專利名稱：顯示出縮短的生物學活性的神經(jīng)毒素的制作方法
顯示出縮短的生物學活性的神經(jīng)毒素本發(fā)明涉及制藥領域。具體地，預期編碼神經(jīng)毒素多肽的多核苷酸，所述多肽在受試者中顯示出生物學效應減少的持續(xù)時間，其中所述多肽在輕鏈中包含至少一個降解信號，以及包含所述多核苷酸的載體和宿主細胞，由此編碼的多肽，和特異性地與所述多肽結合的抗體。此外，本發(fā)明涉及包含所述多核苷酸和多肽的藥物以及該藥物特定的治療應用。 此外，本發(fā)明預期用于所述多肽和藥物生產(chǎn)的方法。肉毒桿菌和破傷風梭菌產(chǎn)生高效的神經(jīng)毒素，即分別為肉毒毒素(BoNTs)和破傷風毒素(TeNT)。這些梭菌神經(jīng)毒素(CNTs)與神經(jīng)元細胞特異性地結合并且干擾神經(jīng)遞質釋放。每種毒素被合成為無活性的未加工的約150kDa的單鏈蛋白。翻譯后加工涉及二硫鍵的形成和細菌蛋白酶的有限蛋白酶解(切割)?；钚缘纳窠?jīng)毒素由兩條鏈組成，它們是通過二硫鍵連接的約50kDa的N端輕鏈和約IOOkDa的重鏈。CNTs由三個結構域組成，即催化輕鏈，包括易位結構域(N端的一半)的重鏈和受體結合結構域(C端的一半)，見Krieglstein 1990, Eur J Biochem 188,39 ；Krieglsteinl991, Eur J Biochem 202,41 ；Krieglstein 1994，J Protein Chem 13，49。肉毒桿菌神經(jīng)毒素以分子復合體形式合成，其包含150kDa 的神經(jīng)毒素蛋白和相關的無毒性的復合蛋白。基于梭菌菌株和不同的神經(jīng)毒素血清型，復合體的大小在300kDa至900kDa的范圍內(nèi)變化。在這些復合體中的復合蛋白穩(wěn)定神經(jīng)毒素并且保護其免于降解，見 Chen 1998，Infect Immun 66(6) :2420_2425。肉毒桿菌分泌七種抗原性不同的血清型，其被稱作肉毒桿菌神經(jīng)毒素(BoNT)的 A至G型。全部血清型和破傷風梭菌分泌的相關破傷風神經(jīng)毒素(TeNT)是Si2+內(nèi)切蛋白酶，所述Si2+內(nèi)切蛋白酶通過裂解SNARE蛋白封閉突觸的胞吐作用，見Couesnon，2006， Microbiology, 152，759。CNTs在肉毒中毒中引起可見的弛緩性肌肉麻痹，見Fischer 2007，PNAS 104,10447。盡管它具有毒性作用，肉毒桿菌毒素已經(jīng)用于很多疾病或病癥的治療劑。在1989 年肉毒桿菌毒素血清型A在美國被批準用于人的斜視、瞼痙攣和其他的病癥的治療。它可作為肉毒桿菌毒素A蛋白復合體通過商業(yè)途徑得到，例如以商品名BOTOX (Al lergan Inc) 或者商品名DYSP0RT(Ipsen Ltd)獲得。為了治療應用，直接將復合體注射入待治療的肌肉中。在生理PH下，毒素從蛋白復合體中釋放出來，并且產(chǎn)生了所期望的藥理學效應。一種改進的非復合體的神經(jīng)毒素A多肽制劑以商品名XE0MIN(Merz Pharmaceuticals GmbH)獲得。肉毒桿菌毒素的效應只是暫時的，這是需要肉毒桿菌毒素的重復施用以維持治療效果的原因。梭菌神經(jīng)毒素減弱隨意肌強度并且是斜視、包括頸肌張力障礙的灶性張力障礙， 以及良性自發(fā)性瞼痙攣的有效的治療劑。已經(jīng)進一步地顯示梭菌神經(jīng)毒素減輕單側面部痙攣和局限性痙攣，并且，此外，其對多種其他的適應癥如胃腸病癥、多汗以及美容除皺是有效的，見 Jost 2007, Drugs 67，669。然而，對于醫(yī)學狀況或疾病如傷口愈合、骨的固定和腱斷裂治療、外科手術后固定，特別用于痔切除術、牙植入物的引入或者髖關節(jié)置換術(內(nèi)假體)、膝關節(jié)形成術、眼科手術、痤瘡或者易激腸疾病，減弱肌肉強度和收縮也是所希望的。神經(jīng)毒素通常在一段時間內(nèi)顯示它們的生物學效應，所述一段時間比所述疾病或狀況的有效治療實際需要的時間長。然而，在所述醫(yī)學狀況或疾病的治療中延長的肌肉麻痹是有害的或者至少不是優(yōu)選的。 然而，只在所希望的時間段內(nèi)顯示它們的生物學效應的神經(jīng)毒素還不能得到。因此，本發(fā)明的技術問題可以看作是提供滿足前述需要的手段和方法。通過權利要求和下文表征的實施方案解決了該技術問題。因此，本發(fā)明涉及編碼神經(jīng)毒素多肽的多核苷酸，所述多肽在受試者中顯示生物學效應減少的持續(xù)時間，其中所述多肽在輕鏈中包含至少一個降解信號。本文使用的術語“多核苷酸”指的是單鏈或雙鏈DNA分子以及RNA分子。所述術語包括基因組DNA、cDNA、hnRNA、mRNA以及這些分子種類所有的天然出現(xiàn)的或者人工修飾的衍生物。一方面，該多核苷酸可以是線性或者環(huán)形分子。此外，除了編碼前述神經(jīng)毒素多肽的核酸序列，本發(fā)明的多核苷酸可以包含正確的轉錄和/或翻譯需要的其他的序列， 如5'或3' UTR序列。本發(fā)明的多核苷酸編碼經(jīng)修飾的神經(jīng)毒素多肽，所述神經(jīng)毒素多肽來源于肉毒桿菌神經(jīng)毒素的抗原性不同的血清型之一，即BoNT/A、BoNT/B、BoNT/CU BoNT/ D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G或者破傷風神經(jīng)毒素(TeNT)。在本發(fā)明的一方面，所述多核苷酸包含在 SEQ ID NO 1 (BoNT/A)、SEQ ID NO 3 (BoNT/B)、SEQ ID NO :5(BoNT/Cl)、SEQ ID NO :7(BoNT/D)、SEQ ID NO :9 (BoNT/E)、SEQ ID NO : 11 (BoNT/F)、SEQ ID NO 13 (BoNT/G)或者SEQ ID NO 15 (TeNT)中所示的核酸序列。此外，在一方面包括多核苷酸序列，其包含核酸序列，所述核酸序列編碼顯示為SEQ ID NO 2 (BoNT/A)、SEQ ID NO 4 (BoNT/B)、SEQ ID NO 6 (BoNT/Cl)、SEQ ID NO 8 (BoNT/D)、SEQ ID NO 10 (BoNT/E)、SEQ ID NO :12 (BoNT/F)、 SEQ ID NO 14(BoNT/G)或SEQ ID NO 16 (TeNT)中的任一個的氨基酸序列。另一方面，所述多核苷酸是前述多核苷酸的變體，其包含一個或者多個核苷酸取代、缺失和/或添加，在另一方面該變體仍可導致其編碼的氨基酸具有一個或者多個氨基酸的取代、缺失和/或添力口。此外，在另一方面，本發(fā)明的變體多核苷酸包含核酸序列變體，其與SEQ ID NOs :1,3, 5、7、9、11、13或者15的任一個中所示的核酸序列有至少40%，至少50%，至少60%，至少 70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少98%或者至少99%的同一性，或者這樣的核酸序列變體，該核酸序列變體編碼的氨基酸序列與SEQ ID NOs :2,4,6, 8，10，12，14，或者16中的任一個顯示的氨基酸序列有至少40 %，至少50 %，至少60 %，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少98%或者至少99% 的同一性。此處使用的術語“同一性”指的是序列同一性，其如下表征確定兩種核酸序列或者氨基酸序列之間相同的氨基酸數(shù)目，其中所述序列被比對以取得最高階匹配。使用計算機程序中編碼的公開的技術或方法例如BLASTP，BLASTN或FASTA(Altschul 1990，J Mol Biol215，40;3)可以計算序列同一性。一方面，在完整氨基酸序列上計算百分比同一性值。技術人員可得到用于比較不同序列的基于多種算法的一系列程序。在本上下文中， Needleman和^msch或者Smith和Waterman的算法提供特別可信的結果?？梢允褂贸绦?PileUp (Higgins 1989，CABI0S5，151)或者程序 Gap 和 BestFit (Needleman 1970，J Mol Biol 48 ；443 ；Smith 1981, Adv Appl Math 2,482)進行序列比對，所述程序是GCG軟件包 (Genetics Computer Group 1991,575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) 的一部分。在本發(fā)明的另一方面，在完整序列區(qū)使用程序GAP確定上文所述的序列同一性值(以百分比(％ )表示)，使用以下設定空位權重50，長度權重3，平均匹配10. 000和平均錯配0. 000，除非另外特別指出，該設定將一直用作序列比對的標準設定。一方面，每個前述變體多核苷酸編碼保留各自神經(jīng)毒素多肽的一種或者多種或者全部生物學性質的多肽，所述各自神經(jīng)毒素多肽即BoNT/A，BoNT/B，BoNT/Cl，BoNT/D，BoNT/ Ε, BoNT/F, BoNT/G或者破傷風神經(jīng)毒素(TeNT)。盡管可以想到未加工的前體可以行使一些生物功能或者有部分活性，本領域技術人員將理解其只有在蛋白水解激活后才能保持全部生物學活性。此處使用的“生物學活性”指的是(a)受體結合，(b)內(nèi)化，(c)穿過內(nèi)體膜進入胞質的易位，和/或(d)涉及突觸囊泡膜融合的蛋白質的內(nèi)切蛋白酶解切割。用于評估生物學活性的體內(nèi)測定包括Pearce等人(Pearce 1994, Toxicol Appl Pharmacol 128 :69-77)和 Dressier 等人(Dressier 2005,Mov Disord 20 1617-1619,Keller 2006， Neuroscience 139:629-637)描述的小鼠LD50測定和離體小鼠半隔膜測定。生物學活性通常用小鼠單位(MU)表示。此處使用的IMU是經(jīng)腹膜內(nèi)注射后殺死50%的特定小鼠群體的神經(jīng)毒素組分的量，即小鼠i. P. LD50。另一方面，變體多核苷酸可以編碼具有改進的或者改變的生物學性質的神經(jīng)毒素，如它們可以包含切割位點，其改進酶的識別或者可以改進受體的結合或者上文提到的任何其他性質。此外，一方面包括融合多肽，其進一步地包含可檢測的標記肽或者標記。一方面， 適合的標記是FLAG-標記，Myc-標記或者His-標記，所述標記也允許帶標記的多肽的更有效的純化。一方面，可檢測的標記肽包括熒光蛋白如GFP，BFP等等。另一方面，變體多核苷酸應該編碼融合神經(jīng)毒素多肽，其包含不同血清型的至少兩種神經(jīng)毒素多肽的一部分，例如包含BoNT/A的重鏈和BoNT/E的輕鏈的融合神經(jīng)毒素。本發(fā)明的多核苷酸編碼的神經(jīng)毒素多肽在它的輕鏈上進一步地包含至少一個降解信號。在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的多核苷酸編碼的神經(jīng)毒素多肽的所述輕鏈通過輕鏈的修飾得到，被修飾的輕鏈由包含前述特定的核酸序列或者上文描述的它們的變體中的任一個的多核苷酸編碼。前體多肽(單鏈多肽)的蛋白水解切割產(chǎn)生神經(jīng)毒素多肽的輕鏈。 該輕鏈是前體多肽的N端部分，所述N端部分由蛋白水解切割得到。一方面，可以從下表指出的切割位點推導上文涉及的神經(jīng)毒素多肽輕鏈的氨基酸序列。
權利要求
1.編碼神經(jīng)毒素多肽的多核苷酸，所述多肽在受試者中顯示出生物學效應縮短的持續(xù)時間，其中所述多肽在輕鏈中包含至少一個降解信號。
2.權利要求1的多核苷酸，其中所述生物學效應在受試者中引起肌肉麻痹。
3.權利要求1和2的多核苷酸，其中所述縮短的持續(xù)時間持續(xù)少于4、3或者2周。
4.權利要求1至3任一項的多核苷酸，其中所述降解信號選自a)至少一個內(nèi)部或末端引入的PEST基序；b)至少一個內(nèi)部或末端引入的E3連接酶識別基序；c)N-端寡賴氨酸殘基；d)N-端連接的泛素；e)N-端脯氨酸用堿性氨基酸取代；f)表面展示的氨基酸殘基用賴氨酸取代；并且g)N-端脯氨酸用堿性氨基酸取代與表面展示的氨基酸殘基用賴氨酸取代相組合。
5.權利要求1至4任一項的多核苷酸，其中所述多肽的所述輕鏈通過修飾包含核酸序列的多核苷酸編碼的輕鏈得到，所述核酸序列選自a)具有SEQID NO :1、3、5、7、9、11、13或者15中顯示的核苷酸序列的核酸序列；b)編碼具有SEQID NO :2、4、6、8、10、12、14或者16中顯示的氨基酸序列的多肽的核酸序列；和c)與a)或b)的核酸序列有至少40%同一性的核酸序列。
6.載體，其包含權利要求1至5任一項的多核苷酸。
7.宿主細胞，其包含權利要求1至5任一項的多核苷酸或者權利要求6的載體。
8.權利要求7的宿主細胞，其中所述細胞是大腸桿菌細胞或者梭菌屬或者芽孢桿菌屬細胞。
9.權利要求1至5任一項的多核苷酸編碼的多肽。
10.抗體，其與權利要求9的多肽特異性結合。
11.根據(jù)權利要求1至5任一項的多核苷酸，其用作藥物。
12.根據(jù)權利要求9的多肽，其用作藥物。
13.權利要求1至5任一項的多核苷酸或者權利要求9的多肽在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療傷口愈合、骨的固定和腱斷裂治療、外科手術后固定，特別用于痔切除術、 牙移植物的引入或者髖關節(jié)置換術(內(nèi)假體)、膝關節(jié)置換術、眼科手術、痤瘡或者易激腸疾病。
14.制備權利要求1至5任一項的多核苷酸編碼的神經(jīng)毒素多肽的方法，其包括以下步驟a)在允許權利要求1至5任一項的多核苷酸編碼的神經(jīng)毒素多肽表達的條件下培養(yǎng)權利要求7的宿主細胞，并且b)從a)的細菌培養(yǎng)物中得到權利要求1至5任一項的多核苷酸編碼的神經(jīng)毒素多肽。
15.制備藥物的方法，其包括權利要求14的方法的步驟和將權利要求1至5任一項的多核苷酸編碼的神經(jīng)毒素多肽配制為藥物的進一步步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及制藥領域。具體地，預期編碼神經(jīng)毒素多肽的多核苷酸，所述多肽在受試者中顯示出生物學效應減少的持續(xù)時間，其中所述多肽在輕鏈中包含至少一個降解信號，以及包含所述多核苷酸的載體和宿主細胞，由此編碼的多肽，和特異性地與所述多肽結合的抗體。此外，本發(fā)明涉及包含所述多核苷酸和多肽的藥物以及該藥物特定的治療應用。此外，本發(fā)明預期用于所述多肽和藥物生產(chǎn)的方法。
文檔編號A61K38/48GK102471765SQ201080027593
公開日2012年5月23日 申請日期2010年7月1日 優(yōu)先權日2009年7月2日
發(fā)明者F·霍夫曼, J·弗雷韋特 申請人:莫茨制藥有限及兩合公司