專利名稱：：Adcc活性得到增強(qiáng)的抗體及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及將抗體ADCC活性增強(qiáng)的方法和ADCC活性得到增強(qiáng)的抗體。
背景技術(shù)：
：使抗體的可變區(qū)為小鼠型而恒定區(qū)為人型的嵌合抗體、使可變區(qū)和恒定區(qū)雙方均為人型的人源化抗體，作為癌、慢性風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療藥受到期待。在癌的治療中，一直以來使用的順氯氨鉑等化學(xué)合成的治療藥，對癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的識別能力低，毒性高。因此現(xiàn)狀是，癌的化學(xué)療法對癌患者的體力負(fù)擔(dān)大。另一方面，嵌合化或人源化的抗體由于具有識別癌細(xì)胞表面上的特異性分子的作用，因此其毒性低，對于接受治療的患者來說體力負(fù)擔(dān)輕。對于慢性風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療，在以往的以類固醇藥為中心的治療中，停留在延遲風(fēng)濕癥狀的發(fā)展，但是對白介素6受體的人源化抗體由于能夠抑制骨破壞、炎癥的原因因子，因此發(fā)揮顯著的治療效果。這些治療用抗體(嵌合抗體、人源化抗體)的制作方法大致分為3種。第一種是通過基因重組技術(shù)，從小鼠抗體向嵌合抗體、人源化抗體轉(zhuǎn)化，即通過將抗體的抗原結(jié)合部位殘留并置換成人型蛋白來進(jìn)行人源化的方法。第二種是使用噬菌體展示的方法。在該方法中，由于使多種源于人的抗體可變區(qū)在噬菌體表面表達(dá)，因此可以選出能夠識別目的蛋白的完全人型可變區(qū)，從而可以以選出的完全人型可變區(qū)為材料，利用基因重組技術(shù)，制作進(jìn)一步加有人型恒定區(qū)的完全人源化抗體。最后，還有利用通過基因操作而具有人的抗體產(chǎn)生基因的TC小鼠的方法(NatureGenetics,Vol.16,113-114，1997)。該TC小鼠被作為目的蛋白的抗原免疫時，由于小鼠產(chǎn)生的抗體被基因操作使得全部成為人型，因此由將對TC小鼠進(jìn)行抗原免疫后取出的淋巴球細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合而得到的雜交瘤細(xì)胞，可以產(chǎn)生識別所免疫抗原的完全人源化抗體。14雖然可以通過上述的3種方法制作嵌合抗體或人源化抗體，但是無論使用哪種方法，治療抗體的制造成本都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于低分子化合物的治療藥，這是個問題。由于其的高制造成本，治療抗體的價格也非常高，對于癌或風(fēng)濕患者來說形成很大的治療費負(fù)擔(dān)，這是現(xiàn)狀。作為解決該問題的一個解決對策，考慮了使每單位質(zhì)量的治療抗體對癌細(xì)胞等的治療效果上升的方法。也就是說，只要以少的治療抗體量就可以獲得與以往給藥量同樣的治療效果，則可以減少對患者的每一次給藥量，此外，還可以減少每一次的藥費。作為顯示該治療抗體的治療效果的一個指標(biāo)，是抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒(ADCC)活性。該ADCC活性的機(jī)理是，治療抗體的Fc部分與能夠殺傷癌細(xì)胞的殺傷細(xì)胞上的Fq受體結(jié)合，進(jìn)而通過治療抗體的可變區(qū)的識別作用，向癌細(xì)胞導(dǎo)入殺傷細(xì)胞，結(jié)果是殺傷細(xì)胞借助于治療抗體將癌細(xì)胞殺傷。作為用于使ADCC活性上升所要求的治療抗體的性能，可以列舉1)治療抗體的可變區(qū)可以高效識別特異性地位于癌細(xì)胞表面的蛋白，2)治療抗體的Fc部分可以與殺傷細(xì)胞上的Fq受體牢固結(jié)合。一直以來進(jìn)行了很多通過解決該2)的項目而使ADCC活性上升的研究。ShinkawaT等人著眼于與作為治療抗體IgGl的Fc區(qū)域的297位氨基酸即天冬酰胺(Asn)結(jié)合的兩個糖鏈(N-Linkedoligosaccharide)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)如果形成該糖鏈結(jié)構(gòu)的巖藻糖缺損的糖鏈結(jié)構(gòu)，則ADCC活性上升20倍~100倍(J.Biol.Chem.Vol.278,3466-3473，2003)。該由巖藻糖缺損結(jié)構(gòu)帶來的ADCC活性的報道，也由ShieldsRL等人發(fā)表(J.Biol.Chem.Vol.277,26733-26740，2002)。此外，PabloU等人也著眼于同樣的糖鏈結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)通過控制該糖鏈結(jié)構(gòu)中bisectingN國acetylglucosamine的結(jié)合量，ADCC活性可以上升數(shù)倍(NatureBiotechnologyVol.17,176-180,1999)。除了這樣的、通過改變與IgGl的Fc區(qū)域結(jié)合的糖鏈結(jié)構(gòu)來使該治療抗體的ADCC活性上升的方法以外，美國GenentechInc.等研究者釆用計算機(jī)檢索來檢索通過在治療抗體的Fc結(jié)構(gòu)自身的氨基酸中加入變異而使其與Fc受體的結(jié)合增強(qiáng)的技術(shù)，通過S298A，E333A，K334A的三重變異，成功地使ADCC活性增強(qiáng)數(shù)十倍(J.Biol.Chem.Vol.276,6591-6604，2001)。另外，以下列出與本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)。專利文獻(xiàn)l:WO2004/029207專利文獻(xiàn)2:WO2000/042072專利文獻(xiàn)3:WO2004/063351專利文獻(xiàn)4:WO2004/099249專利文獻(xiàn)5:WO2006/019447專利文獻(xiàn)6:特表2006-512407專利文獻(xiàn)7:特表2003-512019專利文獻(xiàn)8:WO2006/104989專利文獻(xiàn)9:WO2006/105062非專利文獻(xiàn)1:NatureGenetics,Vol.16,113-114，1997非專利文獻(xiàn)2:J.Biol.Chem.Vol.278，3466-3473,2003非專利文獻(xiàn)3:J.Biol.Chem.Vol.277,26733-26740，2002非專利文獻(xiàn)4:NatureBiotechnologyVol.l7，176-180，1999非專利文獻(xiàn)5:J.Biol.Chem.Vol.276，6591-6604,200
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的課題在于提供ADCC活性得到增強(qiáng)的抗體及其制造方法。本發(fā)明人進(jìn)一步擴(kuò)展了GenentechInc等研究者進(jìn)行的Fc區(qū)域的氨基酸變異，進(jìn)行了如下研究，即，在Fc區(qū)域?qū)胗捎嬎銠C(jī)檢索無法導(dǎo)出的可能伴有大幅度結(jié)構(gòu)變化的氨基酸即半胱氨酸(Cys)，看是否可以使ADCC活性增強(qiáng)。半胱氨酸置換意味著導(dǎo)入硫醇基(-SH)，所以生成二疏鍵(-S-S-)。因此，期待帶來Fc結(jié)構(gòu)的強(qiáng)烈變化。本發(fā)明人進(jìn)行了如下研究，即，在人Cyl(序列號53記載的氨基酸序列)中，將Elvin16A.Kabat等在SequenceofproteinsofImmunologicalInterest(NIHPublicationNo.91-3242,1991)中給出的人IgGlH鏈恒定區(qū)的EUindex編號(在本說明書中，以下有時記作"kabat編號，，)的280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、2卯、291、292、293、294、298、299、300、301、302、303、305、306、307、308、309、310或314位的氨基酸置換成半胱氨酸(以下，有時簡記為Cys)，看是否可以增強(qiáng)ADCC活性。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將人Cyl的286、287、288、289、290、291、292、294、298、301、302、303、305、306、307、308或309位的氨基酸置換成Cys的嵌合抗體，與野生型嵌合抗體相比顯示出非常高的ADCC活性，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明提供以下〔1〕~〔41〕的發(fā)明。〔1〕一種抗體，其特征在于，在H鏈恒定區(qū)中，選自286、287、288、289、2卯、291、292、294、298、301、302、303、305、306、307、308或309位中的至少1個位置的氨基酸殘基被置換成半胱氨酸?！?〕如〔1〕所述的抗體，其特征在于，H鏈恒定區(qū)是選自人CYl、Cy2、Cy3以及Cy4中的任一個恒定區(qū)。〔3〕如〔1〕或〔2〕中任一項所述的抗體，其特征在于，與置換前相比ADCC活性上升?！?〕如〔1〕~〔3〕中任一項所述的抗體，其特征在于，具有得到改善的穩(wěn)定性、溶解性或?qū)c配體的結(jié)合親和性?！?〕如〔1〕~〔4〕中任一項所述的抗體，其特征在于，被賦予糖鏈?！?〕如〔5〕所述的抗體，其特征在于，改善了效應(yīng)功能?！?〕如〔1〕~〔6〕中任一項所述的抗體，其特征在于，與FqrRI、FcyRII、FcyRIII、或FcRn結(jié)合。〔8〕如〔1〕~〔7〕中任一項所述的抗體，其特征在于，對選自CD20、CD22、CD33、CD52、Her2/neu、EGFR、EpCAM、MUC1、GD3、CEA、CA125、HLA-DR、TNFa和VEGF中的目標(biāo)抗原具有特異性。〔9〕一種抗體，其特征在于，是對CD20具有特異性的人源化抗體，選白286、287、288、289、290、291、292、294、298、301、302、303、305、306、307、308以及309位中的至少1個位置的氨基酸殘基被置換成半胱氨酸?！?0〕下述(1)~(4)中任一項所述的抗體(1)含有具有如下氨基酸序列的H鏈的抗體，所述氨基酸序列是作為CDR1的序列號47記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號49記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號51記載的氨基酸序列、和作為CH的序列號95記載的氨基酸序列；(2)含有具有序列號93記載的氨基酸序列的H鏈的抗體；(3)含有具有如下氨基酸序列的H鏈的抗體，所述氨基酸序列是作為CDR1的序列號47記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號49記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號51記載的氨基酸序列、和作為Fc區(qū)域的序列號97記載的氨基酸序列；(4)具有上述(1)、(2)或(3)中任一項所述的H鏈、和下述(i)或(ii)所述的L鏈的對的抗體(i)具有作為CDR1的序列號58記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號60記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號62記載的氨基酸序列、和作為CL的序列號64記載的氨基酸序列的L鏈；(ii)具有序列號56記載的氨基酸序列的L鏈。〔11〕下述(1)~(4)中任一項所述的抗體(1)含有具有如下氨基酸序列的H鏈的抗體，所述氨基酸序列是作為CDR1的序列號47記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號49記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號51記載的氨基酸序列、和作為CH的序列號101記載的氨基酸序列；(2)含有具有序列號99記載的氨基酸序列的H鏈的抗體；(3)含有具有如下氨基酸序列的H鏈的抗體，所述氨基酸序列是作為CDR1的序列號47記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號49記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號51記載的氨基酸序列、和作為Fc區(qū)域的序列號103記載的氨基酸序列；(4)具有上述(1)、(2)或(3)中任一項所述的H鏈、和下述(i)或(ii)所述的L鏈的對的抗體18(i)具有作為CDR1的序列號58記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號60記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號62記載的氨基酸序列、和作為CL的序列號64記載的氨基酸序列的L鏈；(ii)具有序列號56記載的氨基酸序列的L鏈。〔12〕下述(1)~(4)中任一項所述的抗體(1)含有具有如下氨基酸序列的H鏈的抗體，所述氨基酸序列是作為CDR1的序列號47記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號49記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號51記載的氨基酸序列、和作為CH的序列號107記載的氨基酸序列；(2)含有具有序列號105記載的氨基酸序列的H鏈的抗體；(3)含有具有如下氨基酸序列的H鏈的抗體，所述氨基酸序列是作為CDR1的序列號47記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號49記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號51記載的氨基酸序列、和作為Fc區(qū)域的序列號109記載的氨基酸序列；(4)含有上述(1)、(2)或(3)中任一項所述的H鏈、和下述(i)或(ii)所述的L鏈的對的抗體(i)具有作為CDR1的序列號58記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號60記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號62記載的氨基酸序列、和作為CL的序列號64記載的氨基酸序列的L鏈；(ii)具有序列號56記載的氨基酸序列的L鏈。〔13〕下述(1)~(4)中任一項所述的抗體(1)含有具有如下氨基酸序列的H鏈的抗體，所述氨基酸序列是作為CDR1的序列號47記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號49記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號51記載的氨基酸序列、和作為CH的序列號54記載的氨基酸序列；(2)含有具有序列號45記載的氨基酸序列的H鏈的抗體；(3)含有具有如下氨基酸序列的H鏈的抗體，所述氨基酸序列是作為CDR1的序列號47記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號49記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號51記載的氨基酸序列、和作為Fc區(qū)域的序列號73記載的氨基酸序列；(4)具有上述(1)、(2)或(3)中任一項所述的H鏈、和下述(i)或(ii)所述的L鏈的對的抗體(i)具有作為CDR1的序列號58記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號60記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號62記載的氨基酸序列、和作為CL的序列號64記載的氨基酸序列的L鏈；(ii)具有序列號56記載的氨基酸序列的L鏈?！?4〕下述(1)~(4)中任一項所述的抗體(1)含有具有如下氨基酸序列的H鏈的抗體，所述氨基酸序列是作為CDR1的序列號47記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號49記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號51記載的氨基酸序列、和作為CH的序列號83記載的氨基酸序列；(2)含有具有序列號81記載的氨基酸序列的H鏈的抗體；(3)含有具有如下氨基酸序列的H鏈的抗體，所述氨基酸序列是作為CDR1的序列號47記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號49記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號51記載的氨基酸序列、和作為Fc區(qū)域的序列號85記載的氨基酸序列；(4)具有上述(1)、(2)或(3)中任一項所述的H鏈、和下述(i)或(ii)所述的L鏈的對的抗體(i)具有作為CDR1的序列號58記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號60記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號62記載的氨基酸序列、和作為CL的序列號64記載的氨基酸序列的L鏈；(ii)具有序列號56記載的氨基酸序列的L鏈?！?5〕下述(1)~(4)中任一項所述的抗體(1)含有具有如下氨基酸序列的H鏈的抗體，所述氨基酸序列是作為CDR1的序列號47記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號49記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號51記栽的氨基酸序列、和作為CH的序列號89記載的氨基酸序列；(2)含有具有序列號87記載的氨基酸序列的H鏈的抗體；(3)含有具有如下氨基酸序列的H鏈的抗體，所述氨基酸序列是作為CDR1的序列號47記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號49記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號51記載的氨基酸序列、和作為Fc區(qū)域的序列號91記載的氨基酸序列；(4)具有上述(1)、(2)或(3)中任一項所述的H鏈、和下述(i)或(ii)所述的L鏈的對的抗體20(i)具有作為CDR1的序列號58記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號60記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號62記載的氨基酸序列、和作為CL的序列號64記載的氨基酸序列的L鏈；(ii)具有序列號56記載的氨基酸序列的L鏈、〔16〕下述(1)~(4)中任一項所述的抗體(1)含有具有如下氨基酸序列的H鏈的抗體，所述氨基酸序列是作為CDR1的序列號47記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號49記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號51記載的氨基酸序列、和作為CH的序列號131記載的氨基酸序列；(2)含有具有序列號129記載的氨基酸序列的H鏈的抗體；(3)含有具有如下氨基酸序列的H鏈的抗體，所述氨基酸序列是作為CDR1的序列號47記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號49記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號51記載的氨基酸序列、和作為Fc區(qū)域的序列號133記載的氨基酸序列；(4)具有上述(1)、(2)或(3)中任一項所述的H鏈、和下述(i)或(ii)所述的L鏈的對的抗體(i)具有作為CDR1的序列號58記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號60記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號62記載的氨基酸序列、和作為CL的序列號64記載的氨基酸序列的L鏈；(ii)具有序列號56記載的氨基酸序列的L鏈?！?7〕下述(1)~(4)中任一項所述的抗體(1)含有具有如下氨基酸序列的H鏈的抗體，所述氨基酸序列是作為CDR1的序列號47記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號49記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號51記載的氨基酸序列、和作為CH的序列號137記載的氨基酸序列；(2)含有具有序列號135記載的氨基酸序列的H鏈的抗體；(3)含有具有如下氨基酸序列的H鏈的抗體，所述氨基酸序列是作為CDR1的序列號47記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號49記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號51記載的氨基酸序列、和作為Fc區(qū)域的序列號139記載的氨基酸序列；(4)具有上述(1)、(2)或(3)中任一項所述的H鏈、和下述(i)或(ii)所述的L鏈的對的抗體(i)具有作為CDR1的序列號58記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號60記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號62記載的氨基酸序列、和作為CL的序列號64記載的氨基酸序列的L鏈；(ii)具有序列號56記載的氨基酸序列的L鏈?！?8〕下述(1)~(4)中任一項所述的抗體(1)含有具有如下氨基酸序列的H鏈的抗體，所述氨基酸序列是作為CDR1的序列號47記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號49記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號51記載的氨基酸序列、和作為CH的序列號143記載的氨基酸序列；(2)含有具有序列號141記載的氨基酸序列的H鏈的抗體；(3)含有具有如下氨基酸序列的H鏈的抗體，所述氨基酸序列是作為CDR1的序列號47記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號49記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號51記載的氨基酸序列、和作為Fc區(qū)域的序列號145記載的氨基酸序列；(4)具有上述(1)、(2)或(3)中任一項所述的H鏈、和下述(i)或(ii)所述的L鏈的對的抗體(i)具有作為CDR1的序列號58記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號60記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號62記載的氨基酸序列、和作為CL的序列號64記載的氨基酸序列的L鏈；(ii)具有序列號56記載的氨基酸序列的L鏈?！?9〕下述(1)~(4)中任一項所述的抗體(1)含有具有如下氨基酸序列的H鏈的抗體，所述氨基酸序列是作為CDR1的序列號47記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號49記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號51記載的氨基酸序列、和作為CH的序列號149記載的氨基酸序列；(2)含有具有序列號147記栽的氨基酸序列的H鏈的抗體；(3)含有具有如下氨基酸序列的H鏈的抗體，所述氨基酸序列是作為CDR1的序列號47記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號49記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號51記載的氨基酸序列、和作為Fc區(qū)域的序列號151記載的氨基酸序列；(4)具有上述(1)、(2)或(3)中任一項所述的H鏈、和下述(0或(ii)所述的L鏈的對的抗體(i)具有作為CDR1的序列號58記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號60記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號62記載的氨基酸序列、和作為CL的序列號64記載的氨基酸序列的L鏈；(ii)具有序列號56記載的氨基酸序列的L鏈。〔20〕下述(1)~(4)中任一項所述的抗體(1)含有具有如下氨基酸序列的H鏈的抗體，所述氨基酸序列是作為CDR1的序列號47記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號49記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號51記載的氨基酸序列、和作為CH的序列號155記載的氨基酸序列；(2)含有具有序列號153記載的氨基酸序列的H鏈的抗體；(3)含有具有如下氨基酸序列的H鏈的抗體，所述氨基酸序列是作為CDR1的序列號47記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號49記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號51記載的氨基酸序列、和作為Fc區(qū)域的序列號157記載的氨基酸序列；(4)具有上述(1)、(2)或(3)中任一項所述的H鏈、和下述(i)或(ii)所述的L鏈的對的抗體(i)具有作為CDR1的序列號58記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號60記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號62記載的氨基酸序列、和作為CL的序列號64記載的氨基酸序列的L鏈；(ii)具有序列號56記載的氨基酸序列的L鏈?！?1〕下述(1)~(4)中任一項所述的抗體(1)含有具有如下氨基酸序列的H鏈的抗體，所述氨基酸序列是作為CDR1的序列號47記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號49記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號51記載的氨基酸序列、和作為CH的序列號161記載的氨基酸序列；(2)含有具有序列號159記載的氨基酸序列的H鏈的抗體；(3)含有具有如下氨基酸序列的H鏈的抗體，所述氨基酸序列是作為CDR1的序列號47記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號49記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號51記載的氨基酸序列、和作為Fc區(qū)域的序列號163記載的氨基酸序列；(4)具有上述(1)、(2)或(3)中任一項所述的H鏈、和下述(i)或(ii)所述的L鏈的對的抗體23(i)具有作為CDR1的序列號58記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號60記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號62記載的氨基酸序列、和作為CL的序列號64記載的氨基酸序列的L鏈；(ii)具有序列號56記載的氨基酸序列的L鏈?！?2〕下述(1)~(4)中任一項所述的抗體(1)含有具有如下氨基酸序列的H鏈的抗體，所述氨基酸序列是作為CDR1的序列號47記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號49記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號51記栽的氨基酸序列、和作為CH的序列號167記載的氨基酸序列；(2)含有具有序列號165記載的氨基酸序列的H鏈的抗體；(3)含有具有如下氨基酸序列的H鏈的抗體，所述氨基酸序列是作為CDR1的序列號47記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號49記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號51記栽的氨基酸序列、和作為Fc區(qū)域的序列號169記載的氨基酸序列；(4)具有上述(1)、(2)或(3)中任一項所述的H鏈、和下述(i)或(ii)所述的L鏈的對的抗體(i)具有作為CDR1的序列號58記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號60記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號62記載的氨基酸序列、和作為CL的序列號64記載的氨基酸序列的L鏈；(ii)具有序列號56記載的氨基酸序列的L鏈?！?3〕下述(1)~(4)中任一項所述的抗體(1)含有具有如下氨基酸序列的H鏈的抗體，所述氨基酸序列是作為CDR1的序列號47記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號49記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號51記載的氨基酸序列、和作為CH的序列號173記載的氨基酸序列；(2)含有具有序列號171記載的氨基酸序列的H鏈的抗體；(3)含有具有如下氨基酸序列的H鏈的抗體，所述氨基酸序列是作為CDR1的序列號47記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號49記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號51記載的氨基酸序列、和作為Fc區(qū)域的序列號175記載的氨基酸序列；(4)具有上述(1)、(2)或(3)中任一項所述的H鏈、和下述(i)或(ii)所述的L鏈的對的抗體(i)具有作為CDR1的序列號58記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號60記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號62記載的氨基酸序列、和作為CL的序列號64記載的氨基酸序列的L鏈；(ii)具有序列號56記載的氨基酸序列的L鏈?！?4〕下述(1)~(4)中任一項所述的抗體(1)含有具有如下氨基酸序列的H鏈的抗體，所述氨基酸序列是作為CDR1的序列號47記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號49記栽的氨基酸序列、作為CDR3的序列號51記載的氨基酸序列、和作為CH的序列號179記載的氨基酸序列；(2)含有具有序列號177記載的氨基酸序列的H鏈的抗體；(3)含有具有如下氨基酸序列的H鏈的抗體，所述氨基酸序列是作為CDR1的序列號47記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號49記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號51記載的氨基酸序列、和作為Fc區(qū)域的序列號181記載的氨基酸序列；(4)具有上述(1)、(2)或(3)中任一項所述的H鏈、和下述(i)或(ii)所述的L鏈的對的抗體(i)具有作為CDR1的序列號58記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號60記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號62記載的氨基酸序列、和作為CL的序列號64記載的氨基酸序列的L鏈；(ii)具有序列號56記載的氨基酸序列的L鏈?！?5〕下述(1)~(4)中任一項所述的抗體(1)含有具有如下氨基酸序列的H鏈的抗體，所述氨基酸序列是作為CDR1的序列號47記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號49記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號51記載的氨基酸序列、和作為CH的序列號185記載的氨基酸序列；(2)含有具有序列號183記載的氨基酸序列的H鏈的抗體、(3)含有具有如下氨基酸序列的H鏈的抗體，所述氨基酸序列是作為CDR1的序列號47記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號49記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號51記載的氨基酸序列、和作為Fc區(qū)域的序列號187記載的氨基酸序列；(4)具有上述(1)、(2)或(3)中任一項所述的H鏈、和下述(i)或(ii)所述的L鏈的對的抗體25(i)具有作為CDR1的序列號58記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號60記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號62記載的氨基酸序列、和作為CL的序列號64記載的氨基酸序列的L鏈；(ii)具有序列號56記載的氨基酸序列的L鏈?！?6〕下述(1)~(4)中任一項所述的抗體(1)含有具有如下氨基酸序列的H鏈的抗體，所述氨基酸序列是作為CDR1的序列號47記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號49記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號51記載的氨基酸序列、和作為CH的序列號191記載的氨基酸序列；(2)含有具有序列號189記載的氨基酸序列的H鏈的抗體；(3)含有具有如下氨基酸序列的H鏈的抗體，所述氨基酸序列是作為CDR1的序列號47記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號49記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號51記載的氨基酸序列、和作為Fc區(qū)域的序列號193記載的氨基酸序列；(4)具有上述(1)、(2)或(3)中任一項所述的H鏈、和下述(i)或(ii)所述的L鏈的對的抗體(i)具有作為CDR1的序列號58記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號60記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號62記載的氨基酸序列、和作為CL的序列號64記載的氨基酸序列的L鏈；(ii)具有序列號56記載的氨基酸序列的L鏈。〔27〕下述(1)~(4)中任一項所述的抗體(1)含有具有如下氨基酸序列的H鏈的抗體，所述氨基酸序列是作為CDR1的序列號47記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號49記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號51記載的氨基酸序列、和作為CH的序列號241記載的氨基酸序列；(2)含有具有序列號243記載的氨基酸序列的H鏈的抗體；(3)含有具有如下氨基酸序列的H鏈的抗體，所述氨基酸序列是作為CDR1的序列號47記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號49記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號51記栽的氨基酸序列、和作為Fc區(qū)域的序列號245記載的氨基酸序列；(4)具有上述(1)、(2)或(3)中任一項所述的H鏈、和下述(i)或(ii)所述的L鏈的對的抗體(i)具有作為CDR1的序列號58記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號60記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號62記載的氨基酸序列、和作為CL的序列號64記載的氨基酸序列的L鏈；(ii)具有序列號56記載的氨基酸序列的L鏈?！?8〕下述(1)~(4)中任一項所述的抗體(1)含有具有如下氨基酸序列的H鏈的抗體，所述氨基酸序列是作為CDR1的序列號195記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號197記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號199記載的氨基酸序列、和作為CH的序列號83記載的氨基酸序列；(2)含有具有序列號209記載的氨基酸序列的H鏈的抗體；(3)含有具有如下氨基酸序列的H鏈的抗體，所述氨基酸序列是作為CDR1的序列號195記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號197記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號199記載的氨基酸序列、和作為Fc區(qū)域的序列號85記載的氨基酸序列；(4)具有上述(1)、(2)或(3)中任一項所述的H鏈、和下述(i)或(ii)所述的L鏈的對的抗體(i)具有作為CDR1的序列號203記載的氨基酸序列、作為CDR2的序列號205記載的氨基酸序列、作為CDR3的序列號207記載的氨基酸序列、和作為CL的序列號247記載的氨基酸序列的L鏈；(ii)具有序列號201記載的氨基酸序列的L鏈。〔29〕ADCC活性得到增強(qiáng)的抗體的制造方法，包括如下工序在H鏈恒定區(qū)中，將選自286、287、288、289、290、291、292、294、298、301、302、303、305、306、307、308以及309位中的至少1個位置的氨基酸殘基置換成半胱氨酸?！?0〕ADCC活性得到增強(qiáng)的抗體的制造方法，包括以下的(a)以及(b)的工序(a)使編碼H鏈的DNA、以及編碼L鏈的DNA表達(dá)的工序，在所述H鏈恒定區(qū)中，選自286、287、288、289、2卯、291、292、294、298、301、302、303、305、306、307、308以及309位中的至少1個位置的氨基酸殘基被置換成半胱氨酸；(b)回收工序(a)的表達(dá)產(chǎn)物的工序。27〔31〕如〔29〕或〔30〕所述的方法，其特征在于，H鏈恒定區(qū)是選自人Cyl、C/2、Cy3以及Cy4中的任一個恒定區(qū)?！?2〕一種醫(yī)藥組合物，含有〔1〕~〔28〕中任一項所述的抗體和醫(yī)藥上能容許的擔(dān)載體?！?3〕一種非人哺乳動物的治療方法，包括將〔1〕~〔28〕中的任一抗體給予對象的工序?！?4〕一種核酸，編碼〔1〕~〔28〕中的任一抗體?！?5〕一種載體，含有〔34〕所述的核酸?！?6〕一種宿主細(xì)胞，具有〔35〕所述的載體?！?7〕一種宿主生物，具有〔35〕所述的載體?！?8〕將抗體的ADCC活性增強(qiáng)的方法，其中，包括如下工序在H鏈恒定區(qū)中，將選自286、287、288、289、290、291、292、294、298、301、302、303、305、306、307、308以及309位中的至少1個位置的氨基酸殘基置換成半胱氨酸?！?9〕如〔38〕所述的方法，其特征在于，H鏈恒定區(qū)是選自人Cirl、C/2、Cy3以及C丫4中的任一個恒定區(qū)。〔40〕一種判定工序(a)的抗體的ADCC活性是否得到增強(qiáng)的方法，在工序(b)中測定的ADCC活性高于置換前抗體的ADCC活性時，判定工序(a)的抗體的ADCC活性得到增強(qiáng)；(a)提供具有ADCC活性的抗體的變異體，即選自H鏈恒定區(qū)中的286、287、288、289、2卯、291、292、294、298、301、302、303、305、306、307、308以及309位中的至少1個位置的氨基酸殘基被置換成半胱氨酸的抗體的工序，和(b)測定工序(a)的抗體的ADCC活性的工序?！?1〕ADCC活性得到增強(qiáng)的抗體的篩選方法，其中，包括以下的(a)~(d)的工序(a)提供具有ADCC活性的抗體的工序；(b)將工序(a)的抗體的選自H鏈恒定區(qū)中的286、287、288、289、290、291、292、294、298、301、302、303、305、306、307、308以及309位中的至少1個位置的氨基酸殘基置換成半胱氨酸的工序；(c)采用〔40〕所述的方法判定在工序(b)中得到的抗體的ADCC活性是否得到增強(qiáng)的工序；(d)選擇在工序(c)中判定ADCC活性得到增強(qiáng)的的抗體的工序。根據(jù)本發(fā)明，提供ADCC活性得到增強(qiáng)的抗體及其制造方法。關(guān)于釆用乳酸脫氫酶釋放分析體系評價的ADCC活性，本發(fā)明的抗體與野生型抗體相比，ADCC活性上升(野生型抗體和變異型抗體為相同濃度的2點間的、變異型抗體相對于野生型抗體的細(xì)胞毒比例之比上升)。因此，通過使用本發(fā)明的變異型抗體，與野生型抗體相比，可以引起更多的細(xì)胞毒。此外，本發(fā)明的抗體特別是在低濃度時，ADCC活性上升(野生型抗體和變異型抗體顯示相同的細(xì)胞毒比例的2點間的、變異型抗體相對于野生型抗體的濃度比上升)。因此，通過將本發(fā)明的抗體作為治療抗體使用，可以使對每單位質(zhì)量的癌細(xì)胞等的治療效果上升。此外，如果使用本發(fā)明的抗體，則可以減少對患者的每一次給藥量，因此還可以減少藥費。圖1是表示經(jīng)基因克隆的Anti-CD20小鼠L鏈可變區(qū)的DNA序列的圖。該DNA序列的開始部分與MKV5引物序列一致。此外，圖中的CDR是complementaritydetermingregion的縮寫。粗的下劃線是小鼠L鏈恒定區(qū)的一部分，除了該恒定區(qū)之外的序列是Anti-CD20小鼠L鏈可變區(qū)。圖2是表示經(jīng)基因克隆的Anti-CD20小鼠H鏈可變區(qū)的DNA序列的圖。該DNA序列的開始部分與MHV7引物序列一致。此外，圖中的CDR是complementaritydetermingregion的縮寫。粗的下劃線是小鼠H鏈恒定區(qū)的一部分，除了該恒定區(qū)之外的序列是Anti-CD20小鼠H鏈可變區(qū)。29圖3是表示經(jīng)精制的野生型嵌合抗體或Cys型嵌合抗體的電泳圖像的照片。各種精制嵌合抗體與含有2-巰基乙醇的SDS-PAGE樣品緩沖液混合，煮沸5分鐘。煮沸后的樣品用12.5%SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳。在該照片中，50kDa附近的帶是H鏈，25kDa附近的帶是L鏈。圖4是表示野生型、294Cys型、298Cys型、301Cys型的Anti-CD20嵌合抗體的ADCC活性結(jié)果的曲線圖。與野生型嵌合抗體的ADCC活性相比，294Cys型嵌合抗體和301Cys型嵌合抗體在高濃度條件下(0.1~10ng/mL)顯示出非常高的ADCC活性。另一方面，298Cys型嵌合抗體與野生型相比，在包括低濃度(0.1jig/mL以下的濃度)的所測定的全部范圍內(nèi)，均顯示出高的ADCC活性。圖5是表示野生型、2卯Cys型、291Cys型、292Cys型的Anti-CD20嵌合抗體的ADCC活性結(jié)果的曲線圖。與野生型嵌合抗體的ADCC活性相比，291Cys型嵌合抗體和292Cys型嵌合抗體在高濃度條件下(0.01~10jig/mL)顯示出非常高的ADCC活性。另一方面，290Cys型嵌合抗體與野生型相比，在包括低濃度(0.1ng/mL以下的濃度)的所測定的幾乎全部范圍內(nèi)，均顯示出高的ADCC活性。圖6是表示野生型、302Cys型、303Cys型的Anti-CD20嵌合抗體的ADCC活性結(jié)果的曲線圖。與野生型嵌合抗體的ADCC活性相比，303Cys型嵌合抗體在高濃度條件下(0.0110jig/mL)顯示出非常高的ADCC活性。另一方面，302Cys型嵌合抗體與野生型相比，在包括低濃度(O.lng/mL以下的濃度)的所測定的幾乎全部范圍內(nèi)，均顯示出高的ADCC活性。圖7是表示野生型、298Cys型的Anti-EGFR嵌合抗體的ADCC活性結(jié)果的曲線圖。298Cys型嵌合抗體與野生型相比，在包括低濃度(0.1ng/mL以下的濃度)的所測定的全部范圍內(nèi)，均顯示出高的ADCC活性。圖8是表示野生型、286Cys型、287Cys型、288Cys型、289Cys型的Anti-CD20嵌合抗體的ADCC活性結(jié)果的曲線圖。與野生型嵌合抗體的ADCC活性相比，286Cys型嵌合抗體和289Cys型嵌合抗體在高濃度條件下(0.01~10ng/mL)顯示出非常高的ADCC活性。圖9是表示野生型、305Cys型、306Cys型、307Cys型、308Cys型的Anti-CD20嵌合抗體的ADCC活性結(jié)果的曲線圖。與野生型嵌合抗體的ADCC活性相比，這些嵌合抗體在較高濃度條件下(0.001~10Hg/mL)顯示出高的ADCC活性。圖10是表示野生型以及309Cys型的Anti-CD20嵌合抗體的ADCC活性結(jié)果的曲線圖。與野生型嵌合抗體的ADCC活性相比，這些嵌合抗體在低濃度條件下(0.001~10ng/mL)顯示出高的ADCC活性。具體實施例方式本發(fā)明提供氨基酸殘基被人為地置換成半胱氨酸的抗體，所述氨基酸殘基是ElvinA.Kabat等人在SequenceofproteinsofImmunologicalInterest(NIHPublicationNo.91-3242,1991)中給出的選自人IgGlH鏈恒定區(qū)的EUindex編號(在本說明書中，只要沒有特別說明，以下的氨基酸位置都是按照kabat編號中記載的EUindex而記載的)的280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、2卯、291、292、293、294、298、299、300、301、302、303、305、306、307、308、309、310或314位中的至少l個位置的氨基酸殘基。將人Cy1的堿基序列示為序列號71、氨基酸序列示為序列號53。作為人的免疫球蛋白，已知IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgD、IgE、IgM這9種類型(同種型)。本發(fā)明的抗體包括這些同種型之中的IgGl、IgG2、IgG3、IgG4。此外，本發(fā)明的抗體還包括抗體的Fc區(qū)域以外的部分被置換成具有抗原結(jié)合能力的其他肽的抗體。作為抗體的Fc區(qū)域以外的部分，可以列舉例如可變區(qū)、CH1區(qū)域、絞鏈區(qū)等，但并不限于這些。抗體的同種型由恒定區(qū)的結(jié)構(gòu)決定。IgGl、IgG2、IgG3、IgG4的各同種型的恒定區(qū)分別被稱為Cyl、Cy2、Cy3、Cy4。本發(fā)明的抗體還包括在Cy2、Cy3、或C/4中選自280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、298、299、300、301、302、303、305、306、307、308、309、310或314位中的至少1個位置的氨基酸被置換成Cys的抗體。將人C/2、C/3、G/4的堿基序列例示為序列號65、67、69。此外，將人Cy2、C/3、C/4的氨基酸序列例示為序列號66、68、70。應(yīng)說明的是，在表1~表7中示出本說明書所附的序列表中記載的Cy1(械基序列序列號71;氨基酸序列序列號53)、Cy2(械基序列序列號65;氨基酸序列序列號66)、Cy3(堿基序列序列號67;氨基酸序列序列號68)、以及Cy4(堿基序列序列號69;氨基酸序列序列號70)的各序列中的密碼以及氨基酸、與kabat的EUindex的關(guān)系。表1~7中的密碼以及氨基酸按從上到下的順序、與序列表的N末端側(cè)到C末端側(cè)的密碼以及氨基酸相對應(yīng)。應(yīng)說明的是，本說明書中的恒定區(qū)的序列全部是以[SequenceofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD(1991)]為基礎(chǔ)制作的。表lIgG1(Cr1)IgG2(C")IgG3(Cr3)IsG4(Cr4)EUINDEXofKabatDNA序列氨基酸序列DNA序歹'J氨基酸序列DNA序列氨基酸序列DNA序列氨基酸序列118gccAlagccAlagetAlagetAla"9tecSertecSertecSertecSer1203CCThr3CCThr3CCThr3CCThr121aagLysaagLysLysaag匕ys122ggcGlyggcGlyggcGlvggcGly123CC3ProCC3ProCC3ProCC3Pro124tegSertegSertegSertecSer125EtcValgtcVafRtcValgtcVal126ttcPhettcPhettcPhettcPhe127cccProcccProcccProcccPro128ctg匕euctgLeuctgLeuctg匕eu129gC3AlagcgAlagcgAlagcgAla130cccProcccProcccProcccPro131tecSertgcCystgcCystgcCys132tecSertecSertecSertecSer133asgLysaggArgaggArgaggArg134ageSer3gCSerageSerageSer1353CCThrThr3CCThr3CCThr136tctSertecSertctSertecSer137gggGly靴Gfu鵬GlvsagGlu138ggcGlyageSerGlyageSer1393C3Thr3C3Thr3C3Thr3C3Thr140gcgAlaAlagcgAlagccAla141gccAlagccAlagccAlagccAla142ctgLeuctg匕euctgLeuctgLeu143ggcGlv収cGlyggcGlvggcGly144tgcCystgcCystgcCystgcCys145ctgLeuctgLeuctgLeuctg匕eu146gtcValgtcValfftcValgtcVal147aag匕ysaagLysLys柳Lys148gacAspg3CAspg3CAspgacAsp149t3CThrtacTyrtacTyrtacTV150ttcPhettcPhettcPhettcPhe151cccProcccProcccProcccPro152ga3GlugaaGlu柳GlugaaGlu153ccgProccgProccgProccgPro154StgValgtgValfftgValRtgVal1553CgThracgThrThr3CgThr156ValRtgValValVal157tegSertegSertegSertegSer158tggTrptggIVptggT巾tggTrp15933CAsn33CAsnAsn33CAsn160teaSerteaSertC3SerteaSer161ggcGlyggcGlyggcGlyggcGly162gccAlagetAlagccAlagccAla163ctgLeuctgLeuctgLeuctg匕eu1643CCThr3CCThr3CCThr3CCThr1653gCSerageSerageSerSer166ggcGlyggcGlyGlv戰(zhàn)c'Gly167ValValgtgValgtgVal168C3CHisC3CHisC3CHisC3GHis表2(IH3)兇W邀TOSIV33<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>gacAsp222333LysgtcVal3C3Thr223setThr3CtThr224C3CHis梆GluC3CHiscccPro225Thr3C3ThrCC3Pro226tgcCysCystRCCystgcCys227CC3ProCC3ProCC3ProCC3Pro228ccgProccgProeggArgteaSertgcCysPro靴GluCCCProLystctSer時Cysg3CAsp3C3ThrcctProcccProccgProtgcCysCC3ProeggArgtgcCysCC3ProgagGlucccPro333l_ystctSerCysgacAspThrcctProCCCProProtgcCysProeggArgtgcCysProgagGlucccPro3331_YStctSerCysgacAspThrcctProcccProccgProtgcCysCC3Pro鄉(xiāng)Arg229tgcCysCystgcCystgcCys230CC3ProCC3ProCC3ProCC3Pro表435<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>AsnaatAsn33tAsnsatAsn287gccAlagccAlagccAlaAla28833gLysaagLysLysaagLys2893C3Thr3G3ThrThrThr290aagLysaag匕ys33gLys靴Lys291ccgProCC3ProccgProccgPro292cgtArgc朋Arg鄉(xiāng)Argc照Arg293gagGlu印gGluGlugagGlu294gagGlugagGlugagGlugagGlu295cagGincagGinGincagGin296TyrttcPhetacTyrtePhe29733CAsnAsn33CAsn33CAsn298ageSer3gCSer3gCSer鄉(xiāng)Ser299aegThr3CgThracgThrThr300tacTyrttcPhettcPhetacTyr301cgtArgcgtArgcgtArgArg302gtgValgtgValRtsVal跑Val303gtcValgtcValVaiVal304ageSer3gCSerSerageSer305gtcValValValVal306etcLeuetc匕euetcI_euetcLeu3073CCThr3CCThr3CCThrThr308gtcValffttValValgtcVal309ctgl_euRtgValctgLeuctgLeu310C3CHisC3CHisG3CHisHis311cagGincagGinC3gGincagG[n312gacAspgacAspgacAspgacAsp313tggTrptggTrPtggTVptggT「P314ctgLeuctgLeuctg匕euLeu31533tAsn33CAsn33CAsnAsn316ggcGlv邵GlyGlyGly317a站LVsaagLys匕yssagLys318gagGlugagGluGlugagGlu319t8CTyrtacTyrtacTYrtacTyr320aagLysaagLysaagLysaagLys321CystgcCystgcCystgc322aagLysaagLyssag匕ysaagLys323ValgtcValgtcValgtcVa!324tecSertecSertecSertCGSer32533CAsn33CAsn33CAsnAsn326333Lys333LysLys333Lys327gccAlaGlygccAEaggcGly328etcLeuetcLeuetcLeuetcLeu329CC3ProCCSProProCGgPro330gccAlagccAlagccAlatecSer331cccProCGCProCCCProtCGSer332atelieatelielieatelie333gagGlu柳G，ugagGlu挑Glu334333LysLys333Lys333匕ys3353CCThr3CCThr3CCThr3CCThr336atelieatelieatelielie337tecSertecSertecSertecSer338333LysLys333l_ys333Lys339gccAla3CCThrgccThrAla340333333Lys333Lys333l_ys表637341ggsGlyGlyfgaGlyGly342cagGlnGinGincagGin343cccProcccProcccProcccPro344cgaArgArgArgcgaArg345gaaGlugaaGluGlugagGlu346CC3ProProCC3ProCC3Pro347C3gGincagGincagGinGin348ValgtgValValVal349tacTyrtacTyrTyrtacTyr3503CCThr3CCThr3CCThr3CCThr351ctgLeuctgLeuLeuctgLeu352cccProProcccProcccPro353CC3ProCC3ProCC3ProPro354tccSertccSertccSertccSer355cggArgeggArgeggArgcagGfn356gatAspgagGluK站Glu靴Glu357gagGlugagGlugagGlugagGlu358ctgLeuatgMetatgMetatgMet3593CCThr3CCThr3CCThr3CCThr3603ag匕ys33gLysLysLys36133CAsn33CAsn33CAsn33CAsn362C3gG!ncagGincagGhcagGin363etcValValetcValgtcVal3643gCSer3gCSerageSerageSer365ctgLeuctgI_euctg匕euctgLeu3663CGThr3CCThr3CCThrThr367tgcCystgcCysCystgcCys368ctgl_euctgLeuctg匕euLeu369KtcValValValgtcVal370朋3LysLysLys333Lys371ggcGlyGlyggcGlyG，y372ttcPhettcPhettcPhettcPhe373tatTyrtscTyrtscTyrtacTyr374ProcccProcccProcccPro3753gCSerageSerageSerageSer376gacAspgacAspg3CAspgacAsp3773tclie3tClie3tClieatelie378gccAlagecAlagecAlagecAla379KtgValRtgValgtgValfftgVal380gagGlugagGlugagGiugagGlu381tggTrptggTrptggT卬tggTrp382gagGlugagGlugagGlugagGlu3833gCSer日gcSerageSerageSer38433tAsn33tAsnageSeraatAsn385gggGlygggGlyg戰(zhàn)GfygggGly386cagGincagGincagGincagGin387ccgProccgProccgProccgPro388gagGlugagGlu柳GlugagGlu38933CAsn33CAsn33CAsn33CAsn39033CAsnAsn33CAsnAsn391tacTyrtacTyrTyrtac丁yr392aag匕ysaagLysaasLysLys3933CCThrThr3CCThrThr394acgThrThracgThracgThr395cctProcctProcctProcctPro(￡5)38<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>本發(fā)明的半胱氨酸還包括其衍生物。作為本發(fā)明的半胱氨酸衍生物，可以列舉在半胱氨酸分子中加成有羥基、甲基、乙基、羧基、氨基等的化合物，構(gòu)成半胱氨酸分子的原子、官能團(tuán)部分缺失的化合物，構(gòu)成半胱氨酸分子的原子、官能團(tuán)部分被置換成其他原子、官能團(tuán)的化合物等，但并不限于這些。關(guān)于采用乳酸脫氫酶釋放分析體系評價的ADCC活性，本發(fā)明的抗體與野生型抗體相比，ADCC活性上升(野生型抗體和變異型抗體為相同濃度的2點間的、變異型抗體相對于野生型抗體的細(xì)胞毒比例之比上升)。此外，286Cys型抗體、289Cys型抗體、305Cys型抗體、306Cys型抗體、307Cys型抗體、308Cys型抗體、290Cys型抗體、291Cys型抗體、292Cys型抗體、298Cys型抗體、302Cys型抗體、303Cys型抗體、309Cys型抗體特別在低濃度下，ADCC活性上升約2倍以上、優(yōu)選約5倍以上、更優(yōu)選約10倍以上、約100倍以上，進(jìn)而優(yōu)選約500倍以上、特別優(yōu)選約1000倍以上(野生型抗體和變異型抗體顯示相同細(xì)胞毒比例的2點間的、變異型抗體相對于野生型抗體的濃度之比上升)。此外，本發(fā)明的抗體具有得到改善的穩(wěn)定性、溶解性、對Fc受體的結(jié)合親和性、或CDC活性。本發(fā)明的抗體優(yōu)選與野生型相比其穩(wěn)定性、溶解性、對Fc受體的結(jié)合親和性、或CDC活性沒有變化或者上升。然而本發(fā)明的抗體只要至少ADCC活性上升即可，其穩(wěn)定性、溶解性、對Fc受體的結(jié)合親和性、或CDC活性減少的抗體也包括在本發(fā)明的抗體中。另外，作為Fc受體，可以列舉FcyRl、FcyRII、FcyRIII、FcRn等，但并不限于這些。本發(fā)明的抗體包括多克隆抗體和單克隆抗體這兩者。單克隆抗體和多克隆抗體的制備和精制方法在本領(lǐng)域中是已知的，記載于例如HarlowandLane,Antibodies:ALaboratoryManual(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1988)。本發(fā)明的抗體的一種形態(tài)是人源化抗體。所謂"人源化抗體"，是指使結(jié)構(gòu)與人的抗體類似的抗體，包括人型嵌合抗體(例如抗體的一部分被人源化的抗體、CH2區(qū)域被人源化的抗體、Fc區(qū)域被人源化的抗體、恒定區(qū)被人源化的抗體)、以及在恒定區(qū)以及可變區(qū)存在的CDR(互補(bǔ)性決定區(qū)域)以外的部分被人源化的人型CDR移植(CDR-grafted)抗體(P.T.Johonsetal.,Nature321,522(1986))、完全人源化抗體等。為了提高人型CDR移植抗體的抗原結(jié)合活性，已經(jīng)開發(fā)出選擇與小鼠抗體同源性高的人抗體FR的方法、制作同源性高的人源化抗體的方法、將小鼠CDR移植到人抗體之后進(jìn)一步置換FR的氨基酸的方法的改良技術(shù)(參照美國專利第5585089號、美國專利第5693761號、美國專利第5693762號、美國專利第6180370號、歐州專利第451216號、歐州專利第682040號、日本特許第2828340號等)，還可以用于制作本發(fā)明的人型CDR移植抗體。人型嵌合抗體可以如下制作，例如，將具有上述的H鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)和/或L鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)的抗體的恒定區(qū)置換成人抗體的恒定區(qū)。作為人抗體的恒定區(qū)，可以釆用公知的區(qū)域。以下示出人型嵌合抗體的制作方法的一例。首先，從對特定對象抗原產(chǎn)生小鼠抗體的雜交瘤中提取mRNA，根據(jù)常規(guī)方法合成cDNA。將所合成的cDNA組入栽體，構(gòu)建cDNA文庫。根據(jù)該cDNA文庫，通過將H鏈基因片段以及L鏈基因片段作為探針使用，來選擇含有H鏈基因以及L鏈基因的載體。通過進(jìn)行所選擇載體的插入序列的測序，確定H鏈可變區(qū)以及L鏈可變區(qū)的基因序列。以如此得到的序列數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，釆用化學(xué)合成、生化學(xué)的切斷/再結(jié)合等制作編碼H鏈可變區(qū)的DNA。使所得到的編碼H鏈可變區(qū)的DNA和編碼人H鏈恒定區(qū)的DNA進(jìn)行連接反應(yīng)而組入到表達(dá)用載體中，由此制作H鏈表達(dá)載體。作為表達(dá)載體，可以使用例如基于SV40病毒的載體、基于EB病毒的載體、基于BPV(乳頭瘤病毒)的載體等，但并不限于這些。另一方面，釆用同樣的方法制作L鏈表達(dá)載體。通過這些H鏈表達(dá)載體以及L鏈表達(dá)載體將宿主細(xì)胞共轉(zhuǎn)化。作為宿主細(xì)胞，優(yōu)選使用CHO細(xì)胞(中國倉鼠卵巢細(xì)胞)(人.\￥1^111&S丄.Morrison,J.Immuno1.160，3393-3402(1998))、SP2/0細(xì)胞(小鼠骨髓瘤)(K.Motmansetal"Eur.J.CancerPrev.5，512-519(1996)，R.P.Junghansetal"CancerRes.50，1495-1502(1990))等。此外，轉(zhuǎn)化優(yōu)選4吏用lipofectin法(R.W.Maloneetal"Proc.Natl.Acad.Sci.USA86,6077(1989),P.L.Felgneretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84，7413(1987)、電穿法、磷酸4丐法(F.L.Graham&A.JT.vanderEb，Virology52,456-467(1973))、DEAE-葡聚糖法等。培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體后，從轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞內(nèi)或培養(yǎng)液分離人型嵌合抗體?？贵w的分離、精制可以將離心分離、硫酸銨分級分離、鹽析、超濾、親和41色鐠法、離子交換色鐠法、凝膠過濾色鐠法、蛋白A柱色鐠法、蛋白G柱色鐠法、蛋白L柱色鐠法等方法適當(dāng)組合利用。另一方面，人型CDR移植抗體可以采用例如以下的方法來制作。首先，采用在上述嵌合抗體的制造方法欄中敘述的方法，確定對特定抗原的抗體的H鏈可變區(qū)以及L鏈可變區(qū)的氨基酸序列以及編碼其的堿基序列。并且確定各CDR區(qū)域的氨基酸序列以及堿基序列。接著，選擇夾著CDR區(qū)域而存在的FR(框架區(qū)域)。FR的選擇可以采用大約三種方法。第一種方法是^f吏用NEWM、REI等已經(jīng)清楚三維結(jié)構(gòu)的人抗體框架的方法(RiechmannL.etal.,Nature332，323-3Z7(1988);Tempst，PR.etal"ProteinEngineering7，1501-1507(1994);EllisJH.etal.,J.Immunol155,925-937(1995))。第二種方法是從數(shù)據(jù)庫中選擇與目的小鼠抗體可變區(qū)具有最高同源性的人抗體可變區(qū)，使用其FR的方法(QueenC.etal.,ProcNatlAcadSciUSA86,10029-10033(1989);RozakMJ.etal.,JBiolChem271,22611-22618(1996);ShearmanCW.etal.，J.Immunol147,4366-4373(1991))。第三種方法是在人抗體的FR中選擇最共通使用的氨基酸的方法(SatoK.etal.,MolImmunol31,371-381(1994);KobingerF.etal.，ProteinEngineering6,971-980(1993);KettleboroughCA.etal.，ProteinEngineering4,773-783(1991))。在本發(fā)明中可以使用這些任意的方法。另外，即使是將所選擇的人FR的氨基酸序列改變而得到的氨基酸序列，只要最終得到的人型CDR移植抗體對對象抗原具有特異的結(jié)合性，就可以作為FR的氨基酸序列利用。特別是所選擇的人FR的一部分氨基酸變更為成為CDR的抗體的來源的FR的氨基酸時，抗體的特性得到維持的可能性很高。改變的氨基酸數(shù)目優(yōu)選是FR全體的30%以下，更優(yōu)選是FR全體的20。/。以下，進(jìn)一步優(yōu)選是FR全體的10%以下。接著，將采用這些任一方法選擇的FR和上述CDR組合，由此設(shè)計編碼H鏈可變區(qū)以及L鏈可變區(qū)的DNA。以該設(shè)計為基礎(chǔ)，通過化學(xué)合成、生化學(xué)的切斷/再結(jié)合等分別制作編碼H鏈可變區(qū)的DNA和編碼L鏈可變區(qū)的DNA。接著將編碼H鏈可變區(qū)的DNA與編碼人免疫球蛋白H鏈恒定區(qū)的DNA—起組入到表達(dá)載體中，構(gòu)建H鏈表達(dá)載體。同樣地，將編碼L鏈可變區(qū)的DNA與編碼人免疫球蛋白L鏈恒定區(qū)的42DNA—起組入到表達(dá)載體中，構(gòu)建L鏈表達(dá)載體。作為表達(dá)載體，可以使用例如基于SV40病毒的載體、基于EB病毒的載體、基于BPV(乳頭瘤病毒)的載體等，但并不限于這些。通過用以上方法制作的H鏈表達(dá)載體以及L鏈表達(dá)載體，將宿主細(xì)胞共轉(zhuǎn)化。作為宿主細(xì)胞，優(yōu)選使用CHO細(xì)胞(中國倉鼠卵巢細(xì)胞)(九\￥1^1^&S丄.Morrison，J.Immuno1.160,3393-3402(1998))、SP2/0細(xì)胞(小鼠骨髓瘤)(K.Motmansetal.，Eur.J.CancerPrev.5，512-519(1996)R.P.Junghansetal"CancerRes.50，1495-1502(19卯))等。此外，轉(zhuǎn)化優(yōu)選使用lipofectin法(R.W.Maloneetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86,6077(1989),P.L.Felgneretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84，7413(1987)、電穿法、磷酸鉤法(F.L.Graham&A丄vanderEb，Virology52,456-467(1973))、DEAE-葡聚糖法等。培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體后，從轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞內(nèi)或培養(yǎng)液中將人型CDR移植抗體分離?？贵w的分離、精制可以將離心分離、硫酸銨分級分離、鹽析、超濾、親和色i普法、離子交換色鐠法、凝膠過濾色譜法、蛋白A柱色鐠法、蛋白G柱色鐠法、蛋白L柱色譜法等方法適當(dāng)組合進(jìn)行。此外，人抗體的獲取方法也是已知的。例如，在體外用所需抗原或表達(dá)所需抗原的細(xì)胞致敏人淋巴球，使致敏淋巴球與人骨髓瘤細(xì)胞、例如U266融合，可以得到對抗原具有結(jié)合活性的所需人抗體(參照特公平1-59878)。此外，用所需抗原免疫具有人抗體基因的全部庫的轉(zhuǎn)基因動物，可以獲得所需的人抗體(參照國際專利申請發(fā)明者村上昭弘申請人:株式會社醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所