專利名稱：參與蘑菇形成的調(diào)節(jié)子的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及蘑菇以及生產(chǎn)所述蘑菇的方法，其中，該蘑菇具有增加的多肽表達水平和/或降低的多肽表達水平，其中，該多肽由編碼與選自SEQ IDNO :1-200的氨基酸序列具有至少40%同一性或相似性的蛋白和/或與選自SEQ ID NO :201-208的氨基酸序列具有至少50%同一性或相似性的蛋白的核苷酸序列所編碼。
背景技術(shù)：
蘑菇的形成是高度復雜的發(fā)育過程。作為一個例子，我們描述了用于諸如 Agaricus bisporus (雙孢菇)那些的傘菌子實體形成的通用方案(參見Kiies，2000 ；Umar and van Griensven, 1997) 0在淹沒菌絲體的“臨界質(zhì)量”形成之后，菌絲脫離培養(yǎng)基生長到空氣中。這些菌絲形成聚集體，即所謂的菌絲結(jié)或菌絲結(jié)節(jié)(hyphal nodules)。在結(jié)內(nèi)， 菌絲聚集體形成最初的子實體。細胞的初步分化發(fā)生在核內(nèi)。下部會發(fā)育成菌柄，而上部將形成蓋。在蓋內(nèi)發(fā)育出不同的組織。在蓋的內(nèi)部，菌傘菌髓和具有子實層的菌褶是可區(qū)分的。在子實層中形成不同類型的細胞，其中有孢子臺。在孢子臺中發(fā)生核配合和減數(shù)分裂，最終生成擔子孢子。子實體的發(fā)育是復雜的，不同組織的形成在時間上是重疊的事實也能說明。此外，細胞的直徑、長度，隔膜(s印ta)、細胞核和液泡的數(shù)量以及分子組成(例如碳水化合物的儲備量)在發(fā)育中的蘑菇中是不同的。孢子通過含有兩種不同交配型細胞核的雙孢菇(A. bisporus)形成。因此，這些孢子的萌發(fā)產(chǎn)生了自花能稔的異核菌絲，包括可變數(shù)量的雙核類型。相比之下，從兩個具有不同交配型位點的兼容株的交配導致大多數(shù)形成真菌的蘑菇處于可生育階段。在交配過程中，合作伙伴交換細胞核。這些細胞核不會融合，但保持在菌絲室中。因此這些菌絲被稱為異核體(在每個室含有一個一種類型的細胞核的情況，它被稱為雙核體)。它們可以在適當?shù)沫h(huán)境和營養(yǎng)條件下形成子實體。交配型位點是子實體發(fā)育的主要調(diào)節(jié)子。雙孢菇的交配型系統(tǒng)是鮮為人知的。據(jù)推測，這種真菌含有單一交配型位點。對^^^叩！^^ commune (裂褶菌)和Coprinus cinereus (灰蓋鬼傘)的交配型位點和它們在發(fā)育中的作用已經(jīng)進行了充分研究(其綜述參見KUes，2000)。S. commune和C. cinereus都含有兩個交配型位點。A位點編碼了同源域蛋白。這些蛋白通過與兼容的A位點編碼的同源域蛋白形成異質(zhì)二聚體起作用。有些同源域蛋白似乎也形成功能性的同源二聚體。B位點編碼信息素和受體。這些受體可以與B位點的其它等位基因所編碼的信息素結(jié)合。A位點和B位點調(diào)節(jié)截然不同的細胞過程，該過程參與建立雙核體菌絲體。然而，它們協(xié)同調(diào)節(jié)子實體的啟動。顯然，兼容的A和B交配型位點的存在對于子實體是不夠的。例如，在C. cinereus 中，通過雙核體形成的聚集體可以發(fā)育成初步的子實體或菌核。環(huán)境條件，如光線和養(yǎng)分供應，將決定哪個發(fā)育程序被開啟。不同于蘑菇形成通常所涉及的以及特定子實體啟動的交配型位點所編碼的那些蛋白，對調(diào)節(jié)蛋白知之甚少。相比于雙孢菇，在裂褶菌和灰蓋鬼傘中至少有部分突變體和基因已經(jīng)被確認。在裂褶菌中經(jīng)常出現(xiàn)fbf突變的隱性突變，其在營養(yǎng)菌絲和子實體的形成中抑制了雙核體的特定過程(Springerand Wessels，1989)。因此FBF基因看起來是激活劑。另一方面，裂褶菌的FRT基因抑制單核體中特異性雙核體基因的表達(Horton et al.，1999)。在裂褶菌中其它突變菌株對子實體發(fā)育的影響已經(jīng)被描述了，但所涉及的基因還沒有被確認。這些突變體影響子實體的形態(tài)或其孢子形成(Raper and Krongelb, 1958 ；Bromberg and khwalb，1977)。最近，參與灰蓋鬼傘的子實體形成的幾個基因已被確認。peel基因在A調(diào)節(jié)發(fā)育中起作用并編碼了一個假定的DNA結(jié)合蛋白(Murata et al., 1998)。該基因的突變導致不依賴交配型基因的性別分化的完整過程。但是，peel的功能是未知的。原基的分化涉及ichl和eln2基因(Muraguchi et al.，1998 ；2000)。這些基因的突變分別影響菌傘和菌柄的形成。顯然，這些資料沒有表現(xiàn)出分子水平調(diào)節(jié)的子實體的形成的情況。到目前為止，在蘑菇生產(chǎn)的調(diào)節(jié)/啟動中所涉及的基因還沒有被描述。這些基因控制蘑菇形成，因此是促進蘑菇生產(chǎn)、改善蘑菇質(zhì)量、提高蘑菇生產(chǎn)的可預見性以及使得在不能有效生產(chǎn)蘑菇的培養(yǎng)基上能夠生產(chǎn)蘑菇的靶標。

發(fā)明內(nèi)容
我們研究了蘑菇形成的模型系統(tǒng)裂褶菌中假定的轉(zhuǎn)錄因子的表達。裂褶菌可以在世界各地找到。它是腐爛木頭的擔子菌，在砍伐的硬木上形成子實體，但它也可以在軟木和青貯草上找到。在菌褶中形成的孢子臺是分散的，可以形成單核菌絲體。不同等位基因的單核體在MATA和MATB交配型位點的融合導致在適合的環(huán)境條件下多產(chǎn)的雙核體可以形成子實體。幾天之內(nèi)裂褶菌可以在簡單的合成培養(yǎng)基上形成孢子子實體。這以及單核體可適用的事實就是裂褶菌成為子實體擔子菌的模型系統(tǒng)的原因。裂褶菌的經(jīng)典遺傳學和分子遺傳學都已經(jīng)在裂褶菌中建立了。我們相信，裂褶菌、雙孢菇和其它擔子菌的調(diào)節(jié)程序是相當保守的。我們已經(jīng)證明，裂褶菌的sc3和gpd基因的啟動子在非相關的擔子菌、朱紅密孔菌 (Pycnoporus cinnabarinus)中是具有活性的(Alves et al. 2004)。蘑菇形成的時間、形態(tài)和產(chǎn)量所涉及基因都是可改善的(即，對于目前商業(yè)化生產(chǎn)的蘑菇，包括但不限于普通白蘑菇[“香蕈”]、平菇和香菇(shiitake))或能夠商業(yè)化生成蘑菇(即，目前還不能商業(yè)化生產(chǎn)的蘑菇)的靶標。我們已經(jīng)確認了裂褶菌基因組中編碼假想的調(diào)節(jié)子的200個基因，其表達在蘑菇形成過程中會變化。這些基因可能參與蘑菇形成。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，滅活這些基因中的8個會影響蘑菇的生產(chǎn)。如果所有的都存在，生產(chǎn)會被促進或降低。這些假想的調(diào)節(jié)基因的同源物可以在其它蘑菇形成真菌時找到。此處進一步描述本發(fā)明，我們將利用編碼假想的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子以及其表達在蘑菇形成中會變化的基因來1)能夠商業(yè)化生產(chǎn)那些還不能商業(yè)化生產(chǎn)的蘑菇，2)提高蘑菇的產(chǎn)量，3)提高質(zhì)量 (例如，形狀和形態(tài)的均一性)，4)提高蘑菇形成過程的可預見性和/或能夠在那些還不能用于商業(yè)化生產(chǎn)蘑菇的培養(yǎng)基上生產(chǎn)蘑菇。蘑菇可以被定義為肉質(zhì)多的、結(jié)出孢子的真菌子實體，通常產(chǎn)生于土壤的地面上或其食物來源上。被命名為“蘑菇”的標準是栽培的白蘑菇、雙孢菇(Agaricus bisporus), 因此蘑菇這個詞最常用于那些具有莖(菌柄)、蓋(菌蓋)和位于蓋下側(cè)的菌褶(單個或多個菌褶(lamella))的真菌(擔子菌門(Basidiomycota)，傘菌綱(Agaricomycetes))，就像從商店買的白蘑菇。蘑菇也可能具有微孔以代替菌褶?！澳⒐健币辉~也可以被用于各種各樣的真菌子實體，其產(chǎn)生具有或不具有莖的有性孢子，該術(shù)語更為普遍的用來形容一些子囊菌門(Ascomycota)的肉質(zhì)子實體和一些擔子菌門的木本或革質(zhì)(leathery)子實體。偏離標準形態(tài)的形式通常有更具體的名稱，諸如“馬勃菌”、“鬼筆科菌(StinWlorn) ”和“羊肚菌(morel)”，而由于它們與傘菌屬(Agaricus)或它們所屬的傘菌目(Agaricales)的相似性，有菌褶的蘑菇本身通常被稱為“傘菌類(agarics)”。推而廣之，術(shù)語“蘑菇”也可以指培養(yǎng)的整體的真菌，或形成被稱為蘑菇的子實體的物種的葉狀體(稱為菌絲體)，或該物種本身。^li在第一方面，提供疑似參與蘑菇生產(chǎn)調(diào)節(jié)的200種多肽。這些多肽如表1所示，并且可從公共數(shù)據(jù)庫中獲得(http://jgi.doe. gov/^commune)。本申請關注與選自SEQ ID NO :1-200(表1)的序列具有至少40%氨基酸同一性或相似性的多肽，和/或與選自SEQ ID NO :201-208(表4)的序列具有至少50%氨基酸同一性或相似性的多肽。表5將每個多肽的名稱與給定的與氨基酸序列相對應的SEQ ID號進行鏈接。這些多肽也可命名為調(diào)節(jié)子或轉(zhuǎn)錄因子(TF)，因為它們已經(jīng)被已知存在于TF中的基序(motif)或結(jié)構(gòu)域的存在所確認，例如已知的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如鋅指結(jié)構(gòu)域(更多細節(jié)參見實施例1)。TF基因優(yōu)選地被確認，基于1)使用GO (基因本體論)的自動標注(Ashburner et al. ,2000),(euKaryotic Orthologous Groups)) (Koonin et al., 2004)和3) PFAM 算法(Finn et al. ,2008)。確認的假想TF優(yōu)選隨后針對基因組進行blast (Blast N和Blast P)，以確認假想的TF基因在自動標注中是缺失的。在第二步中，在生產(chǎn)蘑菇的過程中分析它們的表達。本發(fā)明的TF至少在蘑菇的部分生命周期中表達。例如，本發(fā)明的TF的表達在蘑菇的發(fā)育過程中可以變化。本文所使用的“多肽”是指任何肽、寡肽、多肽、基因產(chǎn)物、表達產(chǎn)物或蛋白。多肽由連續(xù)的氨基酸組成。術(shù)語“多肽”包括天然產(chǎn)生或人工合成的分子。此處描述的利用與氨基酸序列具有同一性或相似性(與SEQ ID N01-200具有至少40%的同一性或相似性；與SEQ ID NO 201-208具有至少50%的同一性或相似性)所定義的每個氨基酸序列，在進一步的優(yōu)選實施方式中，與給定的多肽具有至少42%，45%， 50 %，55 %，60 %，65 %，70 %，75 %，80 %，82 %，85 %，90 %，95 %，96 %，97 %，98 %，99 % 或 100%的同一性或相似性。在一個優(yōu)選的實施方式中，序列的同一性或相似性通過比較本文確認的序列的整個長度來確定。此處描述的編碼多肽的每個核苷酸序列可以編碼真菌多肽，S卩，具有與真菌或蘑菇有機體中天然產(chǎn)生的多肽相同的氨基酸序列的多肽。這些多肽的功能依賴于與相應確認的SEQ ID號的氨基酸序列的相關性(同一性或相似性的百分比)。當所述的TF在蘑菇的至少部分生命周期中具有可檢出的轉(zhuǎn)錄活性時，TF優(yōu)選被稱為是功能化的。優(yōu)選的蘑菇是裂褶菌屬(Schizophyllum)。更加優(yōu)選為裂褶菌菌株 4-8(FGSC#9210) (Fungal Genetic Stock Center，Missouri，USA)?；钚?，優(yōu)選是轉(zhuǎn)錄活性的存在，優(yōu)選通過在所述真菌或蘑菇中滅活編碼所述TF的核苷酸序列，以及分析對比對照組的蘑菇生產(chǎn)是否會生成蘑菇來進行評價，其中，在所述對照組中，所述核苷酸序列沒有被激活。如果沒有生成蘑菇或者生成更少或更多的蘑菇，所述TF被稱為顯示出活性，優(yōu)選是轉(zhuǎn)錄活性，因此是功能性的。本文稍后定義更少或更多的蘑菇。另一方面或與前面實施方式相結(jié)合，本發(fā)明的多肽可能是天然的多肽，也可能是非天然生成的多肽。非天然生成的多肽可能是由例如利用定點突變或易錯PCR突變的核酸序列所編碼的多肽。核酸構(gòu)津體在另一方面，提供一種含有編碼多肽的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體，所述多肽含有由選自下列的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列(a)編碼與選自SEQ ID NO 1-200的氨基酸序列具有至少40%氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列的核苷酸序列；以及，(b)編碼與選自SEQ ID NO :201-208的氨基酸序列具有至少50%氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列任選地與能夠驅(qū)動所述核苷酸序列在真菌和/或蘑菇中表達的啟動子操作性連接。核酸構(gòu)建體被定義為核酸分子，其從天然生成的基因中分離或被修飾為含有以本來不存在于自然界的方式結(jié)合或并置的核酸的片段。以核苷酸序列來代表核酸分子。任選地，存在于核酸構(gòu)建體中的核苷酸序列可操作地與一個或多個控制序列連接，其指導所述多肽在真菌中產(chǎn)生?？刹僮鞯剡B接在本文中被定義為一種結(jié)構(gòu)，在該結(jié)構(gòu)中，控制序列位于相對于編碼本發(fā)明的所述多肽的核酸序列的恰當?shù)奈恢?，因此該控制序列指導本發(fā)明的所述多肽在真菌細胞和/或蘑菇中生成。表達將被理解為包括參與產(chǎn)生多肽的任何步驟，包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、 翻譯、翻譯后修飾和分泌。本文所定義的控制序列包括所有對于多肽的表達必要的或有益的組分。在最低限度，所述控制序列包括啟動子和轉(zhuǎn)錄的和翻譯的終止信號。本文所使用的術(shù)語“啟動子”是指核酸片段，其功能為控制一個或多個基因或核酸的轉(zhuǎn)錄，位于基因的轉(zhuǎn)錄起始位點的轉(zhuǎn)錄方向的上游，并且與DNA依賴的RNA聚合酶的結(jié)合位點的存在所確認的結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄起始位點和任何其它的DNA序列相關，包括但不限于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點、抑制子和激活子蛋白結(jié)合位點以及任何其它本領域技術(shù)人員已知的直接或間接地調(diào)節(jié)啟動子的轉(zhuǎn)錄量的核苷酸序列。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，啟動子優(yōu)選在轉(zhuǎn)錄起始位點(TSS)的-1位核苷酸結(jié)束。啟動子優(yōu)選能夠驅(qū)動核苷酸序列在真菌和/或蘑菇中表達。優(yōu)選的啟動子包括 組成型表達的，例如裂褶菌的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gpd)的啟動子(Harmsen et al., 1992) (SEQ ID NO :209)。本發(fā)明也涉及含有本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的表達載體。優(yōu)選地，表達載體含有本發(fā)明的核苷酸序列，其可操作地連接一個或多個控制序列，該控制序列指導所編碼的多肽在真菌細胞和/或蘑菇中產(chǎn)生。表達載體可以被視為重組表達載體。表達載體可以是可方便地經(jīng)受DNA重組過程并能將編碼本發(fā)明的多肽的核苷酸序列在真菌和/或蘑菇中表達的任
7意載體。依賴于所述表達載體所要導入的真菌/蘑菇的確認以及本發(fā)明的核苷酸序列的起始，本領域的技術(shù)人員知道如何選擇最適合的表達載體和控制序列。核酸構(gòu)建體的單個或多個拷貝可被引入真菌細胞和/或蘑菇中。核酸構(gòu)建體可以保持游離而因此含有自主復制序列，例如ARS序列。合適的游離核酸構(gòu)建體可以，例如基于酵母2μ或pKDl質(zhì)粒(Fleer et al.，1991)?？蛇x地，核酸構(gòu)建體以一個或多個拷貝整合進入真菌細胞和/或蘑菇的基因組。整合到真菌細胞和/或蘑菇的基因組可以通過在目標整合位點的非常規(guī)重組或同源重組而隨機發(fā)生。優(yōu)選地，核酸構(gòu)建體整合到真菌和/或蘑菇的基因組中。這種類型的核酸構(gòu)建體可以含有細菌克隆載體、編碼TF和選擇標記物的核苷酸序列。選擇標記物可賦予抗生素耐藥性或為營養(yǎng)缺陷型標記物。這些標記物是本領域技術(shù)人員已知的。含有細菌克隆載體和選擇標記物的核酸構(gòu)建體作為實例et al(1994)和Munoz-Rivas et al (1986)中被公開?？蛇x地，這種類型的核酸構(gòu)建體可以是合成的，例如使用PCR技術(shù)。如果把編碼所述多肽的核苷酸序列引入到表達構(gòu)建體中，本發(fā)明的多肽表達水平將上升。如果把編碼所述多肽的核苷酸序列引入到失活構(gòu)建體(inactivation construct) 中，本發(fā)明的多肽表達水平將下降。這些失活構(gòu)建體是本領域技術(shù)人員已知的。這些構(gòu)建體可含有編碼突變的多肽的核苷酸序列或含有編碼所述多肽的核苷酸序列的側(cè)翼序列的核苷酸序列。這樣的構(gòu)建體將整合到所述多肽的內(nèi)源性基因座中以替換該內(nèi)源性基因并使其失活?？蛇x地，所述失活構(gòu)建體可以含有誘導RNAi的序列。RNAi技術(shù)是本領域技術(shù)人員已知的(De Jong et al，2006)。所述多肽的失活可能是由于響應基因或核苷酸序列的失活。在類似RNAi失活的情況下，mRNA的水平會降低。所述失活構(gòu)建體也可能會導致mRNA的水平與在野生型中所觀察到的類似。在這種情況下，所述編碼的突變多肽具有降低的活性，其中，所述降低的活性通過比較所述多肽的活性與引起的或衍生的突變多肽的活性來評價。多肽的活性可以使用本領域技術(shù)人員已知的測試來評價。這些測試可以包括將所述突變多肽引入到真菌中， 比較表達的所述突變多肽的活性和突變多肽所源自的所述多肽的相應活性。突變多肽的活性可以與對照多肽的活性相比較。如果真菌是裂褶菌屬，對照多肽的對照活性可以是裂褶菌菌株4-8(reSC#9210)的菌株表現(xiàn)出的活性。優(yōu)選地，突變多肽沒有可檢測的活性。活性與本文中較早定義的轉(zhuǎn)錄活性或是功能性的具有相同的含義。合適的轉(zhuǎn)化真菌的過程是本領域技術(shù)人員公知的。例如，蘑菇形成真菌可以使用原生質(zhì)體進行轉(zhuǎn)化，例如使用van Peer et al (2009)的過程。真菌細胞/蘑菇在另一方面，本發(fā)明提供具有增加的多肽表達水平和/或降低的多肽表達水平的真菌和/或蘑菇，其中，所述多肽由與選自SEQ ID NO :1-200的序列具有至少40%氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列，和/或與選自SEQ IDNO =201-208序列具有至少50%氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列所編碼。在一個優(yōu)選的實施方式中，真菌和/或蘑菇含有前文中所定義的本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或表達載體。真菌和/或蘑菇的選擇將在很大程度上取決于本發(fā)明的核酸序列的來源。根據(jù)真菌的同一性，本領域技術(shù)人員知道如何將本發(fā)明的所述構(gòu)建體或載體轉(zhuǎn)化它。在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供一種多肽表達水平增加而另一種多肽表達水平降低的真菌和/或蘑菇。在另一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供至少一種本發(fā)明的多肽表達水平增加和/或至少另一種本發(fā)明的多肽表達水平降低的真菌和/或蘑菇。在真菌和/或蘑菇中表達的本發(fā)明的多肽，如上所述，可以是接下來進一步定義的異源性多肽或內(nèi)源性多肽。優(yōu)選地，例如當本發(fā)明的多肽用于改進食用菌的生產(chǎn)時，在真菌和/或蘑菇中表達的本發(fā)明的多肽是異源性多肽。此處所述的具有“增加的多肽表達水平”的真菌和/或蘑菇，其包括異源性多肽的表達，即使所定義的異源性多肽在真菌和/或蘑菇中不是天然表達的。然而，在這種情況下，所述“增加的”表達水平被解釋為具有可檢測的異源性多肽的表達而對照真菌和/或蘑菇不具有可檢測的異源性多肽的表達。表達水平降低的多肽，如上所述，是內(nèi)源性的多肽。之前所確認的增加的和/或降低的表達并不需要在蘑菇/真菌的整個生命周期中都發(fā)生。根據(jù)所述多肽的同一性，它的表達可以是增加的，而在所述蘑菇/真菌的部分生命周期中則是降低的。真菌可以是任意真菌。優(yōu)選的真菌是其中編碼本文之前所確認的多肽的核苷酸是參與所述真菌的生產(chǎn)的真菌。真菌優(yōu)選是生產(chǎn)蘑菇的真菌。更優(yōu)選的蘑菇是其生產(chǎn)具有吸引力的或被懷疑能夠生產(chǎn)感興趣的物質(zhì)的蘑菇。這可以是由于商業(yè)上的原因。 在一個實施方式中，真菌是擔子菌綱(basidiomycete)或子囊菌綱(Ascomycete)，優(yōu)選是擔子菌綱，優(yōu)選是傘菌目，更優(yōu)選的是裂褶菌科(Schizophyllaceae)以及更優(yōu)選的是裂褶菌屬。更優(yōu)選的是裂褶菌。更加優(yōu)選的是裂褶菌菌株4-8(reSC#9210)。優(yōu)選的傘菌目的例子是雙孢菇，平菇(Pleurotus ostreatus)禾口香菇(Lentius edodus)。根據(jù)優(yōu)選實施方式，真菌和/或蘑菇具有表達水平已增加的多肽，即，產(chǎn)生高于正常量的或具有增加的生產(chǎn)水平的本發(fā)明所述的多肽，和/或在相同的培養(yǎng)和/或測試條件下，比衍生出該真菌/蘑菇的親本真菌/蘑菇顯示出更高的所述多肽的活性。“產(chǎn)生高于正常量的或具有增加的生產(chǎn)水平的所述多肽”在本文中定義為，當兩種細胞(親本的和轉(zhuǎn)化的細胞)在相同的條件下培養(yǎng)時，比衍生出該轉(zhuǎn)化的真菌/蘑菇的親本真菌/蘑菇產(chǎn)生更多的本發(fā)明的多肽。該增加可以發(fā)生在真菌/或蘑菇的部分生命周期中和/或所述真菌/蘑菇生命周期的特定階段。優(yōu)選地，當兩種細胞(親本的和轉(zhuǎn)化的細胞)在相同的條件下培養(yǎng)時，本發(fā)明的真菌/蘑菇產(chǎn)生的多肽比衍生出該轉(zhuǎn)化的真菌/蘑菇的親本真菌/蘑菇高至少3^^6^^10%或15%。產(chǎn)生比親本的真菌/蘑菇高至少20%、 30 % ,40 % ,50 % ,60 % ,70 % ,80 % ,90 % UOO % ,150 % ,500 %, 1000 %、10000 % 或更多的所述多肽的真菌也是優(yōu)選的。根據(jù)另一個優(yōu)選實施方式，將本發(fā)明的真菌/蘑菇的多肽的生產(chǎn)水平與對照菌株中相同多肽的生產(chǎn)水平進行比較。根據(jù)更加優(yōu)選的實施方式，當本發(fā)明的真菌/蘑菇是裂褶菌屬菌株時，將本發(fā)明的所述真菌/蘑菇的多肽的生產(chǎn)水平與作為對照的裂褶菌菌株4-8(reSC#9210)的生產(chǎn)水平進行比較。所述多肽的生產(chǎn)水平的評價可以使用Northern印跡或陣列分析在mRNA水平進行，和/或使用Western印跡在多肽水平進行。所有這些方法都是本領域技術(shù)人員公知的。“顯示更高或增加的多肽活性”在本文中定義為，在使用特定針對所述多肽的活性的測試中，比衍生出該轉(zhuǎn)化的真菌/蘑菇的親本真菌/蘑菇顯示出更高的多肽活性。優(yōu)選地，當使用特定針對所述多肽活性的方法進行測試時，本發(fā)明的所述真菌/蘑菇顯示出比衍生出該轉(zhuǎn)化的真菌/蘑菇的親本真菌/蘑菇顯示出的活性高至少3<%、6%、10%或15% 的活性。顯示出比親本的真菌/蘑菇高至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100 %、150 %、500 %、1000 %、10000 %或更多的所述活性的真菌/蘑菇也是優(yōu)選的。根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方式，將本發(fā)明的所述真菌/蘑菇的所述多肽的活性水平與作為對照的裂褶菌菌株4-8 (FGSC#9210)菌株產(chǎn)生的相應活性水平進行比較。本領域技術(shù)人員知道針對每種多肽可以使用何種活性。在優(yōu)選的實施方式中，所述活性是轉(zhuǎn)錄活性，其可以通過本文之前所定義的進行評價。過表達或表達的增加或上調(diào)可以通過本領域已知的傳統(tǒng)方法來實現(xiàn)，例如相比于天然存在的，引入更多的編碼多肽的核苷酸拷貝到真菌/蘑菇中，其在載體或染色體上。可選地，可以通過將編碼所述多肽的核苷酸融合到在選定的真菌/蘑菇中高表達或適合高水平蛋白表達的強啟動子或兩者的組合而實現(xiàn)過表達。根據(jù)真菌/蘑菇的同一性，本領域的技術(shù)人員知道哪個強啟動子是最適合的。在本文中，強啟動子優(yōu)選意味著相比于可操作地連接到核苷酸序列的內(nèi)源性啟動子上的該核苷酸序列的表達，其能夠誘導可操作地連接到該強啟動子上的該核苷酸序列更高的表達。過表達也可以通過其它方法來實現(xiàn)，例如通過增加mRNA的穩(wěn)定性或通過引入內(nèi)含子。根據(jù)優(yōu)選實施方式，真菌/蘑菇具有已降低的多肽表達水平，S卩，產(chǎn)生低于正常量的或具有降低的生產(chǎn)水平的本發(fā)明的所述多肽，和/或在相同的培養(yǎng)和/或測試條件下，比衍生出該真菌/蘑菇的親本真菌/蘑菇顯示更低的所述多肽的活性。“產(chǎn)生低于正常量的或具有降低的生產(chǎn)水平的所述多肽”在本文中定義為，當兩種細胞(親本的和轉(zhuǎn)化的細胞)在相同的條件下培養(yǎng)時，比衍生出該轉(zhuǎn)化的真菌/蘑菇的親本真菌/蘑菇產(chǎn)生更少的本發(fā)明的多肽。優(yōu)選地，當兩種細胞(親本的和轉(zhuǎn)化的細胞)在相同的條件下培養(yǎng)時，本發(fā)明的真菌/蘑菇產(chǎn)生比衍生出該轉(zhuǎn)化的真菌/蘑菇的親本真菌/ 蘑菇低至少3<%、6%、10%或15%的本發(fā)明的所述多肽。產(chǎn)生相比于親本的真菌/蘑菇低至少 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或 150% 的所述多肽的真菌 / 蘑菇也是優(yōu)選的。本發(fā)明也包括沒有所述多肽的表達被檢出。優(yōu)選地，所述表達在至少部分所述真菌/蘑菇的生命周期中是無法檢出的。根據(jù)另一個優(yōu)選實施方式，將本發(fā)明的所述真菌/蘑菇中的所述多肽的生產(chǎn)水平與對照菌株中的相同多肽的生產(chǎn)水平進行比較。根據(jù)更加優(yōu)選的實施方式，當本發(fā)明的所述真菌/蘑菇是裂褶菌屬菌株時，將本發(fā)明的所述真菌/ 蘑菇中的所述多肽的生產(chǎn)水平與作為對照的裂褶菌菌株4-8(reSC#9210)中的生產(chǎn)水平進行比較。所述多肽的生產(chǎn)水平的評價可以使用Northern印跡或陣列分析在mRNA水平進行，和/或使用Western印跡在多肽水平進行。所有這些方法都是本領域技術(shù)人員公知的。“顯示更低或降低的多肽活性”在本文中定義為，在使用特定針對所述多肽的活性的測試中，比衍生出該轉(zhuǎn)化的真菌/蘑菇的親本真菌/蘑菇顯示出更低的多肽活性。優(yōu)選地，當使用特定針對所述多肽活性的方法進行測試時，本發(fā)明的所述真菌/蘑菇顯示出比衍生出該轉(zhuǎn)化的真菌/蘑菇的親本真菌/蘑菇顯示出的活性低至少3<%、6%、10%或15% 的活性。顯示出比親本的真菌/蘑菇低至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、 100%或150%的所述活性的真菌/蘑菇也是優(yōu)選的。根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方式，將本發(fā)明的所述真菌/蘑菇的所述多肽的活性水平與作為對照的裂褶菌菌株4-8 (FGSC#9210)菌株產(chǎn)生的相應活性水平進行比較。此處多肽的活性也優(yōu)選是指本文之前定義的所述多肽的轉(zhuǎn)錄活性。
根據(jù)更加優(yōu)選的實施方式，真菌/蘑菇不產(chǎn)生任何可檢出量的本發(fā)明的所述多肽和/或不顯示出任何可檢出的所述多肽的活性。優(yōu)選地，真菌/蘑菇不產(chǎn)生或?qū)嵸|(zhì)上不產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。本發(fā)明的所述多肽的表達水平的降低和/或其活性的降低可以通過本領域已知的傳統(tǒng)方法來實現(xiàn)，例如通過失活或下調(diào)或降低編碼所述真菌/蘑菇的所述多肽的內(nèi)源性核苷酸的表達水平。核酸或多肽分子所使用的術(shù)語“內(nèi)源性”是指真菌/蘑菇(優(yōu)選是野生狀態(tài)下的) 天然表達的核酸或多肽。術(shù)語“異源性”被用作“內(nèi)源性”的反義詞。核酸或多肽分子所使用的術(shù)語“異源性”是指源于異體真菌/蘑菇的核酸或多肽，其不會天然產(chǎn)生而作為給定真菌/蘑菇的一部分(所述真菌的基因組或DNA或RNA)，或在真菌/蘑菇中或在基因組或DNA或RNA序列的位點中發(fā)現(xiàn)的不同于在自然界中發(fā)現(xiàn)的。異源性核酸或蛋白對于引入它們的真菌/蘑菇不是內(nèi)源性的，而是從其它真菌/蘑菇得到的或是合成或重組產(chǎn)生的。一般來說，雖然不一定，在該DNA轉(zhuǎn)錄或表達的真菌中通常都不會生成這些核酸編碼的蛋白或多肽，類似的，存在外源性RNA的真菌/蘑菇中通常不會表達編碼蛋白的外源性RNA。此外，已知異源性蛋白或多肽可以包括在所轉(zhuǎn)化的真菌/蘑菇中以不尋常的順序和/或方向排列的同源性元件， 艮口，編碼所述蛋白或多肽的核苷酸序列源自同一物種，但通過蓄意的人為干預對天然形式的成分和/或基因組位點進行實質(zhì)性修飾。異源性的核酸和蛋白也可以是指異體核酸或蛋白。本文中的術(shù)語異源性的核酸或蛋白包括本領域技術(shù)人員承認對表達它的真菌/蘑菇而言作為異源性的或是異體的任何核酸或蛋白。術(shù)語異源性也指核酸或氨基酸序列的非天然組合，即，至少兩個序列的組合對每一個來說都是異體的組合。這種失活或下調(diào)可以通過刪除編碼基因中的一個或多個核苷酸來實現(xiàn)?？蛇x地， 它可以是通過類似于RNAi的機理所導致的。在另一個實施方式中，本發(fā)明涉及在其基因或編碼所述多肽的核苷酸中具有突變的真菌/蘑菇。優(yōu)選地，制備替換或失活載體以及隨后通過轉(zhuǎn)化將其引入到真菌/蘑菇中來構(gòu)建具有失活的編碼所述多肽的核苷酸的真菌/蘑菇。本領域技術(shù)人員知道如何構(gòu)建這樣的載體。例如，這種載體可包括編碼多肽的核苷酸的側(cè)翼區(qū)以及存在于所述側(cè)翼區(qū)之間的選擇標記基因?？蛇x地或與編碼所述多肽的失活的內(nèi)源性核苷酸相結(jié)合，編碼所述多肽的所述核苷酸可以通過將其融合到適合在選定的真菌有機體/選定的蘑菇中低水平蛋白表達的弱啟動子來調(diào)低表達。在本文中，弱啟動子被定義為相比于可操作地連接到核苷酸序列的內(nèi)源性啟動子上的該核苷酸序列的表達，能夠誘導可操作地連接到該啟動子上的核苷酸序列更低的表達的啟動子?？蛇x地或與任何提到的獲得本發(fā)明的真菌/蘑菇的方法相結(jié)合，可以通過具有不同程度的目標基因(即本文中所確認的編碼多肽的核苷酸)的表達的真菌/蘑菇的天然分離物，或可能會通過突變、基因改造或通過諸如使用化學或物理刺激的其它方法來改變這些基因的表達。改變這些多肽的表達的一個方法是對真菌進行經(jīng)典誘變并篩選具有所期望的本文所確認的所述多肽的表達水平的真菌/蘑菇。在一個優(yōu)選的實施方式中，提供一種真菌/蘑菇，其中，含有與選自SEQID N0:29 ； 177 ；20 ；56 ；4組成的組中的序列具有至少40%氨基酸同一性或相似性；和/或與選自SEQID NO 204 ；207 ；208 ；202 ；201組成的組中的序列具有至少50%氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列的多肽的表達水平是增加的，以及其中，含有與選自SEQ ID NO 55 ；21力4組成的組中的序列具有至少40%氨基酸同一性或相似性；和/或與選自SEQ ID NO :206 ；205 ； 203組成的組中的序列具有至少50%氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列的多肽的表達水平是降低的。200個確認的基因示于表1。為了知道表1中給定基因/核苷酸的表達是增加還是降低，本領域的技術(shù)人員可以在給定的真菌或蘑菇中降低，優(yōu)選是滅活該基因。優(yōu)選的蘑菇是裂褶菌屬。更加優(yōu)選的是裂褶菌菌株4-8(reSC#9210)。隨后，與未滅活所述核苷酸序列的對照蘑菇的蘑菇生產(chǎn)相比較，分析是否會產(chǎn)生蘑菇。本文中已經(jīng)描述了滅活基因的方式。如果不產(chǎn)生蘑菇或者產(chǎn)生的蘑菇少，包含在本發(fā)明的真菌/蘑菇中的所述基因/ 核苷酸序列的表達水平或相應的編碼的多肽的活性表達水平優(yōu)選增加。反之，如果產(chǎn)生蘑菇或者產(chǎn)生的蘑菇多，包含在本發(fā)明的真菌/蘑菇中的所述基因/核苷酸序列的表達水平或相應的編碼的多肽的活性表達水平優(yōu)選降低。然而，只要可以避免蘑菇團簇，包含在本發(fā)明的真菌/蘑菇中的編碼的多肽的活性表達水平優(yōu)選是增加的。例如，當期望蘑菇的發(fā)育不受其它可能更小、在其附近且沒有完全發(fā)育的蘑菇阻礙時。 例如，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)SEQ IDN0:21、M、55的失活導致更多蘑菇的生產(chǎn)。因此，為了生產(chǎn)更多的蘑菇，優(yōu)選降低含有與本文其它地方進一步定義的、與SEQ ID NO :2154或55具有同一性或相似性的氨基酸序列的多肽的表達。然而，當期望生產(chǎn)更少但更大的蘑菇時，優(yōu)選過表達含有與SEQ ID NO :21、討或55具有同一性或相似性的氨基酸序列的多肽。更少的蘑菇意味著，當兩種細胞(親本的和轉(zhuǎn)化的細胞)在相同的條件下培養(yǎng)時， 產(chǎn)生的蘑菇比衍生出該轉(zhuǎn)化蘑菇的親本蘑菇低至少3<%、6%、10%或15%。產(chǎn)生相比于親本蘑菇低至少 20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,100%^； 150% 的所述蘑菇也是優(yōu)選的。本發(fā)明也包括沒有蘑菇被檢出。更多的蘑菇意味著，當兩種細胞(親本的和轉(zhuǎn)化的細胞)在相同的條件下培養(yǎng)時， 產(chǎn)生的蘑菇比衍生出該轉(zhuǎn)化蘑菇的親本蘑菇高至少l^d^j^UO^或15%。產(chǎn)生相比于親本蘑菇高至少 20 %,30 %,40 % ,50 %,60 %,70 %,80 %,90 % UOO % ,150 % ,500 %, 1000 %、10000 %或更多的所述蘑菇也是優(yōu)選的。蘑菇的檢測優(yōu)選是可視化的，例如確定具有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿、容器中或蘑菇床中蘑菇的數(shù)量。在實驗部分，表1中所確認的一些基因已經(jīng)被滅活了。結(jié)果列于表3中。從這些結(jié)果，我們得出結(jié)論，在優(yōu)選的實施方式中，提供了一種真菌/蘑菇，其中，含有與選自 SEQ ID NO :204、207、208、202 和 201 組成的組中的序列具有至少 50% ,55%,60%,65%, 70%,75%,80%,82%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 的氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列的所述多肽的表達水平是增加的，以及，其中，含有與選自SEQ ID NO 206、205 和 203 組成的組中的序列具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、82%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列的所述多肽表達水平是降低的。SEQ ID NO :204、207、208、202 和 201 分別編碼部分 fst4、hom2、wc2、c2h2、bril。對應的蛋白通過表1中的下列ID確認66861 ；257987，13988，114363，255701 (分別是SEQ ID NO 29 ；177 ；20 ；56 ；4)。 SEQ ID NO =206,205和203分別編碼部分homl、gatl和fst3。對應的蛋白通過表 1 中的下列 ID 確認:257652，255004，257422(分別是 SEQ IDNO 55 ；21 ；54)
這些真菌/蘑菇是有吸引力的，可被用于許多不同的應用中。這些過程可以改進/使蘑菇生產(chǎn)成為可能。改進或使蘑菇生產(chǎn)商業(yè)化可能是由于-在尚不能用于生長商業(yè)化蘑菇的培養(yǎng)基上生長-在時間和空間上控制蘑菇的形成-增加生產(chǎn)水平-增加質(zhì)量(例如尺寸和生長物(outgrowth)更加均一)在另一個實施方式中，我們的發(fā)明可以改進商業(yè)環(huán)境中蘑菇的生長，或允許尚不能生產(chǎn)的品種進行商業(yè)化生產(chǎn)，從而為以便宜的方式生產(chǎn)食用菌或為生產(chǎn)(或提高生產(chǎn)) 農(nóng)業(yè)、食品、飼料或非食品或者非飼料應用中感興趣的藥品或蛋白創(chuàng)造機會。這些蛋白可以是或不是源于蘑菇形成真菌。下面列出了本發(fā)明真菌一些可能的應用。牛產(chǎn)方法在另一方面，本發(fā)明提供一種前文中所確認的真菌/蘑菇的生產(chǎn)方法。本領域的技術(shù)人員知道如何進行這些方法，例如Mamets和Chilton(198 和vanGriensven(1988) 所描述的。這種生產(chǎn)包括培養(yǎng)基(帶或不帶覆土層(casinglayer))的侵染，以及隨后的子實體生產(chǎn)階段。該生產(chǎn)可以以具有最佳產(chǎn)量和/或質(zhì)量水平(尺寸和生長物更加均一)的商業(yè)規(guī)模進行。本發(fā)明也涉及使用本發(fā)明的真菌/蘑菇生產(chǎn)感興趣的物質(zhì)的方法。在該方法中， 為了能夠生產(chǎn)所述物質(zhì)，真菌/蘑菇可能已被修飾。感興趣的物質(zhì)可以是真菌/蘑菇可以生產(chǎn)的任何物質(zhì)。這些物質(zhì)包括蛋白、多肽、代謝物。本文中的蛋白或多肽可以是藥用蛋白或多肽和/或食品、飼料或非食品或者非飼料應用中感興趣的蛋白或多肽。這些物質(zhì)對真菌/蘑菇可以是或者不是內(nèi)源性的。優(yōu)選地，該方法的步驟包括在有利于生成所述感興趣的物質(zhì)的環(huán)境下培養(yǎng)能夠生產(chǎn)感興趣的物質(zhì)的本發(fā)明的真菌/蘑菇；以及任選地回收感興趣的物質(zhì)。在一個實施方式中，真菌/蘑菇含有核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體含有編碼所生產(chǎn)的蛋白/多肽的核苷酸。在這種情況下，感興趣的物質(zhì)可以是這些蛋白/多肽?？蛇x地，所述蛋白/多肽可能涉及這些感興趣的物質(zhì)的生產(chǎn)或合成。本文之前已經(jīng)定義了所述核酸構(gòu)建體的每個特性。本發(fā)明也包括使用真菌/蘑菇，該真菌/蘑菇已通過增加/降低蛋白/ 多肽的表達水平進一步被修飾，已知所述蛋白/多肽參與生產(chǎn)所述物質(zhì)的方法。確認方法監(jiān)測這些基因或編碼所述多肽的核苷酸的表達水平可以允許確認在生產(chǎn)蘑菇的方法中所涉及的刺激因素。因此，在另一方面，本發(fā)明提供一種確認能夠影響蘑菇生產(chǎn)的刺激因素的方法，該方法的步驟包括(a)提供真菌/蘑菇；
(b)對所述真菌/蘑菇應用所述刺激因素；(c)確定步驟b)中真菌/蘑菇的核苷酸序列的表達水平或?qū)木幋a的多肽的活性或穩(wěn)定狀態(tài)水平，其中，所述多肽含有或組成為與選自SEQ IDNO :1-200組成的組中的序列具有至少40%氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列，或與選自SEQ ID NO :201-208組成的組中的序列具有至少50%氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列。(d)將沒有使用所述刺激因素的真菌/蘑菇中的所述核苷酸序列或多肽的表達、 活性或穩(wěn)定狀態(tài)水平與(C)中所確定的表達、活性或穩(wěn)定狀態(tài)水平進行比較；以及(e)確認在使用所述刺激因素的真菌/蘑菇以及沒有使用所述刺激因素的真菌 /蘑菇之間產(chǎn)生所述核苷酸序列或多肽的表達水平、活性或穩(wěn)定狀態(tài)水平的差異的刺激因
ο刺激因素可以是任意類型的刺激因素。它可以是物理刺激，諸如增加/降低溫度、 增加/降低光照強度、改變光照波長，通過例如光或機械方式創(chuàng)造一定程度的損傷。它可能是物質(zhì)或死的或活的有機體的存在。在一個優(yōu)選的方法中，將多于一個核苷酸序列或多于一個多肽的表達水平、活性或穩(wěn)定狀態(tài)水平進行對比。本文已經(jīng)確定了優(yōu)選的多肽和編碼的核苷酸序列。在本發(fā)明的一方面還涉及采用所述方法確認的物質(zhì)、處理或死的或活的有機體。本文已經(jīng)解釋了該方法的每個特征?！爱a(chǎn)生所述核苷酸序列或多肽的表達水平、活性或穩(wěn)定狀態(tài)水平的差別”的含義與 “增加的多肽的表達水平和/或降低的多肽的表達水平”相同。在另一方面，我們將使用對(確認的)調(diào)節(jié)基因有應答性的啟動子元件以(i)確認影響蘑菇形成(例如但不限于蘑菇的數(shù)量或蘑菇的尺寸)的(下游)基因；(ii)基于當前的或未來的商業(yè)蘑菇品種生成生物模型，其將允許A.對特定的(一些)調(diào)節(jié)基因或編碼種特異性相關的結(jié)構(gòu)蛋白的基因的確認、表征和應用；B.對當前最先進的用于養(yǎng)殖蘑菇的調(diào)節(jié)器的表征或改進應用；C.對帶有改進的或新特征的當前最先進的用于養(yǎng)殖蘑菇的調(diào)節(jié)器的衍生物的生成或確認；D.對能夠改進蘑菇養(yǎng)殖、或使目前還不能商業(yè)化生產(chǎn)的蘑菇能夠商業(yè)化養(yǎng)殖的新化合物的生成或確認。序列同一性本文中的“序列同一性”被定義為通過對比序列所確定的兩種或多種氨基酸(多肽或蛋白)或兩種或多種核酸(核苷酸或多聚核苷酸)之間的關系。在本領域，“同一性”也意味著氨基酸或核酸序列之間的序列關聯(lián)度，視情況，可以通過這些序列串之間的匹配來確定。兩個氨基酸序列之間的“相似性”是通過比較氨基酸序列以及其一個多肽到第二個多肽序列的保守氨基酸替代來確定的?！巴恍浴焙汀跋嗨菩浴笨梢酝ㄟ^已知的方法很容易地計算得到，包括但不限于描述在(Computational Molecular Biology，Lesk， Α. Μ. , ed. , OxfordUniversity Press, New York,1988 ；Biocomputing Informatics and GenomeProjects,Smith,D. W. ,ed. ,Academic Press,New York, 1993 ；Computer Analysisof
14Sequence Data, Part I, Griffin, A.M. , and Griffin, H. G. , eds. , Humana Press, New Jersey, 1994 ；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G. , Academic Press, 1987 ；and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. andDevereux, J. , eds. , M Stockton Press,New York,1991 ；and Carillo,H. ,andLipman,D. ,SIAM J. Applied Math., 48 :1073(1988))中的那些。優(yōu)選的確定同一性的方法旨在給出測試序列之間的最大匹配。確定同一性和相似性的方法是編纂的公開可用的計算機程序。優(yōu)選的確定兩個序列之間的同一性和相似性的計算機程序方法包括，例如 GCG 程序包(Devereux etal.，1984)。BestFit、BLASTP、BLASTN 和 FASTA(Altschul，et al.，1990)。BLAST X 程序是可從 NCBI 或其它來源(BLAST Manual, Altschul, S.，et al.，NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894)公開獲得的。公知的 Smith Waterman算法也可以用于確定同一性。用于多肽序列比較的優(yōu)選參數(shù)包括如下算法=Needleman and Wunsch (1970)；比較矩陣來自 Hentikoff 和 Hentikoff 的 BL0SSUM62 (1992)；間隙罰分(Penalty) :12;以及間隙長度罰分4。具有這些參數(shù)的有用的程序作為“Ogap”程序可以從Genetics Computer Group公開獲得，其位于麥迪遜威斯康辛洲(Madison，WI)。上述參數(shù)是氨基酸比較的默認參數(shù)(沒有末端間隙罰分)。用于核酸比較的優(yōu)選參數(shù)包括如下算法Needleman和mmsch，J. Mol. Biol. 48 443-453(1970)；比較矩陣匹配=+10，不匹配=O ；間隙罰分50 ；間隙長度罰分3。Gap 程序可以從Genetics Computer Group獲得，其位于麥迪遜威斯康辛洲。上面給出的是用于核酸比較的默認參數(shù)。任選地，在確定氨基酸相似度時，本領域技術(shù)人員也可以考慮到所謂的“保守”氨基酸替換，本領域技術(shù)人員將會很清楚。保守的氨基酸替換是指具有類似側(cè)鏈殘基的互換性。例如，一組具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；一組具有脂肪族羥基側(cè)鏈的氨基酸是絲氨酸和蘇氨酸；一組具有含有酰胺側(cè)鏈的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；一組具有芳香側(cè)鏈的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一組具有堿性側(cè)鏈的氨基酸是賴氨酸，精氨酸和組氨酸；以及一組具有含硫側(cè)鏈的氨基酸是半胱氨酸和蛋氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸替換組是纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，賴氨酸-精氨酸，丙氨酸-纈氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。本文所公開的氨基酸序列的替換變異體是在所公開的序列中至少一個殘基被刪除而不同的殘基插入到該位置的那些。優(yōu)選地，所述氨基酸的改變是保守的。對于每個天然產(chǎn)生的氨基酸的優(yōu)選保守替換如下:Ala 至Ij ser ；Arg 至Ij Iys ；Asn 至Ij gin 或 his ；Asp 至Ij glu ；Cys 至Ij ser 或 ala ；Gln 至Ij asn ； Glu 至Ij asp ；Gly 至Ij pro ；His 至Ij asn 或 gin ；Ile 至Ij Ieu 或 val ；Leu 至Ij ile 或 val ；Lys 至Ij arg> gin 或 glu ；Met 至Ij Ieu 或 iIe ；Phe 至Ij met、Ieu 或 tyr ；Ser 至Ij thr ；Thr 至Ij ser ；Trp 至Ij tyr ； Tyr 到 trp 或 phe ；以及 Val 到 ile 或 leu。在本文以及權(quán)利要求中，動詞“包括”以及它的變形形式以其非限定的意義來使用
的，意味著包括跟隨該詞的項目，但不排除沒有具體提到的項目。此外，動詞“由......組
成”可以被“基本上由......組成”所替代，意味著本文所定義的產(chǎn)品或組合物可以包括具
體指明的物質(zhì)之外的額外組分，所述額外組分不改變本發(fā)明獨特的特征。此外，除非文字明確要求有一個以及只有一個要素，要素的不定冠詞“a”或“an”不排除存在一個以上的要素的可能性。因此，不定冠詞“a”或“an”通常意味著“至少有一個”。本文中引用的所有專利和文獻在此都通過參考的方式整體引入。接下來的實施例僅僅是出于舉例的目的提供，其不以任何方式限定本發(fā)明的范圍。


圖1 野牛型雙核體(A，D)中的子實體形成，以及雙核體中fst3(B，E)和fst4(C， F)基因已被滅活。D-F是A-C中所顯示的部分菌落的放大圖。條代表5mm(D-F)。圖2 裂褶菌(蛋白ID 13988)、L. bicolor (二色蠟蘑)(蛋白ID 306097)和灰蓋鬼傘(蛋白ID CC1G_01095)的WC2蛋白序列的比對。序列同一性使用星號㈩而相似性使用冒號()在比對的上方標示。采用 CLUSTAL 2. 0. 12 進行比對。SA^裂褶菌(蛋白ID 114363)、二色蠟蘑(蛋白ID 310874)和灰蓋鬼傘(蛋白 ID CC1G_08877)的C2H2蛋白序列的比對。序列同一性使用星號㈩而相似性使用冒號()在比對的上方標示。采用 CLUSTAL 2. 0. 12 進行比對。圖4 裂褶菌(蛋白ID 257422)、二色蠟蘑(蛋白ID 307309)和灰蓋鬼傘(蛋白 ID CC1G_02690)的Fst3蛋白序列的比對。序列同一性使用星號㈩而相似性使用冒號()在比對的上方標示。采用 CLUSTAL 2. 0. 12 進行比對。圖5 裂褶菌(蛋白ID 66861)、二色蠟蘑(蛋白ID 308722)和灰蓋鬼傘(蛋白ID CC1G_05035)的Fst4蛋白序列的比對。序列同一性使用星號㈩而相似性使用冒號()在比對的上方標示。采用 CLUSTAL 2. 0. 12 進行比對。圖6 裂褶菌(蛋白ID 255004)、二色蠟蘑(蛋白ID 292733)和灰蓋鬼傘(蛋白 ID CC1G_01461)的Gatl蛋白序列的比對。序列同一性使用星號㈩而相似性使用冒號()在比對的上方標示。采用 CLUSTAL 2. 0. 12 進行比對。圖7 裂褶菌(蛋白ID 257652)、二色蠟蘑(蛋白ID 324166)和灰蓋鬼傘(蛋白 ID CC1G_01991)的Homl蛋白序列的比對。序列同一性使用星號㈩而相似性使用冒號()在比對的上方標示。采用 CLUSTAL 2. 0. 12 進行比對。圖8 裂褶菌(蛋白ID 257987)、二色蠟蘑(蛋白ID 293988)和灰蓋鬼傘(蛋白 ID CC1G_01962)的Hom2蛋白序列的比對。序列同一性使用星號㈩而相似性使用冒號()在比對的上方標示。采用 CLUSTAL 2. 0. 12 進行比對。圖9 裂褶菌(蛋白ID 255701)、二色蠟蘑(蛋白ID 300797)和灰蓋鬼傘(蛋白 ID CC1G_03649)的Bril蛋白序列的比對。序列同一性使用星號㈩而相似性使用冒號()在比對的上方標示。采用CLUSTAL 2. 0. 12 進行比對。
具體實施例方式實施例棚列1鋼縣綠附白爐人通過Toint Genome hstitute自動調(diào)用裂褶菌菌株4-8 (FGSC#9210)基因組 (8. 29X 覆蓋)的基因得到了 13181 個預測基因(參見 http //jgi. doe. gov/Scommune) 0 ^ 用 GO (Gene Ontology) (Ashburner et al. ,2000)>KOG (euKaryotic Orthologous Groups) (Koonin et al.，2004)和PFAM算法(Finn et al.，2008)對這些基因自動注釋。該自動標注作為起始點來確認轉(zhuǎn)錄因子(TFs)·基于已知的DNA結(jié)合域，將190個基因放置在GO的輸入項“轉(zhuǎn)錄因子活性 (Transcription FactorActivity)，，中(GO :0003700)?！う?6注釋算法預測了 569個通常參與轉(zhuǎn)錄(功能ID:“K”)的基因。這些中，205 個轉(zhuǎn)錄因子被手動確認了。 基于PFAM域PF00096/IPR007087(鋅指結(jié)構(gòu)，C2H2型)的存在，一共確定了 151
個多肽。所有假想的TF被手動檢查，基因模型或注釋在必要時進行調(diào)整。列表中的重復條目被刪除。為了確認在自動注釋中錯過的TF，將確認的TF用于BLASTp (預測蛋白的數(shù)據(jù)庫)和BLASTn (染色體數(shù)據(jù)庫)分析。手動檢查命中結(jié)果并將新確認的TF添加到所述列表中。這些過程導致在裂褶菌基因組中確認了 472個假想的TF。假想轉(zhuǎn)錄因子的表達曲線為了確定在子實體發(fā)育過程中的假想TF的表達曲線，我們使用了 MPSS (大規(guī)模平行測序)技術(shù)。從單核體菌株4-40 (CBS 340. 81)和4-40與4-39 (CBS 341. 81)雜交得到的雙核體中分離總RNA。在黑暗環(huán)境和30°C下，固體匪上生長7天的菌落在200mL匪中使用Waring混合器以低速均質(zhì)1分鐘。2ml均質(zhì)后的菌絲散布到置于固化MM上方的聚碳酸酯膜上。增殖性單核體菌絲體在光線下生長4天。所述雙核體在光線下分別生長2天和 4天以分離I期聚集體和II期原基菌絲體。從在光線下生長了 8天的雙核體培養(yǎng)物中采摘 3天期的成熟蘑菇。根據(jù)van Peer et al.，2009的描述分離RNA。除了 DpnII消化之后使用MmeI生成20bp標簽之外，基本上根據(jù)Brenner et al. ,2000的描述來進行MPSS。使用克隆單分子陣列技術(shù)(Illumina，Hayward, CA, US)對標簽測序。使用Python程序語言開發(fā)的程序來分析數(shù)據(jù)。針對每百萬分之一轉(zhuǎn)錄物(TPM)對標簽數(shù)進行標準化。從數(shù)據(jù)集中刪除最大值< 4TPM的標簽。來源于相同轉(zhuǎn)錄物的標簽的TPM值進行相加，以評價它們的表達水平。如果假想的TF的基因不含有已知的5，或3，UTR，那么，將200bp染色體組DNA添加到各自基因編碼序列的末端。MPSS表達分析與在過去已經(jīng)進行的表達的研究一致(參見綜述 Wosten, H. A. B. &ffessels, 2006)。感興趣的表達曲線的確認在發(fā)育的一個周期，當TF相對于無菌的單核體為向上或向下調(diào)節(jié)時，該TF被認為是潛在參與子實體形成的調(diào)節(jié)。有75個TF為至少2倍的上調(diào)，以及155個為至少2倍的下調(diào)。更有趣的是，其中四個為至少4倍的上調(diào)以及77個為至少4倍的下調(diào)。更有趣的表1A:相比于子實體形成的某些階段的單核體，上調(diào)至少2倍的轉(zhuǎn)錄因子基因(第一 表達通過MPSS來評價，其是在每百萬標簽中的表達。L. bicolour和灰蓋鬼傘中的轉(zhuǎn)錄因虧在最后兩列中表示。
權(quán)利要求
1.具有增加的多肽表達水平和/或降低的多肽表達水平的真菌或蘑菇，其中，所述多肽由與選自SEQ ID NO :56,1-55,57-200的序列具有至少40%氨基酸同一性或相似性的核苷酸序列所編碼，和/或由與選自SEQ IDNO :202、201、203-208的序列具有至少50%氨基酸同一性或相似性的核苷酸序列所編碼。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的真菌或蘑菇，其中，增加的表達水平通過增加的多肽生產(chǎn)和/ 或在相同的培養(yǎng)和/或測試條件下，比衍生出該真菌/蘑菇的親本真菌/蘑菇具有更高的所述多肽的活性來達到。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的真菌或蘑菇，其中，表達水平增加的所述多肽是異源性多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的真菌或蘑菇，其中，表達水平增加的所述多肽是內(nèi)源性多肽。
5.根據(jù)前述任意一項權(quán)利要求所述的真菌或蘑菇，其中，所述降低的表達水平通過降低的多肽生產(chǎn)和/或在相同的培養(yǎng)和/或測試條件下，比衍生出該真菌/蘑菇的親本真菌 /蘑菇具有更低的所述多肽的活性來達到。
6.根據(jù)前述任意一項權(quán)利要求所述的真菌或蘑菇，其中，表達水平增加的所述多肽含有與選自SEQ ID NO 29 ；177 ；20 ；56 ；4的序列具有至少40%氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列；以及其中，表達水平降低的所述多肽含有與選自SEQ ID NO 55 ；21力4的序列具有至少40%氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的真菌或蘑菇，其中，表達水平增加的所述多肽含有與選自SEQ ID NO 204 ；207 ；208 ；202和201組成的組中的序列具有至少50%氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列，以及其中，表達水平降低的所述多肽含有與選自SEQ ID N0:206;205和203 組成的組中的序列具有至少50%氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列。
8.根據(jù)前述任意一項權(quán)利要求所述的真菌或蘑菇，其中，所述真菌/蘑菇是子囊菌綱或擔子菌綱，優(yōu)選是擔子菌綱，優(yōu)選是傘菌目。
9.生產(chǎn)權(quán)利要求1至8中任意一項所定義的蘑菇的方法。
10.使用權(quán)利要求1至8中任意一項所定義的蘑菇生產(chǎn)感興趣物質(zhì)的方法。
11.包含編碼多肽的核苷酸序列的核酸構(gòu)建體，該多肽含有以下氨基酸序列(a)與選自SEQID NO :1-200中的序列具有至少40%氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列；和/或，(b)與選自SEQID NO :201-208中的序列具有至少50%氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列；其中，所述核苷酸序列任選地與能夠驅(qū)動所述核苷酸序列在真菌或蘑菇中表達的啟動子操作性地連接。
12.確認能夠影響蘑菇生產(chǎn)的刺激因素的方法，該方法的步驟包括(a)提供真菌或蘑菇；(b)對所述真菌/蘑菇應用所述刺激因素；(c)確定步驟b)中真菌/蘑菇的核苷酸序列的表達水平或?qū)木幋a的多肽的活性或穩(wěn)定狀態(tài)水平，其中，所述多肽含有與選自SEQ ID NO :1-200組成的組中的序列具有至少 40%氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列，和/或與選自SEQ ID NO :201-208組成的組中的序列具有至少50%氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列，(d)將沒有使用所述刺激因素的真菌/蘑菇中的所述核苷酸序列或多肽的表達、活性或穩(wěn)定狀態(tài)水平與(C)中所確定的表達、活性或穩(wěn)定狀態(tài)水平進行比較；以及(e)確認在使用所述刺激因素的真菌/蘑菇以及沒有使用所述刺激因素的真菌/蘑菇之間產(chǎn)生所述核苷酸序列或多肽的表達水平、活性或穩(wěn)定狀態(tài)水平的差異的刺激因素。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，以此將多于一個核苷酸序列或多于一個多肽的表達水平、活性或穩(wěn)定狀態(tài)水平進行對比。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種真菌或蘑菇以及生產(chǎn)它的方法，其中，所述真菌/蘑菇具有增加的多肽表達水平和/或降低的多肽表達水平，其中，所述多肽含有與選自SEQ ID NO1-200的序列具有至少40％氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列，和/或與選自SEQ ID NO201-208的序列具有至少50％氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列。
文檔編號C07K14/375GK102459318SQ201080024402
公開日2012年5月16日 申請日期2010年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月20日
發(fā)明者H·A·B·沃斯頓, J·F·迪瓊, L·G·盧格尼斯, R·A·奧姆 申請人:烏特勒支大學, 德國科學技術(shù)基金會