腸細胞的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的在于提供以多能性干細胞為起始材料的制造腸細胞的方法。根據(jù)本發(fā)明，提供如下腸細胞的制造方法，其包括：從多能性干細胞誘導分化出胚胎內(nèi)胚層細胞的工序（A）；和在（2’Z,3’E）-6-溴靛玉紅-3’-肟（BIO）和N-［（3,5-二氟苯基）乙酰基］-L-Ala-2-苯基-L-Gly-叔丁基-OH（DAPT）的存在下，培養(yǎng)上述胚胎內(nèi)胚層，由此從上述胚胎內(nèi)胚層誘導分化出腸細胞的工序（B）。
【專利說明】腸細胞的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及腸細胞的制造方法。更詳細地，本發(fā)明涉及以多能性干細胞為起始材料制造腸細胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]胚胎干細胞(ES細胞)和人工多能性干細胞(誘導多能性干細胞)(inducedpluripotent stem cell:1PS細胞)等多能性干細胞是具有向各種細胞分化能力的細胞,幾乎具有無限增殖的能力。近年來，特別在再生醫(yī)療的領(lǐng)域中，要求以這樣的多能性干細胞為起始材料，開發(fā)能夠出在胃、胰臟、肝臟、腸等各種臟器中適用的組織和細胞的制造方法。更具體地，雖然隨著新生兒醫(yī)療的進展，早產(chǎn)兒的存活率迅速上升，但對具有先天性消化道發(fā)育不全的兒童，有效的再生醫(yī)療技術(shù)的必要性提高。另外，即使在消化系統(tǒng)惡性腫瘤、該疾病手術(shù)后的狹窄和纖維化、逆流性食道炎、潰瘍性大腸炎和因伴隨稱為克羅恩病的慢性炎癥性腸疾病的組織破壞而造成的消化道功能不全中，因為產(chǎn)生腸上皮化生和消化道粘膜的不可逆結(jié)構(gòu)變化，所以也要求有利用再生醫(yī)療的治療的必要性。為了使對這樣的消化系統(tǒng)疾病的利用再生醫(yī)療的治療成為可能，開發(fā)以多能性干細胞為起始材料的腸道細胞的有效的制造方法成為當務(wù)之急。
[0003]例如，作為從胚胎干細胞向內(nèi)胚層系細胞誘導分化的方法，已知有將來自中胚層的細胞作為支持細胞使用， 在該支持細胞的存在下，培養(yǎng)胚胎干細胞，由此向內(nèi)胚層系細胞誘導分化的方法(參照專利文獻I)。在專利文獻I中，雖然記載了向肝臟、肺、小腸等來自內(nèi)胚層器官的成熟細胞誘導分化，但是用所公開的方法有效地誘導分化出成熟的各種腸細胞是不可能的。
[0004]另外，如模仿在體內(nèi)(in vivo)的早期胚的誘導那樣,通過在體外(in vitro),在M15細胞的單層上培養(yǎng)ES細胞，將ES細胞連續(xù)誘導成中內(nèi)胚層、胚胎內(nèi)胚層，進而，最終誘導成區(qū)域特異性的來自胚胎內(nèi)胚層的各種器官的技術(shù)被確立(參照非專利文獻I和2)。確認了在這些技術(shù)中，在肝臟細胞、肺細胞、胰臟細胞等的誘導分化中取得成功。特別在非專利文獻2中，記載了在肝臟細胞、肺細胞、胰臟細胞以外，還產(chǎn)生了表達Cdx2的腸前體細胞。但是，利用這些現(xiàn)有技術(shù)，難以大量且有效地制造更成熟的各種腸細胞。
[0005]如上所述，從多能性干細胞大量且有效地誘導分化出各種成熟型腸細胞的技術(shù)的開發(fā)依然沒有進展，現(xiàn)狀是不存在以多能性干細胞為起始材料有效地制造腸細胞的方法。
[0006]現(xiàn)有技術(shù)文獻
[0007]專利文獻
[0008]專利文獻1:國際公開W02006/126574號公報
[0009]非專利文獻
[0010]非專利文獻I:Shiraki, N., Umeda, K., Sakashita, N., Takeya, M., Kume, K.andKume, S.(2008).Differentiation of mouse and human embryonic stem cells intohepatic lineages.Genes Cellsl3, 731-46.[0011 ]非專利文獻 2:Shiraki, N.，Yoshida, T.，Araki, K.，Umezawa, A.，Higuchi, Y.,Goto, H., Kume, K.and Kume, S.(2008b).Guided differentiation of embryonicstem cells into Pdx 1-expressing regional-specific definitive endoderm.StemCells26, 874-85.
【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]發(fā)明所要解決的課題
[0013]本發(fā)明的課題在于提供以多能性干細胞為起始材料的制造腸細胞的方法。
[0014]用于解決課題的方法
[0015]本發(fā)明的發(fā)明人等為了解決上述課題而深入研究的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)從作為多能性干細胞的胚胎干細胞誘導分化出胚胎內(nèi)胚層細胞后，在BIO ((2’ Z，3’ E)-6-溴靛玉紅-3’ -肟)和DAPT (N- [(3，5_ 二氣苯基)乙酸基]-L_Ala_2-苯基-L-Gly-叔丁基-0H)的存在下,培養(yǎng)該胚胎內(nèi)胚層，由此能夠誘導分化出成熟的各種腸細胞。本發(fā)明是利用這樣的發(fā)現(xiàn)而完成的。
[0016]即，本發(fā)明涉及以下內(nèi)容:
[0017](I) 一種腸細胞的制造方法，其包括:從多能性干細胞誘導分化出胚胎內(nèi)胚層細胞的工序(A);和在(2’ Z，3，E)-6-溴靛玉紅-3’ -肟(BIO)和N- [(3，5-二氟苯基)乙?；鵠-L_Ala_2-苯基-L-Gly-叔丁基_0H (DAPT)的存在下，培養(yǎng)上述胚胎內(nèi)胚層，從上述胚胎內(nèi)胚層誘導分化出腸細胞的工序(B)。
[0018](2 )在(I)中記載的方法，其中，通過使用針對E-鈣粘著蛋白(E⑶)和CXCR4的熒光標記抗體的流式細胞儀，從工序(A)中得到的細胞培養(yǎng)物中分離胚胎內(nèi)胚層細胞，在工序
(B)中使用該分離得到的胚胎內(nèi)胚層細胞。
[0019](3)在(I)或(2)中記載的方法，其中，在工序(A)中，通過在支持細胞的存在下且在激活素和/或bFGF的存在下培養(yǎng)上述多能性干細胞，從該多能性干細胞誘導分化出胚胎內(nèi)胚層細胞。
[0020](4)在(3)中記載的方法，其中，支持細胞為來自中胚層的細胞。
[0021](5)在(3)或(4)中記載的方法，其中，支持細胞為M15細胞、MEF細胞或ST2細胞。
[0022](6)在(I)-(5)中任一項記載的方法，其中，在工序(B )中，在Ml 5細胞或MEF細胞的存在下培養(yǎng)上述胚胎內(nèi)胚層。
[0023](7)在(I)-(6)中任一項記載的方法，其中，上述多能性干細胞為胚胎干細胞或人工多能性干細胞。
[0024](8)在(I)-(7)中任一項記載的方法，其中，上述多能性干細胞為人胚胎干細胞或小鼠胚胎干細胞。
[0025](9)利用(I)-(8)中任一項記載的方法得到的、從多能性干細胞誘導分化出的腸細胞。
[0026](10) 一種促進或抑制從多能性干細胞向腸細胞誘導分化的物質(zhì)的篩選方法，其包括如下步驟:在利用(I)-(8)中任一項記載的方法從多能性干細胞向腸細胞誘導分化時，在被檢測物質(zhì)的存在下培養(yǎng)多能性干細胞，比較在被檢測物質(zhì)不存在下培養(yǎng)多能性干細胞時向腸細胞誘導分化的程度與在被檢測物質(zhì)存在下培養(yǎng)多能性干細胞時向腸細胞誘導分化的程度。
[0027](11)在(10)中記載的篩選方法，其中，被檢測物質(zhì)為生長因子或低分子化合物。
[0028](12)在(10)或(11)中記載的篩選方法，其中，以腸細胞中表達的標記轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物量或蛋白量或者該兩者為指標，測定向腸細胞誘導分化的程度。
[0029]發(fā)明的效果
[0030]根據(jù)本發(fā)明的制造方法，就能夠從多能性干細胞大量且有效地制造腸的吸收細胞、帕內(nèi)特細胞、杯形細胞、腸內(nèi)分泌細胞等各種成熟型腸細胞。根據(jù)本發(fā)明，就能夠制造如上所述的各種成熟型腸細胞，這些腸細胞能夠在再生醫(yī)療領(lǐng)域中實際使用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1:圖1A是實驗系統(tǒng)的示意圖。最開始，將ES細胞在M15上，在激活素和bFGF的存在下培養(yǎng)，接著，替換為BIO和DAPT培養(yǎng)到分化的第20天，由此誘導向胚胎內(nèi)胚層的分化。圖1B表示對于在M15細胞上以各種組合加入BIO和DAPT使之分化的ES細胞(分化第12天)進行實時PCR分析的結(jié)果。由BIO和DAPT的組合，腸前體細胞標記物Cdx2和Ifabp的表達被同時增強。圖1C是使用抗Cdx2抗體進行免疫染色的分化第12天的ES細胞照片。表示在M15細胞上培養(yǎng)時，在BIO和DAPT存在下，高比例的ES細胞變化為Cdx2表達細胞。圖1D表示對于在M15細胞上在BIO和DAPT存在下培養(yǎng)的ES細胞，利用RT-PCR解析各種腸標記物隨時間-過程表達的結(jié)果。F1:胎兒腸，Al:成體腸。無DW、cDNA的陰性對照。作為腸標記物的Odx2和絨毛蛋白(Villin)以及作為腸細胞標記物的Ifabp、Isx及乳糖酶，是在BIO和DAPT的存在下且在M15細胞上分化的ES細胞中誘導出的。
[0032]圖2:圖2A表示使用流式細胞儀從在M15細胞上在BIO和DAPT存在下培養(yǎng)的ES細胞中，在第4天篩選胚胎 內(nèi)胚層(Cxcr4+/E⑶+)細胞(四邊形)的結(jié)果。圖2B表示在M15細胞上再培養(yǎng)胚胎內(nèi)胚層細胞，對于再培養(yǎng)11天后(相當于第15天的細胞)的細胞，解析Cdx2和絨毛蛋白(Villin)表達的結(jié)果。這些細胞分化為Cdx2表達細胞(左)和絨毛蛋白表達腸細胞(右)。圖2C表示驗證表示前方背方特異性的標記物系列(marker panel)的表達圖譜，評價胚胎內(nèi)胚層形成圖譜時的BIO和DAPT效果的結(jié)果。在未添加BIO和DAPT時或以低濃度加入時，前方標記物Pax8被誘導。Cdx2和Ifabp被中等程度濃度(1/30-1)的BIO和DAPT誘導。僅在以高濃度加入BIO和DAPT時，Hoxc8 (背方標記物)表達。圖2D表示研究BIO和DAPT的添加對Pax8和HoXC8表達的效果。HoXC8 (背方標記物)被高濃度的BIO誘導。圖2E是對應BIO和DAPT的階梯性濃度的腸區(qū)域形成的假想示意圖。
[0033]圖3:圖3A是表示實驗概要的圖。使ES細胞在M15細胞上分化4天。在第4天，將胚胎內(nèi)胚層細胞分離，再平板接種(plating)在MEF細胞上，在BIO和DAPT的存在下培養(yǎng)。圖3B表示代替M15細胞，在MEF細胞或PA6細胞上再培養(yǎng)來自ES細胞的胚胎內(nèi)胚層細胞后，研究Cdx2表達的結(jié)果。在MEF細胞上再培養(yǎng)胚胎內(nèi)胚層細胞時，觀察到表達Cdx2的分化細胞。圖3C表示對于在M15細胞或MEF細胞上培養(yǎng)的胚胎內(nèi)胚層細胞，利用RT-PCR分析各種腸標記物的表達的結(jié)果。表示Cdx2、Ifabp、Isx、絨毛蛋白(Villin)和乳糖酶(let)在M15細胞或MEF細胞上所培養(yǎng)的胚胎內(nèi)胚層細胞中被誘導。圖3D表示在MEF細胞上培養(yǎng)時、Cdx2表達細胞出現(xiàn)的時間-過程分析的結(jié)果。Cdx2表達細胞從在MEF細胞上分化的第12天起大量被觀察到。圖3E表示各種腸標記物表達的時間-過程分析的結(jié)果。將分化開始時定義為O天。Tff3、杯形細胞標記物；溶菌酶(Lyzl)、帕內(nèi)特細胞標記物；Sst、腸內(nèi)分泌標記物。
[0034]圖4表示對于在MEF細胞上分化的ES細胞，研究各種標記物的表達的結(jié)果。在圖4A中表示來自ES細胞的腸細胞是Cdx2/E⑶/HNF4a陽性細胞。在圖4B中表示在這些細胞中也表達了 Glut2。圖4C表示該細胞集團表達密蛋白7。圖4D表示帕內(nèi)特細胞(溶菌酶表達)和表達內(nèi)分泌標記物(嗜鉻粒蛋白A (Chga)、生長抑素(sst))的細胞被誘導。
[0035]圖5表示對于在MEF細胞(圖5E和F)或M15細胞(圖5G-I)上分化的ES細胞，研究各種標記物的表達的結(jié)果。圖5E表示粘蛋白2(Muc2)、DBA表達細胞也被誘導。圖5F表示Sox9表達細胞在絨毛蛋白(Villin)表達細胞中存在。圖5G表示腸細胞(堿性磷酸酶活性)被誘導。圖5H和I表示杯形細胞(PAS和阿爾辛藍染色陽性)也被誘導。
[0036]圖6:圖6 (A)表示從人ES細胞khES_3，在BIO和DAPT的存在下，在M15細胞上，在第25天誘導表達Cdx2的腸細胞的結(jié)果。圖6(B)表示關(guān)于人ES細胞khES_3，由RT-PCR對于各種腸標記物的表達分析時間-過程的結(jié)果。在BIO和DAPT的存在下且在M15細胞上進行了誘導分化的khES-3細胞中，表達了腸標記物、Cdx2、絨毛蛋白(Villin);腸細胞標記物、Ifabp、Isx ;杯形細胞標記物、Tff3 ;帕內(nèi)特細胞標記物、溶菌酶(Lyzl);和腸內(nèi)分泌標記物、Sst、Set、Sy p、Sst、Gast。圖6C和D表示分化的khES_3細胞表現(xiàn)出堿性磷酸酶活性(C)，且為PAS染色(D)陽性。
[0037]圖7:圖7A表示對于各種標記物，比較在M15細胞上分化的ES細胞中添加BIO和DAPT與添加FGF2 (bFGF)的結(jié)果。由BIO和DAPT的添加，從ES細胞誘導出腸細胞(enterocyte)、杯形細胞(goblet cell)、帕內(nèi)特細胞(paneth cell)和腸內(nèi)分泌細胞(enteroen docrine cell)的分化細胞型。代替 BIO 和 DAPT,由 256ng/ml 的 FGF2 (bFGF),誘導出腸分化(intestine)，但判斷分化細胞標記物的表達為較小的程度。圖7A表示使用第15天的分化細胞進行RT-PCR分析的結(jié)果。圖7B表示研究各種FGF對胚胎內(nèi)胚層的效果的結(jié)果。從使用激活素和bFGF在M15細胞上培養(yǎng)了 4天的ES細胞中篩選出胚胎內(nèi)胚層，將篩選出的細胞再平板接種在MEF細胞上。添加FGF4、5、7、8b、9、10和FGF18，使ES細胞向Cdx2表達細胞的分化亢進，研究這些FGF的潛在能力。圖7B表示在分化第12天進行的免疫組織化學檢測的結(jié)果。圖7C和D表示研究的SU5402 (FGF受體拮抗劑)和LY29402(PI3K抑制劑)和U0126 (MAPK抑制劑)對BIO和DAPT添加效果影響的結(jié)果。從由BIO和DAPT的從ES細胞的腸分化被SU5402 (FGF受體拮抗劑)和LY29402 (PI3K抑制劑)部分地抑制，但不被U0126 (MAPK抑制劑)抑制。在圖7C和D中表示對于Cdx2的表達，通過在第12天分化的ES細胞中的RT-PCR分析(C)和使用抗Cdx2抗體的免疫組織化學檢測(D)進行分析的結(jié)果。在關(guān)于圖7所示的結(jié)果的實驗中，將ES細胞在M15細胞上、使用激活素和bFGF培養(yǎng)4天，然后，使用在M15細胞(圖7A)或MEF細胞(圖7B、C、D)上的對照(2000KRS)，或在BIO和DAPT的存在下，伴隨或不伴隨抑制劑(SU5402、LY29402或U0126)地繼續(xù)培養(yǎng)到第12天。
[0038]圖8是表示實施例2中的試驗例I和2的結(jié)果的圖。
[0039]圖9是表示實施例2中的試驗例3的結(jié)果的圖。
[0040]圖10是表示實施例2中的試驗例4的結(jié)果的圖。【具體實施方式】
[0041]本發(fā)明的腸細胞的制造方法，其特征在于，包括從多能性干細胞誘導分化出胚胎內(nèi)胚層細胞的工序(A);和在(2’ Z，3’E)-6-溴靛玉紅-3’-肟)(BI。)和N- [(3，5-二氟苯基)乙?；鵠-L-Ala-2-苯基-L-Gly-叔丁基-OH (DAPT)的存在下培養(yǎng)上述胚胎內(nèi)胚層，從該胚胎內(nèi)胚層誘導分化出腸細胞的工序(B)。
[0042]在本發(fā)明中，所謂“多能性干細胞”是指在試管內(nèi)等的人工形成條件下(體外的)具有增殖能力、能夠分化為機體全部組織的細胞的細胞。在本發(fā)明中，作為多能性干細胞，優(yōu)選使用胚胎干細胞或人工多能性干細胞，更優(yōu)選使用胚胎干細胞。
[0043](胚胎干細胞)
[0044]在本發(fā)明中使用的胚胎(ES)細胞，只要是來自哺乳動物的ES細胞，其種類等就沒有特別限定，例如，可以使用來自小鼠、猿猴或人的ES細胞等。作為ES細胞，例如，為了將其分化程度的確認變得容易，可以使用在Pdxl基因附近導入了報告基因的細胞。例如，可以使用來自在Pdxl座中組合入LacZ基因的129/Sv的ES細胞株或具有在Pdxl啟動子控制下的GFP報告轉(zhuǎn)基因的ES細胞SK7株等。或者也可以使用具有在Hnf3 β內(nèi)胚層特異性的增強子片段控制下的mRFPl報告轉(zhuǎn)基因和在Pdxl啟動子控制下的GFP報告轉(zhuǎn)基因的ES細胞PH3株。另外，在本發(fā)明中，如果是來自小鼠的ES細胞，就可以使用小鼠ES細胞株Rl，如果是來自人的ES細胞，就可以使用作為人ES細胞株的KhES-1、KhES-2和KhES_3，其中，可以優(yōu)選使用小鼠ES細胞株Rl或人ES細胞株KhES-3。
[0045]來自哺乳動物的ES細胞的培養(yǎng)方法可以按照常規(guī)方法進行，例如，根據(jù)需要，作為飼養(yǎng)細胞，在絲裂霉素C處理的小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)的存在下，能夠在包含1000單位/ml白血病抑制因子(LIF ；Chemicon)U5% KNOCKOUT血清替代物(KSR ；Gibco)U%月臺牛血清(FBS ；Hyclone)> 100 μ M非必需氨基酸(ΝΕΑΑ ；Invitrogen)>2mML-谷氨酰胺(L-Glu ；Invitrogen)> ImM 丙酮酸鈉(Invitrogen)、50 單位 /ml 青霉素和 50 μ g/ml 鏈霉素(PS ;Invitrogen)和100 μ Μβ -巰基乙醇(β -ME ;Sigma)的格拉斯哥極限必需培養(yǎng)基(Invitrogen)中維持。
[0046](人工多能性干細胞)
[0047]在本發(fā)明中使用的人工多能性干細胞(iPS)細胞能夠通過將體細胞初始化制造。在這里使用的體細胞種類沒有特別限定，可以使用任意的體細胞。即，在本發(fā)明中所謂的體細胞，包含構(gòu)成機體的細胞的內(nèi)生殖細胞以外的全部細胞，既可以是分化的體細胞，也可以是未分化的干細胞。體細胞的來源可以是哺乳動物、鳥類、魚類、爬蟲類、兩棲類的任意I種，沒有特別限定，但優(yōu)選為哺乳動物(例如小鼠等嚙齒類或人等靈長類)，特別優(yōu)選為小鼠或人。另外，在使用人的體細胞時，可以使用胎兒、新生兒或成人的任意的體細胞。
[0048]在本發(fā)明中所說的iPS細胞是指在規(guī)定的培養(yǎng)條件下(例如，培養(yǎng)ES細胞的條件下)長期具有自我復制能力，另外，在規(guī)定的誘導分化條件下具有向外胚層、中胚層和內(nèi)胚層的多向分化能力的干細胞。另外，本發(fā)明中的人工多能性干細胞可以是在移植到小鼠等試驗動物時具有形成畸胎瘤的能力的干細胞。[0049]為了從體細胞制造iPS細胞，首先在體細胞中導入至少I種以上的初始化基因。所謂初始化基因是指編碼具有將體細胞初始化變成iPS細胞作用的初始化因子的基因。作為初始化基因組合的具體例子，可以列舉以下的組合，但不限定于這些。[0050]( i ) Oct基因、Klf基因、Sox基因、Myc基因
[0051](ii ) Oct 基因、Sox 基因、NANOG 基因、LIN28 基因
[0052](iii)Oct 基因、Klf 基因、Sox 基因、Myc 基因、hTERT 基因、SV401arge T 基因
[0053](iv) Oct 基因、Klf 基因、Sox 基因
[0054]在Oct基因、Klf基因、Sox基因和Myc基因中分別包含多個家族基因。作為各個家族基因的具體例子，可以使用在從國際公開W02007/069666號公報的說明書第11頁至第13頁中記載的基因。具體如下。
[0055]作為屬于Oct基因的基因具體例子，可以列舉0ct3/4 (NM002701)、OctlA(NM002697)和0ct6 (NM002699)等(括號內(nèi)表示人基因的NCBI登錄號(accessionnumber))。優(yōu)選為0ct3/4。0ct3/4是屬于POU家族的轉(zhuǎn)錄因子，已知是未分化標記物，另外，也有參與多能性維持的報告。
[0056]作為屬于Klf基因的基因具體例子，可以列舉Klfl(NM006563)、Klf2(NM016270)、Klf4(NM004235)和Klf5(NM001730)等(括號內(nèi)表示人基因的NCBI登錄號)。優(yōu)選為Klf4。Klf4 (Kruppel樣因子-4:Kruppel like factor-4)被報告是腫瘤抑制因子。
[0057]作為屬于Sox基因的基因具體例子，可以列舉Soxl(NM005986)、Sox2(NM003106)、Sox3 (NM005634)、Sox7 (NM031439)、Soxl5 (NM006942)、Soxl7 (NM0022454)和 Soxl8(NM018419)(括號內(nèi)表示人基因的NCBI登錄號)。優(yōu)選為Sox2。Sox2在早期發(fā)生過程表達，是編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因。
[0058]作為屬于Myc基因的基因具體例子，可以列舉c_Myc (NM002467)、N-Myc(NM005378)和L-Myc (NM0053 76)等(括號內(nèi)表示人基因的NCBI登錄號)。優(yōu)選為c_Myc。c-Myc是參與細胞分化和增殖的轉(zhuǎn)錄控制因子，有參與多能性維持的報告。
[0059]上述基因是在包含人的哺乳類動物中共同存在的基因，在本發(fā)明中，可以使用來自任意的哺乳類動物(例如來自人、小鼠、大鼠、猿猴等哺乳類動物)的基因。另外，也可以使用對于野生型基因數(shù)個(例如為I-30個、優(yōu)選為I-20個、更優(yōu)選為I-10個、更加優(yōu)選為I-5個、特別優(yōu)選為I-3個)堿基被取代、插入和/或缺失且具有與野生型基因同樣功能的變異基因。
[0060]在本發(fā)明中，作為初始化基因，可以特別優(yōu)選使用0ct3/4基因、Klf4基因、Sox2基因和c-Myc基因的組合。
[0061]在體細胞中導入初始化因子的方法，只要被導入的初始化基因表達能夠?qū)崿F(xiàn)體細胞的初始化，就沒有特別限定。例如，可以使用包含至少I種以上初始化基因的表達載體，在體細胞中導入該初始化基因。在使用載體在體細胞中導入2種以上的初始化基因時，既可以在I個表達載體中組合入2種以上的初始化基因，在體細胞中導入該表達載體，也可以準備2種以上組合入I種初始化基因的表達載體，將這些表達載體導入體細胞。
[0062]表達載體的種類沒有特別限定，既可以是病毒載體，也可以是質(zhì)粒載體，但優(yōu)選為病毒載體，特別優(yōu)選為導入的初始化基因組合入體細胞染色體那樣的病毒載體。作為能夠在本發(fā)明中使用的病毒載體，可以列舉逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(包括慢病毒載體)、腺病毒載體、腺伴隨病毒載體等。上述之中，優(yōu)選為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，特別優(yōu)選為慢病毒載體。
[0063]作為用于制作重組病毒載體而使用的包裝細胞，只要是能夠補充將編碼在病毒的包裝中必須的蛋白質(zhì)的基因中的至少I個缺損的重組病毒載體質(zhì)粒的該缺損蛋白質(zhì)的細胞，就可以使用任意的細胞。例如，可以使用來自人腎臟的HEK293細胞、基于小鼠成纖維細胞NIH3T3的包裝細胞。
[0064]能夠通過在包裝細胞中導入重組病毒載體質(zhì)粒,生產(chǎn)重組病毒載體。向上述包裝細胞導入上述病毒載體質(zhì)粒的方法沒有特別限定，可用磷酸鈣法、脂質(zhì)體法或電穿孔法等公知的基因?qū)敕ㄟM行。
[0065]能夠維持ES細胞的未分化性和多能性的培養(yǎng)基在本領(lǐng)域中是公知的，通過組合使用適當?shù)呐囵B(yǎng)基，可以分離和培養(yǎng)本發(fā)明的人工多能性干細胞。即，作為用于培養(yǎng)本發(fā)明的人工多能性干細胞的培養(yǎng)基，可以列舉ES培養(yǎng)基、在ES培養(yǎng)基中添加10ng/ml FGF-2(bFGF)后培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細胞24小時得到的上清液即MEF條件ES培養(yǎng)基(以下稱為MEF條件ES培養(yǎng)基)等。在用于培養(yǎng)本發(fā)明的人工多能性干細胞的培養(yǎng)基中，可以添加各種生長因子、細胞因子、激素等(例如，F(xiàn)GF-2 (bFGF)、TGFb-1、激活素A、頭蛋白(Noggin)、BDNF、NGF、NT-l、NT-2、NT-3等參與人ES細胞增殖、維持的成分)。另外，被分離的人工多能性干細胞的分化能力和增殖能力，可以利用對于ES細胞已知的確認方法予以確認。
[0066](從多能性干細胞向胚胎內(nèi)胚層細胞的誘導分化)
[0067]在本發(fā)明中，所謂“胚胎內(nèi)胚層細胞”(definitive Endoderm)是指能夠分化為包含食道、胃、小腸和大腸的全部腸道以及肺、肝臟、胸腺、副甲狀腺、甲狀腺、膽囊和胰臟等來自腸道的器官的細胞，具體是指作為標記基因的E-鈣粘著蛋白(E-cadherin ;E⑶)和CXCR4或E-鈣粘著蛋白和CD55為陽性的內(nèi)胚層細胞(Shiraki N, Harada S，Ogaki S，KumeK.and Kume S.1dentification of DAF1/CD55, a novel definitive endoderm marker.Cell Struct.Funct.35，73-80，2010 ;日本特愿 2009-225758)。
[0068]在本發(fā)明中，從多能性干細胞誘導分化出胚胎內(nèi)胚層細胞的工序(A)沒有特別限定，可以由各種公知的方法 進行。例如，能夠使用在日本特表2007-516728等中記載的方法，在下面說明優(yōu)選的方法。
[0069]在本發(fā)明的工序(A)中，通過在適當?shù)闹С旨毎拇嬖谙虑以诩せ钏睾?或堿性成纖維細胞生長增殖因子(bFGF)的存在下培養(yǎng)上述多能性干細胞，可以誘導分化出所需要的胚胎內(nèi)胚層細胞。
[0070]作為可以在本發(fā)明中使用的上述支持細胞，只要是能夠?qū)⒍嗄苄愿杉毎蚺咛?nèi)胚層細胞誘導分化的細胞，就沒有特別限定，但可以優(yōu)選使用來自中胚層的細胞作為支持細胞。作為那樣的支持細胞的具體例子，可以列舉M15細胞、MEF細胞、ST2細胞等。另外，支持細胞可以使用由絲裂霉素C處理或放射線照射而喪失細胞增殖的支持細胞。
[0071]在本發(fā)明中使用的M15細胞(小鼠(mouse),中腎(mesonephros)),作為登錄號ECACC95102517 登錄在細胞庫(CAMR Centre for Applied Microbiology&Research (ECACC, Salisbury, Wiltshire))中。M15 細胞能夠根據(jù)文獻(Larsson, S.H., Charlieu, J.P.,Miyagawa, K., et al.(1995).Subnuclear localization of WTlin splicingor transcription factor domains is regulated by alternative splicing.CellSl, 391-401)的記載獲得。下面記載關(guān)于M15的數(shù)據(jù)庫信息。
[0072]Version4.200201
[0073]M15(mouse, mesonephros)
[0074]ECACC95102517[0075]Morphology: Epithelial
[0076]Mouse mesonephric epithelium, polyoma virus large T transformed
[0077]Depositor: Prof V van Heyningenj MRC Human Genetics Unit, Western GeneralHospital,Edinburgh, UK (Originator)
[0078]No restrictions.Patent:None Specified By Depositor
[0079]Properties:Products:WTl(expressed gene)Applications:Gene expressionand protein studies connected to kidney development and Wilmsi tumourigenesis.[0080]Available in the following LABORATORY:
[0081]CAMR Centre for Applied Microbiology&Research(ECACC, Salisbury, Wiltshir
[0082]DMEM+2mM Glutamine +10%Fetal Bovine Serum (FBS).Spl it confluentcultures 1:5to1:1O1.e.seeding at5x1，OOOtoIx10，OOOcelIs/cm2using0.25%trypsinor trypsin/EDTA;5%C02;37C[cel I growth impaired at lower densities].Karyotype: Hyperdiploid [0083]Hazard: CZ-1I
[0084]The WTl-expressing mesonephric cell line M15 (alias Mesol5)wasestablished from mouse mesonephros transgenically expressing the large Tprotein of polyoma virus under the control of the early viral enhancer.As a tumour suppresser gene with a key role in urogenital development, WTlisimplicated as predisposition gene in the pathogenesis of Wilmsi tumour (WT).[0085]Further information
[0086]Research council deposit:Yes
[0087]Price—code: C
[0088]Bibliographic references:
[0089]Celll995;81:391
[0090]By Beatrice...[0091]TITLE:M15
[0092]DATE:2005/04/2400:32
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[0094]European Collection of Cell Cultures,
[0095]Health Protection Agency,Porton Down, Salisbury, Wiltshire, UK
[0096]June Poulton
[0097]European Collection of Cell Cultures
[0098]Health Protection Agency,
[0099]Porton Down
[0100]SP40JG Salisbury, Wiltshire UK
[0101]Phone:+44-1980-612512
[0102]Fax:+44-1980-611315
[0103]E-mai 1: ecacc@hpa.0rg.uk[0104]URL: http: //www.ecacc.0rg.uk/
[0105]MEF細胞(來自ICR小鼠)在ATCC中作為目錄編號ATCC#SCRC-1046登錄。另外，MEF 細胞能夠根據(jù)文獻(Nagy A, et al.Manipulating The Mouse Embryo:A LaboratoryManual.Third Edition Cold Spring Harbor Press; 2003)的記載獲得。
[0106]ST2細胞作為RCB0224在國家高級工業(yè)科學技術(shù)學院國際專利生物保藏中心中登錄。另外，ST2 細胞能夠根據(jù)文獻(Ogawa, M., Nishikawa, S., Ikuta, K., Yamamura, F., Naito,M.,Tkahashi1K.and Nishikawa, S.EMBO J1988; 7:1337-1343)的記載獲得。
[0107]這些飼養(yǎng)細胞可以使用補充了血清等的動物細胞用的通常的培養(yǎng)基(例如，RPMI培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基)按照常規(guī)方法培養(yǎng)。
[0108]在本發(fā)明的工序(A)中，在上述支持細胞的存在下培養(yǎng)多能性干細胞的方法沒有特別限定，例如，可以將上述支持細胞作為飼養(yǎng)細胞使用，共培養(yǎng)多能性干細胞。具體而言，可以在預先生長附著一層上述飼養(yǎng)細胞(支持細胞)的板中，使用包含激活素和/或bFGF的適當?shù)呐囵B(yǎng)基，接種多能性干細胞進行共培養(yǎng)。通過進行數(shù)天該共培養(yǎng)，能夠從多能性干細胞誘導分化出胚胎內(nèi)胚層細胞。
[0109]在本發(fā)明的工序(A)中可以使用的培養(yǎng)基，能夠使用DMEM培養(yǎng)基、RPMI培養(yǎng)基等通常的動物細胞用培養(yǎng)基，可以在培養(yǎng)基中添加激活素和/或bFGF使用。另外，在工序(A)中使用的培養(yǎng)基，根據(jù)需要，可以包含胎牛血清等血清、KNOCKOUT血清替代物(KSR)、葡萄糖等任意成分。另外，作為激活素，優(yōu)選使用激活素A。關(guān)于培養(yǎng)基中的激活素的濃度，只要能夠誘導分化出胚胎內(nèi)胚層細胞就沒有特別限定，例如，可以設(shè)為5-300ng/mL，優(yōu)選設(shè)為10-200ng/mL。關(guān)于培養(yǎng)基中的bFGF濃度，只要能夠誘導分化處胚胎內(nèi)胚層細胞就沒有特別限定，例如，可以設(shè)為5-300ng/mL,優(yōu)選設(shè)為10-200ng/mL。
[0110]在本發(fā)明的工序(A)中，是否從多能性干細胞誘導分化出胚胎內(nèi)胚層細胞，能夠通過調(diào)查上述E⑶和CXCR4表達來確認。另外，根據(jù)需要，也可以從工序(A)得到的培養(yǎng)物中分離胚胎內(nèi)胚層細胞，將分離的胚胎內(nèi)胚層細胞供給本發(fā)明的工序(B)使用。具體而言，能夠通過使用對ECD和CXCR4的熒光標記抗體的流式細胞儀，分離胚胎內(nèi)胚層細胞。
[0111](從胚胎內(nèi)胚層細胞向腸細胞的誘導分化)
[0112]在本發(fā)明的工序(B )中，在(2 ’ Z，3 ’ E ) -6-溴靛玉紅_3，-肟)((2，Z，3，E) Homoindirubin-3' -oxime) (BIO)和 N_[(3, 5- 二氣苯基)乙酸基]-L_Ala_2-苯基-L-Gly-叔丁基-0H) ( (3, 5-Difluorophenylacetyl)-Ala-Phg-ObuJ ) (DAPT)的存在下，培養(yǎng)在工序(A)中得到的胚胎內(nèi)胚層，由此從胚胎內(nèi)胚層細胞誘導分化出腸細胞。具體而言，當在BIO和DAPT的存在下，將胚胎內(nèi)胚層細胞培養(yǎng)數(shù)天(例如，I-30天、I-20天、I-16天)，就會出現(xiàn)確認到Cdx2、Ifabp、Isx、Villinl (絨毛蛋白I)、乳糖酶(Lactase)、Glut2等腸細胞標記基因表達的細胞。即，根據(jù)本發(fā)明的工序(B)，就能夠誘導分化出確認到各種腸細胞標記基因表達的腸細胞。培養(yǎng)基中的BIO和DAPT的濃度只要在能夠從胚胎內(nèi)胚層細胞誘導分化出腸細胞的范圍，就沒有特別限定。培養(yǎng)基中的BIO濃度例如可以設(shè)在I-500 μ M的范圍，優(yōu)選設(shè)在I-100 μ M的范圍，更優(yōu)選設(shè)在I-50 μ M的范圍，更加優(yōu)選設(shè)在I-20 μ M的范圍，進一步優(yōu)選設(shè)在I-10 μ M的范圍。另一方面，培養(yǎng)基中的DAPT濃度例如可以設(shè)在I-500 μ M的范圍，優(yōu)選設(shè)在I-100 μ M的范圍，更優(yōu)選設(shè)在I-50 μ M的范圍，更加優(yōu)選設(shè)在I-20μΜ的范圍。另外，在工序(B)中，在BIO和DAPT以外，還可以在培養(yǎng)基中添加使從胚胎內(nèi)胚層細胞向腸細胞的誘導分化活化的其他物質(zhì)。作為這樣的物質(zhì)的例子，可以列舉使FGF信號傳導活化的物質(zhì)、使BMP信號傳導活化的物質(zhì)、使Hedgehog (Hh)信號傳導活化的物質(zhì)等。分別作為使FGF信號傳導活化的物質(zhì)的具體例子可以列舉FGF2，作為使BMP信號傳導活化的物質(zhì)的具體例子可以列舉BMP4，作為使Hedgehog (Hh)信號傳導活化的物質(zhì)的具體例子可以列舉SAG (Smoothened Agonist ;N_甲基-N’- (3-卩比唳基節(jié)基)-N’- (3_氣苯并[b]喔吩_2_擬基)-1, 4_ 二氛基環(huán)己燒,SAGh3X這些物質(zhì)由于在以小鼠ES細胞為起始材料時特別能夠促進向腸細胞的誘導分化，所以在將小鼠ES細胞作為起始材料使用時，優(yōu)選使用這些物質(zhì)，此時可以單獨或組合使用這些物質(zhì)。
[0113]另外，在工序(B)中，優(yōu)選作為支持細胞在M15或MEF細胞的存在下培養(yǎng)上述胚胎內(nèi)胚層細胞。這是因為在上述BIO和DAPT的存在下且在這些支持細胞的存在下培養(yǎng)這些胚胎內(nèi)胚層細胞時，可以得到更強地表達上述腸細胞的標記基因的各種腸細胞分化種類的緣故。
[0114]另外，在由本發(fā)明制造的腸細胞中，包括確認到Tff3 (杯形細胞標記物)、粘蛋白2(Muc2)(杯形細胞標記物)、DBA (Dolilchos biflorus agglutinin)(杯形細胞標記物)、溶菌酶(帕內(nèi)特細胞標記物)、Sox9 (帕內(nèi)特細胞標記物)、生長抑素(Sst)(腸內(nèi)分泌細胞標記物)、嗜鉻粒蛋白A (腸內(nèi)分泌細胞標記物)、胃泌素(腸內(nèi)分泌細胞標記物)、突觸泡蛋白(腸內(nèi)分泌細胞標記物)、Sst (腸內(nèi)分泌細胞標記物)、Sct (腸內(nèi)分泌細胞)等各腸細胞類型的標記物的表達的細胞。即，根據(jù)本發(fā)明，就能夠制造腸細胞系統(tǒng)的全部細胞類型。因此，在本發(fā)明的方法中，可以在由工序(B)使腸細胞誘導分化后，設(shè)置以mRNA和/或蛋白質(zhì)水平檢測出上述腸細胞的標記基因、和/或腸細胞系統(tǒng)的各種細胞類型的標記基因的表達的工序。作為檢測這樣的標記基因表達的方法，可以采用RT-PCR法、免疫印跡法等各種公知的方法。在本發(fā)明的方法中，還可以設(shè)置使用流式細胞儀(FACS解析)等各種公知的方法，分別分離誘導分化的腸細胞或各種腸細胞的工序。
[0115]關(guān)于工序(B)，使用的培養(yǎng)基種類、胚胎內(nèi)胚層的培養(yǎng)條件、M15細胞或MEF細胞的培養(yǎng)方法等可以采用按照上述工序(A)的培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)方法。
[0116]如上所述，根據(jù)本發(fā)明的制造方法，因為能夠制造腸細胞系統(tǒng)的全部細胞類型，所以，這些各種腸細胞可以在對于各種消化器官系統(tǒng)惡性腫瘤、潰瘍性大腸炎、克羅恩病等疾病的再生醫(yī)療中使用。另外，由本發(fā)明制造的各種腸細胞也可以在醫(yī)藥品的毒性試驗(安全性試驗)和藥效-藥理試驗中使用。
[0117]根據(jù)本發(fā)明，還提供促進或抑制從多能性干細胞向腸細胞誘導分化的物質(zhì)的篩選方法，其包括如下步驟:在通過從多能性干細胞誘導分化出胚胎內(nèi)胚層細胞的工序(A);和在BIO和DAPT的存在下培養(yǎng)上述胚胎內(nèi)胚層，從該上述胚胎內(nèi)胚層誘導分化出腸細胞的工序(B)來制造腸細胞時，在被檢測物質(zhì)存在下培養(yǎng)多能性干細胞，比較在被檢測物質(zhì)不存在下培養(yǎng)多能性干細胞時向腸細胞的誘導分化的程度和在被檢測物質(zhì)存在下培養(yǎng)多能性干細胞時向腸細胞的誘導分化程度。作為被檢測物質(zhì)，可以使用生長因子或低分子化合物等。此時，能夠以在腸細胞中表達的標記物的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和/或蛋白量為指標，測定向腸細胞誘導分化的程度。
[0118]利用以下的實施例更具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受以下的實施例限定。
[0119]實施例[0120][實施例1]
[0121](A)材料和方法
[0122](I)細胞株
[0123]在本實施例中，作為小鼠的ES細胞使用Rl細胞株。將Rl細胞株在添加了白血病抑制因子(LIF)、10%胎牛血清(FBS)、100 μ M非必需氨基酸(NEAA)、2mM L-Gln,50單位/mL青霉素和50 μ g/mL鏈霉素(PS)和100 μ Μβ -巰基乙醇的2000mg/L葡萄糖DMEM中的來自小鼠胚胎的成纖維細胞(MEF)的飼養(yǎng)(feeder)上維持。
[0124]MEF從胎生期(E) 12.5-14.5的小鼠胚胎分離。
[0125]中腎細胞株M15是由 T.Noce 博士 (慶應大學)和 Rassoulzadegan 博士(Universityof Nice-Sophia Antipolis, Antipolis, France)分給的細胞株。RlES 細胞是由 AndrasNagy博士分給的細胞。以絲裂霉素C (Sigma)處理MEF細胞和M15細胞，然后，如過去報告的那樣使用(Shiraki, N., Higuchi, Y., Harada, S., Umeda, K., Isagawa, T., Aburatani, H.,Kume, K.and Kume, S.(2009).Differentiation and characterization of embryonicstem cells into three germ layers.Biochem Biophys Res Commun381, 694-9 ；Shiraki, N., Umeda, K., Sakashita, N., Takeya, M., Kume, K.and Kume, S.(2008).Differentiationof mouse and human embryonic stem cells into hepatic lineages.GenesCellsl3, 731-46 ；Shiraki, N., Yoshida, T., Araki, K., Umezawa, A., Higuchi, Y., Goto, H.,Kume, K.and Kume, S.(2008).Guided differentiation of embryonic stem cells intoPdx1-expressing regional-specific definitive endoderm.Stem Cells26, 874-85.X
[0126](2)小鼠ES細胞的腸分化
[0127]在包含10%胎牛血 清和4500mg/ml葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基中加入20ng/ml激活素和50ng/ml bFGF的M15細胞上培養(yǎng)ES細胞5天,對于胚胎內(nèi)胚層(definitive endoderm)使用流式細胞儀進行分析。為了腸分化，在M15細胞或MEF細胞上，將ES細胞在BIO和DAPT的存在下，或者沒有BIO和DAPT，但存在bFGF、存在10% KSR的培養(yǎng)基中，以2000mg/ml的葡萄糖濃度進一步培養(yǎng)。
[0128](3)人ES細胞的維持
[0129]人ES細胞(KhES-3) (PMID:16707099)是由中辻博士和末盛博士(京都大學)分給的人ES細胞，按照日本政府的hES細胞指南使用。在MEF的飼養(yǎng)層上，在添加了 20%KSR、L-Gln>NEAA β-ME 的 Knockout DMEM/F12 (Invitrogen)中，在 3% CO2 下維持未分化的hES細胞。為了將hES細胞傳代，使用包含20% KSR和ImM CaCl2的PBS中的0.25%胰蛋白酶與0.lmg/ml膠原酶IV，以37°C將hES細胞集落處理5分鐘，接著加入培養(yǎng)液，平穩(wěn)地進行數(shù)次移液器抽吸操作，使ES細胞塊脫凝集為小片(5-20個細胞)，使其從飼養(yǎng)層剝離。
[0130](4)人ES細胞的腸分化
[0131]在誘導分化中，使用Y27632(Wako)對人ES細胞進行前處理24小時，在預先由M15細胞包被的24孔板中，每I孔接種50000個細胞。使用0.25%胰蛋白酶-EDTA( Invitrogen)分離ES細胞，在包含ES維持培養(yǎng)基的Y27632中培養(yǎng)I天。在接種I天后，用PBS清洗細胞，將培養(yǎng)基改為分化培養(yǎng)基。在第I分化培養(yǎng)基[添加了 2% B27 (Invitrogen), NEAA,L-Gln、PS和β-ME的RPMI1640 (Invitrogen)]中在第O-第10天培養(yǎng)細胞，在第10天換為第2分化培養(yǎng)基(添加了 10% KSR、NEAA, L-Gln, PS和β -ME的DMEM)，培養(yǎng)到第35天。在分化的第O-第10天加入激活素A(100ng/ml)，在第10-第35天加入BIO和DAPT。將培養(yǎng)基每2天替換為添加了增殖因子的新鮮培養(yǎng)基。
[0132](5)增殖因子和抑制劑
[0133]在沒有特別記載時，使用以下的濃度。BIO (Calbiochem) 5μ M ；DAPT (PeptideInst.) 10 μ M ;重組人激活素 A (R&D Systems)、20ng/ml。人 bFGF (Peprotech)、U0126(Sigma)、LY294002 (Calbiochem)、SU5402 (Calbiochem)UOy g/ml ；FGF2(人 bFGF)(Peprotech)>256ng/ml ；FGF4 (Peprotech)、FGF5 (Sigma)、FGF7 (R&D Systems)、FGF8(Cosmo Bio)、FGF9 (Peprotech)、FGFlO (R&D Systems)和 FGF18 (Sigma)、50ng/ml。
[0134](6)由流式細胞儀分析和篩選出的細胞的再培養(yǎng)
[0135]使用Cell Dissociation Buffer (細胞解離緩沖液)(Invitrogen)分離細胞,調(diào)整為IX IO6個細胞/50 μ I,以適當?shù)目贵w染色。作為抗體,使用生物素或Alexa488綴合E隹丐粘著蛋白單克隆抗體ECO)2、藻紅蛋白(PE)綴合抗Cxcr4mAb2Bll (BD Pharmaingen)?使用FACS Aria (BD Pharmingen)純化被染色的細胞。使用BD FACSDiva軟件程序(BDPharmingen)記錄數(shù)據(jù)，使用Flowjo程序(Tree Star)分析。
[0136](7)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(RT-PCR)分析
[0137]使用TRI Reagent (Sigma)或 RNeasy 微型試劑盒(Qiagen)從 ES 細胞提取 RNA,接著，使用DNase (Sigma)處理。使用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Toyobo)和寡dT引物(Toyobo)將3yg的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄。在表I中表示引物序列和循環(huán)數(shù)。各循環(huán)的PCR條件，最開始以96°C變性I分鐘，從第2循環(huán)開始，以96°C變`性30秒鐘、以60°C退火2秒鐘，然后以72°C延伸20秒鐘。在最終循環(huán)中，以72°C延伸7分鐘。由5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離RT-PCR 產(chǎn)物，使用 SYBR Green I (Molecular Probes)染色，使用 Gel Logic200ImagingSystem (Kodak)進行可視化。
[0138][表I]
【權(quán)利要求】
1.一種腸細胞的制造方法，其特征在于，其包括:從多能性干細胞誘導分化出胚胎內(nèi)胚層細胞的工序(A);和在(2’Z, 3’E)-6-漠親玉紅_3’-月虧(BIO)和N-[(3, 5- 二氣苯基)乙酸基]-L-Ala-2-苯基-L-Gly-叔丁基-OH (DAPT)的存在下，培養(yǎng)所述胚胎內(nèi)胚層，由此從所述胚胎內(nèi)胚層誘導分化出腸細胞的工序(B)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:通過使用針對E-鈣粘著蛋白(ECD)和CXCR4的熒光標記抗體的流式細胞儀，從工序(A)中得到的細胞培養(yǎng)物中分離胚胎內(nèi)胚層細胞，在工序(B)中使用該分離得到的胚胎內(nèi)胚層細胞。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:在工序(A)中，通過在支持細胞的存在下且在激活素和/或bFGF的存在下培養(yǎng)所述多能性干細胞，從該多能性干細胞誘導分化出胚胎內(nèi)胚層細胞。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:支持細胞為來自中胚層的細胞。
5.如權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于:支持細胞為M15細胞、MEF細胞或ST2細胞。`
6.如權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法,其特征在于:在工序(B)中，在M15細胞或MEF細胞的存在下培養(yǎng)所述胚胎內(nèi)胚層。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的方法,其特征在于:所述多能性干細胞為胚胎干細胞或人工多能性干細胞。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項所述的方法，其特征在于:所述多能性干細胞為人胚胎干細胞或小鼠胚胎干細胞。
9.一種腸細胞，其特征在于:其是利用權(quán)利要求1-8中任一項所述的方法得到的、從多能性干細胞誘導分化出的。
10.一種促進或抑制從多能性干細胞向腸細胞誘導分化的物質(zhì)的篩選方法，其特征在于，包括如下步驟:在利用權(quán)利要求1-8中任一項所述的方法從多能性干細胞向腸細胞誘導分化時，在被檢測物質(zhì)的存在下培養(yǎng)多能性干細胞，比較在被檢測物質(zhì)不存在下培養(yǎng)多能性干細胞時向腸細胞誘導分化的程度和在被檢測物質(zhì)存在下培養(yǎng)多能性干細胞時向腸細胞誘導分化的程度。
11.如權(quán)利要求10所述的篩選方法，其特征在于:被檢測物質(zhì)為生長因子或低分子化合物。
12.如權(quán)利要求10或11所述的篩選方法，其特征在于:以腸細胞中表達的標記轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物量或蛋白量或者該兩者為指標，測定向腸細胞誘導分化的程度。
【文檔編號】C12Q1/02GK103459591SQ201180063607
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2011年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2010年11月2日
【發(fā)明者】粂昭苑, 大垣總一郎, 白木伸明, 粂和彥 申請人:國立大學法人熊本大學, Lsip基金運營聯(lián)合公司