 SITH-I 蛋白;B)用于固定化A)的SITH-I蛋白的擔(dān)載體;以及C)用于稀釋生物學(xué)樣品的試劑,其含有由與用于表達(dá)A)的SITH-I蛋白的宿主細(xì)胞相同種的細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液。[實(shí)施方式14]實(shí)施方式13所述的試劑盒,其中,A)的SITH-I蛋白是生物素化的;B)的擔(dān)載體直接或間接地與生物素結(jié)合性蛋白結(jié)合;C)的試劑,是用于稀釋生物學(xué)樣品的包含下述i)或ii)的試劑,i)細(xì)胞破碎提取液和生物素結(jié)合性蛋白,所述細(xì)胞破碎提取液由與用于表達(dá)A) 或B)的SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素結(jié)合性蛋白的宿主細(xì)胞同種的細(xì)胞制備,或ii)由下述細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液,所述細(xì)胞是在與用于表達(dá)工序A)或B)的 SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素結(jié)合性蛋白的宿主細(xì)胞相同種的細(xì)胞中通過基因工程技術(shù)表達(dá)了生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的細(xì)胞。發(fā)明的效果通過本發(fā)明的方法,能夠在生物學(xué)樣品中的SITH-I蛋白抗體的檢測(cè)中,在抑制背景信號(hào)的同時(shí),穩(wěn)定地進(jìn)行靈敏度更高的檢測(cè)。通過本發(fā)明的方法,尤其還使得在生物學(xué)樣品中微量存在的、用通常方法檢測(cè)困難的SITH-I蛋白抗體的檢測(cè)和測(cè)定成為可能。
[圖11圖1示出了Biofese標(biāo)簽(生物素化標(biāo)簽)融合SITH-1蛋白的表達(dá)。具體來講,圖IA是用于檢測(cè)SITH-I蛋白的Western印跡的結(jié)果,圖IB是用于檢測(cè)生物素化蛋白質(zhì)的活性染色的結(jié)果。將表達(dá)BioEase標(biāo)簽融合SITH-I蛋白的大腸桿菌BL21 (DE3)進(jìn)行超聲破碎,將得到的大腸桿菌粗提取液級(jí)分,按總蛋白質(zhì)20μ g/泳道展開于SDS-PAGE(15%丙烯酰胺凝膠)中,之后轉(zhuǎn)印到PVDF上。
具體來講,圖IA為使抗SITH-I抗體(1/1000稀釋)反應(yīng)后,與堿性磷酸酶(AP) 標(biāo)記抗兔IgG抗體(1/1000稀釋)反應(yīng),此后進(jìn)行了 AP染色。圖IB是與鏈霉抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶(HRP) (1/1000稀釋)反應(yīng)后的染色圖像。圖IA和圖IB均給出了來源于只具有表達(dá)載體的大腸桿菌的提取樣本,作為對(duì)照。用箭頭表示出Biofese標(biāo)簽融合 SITH-I蛋白的位置。在圖IB的鏈霉抗生物素蛋白-HRP染色中,檢測(cè)出2條粗帶。因在圖IA的抗 SITH-I抗體中沒有檢測(cè)到,圖IB中位于下方的帶被認(rèn)為是SITH-I部位的一部分被分解的附有Biofese標(biāo)簽的蛋白質(zhì)。[圖2]圖2是顯示了各種血清稀釋液對(duì)非特異性結(jié)合產(chǎn)生的效果的圖。以白四角形(虛線)表示用PBS稀釋的血清區(qū)域,以白四角形(實(shí)線)表示用向PBS中加入純化 tamavidin2(TM2)的溶液稀釋的血清區(qū)域,以星號(hào)(虛線)表示用只含有表達(dá)載體的大腸桿菌破碎提取液稀釋的血清區(qū)域,以星號(hào)(實(shí)線)表示用向只含有表達(dá)載體的大腸桿菌破碎提取液中加入純化TM2的液體稀釋的血清區(qū)域,以黑圓(實(shí)線)表示由表達(dá)TM2的大腸桿菌破碎提取液稀釋的血清區(qū)域。各圖的縱軸(發(fā)光量)表示抗SITH-I抗體的檢測(cè)量,橫軸表示分級(jí)稀釋的抗SITH-I抗體的稀釋比例。[圖3]圖3是將圖2所示的結(jié)果,按照抗SITH-I抗體的稀釋比例,分別求出的S/ N比的圖。以白四角形(虛線)表示用PBS稀釋血清的區(qū)域,以白四角形(實(shí)線)表示用向 PBS中加入純化tamavidin2(TM2)的溶液稀釋血清的區(qū)域,以星號(hào)(虛線)表示用只含有表達(dá)載體的大腸桿菌破碎提取液稀釋血清的區(qū)域,以星號(hào)(實(shí)線)表示用向只含有表達(dá)載體的大腸桿菌破碎提取液中加入純化TM2的液體稀釋血清的區(qū)域,以黑圓(實(shí)線)表示由表達(dá)TM2的大腸桿菌破碎提取液稀釋血清的區(qū)域。[圖4]圖4表示使用了結(jié)合有生物素化SITH-I的TM2板時(shí),對(duì)人血清中的抗 SITH-I抗體效價(jià)測(cè)定的結(jié)果。人血清用TBS-T(三羥甲基氨基甲烷緩沖液生理食鹽水, 0. 1% Tween 20)中含有酪蛋白1 %的溶液稀釋后,使之與TM2板接觸。[圖5]圖5表示了使用結(jié)合有生物素化SITH-I的TM2板時(shí),對(duì)人血清中的抗 SITH-I抗體效價(jià)測(cè)定的結(jié)果。使大腸桿菌粗提取液稀釋的人血清與TM2板接觸。[圖6]圖6表示了使用結(jié)合有生物素化SITH-I的TM2板時(shí),對(duì)人血清中的抗 SITH-I抗體效價(jià)測(cè)定的結(jié)果。使總蛋白質(zhì)5mg/ml的TM2表達(dá)大腸桿菌粗提取液稀釋的人血清與TM2板接觸。[圖7]圖7是表示使用結(jié)合有His標(biāo)簽融合SITH-I蛋白的鎳板的情況下,對(duì)抗 SITH-I兔血清中的抗SITH-I抗體效價(jià)進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果。作為抗SITH-I兔血清,加入了用包括0.2% BSA的PBS (-)稀釋100倍的血清。作為對(duì)照,使用了用無任何表達(dá)的大腸桿菌, 以及使用了 His標(biāo)簽EGFP。[圖8]圖8是表示使用結(jié)合有His標(biāo)簽融合SITH-I蛋白的鎳板的情況下,對(duì)抗 SITH-I兔血清中的抗SITH-I抗體效價(jià)進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果。作為抗SITH-I兔血清,加入了用包括0.2% BSA的PBS (-)稀釋500倍的血清。作為對(duì)照,使用無任何表達(dá)的大腸桿菌以及 His 標(biāo)簽 EGFP。[圖9]圖9表示使用結(jié)合有His標(biāo)簽融合SITH-I蛋白的鎳板的情況下,對(duì)人血
9清中的抗SITH-I抗體效價(jià)進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果。人血清稀釋100倍后加入。作為對(duì)照,使用了 His標(biāo)簽EGFP。此外,作為血清稀釋液,使用了 1%BSA、或大腸桿菌粗提取液。[圖10]圖10表示使用結(jié)合有His標(biāo)簽融合SITH-I蛋白的鎳板的情況下,對(duì)人血清中的抗SITH-I抗體效價(jià)進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果。人血清稀釋500倍后加入。作為對(duì)照,使用了 His標(biāo)簽EGFP。此外,作為血清稀釋液,使用了 1%BSA、或大腸桿菌粗提取液。
具體實(shí)施例方式1.對(duì)生物學(xué)樣品中的SITH-I抗體進(jìn)行檢測(cè)的方法本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中的由HHV-6潛伏感染中間階段轉(zhuǎn)錄物編石馬的小蛋白質(zhì)(Small protein encoded by the Intermediate stage Transcript of HHV-6) (SITH-I)的抗體的方法,該方法包括1)準(zhǔn)備 SITH-I 蛋白;2)使工序1)準(zhǔn)備的SITH-I蛋白與擔(dān)載體結(jié)合;3)使生物學(xué)樣品與工序2)制作的結(jié)合有SITH-I蛋白的擔(dān)載體接觸,檢測(cè)SITH-I 蛋白抗體。1.牛物學(xué)樣品本發(fā)明涉及對(duì)生物學(xué)樣品中的SITH-I蛋白抗體進(jìn)行檢測(cè)的方法。作為本發(fā)明中的生物學(xué)樣品,只要是來源于人、感染HHV-6的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、或?qū)?SITH-I基因的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,可能含有成為檢測(cè)對(duì)象的SITH-I蛋白抗體的樣品即可,沒有特別限定。具體來講,是包含從人、感染HHV-6的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(猴子等)、或?qū)隨ITH-I基因的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(鼠等)采集的細(xì)胞、組織或其碎片等的樣本,例如體液、更優(yōu)選為血液、血清、腦脊髓液、唾液、咽喉拭子、汗、尿、淚、淋巴液、精液、腹水以及母乳等。這些體液,按需要稀釋后使用。稀釋率通常為10倍至10000倍左右,優(yōu)選100倍至1000倍左右,但不局限于此。用于稀釋的溶液可以使用任意的緩沖液,也可以含有適當(dāng)?shù)姆忾]劑。作為封閉劑,理想的是抑制非特異性結(jié)合的效果高的封閉劑,例如可以使用BSA、 酪蛋白等本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的封閉劑。通過本發(fā)明,例如,使對(duì)來源于雖是自身免疫性疾病的患者或健康人,但自身抗體等背景高的檢驗(yàn)對(duì)象的樣本的SITH-I蛋白抗體的測(cè)定也成為可能。這些樣本在以往的方法中非特異性結(jié)合多,難于進(jìn)行檢測(cè)和正確定量。這些樣本中SITH-I蛋白抗體的抗體效價(jià)低,需要抑制血清的稀釋率,結(jié)果來源于血清中成分的非特異性結(jié)合也增加,因此用現(xiàn)有的方法難于對(duì)該抗體進(jìn)行檢測(cè)和定量。但通過本發(fā)明的方法能夠容易地檢測(cè)、或更加正確地進(jìn)行定量。2. SITH-I 蛋白在本發(fā)明中,所謂SITH-I蛋白,是指由HHV-6潛伏感染中間階段轉(zhuǎn)錄物編碼的小蛋白質(zhì)(Small protein encoded by the Intermediate Transcript of HHV-6)及其變體?;赑CT/JP2008/67300 的記載內(nèi)容的 SITH-I(I)SITH-I 蛋白、核酸SITH-I蛋白、核酸的結(jié)構(gòu)及功能,揭示于PCT/JP2008/67300中,將其全部?jī)?nèi)容引入本說明書中。
SITH-I是與皰疹病毒的潛伏感染相關(guān)的因子,更詳細(xì)地講,是在皰疹病毒的潛伏感染時(shí)特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)。在這里“在皰疹病毒的潛伏感染時(shí)特異性表達(dá)”,是指在感染了皰疹病毒的宿主中,在皰疹病毒潛伏感染(沒有增殖感染)時(shí),來源于皰疹病毒的基因或基因產(chǎn)物進(jìn)行特異性表達(dá)。SITH-I蛋白優(yōu)選選自以下的組(a)具有SEQ ID NO=I的氨基酸序列的蛋白質(zhì);(b)具有SEQ ID NO=I的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列,并且具有使細(xì)胞內(nèi)鈣濃度上升的活性的蛋白質(zhì);(c)具有與SEQ ID NO=I的氨基酸序列的同一性至少為80%的氨基酸序列,并且具有使細(xì)胞內(nèi)鈣濃度上升的活性的蛋白質(zhì);(d)具有由SEQ ID NO 2的堿基序列所構(gòu)成的核酸編碼的氨基酸序列的蛋白質(zhì);(e)具有由SEQ ID NO 2的堿基序列中缺失、取代、插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)核苷酸而得到的堿基序列所構(gòu)成的核酸編碼的氨基酸序列,并且具有使細(xì)胞內(nèi)鈣濃度上升的活性的蛋白質(zhì);(f)具有由與SEQ ID NO :2的堿基序列的同一性至少為80%的核酸序列所構(gòu)成的核酸編碼的氨基酸序列,并且具有使細(xì)胞內(nèi)鈣濃度上升的活性的蛋白質(zhì);以及(g)由與SEQ ID NO 2的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列所構(gòu)成的核酸在嚴(yán)格雜交條件下雜交的核酸編碼,并且具有使細(xì)胞內(nèi)鈣濃度上升的活性的蛋白質(zhì)。 SITH-I蛋白典型地具有SEQ ID NO 1氨基酸序列。SEQ ID NO 1的氨基酸序列優(yōu)選是由SEQ ID NO :2堿基序列構(gòu)成的核酸編碼的。由SEQ ID NO :1的SITH-1氨基酸序列所構(gòu)成的SITH-1蛋白,如后述的參考例所示,是作為人皰疹病毒-6(HHV-6)的潛伏感染時(shí)特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)被分離和鑒定的。SITH-I蛋白具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列,是由159氨基酸構(gòu)成的,分子量約 17. 5kDa的蛋白質(zhì)。SITH-I蛋白質(zhì)由SITH-I基因的核酸編碼。該SITH-1基因的cDNA如SEQ ID NO 3所示,具有1795個(gè)堿基對(duì)(約1. 79kbp)的大小,第%4 第956位的堿基序列為起始密碼子(Kozak ATG),第1431 第1433位的堿基序列為終止密碼子(TAA)。因此,在如SEQ ID NO 3所示的堿基序列中,上述SITH-I核酸具有從第卯4 1430位的堿基序列作為開放閱讀框(ORF),該ORF具有477個(gè)堿基對(duì)(約0. 48kbp)的大小。在SITH-I的cDNA中,表示ORF區(qū)域的堿基序列如SEQ ID N0:3所示。需要說明的是,所記載的SEQ ID NO :2所示的堿基序列含有終止密碼子的3個(gè)堿基。SITH-I核酸通常均在HHV-6潛伏感染的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá),另一方面,在增殖感染細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)有表達(dá)。編碼SITH-I蛋白質(zhì)的核酸由與到目前為止報(bào)告的HHV-6潛伏感染特異的基因(H6LT)成互補(bǔ)鏈的關(guān)系的DNA編碼,其表達(dá)在HHV-6的潛伏感染的中間階段增強(qiáng)。從這些事實(shí)可以認(rèn)為=SITH-I蛋白質(zhì)是在HHV-6的潛伏感染時(shí)進(jìn)行特異表達(dá)的蛋白質(zhì)。SITH-I蛋白,與作為宿主蛋白的CAML (鈣調(diào)節(jié)性親環(huán)蛋白配體,Accesion# ; U18242)結(jié)合,使神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度上升。CAML已知是在宿主生物內(nèi)在腦和淋巴細(xì)胞CN 102449483 A
說明書
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中大量存在,使細(xì)胞內(nèi)的鈣濃度上升的蛋白質(zhì)。還有,由SITH-I蛋白的表達(dá)引起的細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的上升能引起潛伏感染細(xì)胞內(nèi)普遍的信號(hào)傳達(dá)的活化,被認(rèn)為有助于HHV-6的高效
再活化。已知HHV-6在腦內(nèi)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中潛伏感染,可以認(rèn)為在潛伏感染時(shí)、或在作為活性高的潛伏感染狀態(tài)的中間階段,HHV-6表達(dá)SITH-I時(shí),神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的鈣濃度升高。認(rèn)為腦細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的升高與情緒障礙等精神障礙有較大關(guān)系(日本理研年報(bào) 2003)。SITH-I蛋白具有與宿主的蛋白質(zhì)即CAML結(jié)合并保持活性、使細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高的功能。此外,通過在被認(rèn)為是表達(dá)SITH-I蛋白最強(qiáng)的細(xì)胞-腦內(nèi)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)該蛋白質(zhì),可以誘導(dǎo)精神障礙。由此認(rèn)為=SITH-I蛋白在皰疹病毒的潛伏感染時(shí)或再活化初期表達(dá),具有使宿主產(chǎn)生精神障礙的功能。(b)作為SITH-I蛋白的變體的一個(gè)例子,可以是在SEQ ID NO 1氨基酸序列中, 有1個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列,并且具有與SITH-I蛋白同樣的使細(xì)胞內(nèi)鈣濃度上升的活性的蛋白質(zhì)。具體來講,由SEQ ID NO=I所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加1個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選1個(gè)或幾個(gè),例如,1 40個(gè)、1 30個(gè)、1 20個(gè)、1 15個(gè)、更優(yōu)選10、9、 8、7、6、5、4、3、2或1個(gè))氨基酸的氨基酸序列所構(gòu)成,并且具有本發(fā)明的所述活性的蛋白質(zhì)。在這里,氨基酸序列的缺失、取代、插入和/或添加,是指在同一序列中的任意1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸序列中的位置上,有1個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、取代、插入和/或添加。該氨基酸缺失、取代、插入和/或添加,可以是其中的2種以上同時(shí)發(fā)生,該氨基酸缺失、取代、插入和/ 或添加的數(shù)目一般來說越小越好。在上述中,取代優(yōu)選保守性取代,保守性取代是指特定的氨基酸殘基被具有類似物理化學(xué)特征的殘基所取代,但只要不實(shí)質(zhì)性改變?cè)蛄械慕Y(jié)構(gòu)特征,則任意取代均可。作為保守性取代的非限定實(shí)例,包括Ile、Val、LeU或Ala的相互取代這樣的含脂肪族基團(tuán)的氨基酸殘基之間的取代、Lys與Arg、Glu與Asp、Gln與Asn的相互取代這樣的極性殘基之間的取代等。在非保守性取代的場(chǎng)合,可以將上述種類中的某1個(gè)成員與其他種類的成員交換,不過此時(shí),為了保持本發(fā)明的蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能,優(yōu)選考慮氨基酸的親水指數(shù)(親水氨基酸指數(shù))(Kyte等,J. Mol. Biol. ,157 :105-131 (1982))。此外,在非保存性取代時(shí),可以根據(jù)親水性進(jìn)行氨基酸的取代。由在SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列中缺失、取代、和/或添加1個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列所構(gòu)成的蛋白質(zhì),可以通過《Molecular Cloning, ALaboratory Manual 3rd ed. )) (Cold Spring Harbor Press (2001))等中記載的定點(diǎn)變異誘發(fā)法等方法制備。在本說明書中,所謂“一個(gè)或多個(gè)氨基酸”,優(yōu)選是能夠通過定點(diǎn)變異誘發(fā)法而缺失、取代、插入和/或添加的程度的氨基酸。需要說明的是,作為對(duì)蛋白質(zhì)的氨基酸序列在保持其活性的同時(shí)缺失、取代、插入和/或添加1個(gè)或多個(gè)氨基酸的方法,在所述的定點(diǎn)變異誘發(fā)法之外,還可以列舉使用變異原處理基因的方法、選擇性地使基因裂開而去除、置換和/或添加選定的核苷酸后進(jìn)行連接的方法。
(c)本發(fā)明的SITH-I蛋白的變體,可以是具有與SEQ ID NO=I的氨基酸序列的同一性至少為80%的氨基酸序列,并且具有使細(xì)胞內(nèi)鈣濃度上升的活性的蛋白質(zhì)。氨基酸序列的同一性,優(yōu)選至少為85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%,更優(yōu)選99. 3%0兩個(gè)氨基酸序列的同一性%可通過目測(cè)檢查和數(shù)學(xué)計(jì)算來確定?;蛘撸瑑蓚€(gè)蛋白質(zhì)序列的同一性百分比可以通過使用以Needleman,S. B. R Wunsch, C. D. (J. Mol. Bol., 48 :443-453,1970)的算法為基礎(chǔ)、從威斯康星大學(xué)遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組(UWGCG)獲得的GAP計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行序列信息比較來確定。GAP程序優(yōu)選的默認(rèn)參數(shù)包括= (I)Henikoff, S.以 R Henikoff, J. G. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89 10915-10919,1992)中記載的計(jì)分矩陣 (scoring matrix)、blosum62 ; (2) 12分的空位罰分;(3)4分的空位長(zhǎng)度罰分;以及(4)末端空位不罰分。也可使用該領(lǐng)域技術(shù)人員使用的進(jìn)行序列比較的其它程序。關(guān)于同一性百分比,例如可以使用 Altschul 等(Nuc 1. Acids. Res.,25,p. 3389-3402,1997)中記載的 BLAST程序來對(duì)序列信息進(jìn)行比較和確定。該程序可于網(wǎng)絡(luò)上在Nantional Center for Biotechnology Information (NCBI) ^DNA Data Bank of Japan (DDBJ)網(wǎng)立占i^ffi。i亥網(wǎng)立占對(duì)利用BLAST程序進(jìn)行同一性檢索的各種條件(參數(shù))進(jìn)行了詳細(xì)記載,可對(duì)部分設(shè)定進(jìn)行適當(dāng)變更,但檢索通常使用默認(rèn)值來進(jìn)行。此外,兩個(gè)氨基酸序列的同一性%也可用遺傳信息處理軟件GENEITX Ver. 7 (GENETYX制)等程序或FASTA算法等來確定。此時(shí),也可用默認(rèn)值檢索。(e)本發(fā)明的SITH-I蛋白的變體,可以是具有由SEQ ID NO :2的堿基序列中缺失、 取代、插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)核苷酸而得到的堿基序列所構(gòu)成的核酸編碼的氨基酸序列,并且具有使細(xì)胞內(nèi)鈣濃度上升的活性的蛋白質(zhì)。具體來講,可以使用由在SEQ ID NO :2所示的堿基序列中缺失、取代、插入和/或添加1個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選1個(gè)或幾個(gè),例如,1 120個(gè)、1 90個(gè)、1 60個(gè)、1 30個(gè)、1 20個(gè)、1 15個(gè)、更優(yōu)選10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個(gè))核苷酸而得到的核苷酸序列所構(gòu)成, 并且,是包括編碼具有本發(fā)明的所述活性的蛋白質(zhì)的堿基序列的核酸。在這里,堿基序列中的核苷酸缺失、取代、插入和/或添加,是指在同一序列中的任意1個(gè)或數(shù)個(gè)的堿基序列的位置上有1個(gè)或多個(gè)核苷酸缺失、取代、插入和/或添加。該缺失、取代、插入和/或添加可以是其中的2種以上同時(shí)發(fā)生,該缺失、取代、插入和/或添加的數(shù)目一般來說越小越好。(f)本發(fā)明的SITH-I蛋白的變體,可以是具有由與SEQ ID NO 2的堿基序列的同一性至少為80%的核酸序列所構(gòu)成的核酸編碼的氨基酸序列,并且具有使細(xì)胞內(nèi)鈣濃度上升的活性的蛋白質(zhì)。堿基序列的同一性,優(yōu)選至少為85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%,更優(yōu)選 99. 3%。兩個(gè)堿基序列的同一性%可通過目測(cè)檢查和數(shù)學(xué)計(jì)算來確定?;蛘吒鼮閮?yōu)選的是,該比較通過使用計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行序列信息比較來實(shí)現(xiàn)。具有代表性的優(yōu)選計(jì)算機(jī)程序?yàn)檫z傳學(xué)計(jì)算機(jī)組(GCG ;威斯康星州Madison)的威斯康星軟件包、10. O版“GAP”程序 (Devereux等,1984,Nucl. Acids Res.,12 :387)。使用該“GAP”程序,不僅可對(duì)兩個(gè)堿基序列進(jìn)行比較,還可比較兩個(gè)氨基酸序列,以及進(jìn)行堿基序列與氨基酸序列之間的比較。
(g)本發(fā)明的SITH-I蛋白的變體,可以是由與SEQ ID NO 2的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列所構(gòu)成的核酸在嚴(yán)格雜交條件下雜交的核酸編碼,并且具有使細(xì)胞內(nèi)鈣濃度上升的活性的蛋白質(zhì)。雜交條件的強(qiáng)度主要是由雜交條件,更優(yōu)選是由雜交條件及清洗條件而決定。本說明書中的“嚴(yán)格條件”中,包括中度嚴(yán)格條件或高度嚴(yán)格條件。具體來講,作為中度嚴(yán)格條件,例如雜交條件為1XSSC 6XSSC,42°C 55°C& 條件,更優(yōu)選1 X SSC 3 X SSC,450C 50°C的條件,最優(yōu)選2 X SSC,50°C的條件。在雜交溶液中,例如,包括約50%的甲酰胺時(shí),采用比所述溫度低5至15°C的溫度。作為清洗條件,可以舉出0. 5 X SSC 6 X SSC, 400C 60°C。在雜交以及清洗時(shí),一般來說可以加入0. 05% 0. 2%,優(yōu)選加入約0. 1% SDSo作為高度嚴(yán)格的(高嚴(yán)格)條件,包括比中度嚴(yán)格條件在更高溫度和/或低的鹽濃度下進(jìn)行雜交和/或清洗。例如可以列舉雜交條件為0. IXSSC 2XSSC,55°C 65°C 的條件,更優(yōu)選0. IXSSC 1父55(,601 651的條件,最優(yōu)選0. 2XSSC,63°C的條件。作為清洗條件,有0. 2 X SSC 2 X SSC, 500C 68°C的條件,更優(yōu)選0. 2 X SSC, 60°C 65°C的條件。作為雜交條件,例如可以列舉但不限于如下條件在5XSSC,1 % SDS,50mM Tris-HCl (pH7. 5)及50%甲酰胺中在42°C條件下進(jìn)行預(yù)雜交后,添加探針并在42°C下放置一晚使雜交體形成,此后,在0. 2XSSC 0. SDS中,進(jìn)行3次在65°C下20分鐘的清洗。( 抗 SITH-I 抗體以抗SITH-I抗體、SITH-I蛋白或其變體、或它們的部分肽段作為抗原,通過公知的方法,得到作為多克隆抗體或單克隆抗體的抗SITH-I抗體。作為公知的方法,可以舉出例如文獻(xiàn)(Harlow 等人的"Antibodies :Alaboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New ^rk (1988)) ”、巖崎等人的“單克隆抗體雜交瘤與ELISA、講談社(1991) ”) 中所述的方法。這樣得到的抗體可以用于SITH-I蛋白的檢測(cè)/測(cè)定等。用語(yǔ)“抗體”表示免疫球蛋白(IgA、IgD、IgE、IgG、IgM及它們的Fab片段、F(ab,)2 片段、Fc片段),作為實(shí)例,可以列舉多克隆抗體、單克隆抗體、單鏈抗體、抗獨(dú)特型抗體及人源化抗體,但不限于這些抗體。用語(yǔ)“識(shí)別SITH-I蛋白的抗體”是指包括能夠與SITH-I蛋白特異性結(jié)合的完整的分子及抗體片段(例如,F(xiàn)ab及F(ab’)2片段)??梢允褂靡罁?jù)本說明書中公開的方法,或公知的方法而獲得Fab和F(ab’ )2以及SITH-I抗體的其它片段。這樣的片段,代表性地, 使用以木瓜蛋白酶(產(chǎn)生Fab片段)或胃蛋白酶(產(chǎn)生F(ab’)2片段)這樣的酶,通過基于蛋白質(zhì)分解的切斷而產(chǎn)生。認(rèn)為情緒障礙患者或有情緒障礙可能性的個(gè)體,SITH-I蛋白的表達(dá)量增加,其結(jié)果SITH-I抗體效價(jià)也升高。就本發(fā)明而言,在一種方式中,通過對(duì)生物學(xué)樣品中的SITH-I 抗體進(jìn)行檢測(cè),可以鑒定情緒障礙患者或有情緒障礙可能性的個(gè)體。
_3] 3.結(jié)合有SITH-Ig白的擔(dān)載體本發(fā)明的檢測(cè)方法1)準(zhǔn)備 SITH-I 蛋白;2)使工序1)準(zhǔn)備的SITH-I蛋白與擔(dān)載體結(jié)合,
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使用結(jié)合有SITH-I蛋白的擔(dān)載體。SITH-I蛋白的準(zhǔn)備為了檢測(cè)SITH-I抗體,可以使用用于制備蛋白的公知的方法來準(zhǔn)備SITH-I蛋白。 雖不局限于此,但例如可以如下進(jìn)行制備。為了表達(dá)SITH-I蛋白,可通過將編碼SITH-I蛋白的基因重組到表達(dá)載體中,在所期望的宿主細(xì)胞中表達(dá)。作為宿主細(xì)胞,可以列舉出哺乳類細(xì)胞(例如,雖不局限于此,如來源于人、猴等的靈長(zhǎng)類,小鼠(mouse)、大鼠(rat)、中國(guó)倉(cāng)鼠(Chinese hamster) 等的嚙齒類,或狗等的細(xì)胞)、昆蟲細(xì)胞(利用桿狀病毒(baculovirus)的表達(dá)系統(tǒng)、果蠅 (Drosophila)系統(tǒng)等)、酵母、大腸桿菌、植物、枯草芽孢桿菌等。優(yōu)選大腸桿菌。此外,優(yōu)選使用例如人的HEK293、HeLa, HepG2,293T,嚙齒類的CHO、NIH3T3、PCI2,其他哺乳類的 COS-1、C0S-7、MDCK、Vero,昆蟲細(xì)胞的Sf9、S2等確立的培養(yǎng)細(xì)胞體系。此外還可以使用小麥胚芽提取液、昆蟲細(xì)胞提取液等無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)使蛋白質(zhì)表達(dá)。關(guān)于表達(dá)載體,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)選擇適合用于宿主細(xì)胞的表達(dá)載體。表達(dá)的SITH-I蛋白可以進(jìn)行純化。此外,在后述的利用抗生物素蛋白-生物素結(jié)合這樣的強(qiáng)結(jié)合而固定化于擔(dān)載體的情況下,不需要預(yù)先純化,可以使結(jié)合有抗生物素蛋白或者生物素的擔(dān)載體直接與SITH-I蛋白表達(dá)細(xì)胞提取液反應(yīng),同時(shí)進(jìn)行純化和固定化。作為SITH-I蛋白的純化方法,可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的方法。可以組合使用通常的離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾層析等的層析,也可以使用純化用的標(biāo)簽序列。此時(shí),例如,可以作為與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、麥芽糖結(jié)合蛋白、纖維素結(jié)合蛋白質(zhì)、甲殼質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì)、硫氧還蛋白等的融合蛋白,使SITH-I蛋白在大腸桿菌、哺乳類等的任意宿主中表達(dá),分別利用與谷胱甘肽、麥芽糖、纖維素、甲殼質(zhì)、硫氧還蛋白的親和性(例如采用谷胱甘肽固定化柱)來進(jìn)行純化。此外,如果預(yù)先在和SITH-I的融合部位上預(yù)先導(dǎo)入蛋白酶的識(shí)別部位,則通過在純化后用該蛋白酶處理該標(biāo)簽序列,能夠進(jìn)行去除。作為蛋白酶,例如可以是腸激酶、因子 )(a等本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的蛋白酶。此外,可以使用Hishg、Flaghg、或Mi^p(II)-I1ag 等,通過固定化有離子化的鎳、抗Flag抗體、StrepTactin的柱分別進(jìn)行純化。并且,為了進(jìn)一步提高純化度,可以使多個(gè)標(biāo)簽與SITH-I蛋白融合,將純化法組合后使用。例如,使 SITH-I蛋白的末端與HisTag、BioEASE 等的生物素化序列融合,在宿主中作為重組蛋白表達(dá)后,通過鎳柱進(jìn)行純化,并且通過低親和性抗生物素蛋白、低親和性鏈霉抗生物素蛋白 (例如SA突變蛋白,Roche公司)柱純化。擔(dān)載體構(gòu)成固體擔(dān)載體的材料包括纖維素、特氟隆(teflon)(注冊(cè)商標(biāo))、硝酸纖維素、瓊脂糖、高交聯(lián)球狀瓊脂糖、葡聚糖、殼聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚丙烯、尼龍、聚偏二氟乙烯、膠乳、聚苯乙烯膠乳、二氧化硅、玻璃、玻璃纖維、金、鉬、 銀、銅、鐵、不銹鋼、鐵氧體(ferrite)、硅晶片、聚乙烯、聚乙烯亞胺、聚乳酸、樹脂、多糖類、 蛋白質(zhì)(白蛋白等)、碳或它們的組合等,但不限于上述這些。此外,優(yōu)選具有一定強(qiáng)度,組成穩(wěn)定,并且非特異性結(jié)合少的材料。固體擔(dān)載體的形狀包括微珠、磁珠、薄膜、微管、濾膜、板、微孔板、碳納米管、傳感器芯片等,但并不限于上述這些。如本技術(shù)領(lǐng)域中所知的,可以在薄膜、板等平坦固體擔(dān)載體上設(shè)置凹坑、溝槽、濾膜底部等。在發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中,微珠可以具有約25nm 約Imm范圍的球體直徑。在優(yōu)選的實(shí)施方式中,珠子具有約50nm 約10 μ m范圍的直徑。雖不局限于此,例如,在期望具有高檢測(cè)靈敏度的情況下,從待檢測(cè)物質(zhì)和與其特異性結(jié)合的物質(zhì)之間的接觸頻繁程度、清洗操作的容易性這樣的觀點(diǎn)來看,可以優(yōu)選使用上述這樣的珠子作為固體擔(dān)載體。使SITH-I蛋白與擔(dān)載體結(jié)合的方法使工序1)準(zhǔn)備的SITH-I蛋白與擔(dān)載體結(jié)合。作為使SITH-I蛋白與擔(dān)載體結(jié)合的方法,可以使用用于將蛋白質(zhì)結(jié)合在擔(dān)載體上的任意的方法。雖不局限于此,例如,疏水結(jié)合、共價(jià)結(jié)合、使用各種各樣的標(biāo)簽的方法, 或,利用生物素-生物素結(jié)合性蛋白之間的結(jié)合的方法等。利用疏水結(jié)合、共價(jià)結(jié)合時(shí),優(yōu)選預(yù)先純化SITH-I蛋白。利用疏水結(jié)合時(shí),利用擔(dān)載體的疏水性表面與SITH-I蛋白的疏水性部分的相互作用使之結(jié)合。具體來講,例如,將SITH-I蛋白溶液與微孔板等擔(dān)載體表面直接接觸,放置一定時(shí)間而使其通過SITH-I蛋白的疏水性部分與擔(dān)載體的疏水性部分之間的相互作用而結(jié)合,從而固定化。所述微孔板等例如有Nimc-Immimo ?板(Nunc公司)、 SpectraPlate-96HB(Perkin Elmer 公司)或 Reacti-Bind 96-ffell Plates Corner Notch (PIERCE公司)等,但不局限于此。另一方面,在共價(jià)結(jié)合時(shí),通過將官能團(tuán)配置在擔(dān)載體表面上,使其與SITH-I蛋白中的官能團(tuán)結(jié)合。為了這樣結(jié)合,優(yōu)選使用市售的、在表面上配置有各種官能團(tuán)的各種擔(dān)載體。例如,雖不局限于此,作為在表面配置有官能團(tuán)的微孔板,可以列舉無水馬來酸板, 例如Reacti-Bind(商標(biāo))Maleic馬來酸酐活化的聚苯乙烯96孔板(PIERCE公司);活性氨基板,例如Immobilizer (商標(biāo))-氨基模組/板(Nunc公司);或羧基板,例如ELISA用板MS-8796F(96孔/C型/平底/Carbo)(住友電木公司)。SITH-I蛋白與固體擔(dān)載體的連接,依照擔(dān)載體所附的說明書即可。具體來講,雖不局限于此,可以使用如下所述的,本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的蛋白質(zhì)和固體擔(dān)載體的偶聯(lián)(coupling)法來進(jìn)行。例如,通過在交聯(lián)劑 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC)的存在下,使經(jīng)過表面修飾而使羧基外露在表面上的固體擔(dān)載體的羧基與蛋白質(zhì)的氨基發(fā)生耦合反應(yīng),能夠使蛋白質(zhì)與固體擔(dān)載體連接在一起?;蛘?,在不含伯氨基的PH6. 5 9緩沖液中,將蛋白質(zhì)與表面通過N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活性酯化的固體擔(dān)載體混合,從而使固體擔(dān)載體表面的羧基與蛋白質(zhì)的氨基相結(jié)合。或者,使用交聯(lián)劑BS3 (雙琥珀酰亞胺辛二酸酯磺酸)、DSS (辛二酸二琥珀酰亞胺酯),將固體擔(dān)載體表面的氨基和蛋白質(zhì)的氨基連接在一起、或使用交聯(lián)劑SPDP(3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯)、GMBS (4-馬來酰亞胺-N-琥珀酰胺酯),使固體擔(dān)載體表面的氨基與蛋白質(zhì)的硫醇基連接在一起。此外,也可以通過基因工程使SITH-I與固定化用的標(biāo)簽融合。作為這樣的固定化標(biāo)簽,例如,除了利用后述的抗生物素蛋白-生物素結(jié)合的方法,也可以利用HisTag、 HaloTag (商標(biāo))、Flag等。例如在HisTag的場(chǎng)合,使表面上融合有多個(gè)(通常5-10個(gè))組氨酸的SITH-I與鎳離子化擔(dān)載體反應(yīng),利用HisTag和鎳離子的親和性固定化即可。Mm^Am -勿素結(jié)合+牛蛋白之.丨、曰 的結(jié)合的,SITH-I蛋白與牛旦iH本的結(jié)合
作為本發(fā)明中的SITH-I蛋白與擔(dān)載體的結(jié)合方法,可以適宜地使用任意方法。但是,最為優(yōu)選的是利用生物素-生物素結(jié)合性蛋白之間的結(jié)合。在本發(fā)明中,有時(shí)將“生物素-生物素結(jié)合性蛋白之間的結(jié)合”稱為“抗生物素蛋白-生物素結(jié)合”。利用生物素-生物素結(jié)合性蛋白之間的結(jié)合的SITH-I蛋白與擔(dān)載體的結(jié)合方法例如有,A)在結(jié)合有生物素結(jié)合性蛋白的擔(dān)載體上,結(jié)合生物素化的SITH-I蛋白的方法; B)利用很多生物素結(jié)合性蛋白為四聚體這個(gè)特點(diǎn),使結(jié)合有生物素的擔(dān)載體與生物素結(jié)合性蛋白結(jié)合,并且進(jìn)一步結(jié)合生物素化的SITH-I蛋白的方法;C)在結(jié)合有生物素的擔(dān)載體上,結(jié)合生物素結(jié)合性蛋白-SITH-I融合蛋白的方法等。以下詳細(xì)敘述。牛物素 “生物素”是D-[⑴-順-六氫-2-氧代-IH-噻吩并-(3,4)-咪唑_4_戊酸]的一般名稱。是分類于維生素B族的水溶性維生素的一種,也稱為Vitamin B7(維生素B7), 或者有時(shí)也被稱為維生素H、輔酶R。生物素與蛋清中所包含的糖蛋白中的一種、即抗生物素蛋白的結(jié)合非常強(qiáng),從而使其吸收受阻。為此,存在由于大量攝取生蛋清而導(dǎo)致的生物素缺乏癥。本說明書中的“生物素”除上述生物素之外,還包括亞氨基生物素(imino biotin) (Hofmann 等人(1980) Proc Natl Acad Sci USA 77 :4666-4668)、脫硫生物素(desthio biotin) (Hirsch 等人 Q002) Anal Biochem 308 :343-357)、或生物胞素(biocytin)、生物素亞砜(biotin sufoxide)等生物素類似物。使用生物素-抗生物素蛋白(生物素結(jié)合性蛋白)復(fù)合體的系統(tǒng)廣泛用于生物化學(xué)、分子生物學(xué)、組織免疫學(xué)、DNA分析、臨床化驗(yàn)等領(lǐng)域。在本發(fā)明中,作為使SITH-I與擔(dān)載體結(jié)合的方法之一,可舉出利用生物素-抗生物素蛋白結(jié)合,使SITH-I結(jié)合在擔(dān)載體上的方法。生物素結(jié)合性蛋白作為生物素結(jié)合性蛋白,只要是能夠與抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白、卵白素(neutravidin)、AVR 蛋白(Biochem. J.,(2002),363 :609-617)、Bradavidin (J. Biol. Chem.,(2005),280 :13250-13255)、Rhizavidin (Biochem. J.,(2007),405 :397-405)、 tamavidin (W002/07^17)、它們的變體等生物素強(qiáng)結(jié)合的蛋白質(zhì),其中的任何物質(zhì)均可優(yōu)選使用。優(yōu)選至少與生物素的解離常數(shù)(KD)為10_8以下、更優(yōu)選為10,以下,進(jìn)而更優(yōu)選為10_12以下。但是,就添加到被檢測(cè)樣品中的生物素結(jié)合性蛋白、以及用于封閉擔(dān)載體的生物素結(jié)合性蛋白而言,并不局限于此。作為生物素結(jié)合性蛋白,尤其是可以優(yōu)選使用在大腸桿菌中高表達(dá)的tamavidin 和其變體。tamavidin是從作為食用蘑菇的擔(dān)子菌白黃側(cè)耳(Pleurotus conucopiae)中發(fā)現(xiàn)的生物素結(jié)合性蛋白(W002/072817、Takakura 等人 Q009)FEBS J 276:1383-1397)。 作為tamavidin的變體,可以列舉例如高結(jié)合能力/低非特異性結(jié)合tamavidin(PCT/ JP2009/64302)等。本發(fā)明的“tamavidin” 是指 tamavidin 1 (TMl)、tamavidin 2(TM2)、或它們的變體。具體來說,典型地,本發(fā)明的tamavidin可以是包含SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :7的氨基酸序列的蛋白質(zhì),或也可以是由包含SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :6的堿基序列的核酸編碼的蛋白質(zhì)?;蛘?,本發(fā)明的tamavidin可以是這樣的蛋白質(zhì),其是包含SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :7的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或由包含SEQ ID NO :4或SEQ IDNO :6的堿基序列的核酸編碼的蛋白質(zhì)的變體,并且與tamavidin 1或2具有同樣的生物素結(jié)合活性;或者可以是具有高結(jié)合能力/低非特異性結(jié)合活性的蛋白質(zhì)。在本說明書中,有時(shí)將tamavidin Utamavidin 2以及它們的變體統(tǒng)稱為“tamavidin”。tamavidin 1或2的變體是包含在SEQ ID NO :5或7的氨基酸序列中缺失、取代、 插入和/或添加1個(gè)或多個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列,并且是與tamavidin 1或2具有同樣生物素結(jié)合活性的蛋白質(zhì)。關(guān)于“缺失、取代、插入和/或添加1個(gè)或多個(gè)氨基酸”的定義,與上述SITH-I蛋
白中一樣。tamavidin 1或2的變體,進(jìn)一步而言可以是包含與SEQ ID NO :7或5的氨基酸序列具有至少60%以上、優(yōu)選65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上、更優(yōu)選99. 3%以上氨基酸同一性的氨基酸序列,并且與tamavidinl或2具有相同生物素結(jié)合活性的蛋白質(zhì),或具有高結(jié)合能力/低非特異性結(jié)合活性的蛋白質(zhì)。關(guān)于“氨基酸序列的同一性%”的定義,與上述SITH-I蛋白中一樣。并且,tamavidin的變體也包括如下(i)具有由在SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :6的堿基序列中,有1個(gè)或多個(gè)核苷酸缺失、取代、插入和/或添加的堿基序列所構(gòu)成的核酸所編碼的氨基酸序列,并且與 tamavidin 1或2具有相同生物素結(jié)合活性的蛋白質(zhì),或具有高結(jié)合能力/低非特異性結(jié)合活性的蛋白質(zhì)。(ii)具有由與SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 6的堿基序列具有80%以上的同一性的堿基序列所構(gòu)成的核酸所編碼的氨基酸序列,并且與tamavidin 1或2具有相同生物素結(jié)合活性的蛋白質(zhì),或具有高結(jié)合能力/低非特異性結(jié)合活性的蛋白質(zhì)。(iii)具有由與SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 6的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列所構(gòu)成的核酸在嚴(yán)格雜交條件下雜交的核酸所編碼的,且與tamavidin 1或2具有相同生物素結(jié)合活性的蛋白質(zhì),或具有高結(jié)合能力/低非特異性結(jié)合活性的蛋白質(zhì)。關(guān)于“1個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失、取代、插入和/或添加”、堿基序列的“80%以上的同一性”、“嚴(yán)格雜交條件”等的定義,與上述SITH-I蛋白中一樣。需要說明的是,利用生物素-生物素結(jié)合性蛋白之間的結(jié)合使SITH-I蛋白與擔(dān)載體結(jié)合時(shí),優(yōu)選在此使用的“生物素結(jié)合性蛋白”具有生物素結(jié)合能力。由此,雖不局限于此,上述tamavidin 1或tamavidin 2的變體,與利用它們的野生型形成融合蛋白的情況相比,優(yōu)選生物素結(jié)合活性無明顯減少。由此,非限定地,tamavidin 1的變體優(yōu)選如下序列SEQ ID NO 5的氨基酸序列中N14、S18 J34、S36、S78、W82、W98、W110、D118未被修飾。需要說明的是,該表述例如TO4 是表示SEQ ID NO :5的氨基酸序列34位的酪氨酸殘基?;蛘?,在對(duì)這些氨基酸進(jìn)行修飾的情況下,優(yōu)選被修飾為性質(zhì)或結(jié)構(gòu)類似的氨基酸,優(yōu)選分別進(jìn)行如下修飾,例如當(dāng)為天冬酰胺(附4)時(shí),可以修飾為谷氨酰胺⑴)、天冬氨酸(D),優(yōu)選修飾為天冬氨酸;當(dāng)為絲氨酸(S18、S36、S78)時(shí),可以修飾為蘇氨酸(T)或酪氨酸(Y),優(yōu)選修飾為蘇氨酸;當(dāng)為酪氨酸 (Y34)時(shí),可以修飾為絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)或苯丙氨酸(F),優(yōu)選修飾為苯丙氨酸;當(dāng)為色氨酸(W82、W98、W110)時(shí),可以修飾為苯丙氨酸(F);當(dāng)為天冬氨酸(Dl 18)時(shí),可以修飾為谷氨酸(E)、天冬酰胺(N),優(yōu)選修飾為天冬酰胺。此外,tamavidin 2的變體優(yōu)選在SEQ ID NO 7的氨基酸序列中的四個(gè)色氨酸殘基(W69、W80、W96、W108)未被修飾?;蛘撸趯?duì)這些氨基酸進(jìn)行修飾的情況下,優(yōu)選被修飾為性質(zhì)或結(jié)構(gòu)類似的氨基酸,例如苯丙氨酸(F)。此外,期望被認(rèn)為與生物素直接進(jìn)行相互作用的氨基酸殘基(附4、S18、Y34, S36、S76、T78、D116)也未被修飾?;蛘?,在對(duì)這些氨基酸進(jìn)行修飾的情況下,優(yōu)選修飾為性質(zhì)或結(jié)構(gòu)類似的氨基酸從而可以保持與生物素的結(jié)合,優(yōu)選分別進(jìn)行如下修飾,例如為天冬酰胺(N14)時(shí),可以修飾為谷氨酰胺⑴)、天冬氨酸(D),優(yōu)選修飾為天冬氨酸;當(dāng)為天冬氨酸(D40)時(shí),可以修飾為天冬酰胺(N);當(dāng)為絲氨酸(S18、S36、S76)時(shí),可以修飾為蘇氨酸(T)或酪氨酸(Y),優(yōu)選修飾為蘇氨酸;當(dāng)為酪氨酸(TO4)時(shí),可以修飾為絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)或苯丙氨酸(F),優(yōu)選修飾為苯丙氨酸;當(dāng)為蘇氨酸(T78)時(shí),可以修飾為絲氨酸(S)、酪氨酸(Y),優(yōu)選修飾為絲氨酸;當(dāng)為天冬氨酸 (D116)時(shí),可以修飾為谷氨酸(E)、天冬酰胺(N),優(yōu)選修飾為天冬酰胺。在本發(fā)明中,優(yōu)選的tamavidin修飾體包含以下(PCT/JP2009/64302)在包含SEQ ID NO 7所述的氨基酸序列、或者在該序列中具有1個(gè) 多個(gè)氨基酸突變的氨基酸序列、或者與該序列具有80%以上同一性的氨基酸序列,且顯示生物素結(jié)合活性的蛋白質(zhì)中,選自下組中的1個(gè)或多個(gè)殘基被取代成酸性氨基酸殘基或中性氨基酸殘基而得到的修飾型生物素結(jié)合蛋白質(zhì)DSEQ ID NO 7的104位的精氨酸殘基;2) SEQ ID NO 7的141位的賴氨酸殘基;3) SEQ ID NO 7的洸位的賴氨酸殘基;以及4) SEQ ID NO 7的73位的賴氨酸殘基。更優(yōu)選選自下組中的修飾型生物素結(jié)合蛋白質(zhì)在SEQ ID NO 7中,104位的精氨酸殘基被取代成谷氨酸殘基、且141位的賴氨酸殘基被取代成谷氨酸殘基而得到的修飾型生物素結(jié)合蛋白質(zhì)(R104E-K141E);在SEQ ID NO :7中,40位的天冬氨酸殘基被取代成天冬酰胺殘基、且104位的精氨酸殘基被取代成谷氨酸殘基而得到的修飾型生物素結(jié)合蛋白質(zhì)(D40N-R104E);在SEQ ID NO :7中,40位的天冬氨酸殘基被取代成天冬酰胺殘基、且141位的賴氨酸殘基被取代成谷氨酸殘基而得到的修飾型生物素結(jié)合蛋白質(zhì)(D40N-K141E);以及在SEQ ID NO :7中,40位的天冬氨酸殘基被取代成天冬酰胺殘基、且104位的精氨酸殘基被取代成谷氨酸殘基、且141位的賴氨酸殘基被取代成谷氨酸殘基而得到的修飾型生物素結(jié)合蛋白質(zhì)(D40N-R104E-K141E)。結(jié)合有生物素結(jié)合性蛋白的擔(dān)載體作為利用生物素-生物素結(jié)合性蛋白之間的結(jié)合將SITH-I蛋白結(jié)合到擔(dān)載體上的方法,例如可以列舉出如下方法:A)在結(jié)合有生物素結(jié)合性蛋白的擔(dān)載體上結(jié)合生物素化SITH-I蛋白的方法;B)利用很多生物素結(jié)合性蛋白為四聚體這個(gè)特點(diǎn),使結(jié)合有生物素的擔(dān)載體與生物素結(jié)合性蛋白結(jié)合,并且進(jìn)一步結(jié)合生物素化的SITH-I蛋白的方法;C)在
19結(jié)合有生物素的擔(dān)載體上,結(jié)合生物素結(jié)合性蛋白-SITH-I融合蛋白的方法等。作為制作結(jié)合有生物素結(jié)合性蛋白的擔(dān)載體的方法,可以使生物素結(jié)合性蛋白與擔(dān)載體直接結(jié)合(上述實(shí)施方式A)?;蛘撸梢再?gòu)買預(yù)先固定化有生物素結(jié)合性蛋白的擔(dān)載體(上述實(shí)施方式A)?;蛘撸蒙锼?生物素結(jié)合性蛋白之間的結(jié)合,在生物素化的擔(dān)載體上,結(jié)合生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)(上述實(shí)施方式B)?;蛘撸蒙锼?生物素結(jié)合性蛋白之間的結(jié)合,在生物素化擔(dān)載體上結(jié)合生物素結(jié)合性蛋白-SITH-I融合蛋白(上述實(shí)施方式C)。作為直接結(jié)合生物素結(jié)合性蛋白的方法,如在所述SITH-I蛋白與擔(dān)載體的結(jié)合方法中詳細(xì)記載的那樣,有利用疏水結(jié)合和共價(jià)結(jié)合的方法等。此外,可以在如NEW ELISA Plate試劑盒(住友電木公司)的微孔板上,按照試劑盒所附的說明書使生物素結(jié)合性蛋白直接結(jié)合,而進(jìn)行固定化。需要說明的是,抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白,是例如SIGMA 公司等市售的。作為固定化有生物素結(jié)合性蛋白的擔(dān)載體,可以列舉例如=Reacti-Bind ? Streptavidin Coated Plates(PIERCE 公司)> Nunc Streptavidin Coated 96 Micro Well Plates (Nalge Nunc 公司)等的微孔板類,或 Dynabeads M-280Streptavidin (Dynal 公司)、MagnaBind ? Streptavidin Beads (PIERCE公司)等的磁珠類的市售品,但不局限于此。此外,如同上述,可以將擔(dān)載體生物素化,利用生物素-生物素結(jié)合性蛋白之間的結(jié)合,使生物素結(jié)合性蛋白與擔(dān)載體結(jié)合。作為使擔(dān)載體生物素化的方法,可以列舉使用例如生物素化試劑的方法。作為生物素化試劑,可以利用例如=PIERCE公司制造的(括號(hào)內(nèi)按照順序?yàn)榻宇^長(zhǎng)度、反應(yīng)基團(tuán))EZ-Link(注冊(cè)商標(biāo))磺基-NHS-生物素(13.5A、伯胺)、EZ-Link(注冊(cè)商標(biāo))磺基-NHS-LC-生物素(22.4A、伯胺)、EZ-Link(注冊(cè)商標(biāo))磺基-NHS-LCLC-生物素(30.5A 、伯胺)、EZ-Link(注冊(cè)商標(biāo))PFP-生物素(9.6 A、胺)、EZ-Link(注冊(cè)商標(biāo))馬來酰亞胺-PE02-生物素09.1A、巰基)、EZ-Link(注冊(cè)商標(biāo))生物素-PE02胺( 20.4A、羧基)、EZ-Link (注冊(cè)商標(biāo))生物素-PE03-LC Amine ( 22.9A、羧基)、EZ-Link (注冊(cè)商標(biāo)) 生物素-酰胼(15.7A、醛基)、EZ-Link(注冊(cè)商標(biāo))生物素-LC-酰胼(24.7A、醛基)、 EZ-Link(注冊(cè)商標(biāo))NHS-亞感激生物素(13.5A、伯胺)等,但并不限于上述物質(zhì)。利用上述生物素化試劑,使用公知的方法,可以使生物素結(jié)合在微孔板、微珠、或傳感器芯片等期望的擔(dān)載體上。例如有使用具有氨基、羧基、巰基、甲苯磺?;?、環(huán)氧基、 馬來酰亞胺基、活性酯等各種官能團(tuán)的擔(dān)載體(例如磁珠、kpharose珠子、瓊脂糖珠子 (agarose beads)、膠乳珠子、微量滴定板等)的方法。此時(shí)例如,在使用含NHS酯的生物素化試劑的情況下,可以利用如DMSCKdemethlvsulfoxide,二亞基亞砜)這樣的有機(jī)溶劑或 PH7至9的磷酸緩沖液溶解含NHS酯的生物素化試劑,并通過添加到具有氨基的固定化擔(dān)載體中從而使生物素結(jié)合。此外例如,在使用含氨基的生物素化試劑的情況下,還可以使用如 EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(l-ethyl-3-(3-dimethylaminopr opyDcarbodiimide hydrochloride))這樣的碳二亞胺,使固定化擔(dān)載體的羧基變成活性酯,然后,添加在PH5附近的緩沖液中溶解的生物素化試劑,從而使生物素結(jié)合。需要說明的是,就經(jīng)生物素化的固定化擔(dān)載體而言,優(yōu)選對(duì)未反應(yīng)的官能團(tuán)進(jìn)行去活化后,利用BSA 等進(jìn)行封閉。此外,可以利用經(jīng)生物素化的市售擔(dān)載體。作為經(jīng)生物素化的微孔板,可以利用例如Reacti-Bind 生物素包被的聚苯乙烯板(PIERCE公司制造),但不限定于此。作為經(jīng)生物素化的微珠,例如,作為磁珠,可以利用BioMagBiotin (Polysciences公司制造),或作為納米磁珠,可以利用Corefront公司制造的nanomag(注冊(cè)商標(biāo))-D生物素、nanomag(注冊(cè)商標(biāo))-二氧化硅生物素,或作為聚苯乙烯制的微珠,可以使用Beadlyte (注冊(cè)商標(biāo))生物素珠子(Upstate公司制造),或作為瓊脂糖可以使用Sigma公司制造的生物素瓊脂糖、 2-亞氨基生物素-瓊脂糖,或作為高交聯(lián)瓊脂糖,可以使用生物素-S印harosdBiosearch Technologies公司制造),但并不限定于上述這些。就連接擔(dān)載體與生物素的接頭的長(zhǎng)度而言,優(yōu)選至少長(zhǎng)于5 A,更優(yōu)選為13.5 A 以上。牛物素化SITH-I蛋白在本發(fā)明中,也可以使SITH-I蛋白與生物素結(jié)合而制作生物素化SITH-I蛋白,利用生物素-生物素結(jié)合性蛋白之間的結(jié)合,將其結(jié)合在結(jié)合有生物素結(jié)合性蛋白的擔(dān)載體上。作為結(jié)合有生物素結(jié)合性蛋白的擔(dān)載體,如上所述,可以使生物素結(jié)合性蛋白與擔(dān)載體直接結(jié)合,或者,可以購(gòu)買預(yù)先固定化有生物素結(jié)合性蛋白的擔(dān)載體(上述實(shí)施方式A)?;蛘撸蒙锼?生物素結(jié)合性蛋白之間的結(jié)合,在生物素化的擔(dān)載體上結(jié)合生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)(上述實(shí)施方式B)。作為生物素化SITH-I蛋白的制作方法,沒有特別的限制。例如,可以使用生物素標(biāo)記試劑盒(雖不局限于此,例如=EZ-Link (注冊(cè)商標(biāo))NHS-Lc-生物素PIERCE公司)、生物素標(biāo)記試劑盒-NH2 (D0JIND0 MOLECULAR TECHNOLOGIES INC.公司)等,使 SITH-1 蛋白與生物素結(jié)合。或者使SITH-I基因與編碼包括生物素化序列在內(nèi)的肽的DNA融合,通過構(gòu)建表達(dá)該融合基因的載體,在任意的宿主中作為與生物素化序列的融合蛋白表達(dá),可以制作生物素化 SITH-I (Schwarz 等人.,(1988) · J. Biol. Chem. 263 :9640-9645.)。作為這樣的載體雖不局限于此,例如可以列舉包含hvitrogen公司的 BioEase (商標(biāo))標(biāo)簽的載體。其中,作為哺乳類細(xì)胞表達(dá)用,有pcDNA (商標(biāo))6載體;作為大腸桿菌表達(dá)用,有PET104載體;或作為果蠅表達(dá)用,有pMT/Biofese載體。并且,優(yōu)選在SITH-I蛋白的生物素化時(shí),也可以使用于將所述載體生物素化時(shí)相同的方法。也就是說,可以列舉使用例如生物素化試劑的方法。作為生物素化試劑,可以利用例如=PIERCE公司制造的(括號(hào)內(nèi)按照順序?yàn)榻宇^長(zhǎng)度、反應(yīng)基團(tuán))EZ-Link(注冊(cè)商標(biāo)) 磺基-NHS-生物素(13.5A、伯胺)、EZ-Link(注冊(cè)商標(biāo))磺基-NHS-LC-生物素(22.4A 、伯胺)、EZ-Link (注冊(cè)商標(biāo))磺基-NHS-LCLC-生物素(30.5A、伯胺)、EZ-Link (注冊(cè)商標(biāo))PFP-生物素(9.6A、胺)、EZ-Link(注冊(cè)商標(biāo))馬來酰亞胺-PE02-生物素(29.lA、 巰基)、EZ-Link (注冊(cè)商標(biāo))生物素-PE02 Amine ( 20.4A、羧基)、EZ_Link (注冊(cè)商標(biāo))生物素-PE03-LC胺(22.9A、羧基)、EZ-Link(注冊(cè)商標(biāo))生物素-酰胼(15.7A、醛基)、
EZ-Link (注冊(cè)商標(biāo))生物素-LC-酰胼24.7A、醛基)、EZ_Link (注冊(cè)商標(biāo))NHS-亞氨基生物素(13.5A、伯胺)等,但并不限于上述物質(zhì)。利用上述生物素化試劑,使用公知的方法,可以使生物素結(jié)合在SITH-I蛋白上。 例如,在使用含NHS酯的生物素化試劑的情況下,可以利用如DMSO ( 二亞基亞砜)這樣的有機(jī)溶劑或PH7至9的磷酸緩沖液溶解含NHS酯的生物素化試劑,并添加到具有氨基的固定化擔(dān)載體中從而使生物素結(jié)合。此外例如,在使用含氨基的生物素化試劑的情況下,還可以使用如EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(l-ethyl-3-(3-dimethylamin propyl) carbodiimide hydrochloride))這樣的碳二亞胺,使固定化擔(dān)載體的羧基變成活性酯,然后,添加在PH5附近的緩沖液中溶解的生物素化試劑,從而使生物素結(jié)合。此外,使用這樣的生物素化試劑制造生物素化SITH-I蛋白時(shí),優(yōu)選如同上述,預(yù)先純化SITH-I蛋白。 在本發(fā)明中,可以準(zhǔn)備結(jié)合有生物素結(jié)合性蛋白的擔(dān)載體和生物素化SITH-I蛋白后使兩者接觸,通過生物素-生物素結(jié)合性蛋白之間的結(jié)合使擔(dān)載體與SITH-I蛋白結(jié)
I=I O雖不局限于此,生物素化SITH-I蛋白與擔(dān)載體的結(jié)合,例如可以通過如下方法進(jìn)行。將含有生物素化SITH-I蛋白的細(xì)胞破碎粗提取液,制作成總蛋白濃度0. lmg/ml至5mg/ ml,優(yōu)選0. 2mg/ml至2mg/ml。將此在4°C至40°C,優(yōu)選15°C至30°C條件下與結(jié)合有生物素結(jié)合性蛋白的擔(dān)載體接觸5分鐘至2小時(shí),優(yōu)選30分鐘至1小時(shí)。通過此操作,生物素化 SITH-I蛋白被固定化在結(jié)合有生物素結(jié)合性蛋白的擔(dān)載體上。此后,優(yōu)選在0. 05%至1%, 進(jìn)一步優(yōu)選0. 1 %至0. 3%的Tween20等界面活性劑的PBS或者TBS等的緩沖液中,洗去多余的細(xì)胞破碎粗提取物。此外,通過這樣與使細(xì)胞破碎粗提取液接觸而使生物素化SITH-I蛋白結(jié)合,事實(shí)上,是同時(shí)進(jìn)行了純化和固定化。因此,此時(shí)不需要其他的純化操作。再或者,也可以使制備為0. 1 μ g/ml至5 μ g/ml濃度的純化生物素化SITH-I蛋白與結(jié)合有生物素結(jié)合性蛋白的擔(dān)載體接觸。4.牛物學(xué)樣品與結(jié)合有SITH-I蛋白的擔(dān)載體接觸本發(fā)明的方法中,在工序2)準(zhǔn)備結(jié)合有SITH-I蛋白的擔(dān)載體之后,工序3)是使工序2)制作的結(jié)合有SITH-I蛋白的擔(dān)載體與生物學(xué)樣品接觸,從而進(jìn)行SITH-I蛋白抗體的檢測(cè)。生物學(xué)樣品與擔(dān)載體的接觸沒有特別限制,可以用任意的方法進(jìn)行。一般來說, 在利用了擔(dān)載體的檢測(cè)方法中,為了使導(dǎo)致背景信號(hào)的非特異性結(jié)合減少,有使在檢測(cè)用試劑中包含細(xì)菌成分提取液的方法(日本特開昭59-99257);將導(dǎo)入有與用于生產(chǎn)與被檢測(cè)物質(zhì)特異性結(jié)合的重組蛋白質(zhì)的載體同種的、且不含編碼該蛋白質(zhì)的基因的載體的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)成分添加到樣品中的方法(日本特開平8-4339 ;對(duì)來自和生產(chǎn)與被檢測(cè)物質(zhì)特異性結(jié)合的重組蛋白質(zhì)的細(xì)胞相同種、且不含該蛋白質(zhì)的細(xì)胞的水提取液進(jìn)行加熱處理后,將其水溶性級(jí)分添加到樣品中的方法(日本特開2004-301646)等。添加細(xì)胞提取液以往的方法對(duì)來源于自身免疫性疾病患者、或雖是健康人但自身抗體等的背景高的檢驗(yàn)對(duì)象的SITH-I蛋白抗體的測(cè)定,因非特異性結(jié)合多而難以實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明人等深入研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)了即使是來源于這樣的檢驗(yàn)對(duì)象的樣本,通過使得生物學(xué)樣品與擔(dān)載體接觸時(shí)有細(xì)胞破碎提取液存在,能夠進(jìn)行SITH-I蛋白抗體的測(cè)定。因此,作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式,優(yōu)選在工序3)中,將(a)生物學(xué)樣品,以及(b)由與用于表達(dá)工序1)的SITH-I蛋白的宿主細(xì)胞相同種的細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液混合后添加至由工序2)制作的結(jié)合有SITH-I蛋白的擔(dān)載體中。特別是,在利用生物素-生物素結(jié)合性蛋白之間的結(jié)合,將SITH-I蛋白結(jié)合在擔(dān)載體上的體系中,通過如下方法,能夠得到更加顯著的效果。在工序3)中,將(a)生物學(xué)樣品;以及(b)細(xì)胞破碎提取液和生物素結(jié)合性蛋白,所述細(xì)胞破碎提取液由與用于表達(dá)工序1)或2)的SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素結(jié)合性蛋白的宿主細(xì)胞同種的細(xì)胞制備,混合后添加至由工序2)制作的結(jié)合有SITH-I蛋白的擔(dān)載體中。細(xì)胞破碎提取液的來源細(xì)胞可以是大腸桿菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、哺乳類細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞等,沒有特別限制,優(yōu)選與用于表達(dá)SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/ 或用大腸桿菌制備的生物素結(jié)合性蛋白的宿主細(xì)胞相同種的細(xì)胞。例如,在SITH-I蛋白、 生物素化SITH-I蛋白、和/或用大腸桿菌制備的生物素結(jié)合性蛋白是利用大腸桿菌制備的情況下,優(yōu)選細(xì)胞破碎提取液也通過大腸桿菌來制備。此外,在通過無細(xì)胞系表達(dá)SITH-I 蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素結(jié)合性蛋白時(shí),使用的細(xì)胞破碎提取液可以直接使用,或者可以將細(xì)胞破碎提取液懸浮在所期望的緩沖液中來使用。此外,SITH-I蛋白、和/或生物素化SITH-I蛋白可以不是通過基因工程技術(shù)來表達(dá)的,而是從本來就具有這些蛋白質(zhì)的細(xì)胞中間進(jìn)行提取和純化的。例如,用tamavidin作為生物素結(jié)合性蛋白時(shí),可以使用擔(dān)子菌白黃側(cè)耳(Pleurotus conucopiae)細(xì)胞的細(xì)胞破碎提取液。如上所述,本發(fā)明的細(xì)胞提取液也包括本來就含有生物素結(jié)合性蛋白和/或 SITH-I蛋白的細(xì)胞的破碎提取液。此外,用于制備細(xì)胞破碎提取液的細(xì)胞可以含有任意載體,優(yōu)選含有空載體??蛰d體可以是與用于表達(dá)SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素結(jié)合性蛋白時(shí)使用的載體相同種、并且不含編碼上述這些蛋白質(zhì)的基因的載體,或者,例如可以是使這些空載體進(jìn)一步含有任意核酸的任意的載體。此外,用于表達(dá)SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、 和/或生物素結(jié)合性蛋白時(shí)使用的載體,可以是不同種類的載體。作為細(xì)胞的破碎提取液,只要是細(xì)胞來源的成分即可,沒有特別限制,例如,可以使用其蛋白質(zhì)成分、糖類成分、脂質(zhì)成分或它們的混合成分。優(yōu)選可以使用細(xì)胞的可溶性提取物。細(xì)胞的破碎提取液的制備方法沒有特別限制,可以使用各種方法。通常,可以如下制備將在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞,通過使用超聲波等物理方法或表面活性劑等化學(xué)方法、或酶處理等進(jìn)行破碎或可溶化,以及進(jìn)行離心分離或過濾等操作,從而得到可溶性成分。此外,為了延長(zhǎng)保存壽命,優(yōu)選向通過離心分離或過濾等得到的澄清液體中,添加例如蛋白酶抑制劑,或?qū)嵤└邏簻缇幚淼燃訜崽幚?,?duì)來源于細(xì)胞的各種酶等進(jìn)行抑制或使其失活。細(xì)胞破碎提取液的添加濃度,可以根據(jù)產(chǎn)生的非特異反應(yīng)的強(qiáng)度來改變,可以適當(dāng)設(shè)定吸收該非特異反應(yīng)的充分的濃度。作為制備細(xì)胞破碎提取液的具體方法的實(shí)例,雖不局限于此,例如在大腸桿菌細(xì)胞的情況下,可以將大腸桿菌(可以含有載體,或載體可以含有編碼生物素結(jié)合性蛋白的基因),接種到含抗生素的LB培養(yǎng)基中,在25°C 37°C振蕩培養(yǎng)使0D600的吸光度達(dá)到 0. 1 1,優(yōu)選達(dá)到0. 3 0. 8,然后,添加0. OlmM 5mM、優(yōu)選0. ImM ImM的IPTG,進(jìn)一步,在4°C 37°C,優(yōu)選25 V 37°C,進(jìn)行2小時(shí) 48小時(shí)、優(yōu)選進(jìn)行4小時(shí) M小時(shí)的振蕩培養(yǎng)。對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行離心回收菌體,將菌體懸浮到所期望的緩沖液中,然后破碎,離心破碎液,回收其上清作為大腸桿菌粗提取液。在向生物學(xué)樣品中混合細(xì)胞破碎粗提取液的情況下,雖不局限于此,使通過所期望的緩沖液(可以含有BSA或酪蛋白、市售的封閉劑等)制備的總蛋白質(zhì)濃度為0. 05mg/ ml 5mg/ml、優(yōu)選為0. 5mg/ml 5mg/ml的細(xì)胞破碎粗提取液,與樣品在4°C 37°C、優(yōu)選在15°C 30°C反應(yīng)1分鐘 M小時(shí)、優(yōu)選反應(yīng)10分鐘 4小時(shí),更優(yōu)選反應(yīng)30分鐘 2 小時(shí)。需要說明的是,當(dāng)生物學(xué)樣品為血清等時(shí),雖不局限于此,可以將上述細(xì)胞破碎粗提取液稀釋10倍 10000倍,優(yōu)選100倍 1000倍,更優(yōu)選100倍 500倍后使用。添加牛物素結(jié)合件蛋白本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)更優(yōu)選在使生物學(xué)樣品與擔(dān)載體接觸時(shí),與細(xì)胞破碎提取液一起, 使生物素結(jié)合性蛋白同時(shí)存在。因此,在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中,在工序3)中,將(a)生物學(xué)樣品;以及 (b-i)細(xì)胞破碎提取液和生物素結(jié)合性蛋白,所述細(xì)胞破碎提取液由與用于表達(dá)工序1)或2)的SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素結(jié)合性蛋白的宿主細(xì)胞同種的細(xì)胞制備,或(b-ii)由下述細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液,所述細(xì)胞是在與用于表達(dá)工序1)或 2)的SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素結(jié)合性蛋白的宿主細(xì)胞相同種的細(xì)胞中通過基因工程技術(shù)表達(dá)了生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的細(xì)胞;混合后添加至由工序2)制作的結(jié)合有SITH-I蛋白的擔(dān)載體中。在本發(fā)明的方法中,通過在生物學(xué)樣品中添加生物素結(jié)合性蛋白,能夠有效地抑制背景信號(hào)。這樣的生物素結(jié)合性蛋白可以是上述生物素結(jié)合性蛋白中的任一種,沒有特別限制。此外,可以是野生型也可以是變體,與野生型相比,生物素結(jié)合能力可以是相同的,也可以更高,或可以更低。此外,作為添加的方式,可以直接添加生物素結(jié)合性蛋白(可以是天然來源的,也可以是通過基因工程表達(dá)的蛋白質(zhì))的粉末,也可以溶解在適當(dāng)?shù)囊后w中然后添加。此外, 也可以為如下方式例如,不將生物素結(jié)合性蛋白直接添加到樣品中,而是借助固定有生物素結(jié)合性蛋白的擔(dān)載體(例如過色譜柱)來處理樣品和細(xì)胞破碎提取液的混合物。(工序 b-i)。生物素結(jié)合性蛋白的濃度以最終濃度計(jì)為lyg/ml 500yg/ml、優(yōu)選為10yg/ml ΙΟΟμ g/ml。在通過基因工程在該細(xì)胞中表達(dá)生物素結(jié)合性蛋白的情況下,生物素結(jié)合性蛋白的濃度也可以為同樣的濃度,但不局限于此?;蛘?,也可以使用細(xì)胞提取液,該細(xì)胞提取液是將編碼生物素結(jié)合性蛋白的基因?qū)胨拗骷?xì)胞中并表達(dá)后,并破碎該宿主細(xì)胞得到的包含生物素結(jié)合性蛋白的細(xì)胞提取液 (工序b-ii)。此時(shí),在所期望的宿主中,生物素結(jié)合性蛋白可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來表達(dá),但通過基因工程表達(dá)工序1)或2)的SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和 /或生物素結(jié)合性蛋白時(shí),優(yōu)選是與其宿主是相同種的。此外,與通過基因工程表達(dá)SITH-I 蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素結(jié)合性蛋白的宿主不同時(shí),雖不局限于此,在生物學(xué)樣品中添加并使其反應(yīng)的細(xì)胞提取液可以使用來源于雙方的宿主細(xì)胞的細(xì)胞提取液。當(dāng)宿主為大腸桿菌時(shí),將編碼生物素結(jié)合性蛋白的基因重組到表達(dá)載體中,并將該表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌,在誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)的同時(shí),進(jìn)行大腸桿菌的培養(yǎng)。表達(dá)載體、宿主大腸桿菌株、培養(yǎng)基成分、IPTG濃度、培養(yǎng)溫度等誘導(dǎo)條件,可以適當(dāng)選擇。向擔(dān)載體上添加牛物學(xué)樣品等可以利用任意方法向擔(dān)載體中添加生物學(xué)樣品、細(xì)胞破碎提取液以及生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)。但是,在生物學(xué)樣品與擔(dān)載體接觸的同時(shí)或接觸之前,生物學(xué)樣品必須與細(xì)胞破碎提取液以及生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)接觸。即,只要使生物學(xué)樣品在與擔(dān)載體接觸的同時(shí),或在接觸之前,與細(xì)胞破碎提取液以及生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)充分接觸即可,不是必須最終將細(xì)胞破碎提取液來源的成分和生物學(xué)樣品一起添加到擔(dān)載體中。例如,可以制作結(jié)合有細(xì)胞破碎提取液成分的擔(dān)載體,并向其使用經(jīng)處理的生物學(xué)樣品。具體來說,可以舉出使生物學(xué)樣品在與擔(dān)載體接觸之前,通過細(xì)胞破碎提取液成分色譜柱等的實(shí)施方式。需要說明的是,在添加后,雖沒有特別限制,將生物學(xué)樣品和細(xì)胞破碎提取液與擔(dān)載體在10°C至30°C、優(yōu)選20°C至30°C下,反應(yīng)10分鐘至4小時(shí)、優(yōu)選反應(yīng)30分至2小時(shí)。5. SITH-I蛋白抗體的檢測(cè)方法本發(fā)明的檢測(cè)方法,在工序3)中進(jìn)行SITH-I蛋白抗體的檢測(cè)。對(duì)SITH-I蛋白抗體進(jìn)行檢測(cè)的方法,本領(lǐng)域技術(shù)人員而可以適當(dāng)選擇。作為優(yōu)選的方法,可以列舉酶結(jié)合免疫吸附分析法(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)等免疫分析法、 表面等離子共振法等這樣的分析法。使通過抗生物素蛋白-生物素結(jié)合固定化的SITH-I 蛋白抗體,與生物學(xué)樣品反應(yīng)后,對(duì)該SITH-I蛋白抗體進(jìn)行檢測(cè)。在免疫分析中,將作為抗原的SITH-I蛋白固定化、使其與存在于生物學(xué)樣品中的 SITH-I蛋白抗體發(fā)生反應(yīng),利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行檢測(cè)。例如,相對(duì)于結(jié)合有SITH-I蛋白的SITH-I蛋白抗體,使用識(shí)別并結(jié)合人抗體的例如抗人抗體作為第二抗體來。此時(shí),通過預(yù)先用熒光、酶、或放射性同位素進(jìn)行標(biāo)記該抗人抗體,可以通過測(cè)定最終的熒光量、酶活性、或放射性量,來間接地對(duì)抗體的量進(jìn)行測(cè)定、定量。上述標(biāo)記可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法進(jìn)行,此外也可以使用市售的、 由熒光、酶標(biāo)記的抗人抗體等。作為熒光標(biāo)記,還可以考慮例如通過熒光素及羅丹明等標(biāo)記、GFP(綠色熒光蛋白)等熒光蛋白進(jìn)行標(biāo)記。作為酶標(biāo)記,可以利用過氧化物酶、堿性磷酸酶或熒光素酶、葡萄糖氧化酶等,但并不限于上述這些酶。用于通過這些酶測(cè)定的基質(zhì)是市售的,例如為過氧化物酶時(shí),可以使用TBA、化學(xué)發(fā)光法用的基質(zhì)。此外,作為放射性同位素,可以舉出例如碘(1251、1211)、碳(14C)、硫(%)、以及氣(3H),為核酸時(shí),可以舉出磷(32P)寸。生物學(xué)樣品(sample)中存在的抗體的量,可以使用例如直線回歸計(jì)算機(jī)算法,通過與標(biāo)準(zhǔn)的制備物(例如為臨床樣本時(shí),健康人的標(biāo)準(zhǔn)樣品或者典型患者的標(biāo)準(zhǔn)樣品)中存在的量進(jìn)行比較可以簡(jiǎn)單地算出。用于檢測(cè)抗體的這樣的分析法,例如,關(guān)于ELISAjn Iacobelli 等人,Breast Cancer Research and Treatment 11:19-30(1988)中所記載。或者,例如,當(dāng)SITH-I蛋白的抗體效價(jià)低時(shí),由于非特異性結(jié)合導(dǎo)致的背景信號(hào)的影響增大。此時(shí),如實(shí)施例所示,通過從測(cè)定值中適當(dāng)?shù)販p去沒有固相化抗原的區(qū)域的測(cè)定值,能更正確地求出抗體的量。例如,當(dāng)生物學(xué)樣品中的SITH-I蛋白的抗體少時(shí)(抗體效價(jià)低時(shí))、或血清等的生物學(xué)樣品中的非特異性結(jié)合多時(shí),非特異性結(jié)合對(duì)背景信號(hào)的影響變大。為此,通過從測(cè)定值中適當(dāng)?shù)販p去背景信號(hào),可以更為正確地對(duì)想要檢測(cè)的物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)實(shí)驗(yàn)體系適當(dāng)?shù)嘏袛嗨鶞p去的背景。例如實(shí)施例2至4中所記載的,下述實(shí)施方式也是有效的從固定化有SITH-I抗原的擔(dān)載體的測(cè)定值,減去沒有固定化SITH-I抗原的區(qū)域(但與固定化有SITH-I抗原的區(qū)域一樣,進(jìn)行了 BSA等的封閉操作,并且添加了含抗SITH-I抗體的血清(生物學(xué)樣品)) 的測(cè)定值。或優(yōu)選,通過減去固定化有人類不具有抗體的任意蛋白質(zhì)(可以列舉GFP等,但不局限于此)的區(qū)域的測(cè)定值,能更正確地求出抗體的量。固定化的方法沒有特別限制,優(yōu)選將對(duì)象的蛋白質(zhì)生物素化,通過生物素-生物素結(jié)合性蛋白之間的結(jié)合而固定化在結(jié)合有生物素結(jié)合性蛋白的擔(dān)載體上。本發(fā)明的檢測(cè)方法,能夠?qū)ρ逯械目贵w效價(jià)低的SITH-I蛋白抗體進(jìn)行特異性檢測(cè)。II.結(jié)合有SITH-I蛋白的擔(dān)載體本發(fā)明還提供一種用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中的SITH-I蛋白抗體的擔(dān)載體。本發(fā)明的擔(dān)載體是結(jié)合有SITH-I蛋白的擔(dān)載體,作為結(jié)合方法,如上所述,可以列舉疏水結(jié)合、共價(jià)結(jié)合、抗生物素蛋白-生物素結(jié)合等的方法、使用各種各樣的標(biāo)簽的方法等。本發(fā)明的擔(dān)載體,更優(yōu)選為其特征在于=SITH-I蛋白與擔(dān)載體通過生物素-生物素結(jié)合性蛋白之間的結(jié)合而結(jié)合在一起。本發(fā)明的擔(dān)載體,優(yōu)選為是以如下方法所制備的1)準(zhǔn)備結(jié)合有生物素結(jié)合性蛋白的擔(dān)載體,以及生物素化SITH-I蛋白;2)通過生物素-生物素結(jié)合性蛋白之間的結(jié)合,使工序1)中準(zhǔn)備的擔(dān)載體與生物素化SITH-I蛋白結(jié)合。其中,1)的生物素結(jié)合性蛋白,可以直接與擔(dān)載體結(jié)合,也可以藉由生物素與擔(dān)載體結(jié)合。III.試劑盒本發(fā)明還提供一種用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中的SITH-I蛋白抗體的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒,包括A)結(jié)合有所述SITH-I蛋白的擔(dān)載體;以及,
B)用于稀釋生物學(xué)樣品的試劑,其含有由與用于表達(dá)A)的SITH-I蛋白的宿主細(xì)胞相同種的細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液。關(guān)于“結(jié)合有所述SITH-I蛋白的擔(dān)載體”,同上所述。用于稀釋生物學(xué)樣品的試劑,可以是細(xì)胞破碎提取液(以及生物素結(jié)合性蛋白) 本身,或者是將細(xì)胞破碎提取液與生物學(xué)樣品一起進(jìn)一步稀釋的試劑,也可以含有適當(dāng)?shù)木彌_液、市售的細(xì)胞稀釋液或血清稀釋液等的溶劑。此外,本發(fā)明的試劑盒,優(yōu)選為A)的擔(dān)載體,是通過生物素-生物素結(jié)合性蛋白之間的結(jié)合,結(jié)合有SITH-I蛋白的擔(dān)載體;并且,B)的試劑,是用于稀釋生物學(xué)樣品的包含下述i)或ii)的試劑,i)細(xì)胞破碎提取液和生物素結(jié)合性蛋白,所述細(xì)胞破碎提取液由與用于表達(dá)A) 的SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素結(jié)合性蛋白的宿主細(xì)胞同種的細(xì)胞制備,或ii)由下述細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液,所述細(xì)胞是在與用于表達(dá)工序A)的 SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素結(jié)合性蛋白的宿主細(xì)胞相同種的細(xì)胞中通過基因工程技術(shù)表達(dá)了生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的細(xì)胞。關(guān)于“通過生物素-生物素結(jié)合性蛋白之間的結(jié)合,結(jié)合有與SITH-I蛋白的擔(dān)載體”,同上所述。此外,關(guān)于“由與用于表達(dá)A)的SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素結(jié)合性蛋白的宿主細(xì)胞同種的細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液”,“生物素結(jié)合性蛋白” “由在與用于表達(dá)工序A)的SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素結(jié)合性蛋白的宿主細(xì)胞相同種的細(xì)胞中通過基因工程技術(shù)表達(dá)了生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液”,同上所述。此外,本發(fā)明的試劑盒,包括A)所述 SITH-I 蛋白;B)用于固定化A)的SITH-I蛋白的擔(dān)載體;以及C)用于稀釋生物學(xué)樣品的試劑,其含有由與用于表達(dá)A)的SITH-I蛋白的宿主細(xì)胞相同種的細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液。關(guān)于“所述SITH-I蛋白”,當(dāng)利用疏水結(jié)合、共價(jià)結(jié)合等而與擔(dān)載體結(jié)合時(shí),優(yōu)選是經(jīng)過純化的。利用上述的使用各種各樣的標(biāo)簽的方法、利用生物素-生物素結(jié)合性蛋白之間的結(jié)合的方法時(shí),如同上述,優(yōu)選是結(jié)合有該標(biāo)簽、生物素的SITH-I蛋白?!坝糜诠潭ɑ疉)的SITH-I蛋白的擔(dān)載體”,可以使用上述的擔(dān)載體,優(yōu)選進(jìn)行過用于與“所述SITH-I蛋白”結(jié)合的處理的擔(dān)載體?!坝膳c用于表達(dá)A)的SITH-I蛋白的宿主細(xì)胞相同種的細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液” “用于稀釋生物學(xué)樣品的試劑”也是如同上述。所述本發(fā)明的試劑盒,優(yōu)選如下所述A)的SITH-I蛋白是生物素化的;B)的擔(dān)載體直接或間接地與生物素結(jié)合性蛋白結(jié)合;C)的試劑,是用于稀釋生物學(xué)樣品的包含下述i)或ii)的試劑,
i)細(xì)胞破碎提取液和生物素結(jié)合性蛋白,所述細(xì)胞破碎提取液由與用于表達(dá)A)或B)的SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素結(jié)合性蛋白的宿主細(xì)胞同種的細(xì)胞制備,或ii)由下述細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液,所述細(xì)胞是在與用于表達(dá)工序A)或B)的 SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素結(jié)合性蛋白的宿主細(xì)胞相同種的細(xì)胞中通過基因工程技術(shù)表達(dá)了生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的細(xì)胞。SITH-I蛋白的生物素化的方法,與生物素結(jié)合性蛋白直接或間接地結(jié)合的擔(dān)載體,如同上述。此外,“由與用于表達(dá)A)或B)的SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素結(jié)合性蛋白的宿主細(xì)胞同種的細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液”、“生物素結(jié)合性蛋白”、“由在與用于表達(dá)工序A)或B)的SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素結(jié)合性蛋白的宿主細(xì)胞相同種的細(xì)胞中通過基因工程技術(shù)表達(dá)了生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液?!?、“用于稀釋生物學(xué)樣品的試劑”如同上述。實(shí)施例以下,通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體說明,但這些實(shí)施例不是用于限定本發(fā)明的技術(shù)范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員依據(jù)本說明書的記載可以容易地對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修飾/變更,這些也包含在本發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)。在本說明書的實(shí)施例1至3中,利用大腸桿菌表達(dá)來源于人皰疹病毒6 (HHV-6)的 SITH-I蛋白和生物素化序列anvitrogen公司的Biofese標(biāo)簽)的融合蛋白,使由此得到的大腸桿菌粗提取液直接與tamavidin2(以下,記載為“TM2”)固定化微孔板反應(yīng),融合蛋白通過tamavidin-生物素結(jié)合與微孔板結(jié)合。在這樣得到的SITH-I蛋白質(zhì)結(jié)合板中,與利用大腸桿菌粗提取液稀釋的人血清 (包含兔抗SITH-I抗體。因市售的人血清中不包含抗SITH-I抗體,在本試驗(yàn)中,作為樣本, 使用了向市售的人血清中加入逐級(jí)稀釋的兔抗SITH-I抗體(抗血清)而得到的血清。)反應(yīng),對(duì)人血清中包含的抗SITH-I抗體效價(jià)進(jìn)行了測(cè)定。實(shí)施例1構(gòu)建SITH-I與生物素化序列(Bic^ase標(biāo)簽)的融合蛋白的表達(dá)用載體設(shè)計(jì)編碼融合蛋白的基因,該融合蛋白是在SITH-I蛋白的N末端配置有Biofese 標(biāo)簽的融合蛋白。該BioEase標(biāo)簽是包含在生物體內(nèi)(此情況為大腸桿菌中),通過生物體內(nèi)的生物素化酶被生物素化的序列的肽標(biāo)簽。將Biofese-SITH-I融合蛋白的氨基酸序列表示在SEQ ID NO 8中,將編碼的堿基序列表示在SEQ ID NO :9中。1-1.引物的設(shè)計(jì)為了構(gòu)建Biofese-SITH-I融合基因,首先,設(shè)計(jì)了用于擴(kuò)增SITH-1基因的引物。也就是說,設(shè)計(jì)了由編碼SITH-I蛋白的N末端部位的DNA序列所構(gòu)成的引物 (SITHlNtermGff-F)和逆向編碼SITH-I蛋白的C末端部位的DNA序列所構(gòu)成的引物 (SITHlCtermGff-R)。將用于構(gòu)建SITH-I和Biofese標(biāo)簽的融合基因的引物表示在表1中。[表 1]SITH-I基因擴(kuò)增用引物
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中的由HHV-6潛伏感染中間階段轉(zhuǎn)錄物編碼的小蛋白質(zhì) (SITH-I)的抗體的方法,該方法包括1)準(zhǔn)備SITH-I蛋白;2)使工序1)準(zhǔn)備的SITH-I蛋白與擔(dān)載體結(jié)合;3)使生物學(xué)樣品與工序2)制作的結(jié)合有SITH-I蛋白的擔(dān)載體接觸,檢測(cè)SITH-I蛋白抗體。
2.權(quán)利要求1所述的方法,其中,SITH-I蛋白選自以下的組(a)具有SEQID NO 1的氨基酸序列的蛋白質(zhì);(b)具有SEQID NO :1的氨基酸序列中缺失、取代、插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列,并且具有使細(xì)胞內(nèi)鈣濃度上升的活性的蛋白質(zhì);(c)具有與SEQID NO 1的氨基酸序列的同一性至少為80%的氨基酸序列,并且具有使細(xì)胞內(nèi)鈣濃度上升的活性的蛋白質(zhì);(d)具有由SEQID NO 2的堿基序列構(gòu)成的核酸編碼的氨基酸序列的蛋白質(zhì);(e)具有由SEQID NO :2的堿基序列中缺失、取代、插入和/或添加一個(gè)或多個(gè)核苷酸而得到的堿基序列構(gòu)成的核酸編碼的氨基酸序列,并且具有使細(xì)胞內(nèi)鈣濃度上升的活性的蛋白質(zhì);(f)具有由與SEQID NO :2的堿基序列的同一性至少為80%的核酸序列構(gòu)成的核酸編碼的氨基酸序列,并且具有使細(xì)胞內(nèi)鈣濃度上升的活性的蛋白質(zhì);以及(g)由與由SEQID NO :2的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列構(gòu)成的核酸在嚴(yán)格雜交條件下雜交的核酸編碼,并且具有使細(xì)胞內(nèi)鈣濃度上升的活性的蛋白質(zhì)。
3.權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)方法,其中,在權(quán)利要求1的工序3)中,將(a)生物學(xué)樣品,以及(b)由與用于表達(dá)工序1)的SITH-I蛋白的宿主細(xì)胞同種的細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液混合后添加至由工序2)制作的結(jié)合有SITH-I蛋白的擔(dān)載體中。
4.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法,其中,在權(quán)利要求1的工序2)中,利用生物素-生物素結(jié)合性蛋白之間的結(jié)合,使SITH-I蛋白與擔(dān)載體結(jié)合。
5.權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法,其中,在權(quán)利要求1的工序3)中,將(a)生物學(xué)樣品;以及(b-i)細(xì)胞破碎提取液和生物素結(jié)合性蛋白,所述細(xì)胞破碎提取液由與用于表達(dá)工序 1)或2)的SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素結(jié)合性蛋白的宿主細(xì)胞同種的細(xì)胞制備,或(b-ii)由下述細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液,所述細(xì)胞是在與用于表達(dá)工序1)或2)的 SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素結(jié)合性蛋白的宿主細(xì)胞同種的細(xì)胞中通過基因工程技術(shù)表達(dá)了生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的細(xì)胞;混合后添加至由工序2)制作的結(jié)合有SITH-I蛋白的擔(dān)載體中。
6.權(quán)利要求3至5中任一項(xiàng)所述的方法,其中,在權(quán)利要求3的工序3(b)或權(quán)利要求5 的工序3 (b-i)中,添加由含任意載體的細(xì)胞提取的細(xì)胞破碎提取液作為細(xì)胞破碎提取液。
7.權(quán)利要求4至6中任一項(xiàng)所述的方法,其中,生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)是tamavidin或其變體。
8.權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法,其中,生物學(xué)樣品選自血液、血清、腦脊髓液、 唾液、咽喉拭子、汗、尿、淚、淋巴液、精液、腹水以及母乳。
9.一種用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中的由HHV-6潛伏感染中間階段轉(zhuǎn)錄物編碼的小蛋白質(zhì) (SITH-I)的抗體的擔(dān)載體,其是結(jié)合有所述SITH-I蛋白的擔(dān)載體。
10.權(quán)利要求9所述的擔(dān)載體,其中,SITH-I蛋白通過生物素-生物素結(jié)合性蛋白之間的結(jié)合而與擔(dān)載體結(jié)合。
11.一種用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中的由HHV-6潛伏感染中間階段轉(zhuǎn)錄物編碼的小蛋白質(zhì) (SITH-I)的抗體的試劑盒,其包括A)結(jié)合有所述SITH-I蛋白的擔(dān)載體;以及,B)用于稀釋生物學(xué)樣品的試劑,其含有由與用于表達(dá)A)的SITH-I蛋白的宿主細(xì)胞同種的細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液。
12.權(quán)利要求11所述的試劑盒,其中,A)的擔(dān)載體是通過生物素-生物素結(jié)合性蛋白之間的結(jié)合而結(jié)合有SITH-I蛋白的擔(dān)載體;并且,B)的試劑是用于稀釋生物學(xué)樣品的包含下述i)或ii)的試劑,i)細(xì)胞破碎提取液和生物素結(jié)合性蛋白,所述細(xì)胞破碎提取液由與用于表達(dá)A)的 SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素結(jié)合性蛋白的宿主細(xì)胞同種的細(xì)胞制備, 或 )由下述細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液,所述細(xì)胞是在與用于表達(dá)工序A)的SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素結(jié)合性蛋白的宿主細(xì)胞相同種的細(xì)胞中通過基因工程技術(shù)表達(dá)了生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的細(xì)胞。
13.一種用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中的由HHV-6潛伏感染中間階段轉(zhuǎn)錄物編碼的小蛋白質(zhì) (SITH-I)的抗體的試劑盒,其包括A)所述SITH-I蛋白;B)用于固定化A)的SITH-I蛋白的擔(dān)載體;以及C)用于稀釋生物學(xué)樣品的試劑,其含有由與用于表達(dá)A)的SITH-I蛋白的宿主細(xì)胞同種的細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液。
14.權(quán)利要求13所述的試劑盒,其中,A)的SITH-I蛋白是生物素化的;B)的擔(dān)載體直接或間接地與生物素結(jié)合性蛋白結(jié)合;C)的試劑是用于稀釋生物學(xué)樣品的包含下述i)或ii)的試劑,i)細(xì)胞破碎提取液和生物素結(jié)合性蛋白,所述細(xì)胞破碎提取液由與用于表達(dá)A)或B) 的SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素結(jié)合性蛋白的宿主細(xì)胞同種的細(xì)胞制備,或ii)由下述細(xì)胞制備的細(xì)胞破碎提取液,所述細(xì)胞是在與用于表達(dá)工序A)或B)的 SITH-I蛋白、生物素化SITH-I蛋白、和/或生物素結(jié)合性蛋白的宿主細(xì)胞同種的細(xì)胞中通過基因工程技術(shù)表達(dá)了生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)的細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中的由HHV-6潛伏感染中間階段轉(zhuǎn)錄物編碼的小蛋白質(zhì)(Small protein encoded by the Intermediate stage Transcript of HHV-6)(SITH-1)的抗體的方法。本發(fā)明的方法包括1)準(zhǔn)備SITH-1蛋白;2)使工序1)準(zhǔn)備的SITH-1蛋白與擔(dān)載體結(jié)合;3)使生物學(xué)樣品與工序2)制作的結(jié)合有SITH-1蛋白的擔(dān)載體接觸,檢測(cè)SITH-1蛋白抗體。
文檔編號(hào)C07K14/03GK102449483SQ20108002390
公開日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2010年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月31日
發(fā)明者岡直美, 小林伸行, 近藤一博, 高倉(cāng)由光 申請(qǐng)人:日本煙草產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社