專利名稱：一種用于檢測豬瘟病毒的試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及豬瘟病毒的檢測方法，具體說是一種RT-PCR —步法用于檢測豬瘟病 毒的試劑盒，本發(fā)明還包括該試劑盒的檢測方法。
背景技術(shù)：
古典豬瘟(Classical swine fever，CSF)簡稱豬瘟，是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的豬的急性、烈性、接觸性傳染病，我國是豬瘟嚴重的流行 國家之一，每年因豬瘟造成的直接經(jīng)濟損失有數(shù)十億元，嚴重威脅我國養(yǎng)豬業(yè)及其國際貿(mào) 易的發(fā)展。我國是世界上養(yǎng)豬最多的國家，養(yǎng)豬業(yè)已成為我國畜牧業(yè)的一大支柱產(chǎn)業(yè)，但每 年因感染豬瘟死亡的豬就占飼養(yǎng)總量的2% 5%，引起的經(jīng)濟損失每年在20億 50億左 右。我國采取接種豬瘟兔化弱毒疫苗的方法來預防和控制豬瘟的流行，已經(jīng)成功的控制了 豬瘟的大爆發(fā)。然而，豬瘟的流行特點卻從大流行轉(zhuǎn)變?yōu)榈胤叫粤餍泻蜕l(fā)，并且不分季節(jié) 的隨時發(fā)生。臨床特點也從典型豬瘟轉(zhuǎn)變?yōu)榉堑湫托载i瘟，診斷和預防難度越來越大，因此 豬瘟仍是威脅養(yǎng)豬戶的頭號傳染病。國外和國內(nèi)均已建立了 RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應)檢測方法。國外應用PCR 診斷CSFV已取得很大進展，許多學者根據(jù)CSFV序列，設(shè)計了不同引物，建立了檢測CSFV核 酸的套式RT-PCR方法。該方法直接從豬的脾臟、血清、淋巴結(jié)及肉品等中擴增出預期的片 斷，但該方法僅應用了兩對引物，通過兩次PCR擴增產(chǎn)生一個核苷酸片段。因此檢測一份 樣品需耗時7小時，即耗時又耗力。另外，RNA(核糖核酸)病毒具有高度變異能力，一個片 段不足以解決此問題，同時CSFV是一種高度傳染性的病毒，因此現(xiàn)有的檢測方法不具有快 速，敏感和準確的特點，需要研制并開發(fā)出快速，敏感、準確以及價格便宜的CSFV檢測試劑 盒和檢測方法，以彌補我國在CSFV檢測上的薄弱環(huán)節(jié)，同時有利于剔除隱性帶毒動物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有檢測方法不能適應快速、敏感和準確的檢測 需求，從而提供一種能夠快速、敏感、準確地檢測病毒的一種用于檢測豬瘟病毒的試劑盒， 本發(fā)明還提供該試劑盒的檢測方法。為解決上述問題，本發(fā)明采用了下述技術(shù)方案一種用于檢測豬瘟病毒的試劑盒，包含RNA酶抑制劑、AMV(禽成髓細胞性白血病 病毒)逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶(耐熱脫氧核糖核酸聚合酶)、無RNA酶水、OneStep RNA PCR ( 一 步RNA聚合酶鏈反應)混合液、陰、陽性對照以及序列SEQ IDNO :1至SEQ ID NO 6引物的 混合物。所述序列SEQ ID NO :1至SEQ ID NO 6引物混合物的包括619bp條帶的引物序列為SEQ ID NO 1 上游引物 TCAGGGGGATGTGCAGAGATGTGTSEQ ID NO 2 下游引物 GCTTTTTCCGCGCCTGATTGATA 395bp 條帶的引物序列為
SEQ ID NO :3 上游引物 CCGCCGGTGATTTCGTGSEQ ID NO :4 下游引物 ACTGCCTCTTTGCCCTTTCCTTAT 274bp 條帶的引物序列為SEQ ID NO :5 上游引物 CTGGCCAAGAGGGGTGAGCSEQ ID NO :6 下游引物 ACAGGCCGTCTTGGGTATTC所述引物混合物序列為序列SEQ ID NO 1至SEQID NO 6的向5，端和/或3，端延長的序列；619bp (NO :7)tcagggggatgtgcagagatgtgtggaagccatgaccaattatgcaagagagggtatccaatttatgaa gtctcaagcactgaaggtgaaggaaacccctacttacaaggagacaatggacactgtgacggactatgtaaagaaatteat ggaggcgctggcagacagtaaagaagacatcataaaatatgggctgtgggggacgcacacagccttatataagagcatc agtgccaggcttgggggtgagactgcgttcgctaccctggtagtgaagtggctggcatttgggggtgaatcaatagcag accatgtcaaacaagcggccacagacttggtcgtttactatatcatcaacagacctcagttcccaggagacacggagacac aacaagacggaaggaaatttgtggccagcctactggcctcagctctagctacttacacatacaaaagctggaattacaat aacctgtccaagatagttgaaccggctttggccactctgccctatgccgccacagctctcaaattatttgcccccacccgatt agagagcgttgtcatattaagtaccgcaatctacaagacctacctatcaatcaggcgcggaaaaagc395bp (NO :8)ccgccggtgatttcgtggacgagaagaaacctagagtcatacaataccctgaagcaaaaacaagactgg ccatcaccaaggtgatgtataagtgggtgaagcagaagccagtagttatacccgggtatgaagggaagacacctctatt ccaaatttttgacaaagtgaagaaggaatgggatcaatttcaaaatccagtggcagtgagcttcgacactaaggcgtgggac acccaggtaaccacaaaagatttggagctgataagggacatacaaaagtattatttcaagaagaaatggcacaaattta ttgacaccctgaccacgcatatgtcagaagtacccgtgattagtgctgatggggaagtatacataaggaaagggcaaagagg cagt274bp (NO :9)ctggccaagaggggtgagccaagaaccctgaagtggattagaaatttcaccgactgtccattgtgggtt accagttgctccgatgatggcgcgagtgggagtaaagagaagaagccagataggatcaacagaggcaaattaaaaatagcc ccaaaagagcatgagaaggacagcagaactaggccacctgacgctacgatcgtggtggaaggagtaaaataccaggt
6caaaaagaaaggtaaagttaaaggaaagaatacccaagacggcctgt所述One Step RNA PCR混合液包含PCR緩沖液、dNTP和Mg2+。PCR緩沖液的濃度 為10x、dNTP的濃度為10mM，Mg2+的濃度為25mM，所述PCR緩沖液、dNTP和Mg2+的配比為 5 · 4 · 3 ο所述引物濃度為50ρπιο1/μ 1，三對引物274bp，3%bp，619bp的配比為 13 12 5。所述陰性對照為正常細胞培養(yǎng)上清，空白對照為無RNA酶水。所述陽性對照為CSFV C株細胞毒。本發(fā)明還提供了用所述試劑盒檢測豬瘟病毒的方法，包括以下步驟a.分別取400 μ L組織樣品研磨上清液(細胞毒培養(yǎng)上清或血清)、空白對照及 陰、陽性對照提取總RNA;b.使用本發(fā)明所述的檢測試劑盒進行RT-PCR擴增，其中條件如下50°C反轉(zhuǎn)錄30 分鐘，94°C預變性2分鐘，94°C 40秒，退火溫度57 °C 40秒，72 °C 50秒，30個循環(huán)后72°C延 伸8分鐘；c.電泳電壓 80V-100V，或電流 40mA-50mA。電泳 15min_25min ；d.結(jié)果分析，與DL2000標準分子量對照，如果陽性對照出現(xiàn)619bp、395bp及 274bp三條條帶或三條中的任何一條，樣品擴增產(chǎn)物出現(xiàn)274bp、395bp以及619bp中的任何 一條條帶，而陰性對照無擴增條帶，則可判定該樣品為陽性，否則為陰性。所述樣品可以是待測豬的脾臟、血、淋巴結(jié)及肉品等。本發(fā)明在檢測過程中將反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增過程在一步反應中完成，使得檢測時間 由原來的4-5小時縮短到現(xiàn)在的2-3小時，從而有利于快速檢測。同時本發(fā)明使用了三對 引物，使該方法與普通PCR方法相比具有更高的敏感性，有助于CSFV的防控和隱性帶毒動 物的剔除，避免造成大范圍的傳染。所述方法適用于任何實驗室和基層各級防控單位、獸醫(yī) 站及大中小型養(yǎng)殖場等。


圖1為本發(fā)明樣本檢測電泳圖。圖中泳道1為分子量標準DL2000 ；泳道2為陽性對照；泳道3_6分別為豬脾臟、 全血、血清及淋巴結(jié)，其中泳道3和泳道4為強陽性樣品；泳道5和6為陽性樣品；泳道7為 陰性對照；泳道8為空白對照。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行進一步詳細敘述實施例11、引物的設(shè)計和制備參照GenBank (基因庫)查找多個毒株，尋找多個序列上均保守的區(qū)域進行序列比 對，根據(jù)比對結(jié)果設(shè)計相對保守的三對特異引物，引物序列如下619bp條帶的引物序列為
上游引物TCAGGGGGATGTGCAGAGATGTGT(SEQ ID NO 1)下游引物GCTTTTTCCGCGCCTGATTGATA(SEQ ID NO 2)395bp條帶的引物序列為上游引物為CCGCCGGTGATTTCGTG(SEQ ID NO:3)下游引物為ACTGCCTCTTTGCCCTTTCCTTAT(SEQ ID NO 4)274bp條帶的引物序列為上游引物為CTGGCCAAGAGGGGTGAGC(SEQ ID NO:5)下游引物為ACAGGCCGTCTTGGGTATTC(SEQ ID NO:6)上述引物由大連寶生物工程有限公司合成。陽性對照本發(fā)明試劑盒的陽性對照是滅活CSFV C株細胞毒，由中國農(nóng)業(yè)科學院 蘭州獸醫(yī)研究所傳代并大量培養(yǎng)。2、樣品的制備(1)分別取陽性對照、豬脾臟組織研磨上清液取、陰性對照、無RNA酶水即空白對 照400μ 1，置1.5mL印pendorf管中，加1000 μ 1 Trizol (核酸抽提試劑)，混勻，4°C放置 5min。(2)力Π 200 μ 1三氯甲烷，蓋上蓋振搖15秒，室溫放置3分鐘。(3) 12000轉(zhuǎn)/分和4°C離心15分鐘，分為三層。(4)將上層水相(約700 μ 1)轉(zhuǎn)移至另一 1.5ml管中，加入等量(700 μ 1)異丙醇， 混勻，室溫放置10分鐘。(5) 10000轉(zhuǎn)/分和4°C離心10分鐘，棄上清。(6)加1000 μ 1用無核糖核酸酶水配制的75%乙醇，漂洗沉淀一次，8000轉(zhuǎn)/分和
4°C離心5分鐘，棄上清。(7) 8000rpm, 4°C，離心2min，吸棄上清，室溫充分干燥RNA沉淀。(8)加20 μ 1無RNA酶水，溶解RNA沉淀，即可用于PCR擴增，其余RNA沉淀-20 V
保存?zhèn)溆谩?、制備試劑盒本試劑盒由以下組分組成a. One Step RNA PCR 混合液 10 μ 1，濃度 IOxb. RNA 酶抑制劑 0. 5 μ 1，濃度為 40U/ μ 1c. AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 0. 5 μ 1，濃度為 5U/ μ 1d. Taq 酶 0. 5 μ 1，濃度為 5U/ μ 1e.引物濃度均為50ρ θ1/μ 1的三對引物混合液1.5μ l，274bp引物0.65 μ 1， 395bp引物 0· 6 μ l，619bp 引物 0. 5 μ 1。f ·無 RNA 酶水 7 μ 1g.陽性對照5μ1h.陰性對照5μ14、用本發(fā)明試劑盒檢測豬瘟病毒(I)PCR總體系為25 μ 1。分別將本發(fā)明試劑盒中a. One Step RNA PCR混合液10 μ 1 ；b. RNA 酶抑制劑 0. 5 μ 1 ；c. AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 0. 5 μ 1 ；d.Taq 酶 0.5μ 1 ；e.三對引物 1. 5 μ 1 ;f.無RNA酶水7 μ 1，加入到4根0. 2ml擴增管中；(2)分別向上述擴增管中加入陽性對照5μ 1、從豬脾臟提取的RNA模板5μ 1、陰性 對照5 μ 1、無RNA酶水即空白對照5 μ 1，12000rpm離心5_30秒，將擴增管放入擴增儀中，在 以下設(shè)定程序下擴增50°C反轉(zhuǎn)錄30min，94°C預變性2min，94°C 40s，退火溫度57°C 40s, 72°C 50s, 30個循環(huán)后72°C延伸8分鐘，得到擴增產(chǎn)物。實施例21、引物的設(shè)計和制備同實施例12、樣品的制備(1)取待檢豬全血400μ 1，置1. 5mL印pendorf管中，加1000 μ 1 Trizol (核酸抽 提試劑)，混勻，4°C放置5min。步驟O)-步驟(8)同實施例1中23、制備試劑盒同實施例1中34、用本發(fā)明試劑盒檢測豬瘟病毒(I)PCR總體系為25 μ 1。將本發(fā)明試劑盒中a. One Step RNA PCR混合液10 μ 1 ； b. RNA 酶抑制劑 0.5 μ 1 ；c. AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 0.5 μ 1 ；d.Taq 酶 0.5 μ 1 ；e.三對引物 1.5μ 1 ； f.無RNA酶水7 μ 1加入0. 2ml擴增管中；(2)向上述擴增管中加入從豬全血中提取的RNA模板5 μ l，12000rpm離心5-30 秒，將擴增管放入擴增儀中，在以下設(shè)定程序下擴增50°C反轉(zhuǎn)錄25min，94°C預變性2min， 94°C 30s，退火溫度57°C 35s，72°C 40s, 25個循環(huán)后72°C延伸8分鐘，得到擴增產(chǎn)物。實施例31、引物的設(shè)計和制備同實施例12、樣品的制備(1)取待檢豬血清400μ 1，置1. 5mL印pendorf管中，加1000 μ 1 Trizol(核酸抽 提試劑)，混勻，4°C放置5min。步驟O)-步驟(8)同實施例1中23、制備試劑盒同實施例1中34、用本發(fā)明試劑盒檢測豬瘟病毒(I)PCR總體系為25 μ 1。分別將本發(fā)明試劑盒中a. One Step RNA PCR混合液 10 μ 1 ；b. RNA 酶抑制劑 0. 5 μ 1 ；c. AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 0. 5 μ 1 ；d.Taq 酶 0.5μ 1 ；e.三對引物 1. 5μ 1 ；f.無RNA酶水7 μ 1加入0. 2ml擴增管中；(2)向上述擴增管中加入從豬全血中提取的RNA模板5 μ l，12000rpm離心5-30 秒，將擴增管放入擴增儀中，在以下設(shè)定程序下擴增50°C反轉(zhuǎn)錄40min，94°C預變性5min， 94°C 60s，退火溫度57°C 60s, 72°C 90s, 40個循環(huán)后72°C延伸15分鐘，得到擴增產(chǎn)物。實施例41、引物的設(shè)計和制備同實施例12、樣品4的制備(1)取待檢豬淋巴結(jié)研磨上清液400μ 1，置1.5ml印pendorf管中，加1000 μ 1 Trizol (核酸抽提試劑)，混勻，4°C放置5min。
步驟⑵-步驟(8)同實施例1中23、制備試劑盒同實施例1中34、用本發(fā)明試劑盒檢測豬瘟病毒(I)PCR總體系為25μ 1。分別將本發(fā)明試劑盒中a. One Step RNA PCR混合液 10 μ 1 ；b. RNA 酶抑制劑 0. 5 μ 1 ；c. AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 0. 5 μ 1 ；d.Taq 酶 0.5μ 1 ；e.三對引物 1. 5μ 1 ；f.無RNA酶水7 μ 1加入0. 2ml擴增管中；(2)向上述擴增管中加入從豬全血中提取的RNA模板5 μ l，12000rpm離心5-30 秒，將擴增管放入擴增儀中，在以下設(shè)定程序下擴增50°C反轉(zhuǎn)錄30min，94°C預變性2min， 94°C 60s，退火溫度57°C 50s, 72°C 50s, 35個循環(huán)后72°C延伸10分鐘，得到擴增產(chǎn)物。結(jié)果判定1、稱取l.Og瓊脂糖，加入IOOml 1 XTAE緩沖液中，加熱融化，加入5 μ L(IOOmg/ ml)溴化乙錠，混勻，倒入插有8孔道梳子的水平放置的凝膠盤中，膠板厚度為5mm，待凝膠 冷卻后拔出梳子，將凝膠放入電泳槽中，加IXTAE緩沖液淹沒膠面。2、分別取5μ 1上述實施例1-4所得PCR擴增產(chǎn)物和2μ L 6x Ioadingbuffer (上 樣緩沖液)，混勻，加入加樣孔中，同時加5 μ 1 DL2000分子量標準。3、80V-100V 電壓或 40mA_50mA 電流電泳 15min_25min。取出凝膠板置于紫外透射儀上，打開紫外燈觀察并拍攝照片，結(jié)果見圖1。如圖所示，與DL 2000標準分子量對照可知，實施例1中豬脾臟和實施例2中豬全 血的電泳結(jié)果出現(xiàn)了三條不同的條帶，即619bp、3%bp以及274bp ；實施例3中豬血清和實 施例中淋巴結(jié)出現(xiàn)了兩條帶，與陽性對照相符，同時陰性對照和空白對照無擴增條帶，所以 判定實施例1-實施例4中樣品1-樣品4為陽性，即所述的待檢豬脾臟、全血、血清及淋巴 結(jié)包含豬瘟病毒。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測豬瘟病毒的試劑盒，包含RNA酶抑制劑、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶、無RNA 酶水、One Step RNA PCR混合液、陰、陽性對照，其特征在于所述試劑盒還包括序列SEQ ID NO :1至SEQ ID NO 6引物的混合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測豬瘟病毒的試劑盒，其特征在于所述序列SEQ ID NO :1至SEQ ID NO 6引物混合物包括619bp條帶的引物序列為SEQ ID NO 1 上游引物 TCAGGGGGATGTGCAGAGATGTGTSEQ ID NO :2 下游引物 GCTTTTTCCGCGCCTGATTGATA395bp條帶的引物序列為SEQ ID NO :3 上游引物 CCGCCGGTGATTTCGTGSEQ ID NO :4 下游引物 ACTGCCTCTTTGCCCTTTCCTTAT274bp條帶的引物序列為SEQ ID NO 5 上游引物 CTGGCCAAGAGGGGTGAGCSEQ ID NO 6 下游引物 ACAGGCCGTCTTGGGTATTC
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測豬瘟病毒的試劑盒，其特征在于所述引物混合 物序列為序列SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :6的向5，端和/或3，端延長的序列； 619bp(NO 7)tcagggggatgtgcagagatgtgtggaagccatgaccaattatgcaagagagggtatccaatttatgaagtct caagcactgaaggtgaaggaaacccctacttacaaggagacaatggacactgtgacggactatgtaaagaaattcatggag gcgctggcagacagtaaagaagacatcataaaatatgggctgtgggggacgcacacagccttatataagagcatcagtg ccaggcttgggggtgagactgcgttcgctaccctggtagtgaagtggctggcatttgggggtgaatcaatagcagacca tgtcaaacaagcggccacagacttggtcgtttactatatcatcaacagacctcagttcccaggagacacggagacacaaca agacggaaggaaatttgtggccagcctactggcctcagctctagctacttacacatacaaaagctggaattacaataacc tgtccaagatagttgaaccggctttggccactctgccctatgccgccacagctctcaaattatttgcccccacccgattagag agcgttgtcatattaagtaccgcaatctacaagacctacctatcaatcaggcgcggaaaaagc 395bp (NO 8)ccgccggtgatttcgtggacgagaagaaacctagagtcatacaataccctgaagcaaaaacaagactggccatCciCCciciggtgatgtataagtgggtgaagcagaagccagtagttatacccgggtatgaagggaagacacctctattccaa atttttgacaaagtgaagaaggaatgggatcaatttcaaaatccagtggcagtgagcttcgacactaaggcgtgggacacccaggtaaccacaaaagatttggagctgataagggacatacaaaagtattatttcaagaagaaatggcacaaatttattga caccctgaccacgcatatgtcagaagtacccgtgattagtgctgatggggaagtatacataaggaaagggcaaagaggcagt274bp (NO 9)ctggccaagaggggtgagccaagaaccctgaagtggattagaaatttcaccgactgtccattgtgggttacca gttgctccgatgatggcgcgagtgggagtaaagagaagaagccagataggatcaacagaggcaaattaaaaatagccccaaaagagcatgagaaggacagcagaactaggccacctgacgctacgatcgtggtggaaggagtaaaataccaggtcaaa aagaaaggtaaagttaaaggaaagaatacccaagacggcctgt
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測豬瘟病毒的試劑盒，其特征在于所述OneStep RNA PCR混合液包含PCR緩沖液、dNTP和Mg2+，所述PCR緩沖液的濃度為10x，dNTP的濃度 為IOmM, Mg2+的濃度為25mM,所述PCR緩沖液、dNTP和Mg2+的比例為5:4:3。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測豬瘟病毒的試劑盒，其特征在于所述引物濃度 為 50pmol/y L，三對引物 274bp，395bp，619bp 的配比為 13 12 5。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測豬瘟病毒的試劑盒，其特征在于所述陰性對照 為正常細胞培養(yǎng)上清，空白對照為無RNA酶水。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測豬瘟病毒的試劑盒，其特征在于所述陽性對照 為CSFV C株細胞毒。
8.—種如權(quán)利要求1所述試劑盒檢測豬瘟病毒的方法，其特征在于，所述方法包括以 下步驟a.Trizol法提取樣品總RNA ；b.使用權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒進行RT-PCR擴增，條件如下50°C反轉(zhuǎn)錄25 40分鐘，94°C預變性2 5分鐘，94°C 30秒 60秒，退火溫度57°C 35 60秒，72°C 40 90秒，25 40個循環(huán)后72°C延伸8 15分鐘；c.常規(guī)電泳；d.結(jié)果分析，如果樣品擴增產(chǎn)物出現(xiàn)274bp、395bp以及619bp中的任何一條條帶，而陰 性對照和空白對照無擴增條帶，則判定該樣品為陽性。
9.一種如權(quán)利要求10所述試劑盒檢測豬瘟病毒的方法，其特征在于，所述方法包括以 下步驟a.Trizol法提取樣品總RNA ；b.使用權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒進行RT-PCR擴增，條件如下50°C反轉(zhuǎn)錄30分 鐘，94°C預變性2分鐘，94°C 40秒，退火溫度57 °C 40秒，72 °C 50秒，30個循環(huán)后72°C延伸 8分鐘；c.常規(guī)電泳；d.結(jié)果分析，如果樣品擴增產(chǎn)物出現(xiàn)274bp、395bp以及619bp中的任何一條條帶，而陰 性對照和空白對照無擴增條帶，則判定該樣品為陽性。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的一種用于檢測豬瘟病毒的試劑盒，其特征在于所述樣品 可以是待測豬的脾臟、血、淋巴結(jié)及肉品。
全文摘要
一種用于檢測豬瘟病毒的試劑盒，包含RNA酶抑制劑、AMV(禽成髓細胞性白血病病毒)逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶(耐熱脫氧核糖核酸聚合酶)、無RNA酶水、One Step RNA PCR(一步RNA聚合酶鏈反應)混合液、陰、陽性對照以及序列SEQ ID NO1至SEQ ID NO6引物的混合物。本發(fā)明在檢測過程中將反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增過程在一步反應中完成，使得檢測時間由原來的4-5小時縮短到現(xiàn)在的2-3小時，從而有利于快速檢測。同時本發(fā)明使用了三對引物，使該方法與普通PCR方法相比具有更高的敏感性，有助于CSFV的防控和隱性帶毒動物的剔除，避免造成大范圍的傳染。所述方法適用于任何實驗室和基層各級防控單位、獸醫(yī)站及大中小型養(yǎng)殖場等。
文檔編號C12Q1/70GK102140540SQ201110035770
公開日2011年8月3日 申請日期2011年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月29日
發(fā)明者劉湘濤, 吳錦艷, 尚佑軍, 尹雙輝, 張克山, 楊順利, 王光祥, 田宏, 陳妍, 靳野 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所