專(zhuān)利名稱(chēng)：白介素-17f抗體及其它il-17f信號(hào)傳遞拮抗劑和它們的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗體，例如，完整抗體及其抗原結(jié)合片段，及其它IL-17F信號(hào)傳遞拮抗劑，例如，可溶的IL-17F受體，其干擾白介素-17F(IL-17F)信號(hào)傳遞，更具體地，涉及人 IL-17F和它們?cè)谡{(diào)節(jié)IL-17F相關(guān)活性中的應(yīng)用。本文公開(kāi)的抗體和相關(guān)的IL-17F分子可以用于診斷、預(yù)后、監(jiān)測(cè)、預(yù)防、和/或治療IL-17F相關(guān)病癥，例如，炎性病癥(例如，自身免疫病(例如，關(guān)節(jié)炎(包括類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎)，銀屑病，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，多發(fā)性硬化)， 呼吸系統(tǒng)疾病(例如，C0PD，囊性纖維化，哮喘，變態(tài)反應(yīng))，移植排斥(包括實(shí)體器官移植排斥)和炎性腸疾病或病癥(IBD，例如，潰瘍性結(jié)腸炎，克隆氏病))。
背景技術(shù)：
細(xì)胞因子是具有參與免疫和炎癥反應(yīng)的多效活性的分泌型可溶蛋白，例如，細(xì)胞因子可以造成靶細(xì)胞的分化、募集或其它生理反應(yīng)，例如，分泌炎癥的特征蛋白。細(xì)胞因子結(jié)合特定的細(xì)胞表面受體，這會(huì)觸發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，導(dǎo)致細(xì)胞激活、增殖和分化。從鼠雜交瘤分離和克隆了一種這樣的細(xì)胞因子，即白介素-17 (IL-17)，它最初稱(chēng)作CTLA-8，并證實(shí)它與T淋巴親嗜性猿猴皰疹病毒的開(kāi)放讀碼框13具有同源性(Rouvier等(1993) J. Immunol. 150 :5445-56 ；Yao 等(1996)Genel68 :223-25 ；Golstein 等，公開(kāi)的國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朩095/01^6)。此后，已經(jīng)鑒別出5種相關(guān)的細(xì)胞因子，它們與IL-17具有20-50%同源性(參見(jiàn) Moseley 等(2003) Cytokine&Growth Factor Reviewsl4 :155-74)。為了將 IL-17 標(biāo)記為IL-17細(xì)胞因子家族的已知成員，已經(jīng)將它命名為IL-17A (Moseley，同上)；已經(jīng)將其它成員命名為IL-17B，IL-17C，IL-17D，IL-17E和IL-17F。IL-17細(xì)胞因子家族成員具有保守的半胱氨酸殘基。感興趣的是IL-17A，尤其是IL-17F，它們具有50%同一性；這兩種細(xì)胞因子由IL-23誘導(dǎo)，由T細(xì)胞共表達(dá)，且被視作T細(xì)胞-介導(dǎo)的自身免疫病的潛在靶。 類(lèi)似于IL-17A，IL-17F中的保守半胱氨酸殘基表現(xiàn)出存在于骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (TGF-β)，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)和血小板衍生因子BB(PDGF-BB)中的經(jīng)典半胱氨酸結(jié)基序的特征(Hymowitz 等 Q001)EMB0 J. 20 :5332-41 ；McDonald 等(1993)Cell 73 421-24)。IL-17F是一種17kD分泌型蛋白，它克隆自激活的人PBMC文庫(kù)(SST)(美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 6，043，344和6，074，849)。它形成30_35kD 二硫鍵連接的同二聚體(Hymowitz,同上)，且類(lèi)似于IL-17A，主要由激活的T細(xì)胞表達(dá)(Moseley，同上)。但是，還已經(jīng)證實(shí)了激活的單核細(xì)胞、激活的嗜堿粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞會(huì)表達(dá)IL-17F(Kawaguchi等Q002) J. Immunol. 167 4430-35)。IL-17F誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞表達(dá)許多細(xì)胞因子和趨化因子(Moseley，同上)。通過(guò)誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的生成和中性粒細(xì)胞增多，IL-17F在炎癥反應(yīng)中起部分作用。它與幾種自身免疫病的發(fā)展相關(guān)，例如，關(guān)節(jié)炎(包括類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和萊姆關(guān)節(jié)炎)， 系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)和哮喘(Bettelli 和 Kuchroo (2005) J.Exp. Med. 201 :169-71)。例如，最近已經(jīng)證實(shí)，IL-23是T細(xì)胞群體的擴(kuò)展所必需的，所述擴(kuò)展的特征在于，尤其是， IL-17F的生成，該T細(xì)胞群體的被動(dòng)轉(zhuǎn)移是建立與中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫相關(guān)的器官特異性的炎癥所必需的(Langrish等(2005) J. Exp. Med. 201 :233-40)，IL-17-缺陷型小鼠能抗實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎(EAE ；多發(fā)性硬化的動(dòng)物模型)(Nakae等Q003)J. Immunol. 171 6173-77)。IL-17F在已知的炎性細(xì)胞因子中是獨(dú)特的，因?yàn)樗鼤?huì)增加蛋白聚糖分解和減少關(guān)節(jié)軟骨的蛋白聚糖合成(Hymowitz，同上)。另外，已經(jīng)證實(shí)了從變應(yīng)原攻擊后的哮喘患者采集的支氣管肺泡灌洗(BAL)中比從對(duì)照患者采集的BAL中的IL-17F表達(dá)有所增強(qiáng)(Kawaguchi，同上)。并且，潰瘍性結(jié)腸炎和克隆氏病患者中的IL-17F mRNA表達(dá)增加 (Gurney 等 Q003) GTCBIO Conf =Cytokines 和 Beyond)。這些發(fā)現(xiàn)暗示著，IL-17F 信號(hào)傳遞的阻斷會(huì)減少促炎細(xì)胞因子生產(chǎn)，并減少骨侵蝕。因此，IL-17F信號(hào)傳遞途徑是治療和/ 或預(yù)防炎性疾病的有吸引力的目標(biāo)，所述炎性疾病例如其中募集的中性粒細(xì)胞是組織病變的關(guān)鍵介質(zhì)，例如，在自身免疫病(例如，關(guān)節(jié)炎(包括類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎)、銀屑病，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，多發(fā)性硬化)、呼吸系統(tǒng)疾病(例如，C0PD，囊性纖維化，哮喘，變態(tài)反應(yīng))、移植排斥 (包括實(shí)體器官移植排斥)、和炎性腸病癥或疾病(IBD，例如，潰瘍性結(jié)腸炎，克隆氏病)的發(fā)展過(guò)程中。目前，關(guān)于IL-17家族成員的受體知之甚少。已經(jīng)證實(shí)，IL_17R(即IL-17A的受體)在迄今檢查的所有組織中都表達(dá)，IL-17A與IL-17R的結(jié)合通常會(huì)通過(guò)激活NF-κ B， 導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的誘導(dǎo)(Moseley，同上)。已經(jīng)鑒別出另外4種與IL-17R具有部分序列同源性的受體1)IL-17RH1(也稱(chēng)作IL-17RB)，2)IL-17-受體樣蛋白(也稱(chēng)作IL-17RL或 IL-17RC)，3) IL-17RD (也稱(chēng)作 SEF 或 IL-17RLM)和 4) IL-17RE (Moseley,同上)。在這另外 4種受體中，僅證實(shí)了 IL-17RH1會(huì)結(jié)合IL-17細(xì)胞因子，即IL-17B和IL-17E ；但是，尚未證實(shí)結(jié)合 IL-17RH1 的 IL-17B 和 IL-17E 的功能(Shi 等(2000) J. Biol. Chem. 275 :19167-76 ； Lee等0001)J.Biol· Chem. 276 :1660-64)。迄今為止，尚未報(bào)道IL-17F的受體。因而，還不能為預(yù)防和/或治療疾病而靶定IL-17F信號(hào)傳遞，盡管它可能在組織(例如，關(guān)節(jié)組織) 的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和各種疾病(例如，關(guān)節(jié)炎，哮喘，變態(tài)反應(yīng)，C0PD，囊性纖維化，潰瘍性結(jié)腸炎， 克隆氏病，等)的進(jìn)展中起重要作用。通過(guò)鑒別和靶定參與IL-17F蛋白的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵參與物，本發(fā)明解決了該問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是，鑒別IL-17F信號(hào)傳遞途徑的組分，例如，IL-17F和它的受體，和在治療與IL-17F信號(hào)傳遞相關(guān)的病癥的方法中靶定這些組分。這樣的IL-17F相關(guān)病癥和與增強(qiáng)的IL-17F信號(hào)傳遞相關(guān)的病癥包括但不限于，炎性病癥，例如，自身免疫病 (例如，關(guān)節(jié)炎(包括類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎)，銀屑病，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，多發(fā)性硬化)，呼吸系統(tǒng)疾病(例如，C0PD，囊性纖維化，哮喘，變態(tài)反應(yīng))，移植排斥(包括實(shí)體器官移植排斥)和炎性腸病(例如，潰瘍性結(jié)腸炎，克隆氏病)。這樣，作為本發(fā)明基礎(chǔ)的研究提供了證據(jù)表明，IL-17F通過(guò)它與IL-17R和/或 IL-17RC的結(jié)合，介導(dǎo)蛋白聚糖分解和炎癥反應(yīng)。作為IL-17F受體的IL-17R和IL-17RC的測(cè)定，揭示這些分子是治療與IL-17F信號(hào)傳遞相關(guān)的病癥的靶。本文提供了 IL-17F信號(hào)傳遞拮抗劑，包括但不限于，IL-17F抑制性多核苷酸， IL-17R抑制性多核苷酸，IL-17RC抑制性多核苷酸，包含IL-17R或其IL-17F結(jié)合片段的可溶多肽，包含IL-17RC或其IL-17F結(jié)合片段的可溶多肽，抑制性抗IL-17F抗體，抑制性抗IL-17R抗體，抑制性抗IL-17RC抗體和拮抗性小分子。IL-17F信號(hào)傳遞拮抗劑的優(yōu)選實(shí)例包括，針對(duì)IL-17R和IL-17RC的siRNA，包含IL-17R和IL-17RC (或其IL-17F結(jié)合片段)的可溶融合蛋白和抑制性(即拮抗性)IL-17F抗體。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，IL-17F信號(hào)傳遞拮抗劑，例如，針對(duì)IL-17R或IL-17RC的siRNA、包含IL-17R或 IL-17RC(或其IL-17F結(jié)合片段)的可溶融合蛋白、或抑制性IL-17F抗體，會(huì)降低IL-17F 生物活性和/或NF- κ B的激活NF- κ B反應(yīng)基因的能力。另外，基于IL-17A和IL-17F之間的結(jié)構(gòu)和序列相似性，發(fā)明人假設(shè)并證實(shí)了新的IL-17A/IL-17F異二聚體的形成。在證實(shí)存在IL-17A/IL-17F異二聚體時(shí)，發(fā)明人首先證實(shí)了，IL-21會(huì)導(dǎo)致IL-17A同二聚體、IL-17F同二聚體和IL-17A/IL-17F異二聚體的增加生產(chǎn)，并暗示著與IL-21結(jié)合并激活I(lǐng)L-21R相關(guān)的作用可能歸因于、至少部分地歸因于 IL-17信號(hào)傳遞。發(fā)明人還從這些細(xì)胞因子的天然來(lái)源(例如，激活的T細(xì)胞)中首次分離了 IL-17A同二聚體、IL-17F同二聚體和IL-17A/IL-17F異二聚體。因而，本發(fā)明還提供了減輕與IL-21結(jié)合并激活I(lǐng)L-21R相關(guān)的效應(yīng)的方法，例如，通過(guò)抑制IL-17A和/或IL-17F 信號(hào)傳遞。另外，本發(fā)明提供了天然的(即非重組的)IL-17A同二聚體、IL-17F同二聚體、 和IL-17A/IL-17F異二聚體，以及分離和靶定它們的方法，例如，在治療與增強(qiáng)的IL-17F信號(hào)傳遞相關(guān)的病癥和/或與IL-21結(jié)合并激活I(lǐng)L-21R相關(guān)的病癥的方法中。另外，本文公開(kāi)了重組IL-17A同二聚體、IL-17F同二聚體、和IL-17A/IL-17F異二聚體，和分離基本上不含有IL-17A同二聚體和IL-17F同二聚體的IL-17A/IL-17F異二聚體(重組的或天然的) 的方法。靶定IL-17F信號(hào)傳遞的方法可以包含IL-17F，IL-17R和/或IL-17RC多核苷酸 (包括抑制性多核苷酸，例如反義，siRNA和適體)，多肽及其片段，作為IL-17F信號(hào)傳遞拮抗劑。另外，也可以使用能抑制IL-17F蛋白(作為IL-17F同二聚體或IL-17A/IL-17F異二聚體)與它的受體的相互作用的抗體。本發(fā)明還涉及，在篩選能靶定IL-17F信號(hào)傳遞途徑的測(cè)試化合物的方法中，和在診斷、預(yù)后、監(jiān)測(cè)和/或治療與IL-17F信號(hào)傳遞相關(guān)的病癥的方法中，使用本文公開(kāi)的分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了篩選能拮抗IL-17F信號(hào)傳遞的測(cè)試化合物的方法，其包含下述步驟使含有IL-17F和IL-17R的樣品接觸化合物；和確定樣品中IL-17F 與IL-17R的相互作用相對(duì)于未接觸該化合物的樣品中IL-17F與IL-17R的相互作用是否降低，由此，接觸該化合物的樣品中IL-17F與IL-17R的相互作用的降低，將該化合物鑒別為能抑制IL-17F與IL-17R的相互作用且能拮抗IL-17F信號(hào)傳遞的化合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種類(lèi)似的與IL-17RC相關(guān)的篩選方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了診斷受試者中與增強(qiáng)的IL-17F信號(hào)傳遞相關(guān)的病癥的方法，其包含下述步驟檢測(cè)受試者樣品中IL-17F信號(hào)傳遞基因產(chǎn)物的測(cè)試量；和對(duì)比該測(cè)試量與對(duì)照樣品中相同IL-17F信號(hào)傳遞基因產(chǎn)物的正常量，由此，明顯超過(guò)正常量的測(cè)試量提供了診斷與增強(qiáng)的IL-17F信號(hào)傳遞相關(guān)的病癥的陽(yáng)性指示。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述病癥選自自身免疫病，呼吸系統(tǒng)疾病和炎性腸病。在其它實(shí)施方案中， IL-17F信號(hào)傳遞基因產(chǎn)物是IL-17F基因產(chǎn)物，IL-17R基因產(chǎn)物，或IL-17RC基因產(chǎn)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療具有患與增強(qiáng)的IL-17F信號(hào)傳遞相關(guān)的病癥的危險(xiǎn)或診斷出患有這樣的病癥的受試者的方法，其包含給該受試者施用治療有效量的IL-17F信號(hào)傳遞拮抗劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，IL-17F信號(hào)傳遞拮抗劑選自IL_17F 抑制性多核苷酸，IL-17R抑制性多核苷酸，IL-17RC抑制性多核苷酸，包含IL-17R或其 IL-17F結(jié)合片段的可溶多肽，包含IL-17RC或其IL-17F結(jié)合片段的可溶多肽，抑制性抗 IL-17F抗體，抑制性抗IL-17R抗體，抑制性抗IL-17RC抗體和拮抗性小分子。在有些實(shí)施方案中，IL-17F信號(hào)傳遞拮抗劑是IL-17R抑制性多核苷酸或IL-17RC抑制性多核苷酸。 在有些其它實(shí)施方案中，抑制性多核苷酸是選自SEQ ID NO :17-32所述的核苷酸序列的 SiRNA0在有些實(shí)施方案中，IL-17F信號(hào)傳遞拮抗劑是包含IL-17R或其IL-17F結(jié)合片段的可溶多肽，或包含IL-17RC或其IL-17F結(jié)合片段的可溶多肽。在有些其它實(shí)施方案中，可溶多肽具有SEQ ID N0:34或SEQ ID NO :35所述的氨基酸序列。在有些其它實(shí)施方案中， (1)IL-17F抑制性多核苷酸包含SEQ ID NO :1所述的核苷酸序列、或與SEQ ID N0:1所述的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，或SEQ ID N0:1的片段，或其RNA等同物，且其中所述抑制性多核苷酸在細(xì)胞中的表達(dá)，導(dǎo)致IL-17F的表達(dá)降低；0)IL-17R抑制性多核苷酸包含 SEQ ID NO :5所述的核苷酸序列、或與SEQ ID NO :5所述的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列， 或SEQ IDNO :5的片段，或其RNA等同物，且其中所述抑制性多核苷酸在細(xì)胞中的表達(dá)，導(dǎo)致降低的IL-17R表達(dá)；和(3)IL-17RC抑制性多核苷酸包含選自SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :9、 SEQ ID NO =IUSEQ ID NO :13 JPSEQ ID NO :15 所述的核苷酸序列，或與選自 SEQ ID NO: 7, SEQ IDNO :9, SEQ ID NO =IUSEQ ID NO :13 JPSEQ ID NO 15 所述的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，或選自 SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :9、SEQ IDNO 11、SEQ ID NO :13、禾口 SEQ ID NO :15所述的核苷酸序列的片段，或其RNA等同物，且其中所述抑制性多核苷酸在細(xì)胞中的表達(dá)，導(dǎo)致降低的IL-17RC表達(dá)。在有些實(shí)施方案中，與增強(qiáng)的IL-17F信號(hào)傳遞相關(guān)的病癥是炎性病癥。在有些其它實(shí)施方案中，所述炎性病癥選自自身免疫病，呼吸系統(tǒng)疾病和炎性腸病。在有些其它實(shí)施方案中，所述炎性病癥是自身免疫病，所述自身免疫病選自關(guān)節(jié)炎(包括類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎)，銀屑病，系統(tǒng)性紅斑狼瘡和多發(fā)性硬化。在有些其它實(shí)施方案中，所述炎性病癥是呼吸系統(tǒng)疾病，所述呼吸系統(tǒng)疾病是囊性纖維化；或所述炎性病癥是炎性腸病。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還包含，給受試者施用治療有效量的至少一種其它治療劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種其它治療劑選自細(xì)胞因子抑制劑，生長(zhǎng)因子抑制劑，免疫抑制劑，抗炎劑，代謝抑制劑，酶抑制劑，細(xì)胞毒性劑和細(xì)胞抑制劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種其它治療劑選自TNF拮抗劑，抗TNF劑，IL-12拮抗劑，IL-15 拮抗劑，IL-17拮抗劑，IL-18拮抗劑，IL-22拮抗劑，T細(xì)胞消除劑，B細(xì)胞消除劑，環(huán)孢菌素，Π(-506，CCI-779，依那西普，英夫單抗，利妥希瑪，阿達(dá)木單抗(adalimumab)，潑尼松龍， 硫唑嘌呤，金，柳氮磺胺吡啶，氯喹，羥氯喹，米諾環(huán)素，阿那白滯素(anakinra)，阿巴他塞 (abatacept)，甲氨蝶呤，來(lái)氟米特，雷帕霉素，雷帕霉素類(lèi)似物，Cox-2抑制劑，cPLA2抑制劑，NSAIDs，p38 抑制劑，B7. 1、B7. 2、ICOSL、ICOS 和 / 或 CD28 的拮抗劑和 CTLA4 激動(dòng)劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抑制細(xì)胞群體或受試者中NF-K B的激活 NF-K B反應(yīng)性啟動(dòng)子的能力的方法，其包含給所述細(xì)胞群體或受試者施用IL-17F信號(hào)傳遞拮抗劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抑制細(xì)胞群體或受試者中IL-17F生物活性的方法，該方法包含給所述細(xì)胞群體或受試者施用IL-17F信號(hào)傳遞拮抗劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述IL-17F生物活性選自中性粒細(xì)胞分化、中性粒細(xì)胞募集和細(xì)胞因子誘導(dǎo)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含IL-17F信號(hào)傳遞拮抗劑和藥學(xué)上可接受的載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種疫苗佐劑，其包含 IL-17F信號(hào)傳遞拮抗劑和選自下述的抗原自身抗原，變應(yīng)原，同種異體抗原及其片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的抗體，其能特異性地結(jié)合本發(fā)明的氨基酸序列，包括SEQ ID NO :6，8，10，12，14和16所述的那些；在有些實(shí)施方案中，所述抗體拮抗IL-17F 信號(hào)傳遞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的抗體，其能特異性地結(jié)合IL-17F蛋白，還提供了其它實(shí)施方案，其中所述IL-17F蛋白源自人或靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物；其中所述IL-17F 蛋白是多聚體；其中所述IL-17F蛋白是IL-17F同二聚體或IL-17F異二聚體；其中所述 IL-17F異二聚體是IL-17A/IL-17F ；且其中所述抗體抑制IL-17F生物活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述方法，其中IL-17F信號(hào)傳遞和/或 IL-17F生物活性是由IL-17F同二聚體、IL-17F異二聚體、或IL-17F同二聚體和IL-17F異二聚體兩者介導(dǎo)，包括其中所述IL-17F異二聚體是IL-17A/IL-17F。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述藥物組合物和/或上述疫苗佐劑，其中所述IL-17F信號(hào)傳遞拮抗劑拮抗IL-17F同二聚體、IL-17F異二聚體、或IL-17F同二聚體和IL-17F異二聚體兩者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抑制至少一種與IL-21信號(hào)傳遞相關(guān)的活性的方法，其包含，拮抗IL-17F信號(hào)傳遞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抑制至少一種與IL-23信號(hào)傳遞相關(guān)的活性的方法，其包含，拮抗IL-17F信號(hào)傳遞。在有些其它實(shí)施方案中，所述IL-17F信號(hào)傳遞是由IL-17F同二聚體、IL-17F異二聚體、或IL-17F同二聚體和IL-17F異二聚體兩者介導(dǎo)，包括其中所述IL-17F異二聚體是IL-17A/IL-17F。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了純化天然IL-17A蛋白的方法，其包含激活培養(yǎng)基中的T細(xì)胞；和從培養(yǎng)基中免疫沉淀IL-17A蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了純化天然IL-17F蛋白的方法，其包含激活培養(yǎng)基中的T細(xì)胞；和從培養(yǎng)基中免疫沉淀 IL-17F蛋白。在有些其它實(shí)施方案中，提供了這樣的方法，其中所述IL-17A蛋白是IL-17A 同二聚體、IL-17A異二聚體、或IL-17A同二聚體和IL-17A異二聚體兩者，且/或其中所述 IL-17F蛋白是IL-17F同二聚體、IL-17F異二聚體、或IL-17F同二聚體和IL-17F異二聚體兩者；且其中所述IL-17A或IL-17F異二聚體是IL-17A/IL-17F。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基包含IL-21和/或IL-23。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的IL-17F蛋白，其中所述IL-17F蛋白是IL-17F同二聚體或IL-17F異二聚體；其中所述IL-17F蛋白分離自天然來(lái)源；其中所述天然來(lái)源是至少一個(gè)T細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的IL-17A蛋白，其中所述IL-17A蛋白是IL-17A同二聚體或IL-17A異二聚體；其中所述IL-17A蛋白分離自天然來(lái)源；其中所述天然來(lái)源是至少一個(gè)T細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抑制至少一種與IL-17A信號(hào)傳遞相關(guān)的活性的方法，其包含施用IL-17F拮抗劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離基本上不含有IL-17A同二聚體和 IL-17F同二聚體的IL-17A/IL-17F異二聚體的方法，其包含(a)在培養(yǎng)基培養(yǎng)的宿主細(xì)胞中表達(dá)IL-17A融合蛋白和IL-17F融合蛋白，其中所述IL-17A融合蛋白包含融合到第一親和標(biāo)記物上的IL-17A蛋白或其片段，且其中所述IL-17F融合蛋白包含融合到第二親和標(biāo)記物上的IL-17F蛋白或其片段；(b)使宿主細(xì)胞將IL-17A融合蛋白和IL-17F融合蛋白分泌進(jìn)培養(yǎng)基中；(c)在非還原條件下，將培養(yǎng)基加入第一親和層析柱，以便所述IL-17A 融合蛋白結(jié)合第一親和層析柱；(d)在非還原條件下，從第一親和層析柱洗脫結(jié)合的蛋白； (e)在非還原條件下，將從步驟(d)得到的洗脫液加入第二親和層析柱，以便所述IL-17F 融合蛋白結(jié)合第二親和層析柱；和(f)在非還原條件下，從第二親和層析柱洗脫結(jié)合的蛋白，其中從步驟(f)得到的洗脫液含有IL-17A/IL-17F異二聚體形式的IL-17A融合蛋白和 IL-17F融合蛋白。在其它實(shí)施方案中，提供了該方法的變體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)這些不同方法分離的IL-17A/IL-17F異二聚體。


圖1顯示了在不同濃度(ng/ml)的IL-17A和/或IL_17F(x-軸)中培養(yǎng)的㈧ 原代人軟骨細(xì)胞或(B)原代豬軟骨細(xì)胞中的NF-K B-介導(dǎo)的報(bào)道物反式激活(相對(duì)螢光素酶活性；y_軸)。圖2顯示了從在培養(yǎng)基中(對(duì)照；□)或在有20ng/mlIL-17F存在下(IL-17F;·) 培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞收集的上清液中來(lái)自2位患者中的每一位(P1，P2 ；χ-軸) 的細(xì)胞因子(IL-6，IL-8，MCP-I 或 GRO- α ；χ-軸)的濃度(pg/ml ；y-軸)。圖3 顯示了從在培養(yǎng)基中(0ng/mlIL-17F;D)，或含有 lng/ml(·:)、3. 3. ng/ ml( !D)、lOng/ml(0)、或30ng/ml ( ■ ) IL-17F培養(yǎng)的原代鼠肺成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物收集的上清液中炎性細(xì)胞因子(IL-6，JE(CCL2)，KC ；χ-軸)的濃度(pg/ml ；y-軸)。圖4顯示了通過(guò)ELISA測(cè)得的遞增濃度的人IL-17F(左圖)或人IL-17A(右圖) (χ-軸)與(A) IL-I7R-IgG (上圖)或(B)IL-17RC-IgG (下圖)的結(jié)合(0D 450nm;y-軸)。 還標(biāo)注了每對(duì)受體/細(xì)胞因子相互作用的EC5tl值。圖5 顯示了在有(A)0.5ng/mlIL-17A(左圖)或(B)20ng/ml IL-17F(右圖)存在下，從單獨(dú)地(培養(yǎng)基；_)或含有遞增濃度(μ g/ml ；χ-軸)的IL-17R-IgG融合蛋白(hl7R. Fc ；^hIL-HRC-IgG 融合蛋白(hl7RH2. Fc ；■)、對(duì)照 IgG 蛋白(hlgGl ；▲)、抗 IL-17R抗體(ahIL17R ； □)或?qū)φ湛贵w(山羊IgG ； Δ )培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞收集的上清液中GRO- α 的濃度(pg/ml ；y_軸)。圖6顯示了在有遞增濃度(μ g/ml ；χ-軸)的下述6種抗IL-17F抗體之一存在下，抗-人IL-17F抗體的抑制IL-17F結(jié)合IL-17R的能力(0D 450nm ；y-軸)抗 IL-17F-01( □)，抗 IL-17F-02(-)，抗 IL-17F_03( ▲)，抗 IL-17F_05( )，抗 IL-17F-06 ( ·)和抗 IL-17F-07 ( Δ )。圖7顯示了在有遞增濃度(yg/ml;x-軸)的下述6種抗IL-17F抗體之一存在下，抗-人IL-17F抗體的抑制IL-17F結(jié)合IL-17RC的能力(0D450nm ；y-軸) 抗 IL-17F-01( □)，抗 IL-17F-02(-)，抗 IL-17F_03( ▲)，抗 IL-17F_05( )，抗 IL-17F-06 ( ·)和抗 IL-17F-07 ( Δ )。圖8顯示了從在20ng/ml IL-17F和遞增濃度(yg/mlj-軸)的(左圖)抗 IL-17F-01(aIL-17F-01),抗 IL-17F-02(aIL_17F_02)，或抗 IL-17F-03(aIL_17F_03) 和(右圖)抗 IL-17F-05(aIL-17F-05)，抗 IL-17F-06 (aIL_17F_06)，或抗 IL-17F-07 (aIL-17F-07)，或?qū)φ誱lgGl抗體中培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞收集的上清液中 GRO- α 的濃度(pg/ml ；y-軸)。圖9顯示了在下述條件下培養(yǎng)的豬原代軟骨細(xì)胞中的NF-KB-介導(dǎo)的報(bào)道物反式激活(相對(duì)螢光素酶活性；y-軸)僅培養(yǎng)基(空白)中，在IOOng/ ml IL-17A(IL-17A(100ng/ml))中，在 100ng/ml IL-17A 中且存在 IL_17R_IgG 融合蛋白(IL-17A+IL17R/Fc)，在 100ng/mlIL_17A 中且存在抗 IL-17F 抗體(IL17A+ 抗 IL17F)，在 100ng/mlIL-17A 中且存在對(duì)照小鼠 IgG(IL_17A+ 小鼠 IgG)，在 500ng/ mlIL-17F(IL-17F(500ng/ml))中，在 500ng/ml IL-17F 中且存在 IL_17R_IgG 融合蛋白 (IL-17F+IL17R/Fc)，在 500ng/ml IL-17F 中且存在抗 IL-17F 抗體(IL-17F+ 抗 IL17F)，或在500ng/ml IL-17F中且存在對(duì)照小鼠IgG(IL_17F+小鼠IgG)。圖10顯示了從在有20叫/!11111^17 (11^17 ;口)、同種型對(duì)照抗體(同種型Ab ； Θ)，抗IL-17F-01抗體(曰)，或抗IL-17F-07抗體(■)存在下培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞收集的上清液中來(lái)自2位患者中的每一位(P1，P2 ；χ-軸)的細(xì)胞因子(IL-6，IL-8， 或 GRO- α ；χ-軸)的濃度(pg/ml ；y-軸)。圖11顯示了使用對(duì)(A)IL_17A蛋白(包括IL-17A同二聚體和IL-17A異二聚體)、 (B)IL-17F 蛋白(包括 IL-17F 同二聚體和 IL-17F 異二聚體)或(C) IL-17A/IL-17F 異二聚體的檢測(cè)特異性的ELISA測(cè)定，對(duì)IL-17A同二聚體(IL-17A/A ；χ-軸)，IL-17F同二聚體(IL-17F/F ；χ-軸)，或 IL-17A/IL-17F 異二聚體(IL-17A/F ；χ-軸)的檢測(cè)(0D 450nm ； y-軸)°圖12顯示了在有珠子結(jié)合的抗-CD3抗體、遞增濃度的抗-CD^抗體 (抗-⑶沘(ng/ml) ；χ-軸)存在下、和缺少(□)或存在IL-21(_)或IL-23 ( 0 ),從經(jīng)歷初始激活的T細(xì)胞分離的培養(yǎng)基中(A) IL-17A或(B) IL-17F的濃度(生成的細(xì)胞因子 (pg/ml) ；y-軸)。圖13顯示了在下述刺激條件下(χ-軸)，從經(jīng)歷二次激活的T細(xì)胞分離的培養(yǎng)基中IL-17A( ■)或IL-17F( □)的濃度(生成的細(xì)胞因子(pg/ml) ；y-軸)僅 IL-23(IL-23)；僅IL-21 (IL-21)；珠子結(jié)合的抗-CD3抗體和抗-⑶觀抗體(CD3/Q^8)； IL-23，珠子結(jié)合的抗-⑶3抗體和抗-⑶觀抗體(IL-23/⑶；IL-21,珠子結(jié)合的抗-⑶3抗體和抗-⑶觀抗體(IL-21/⑶3/⑶28)；或培養(yǎng)基。圖14顯示了使用對(duì)(A)IL_17A蛋白(包括IL-17A同二聚體和IL-17A異二聚體)、 (B) IL-17F 蛋白(包括 IL-17F 同二聚體和 IL—17F 異二聚體)，或(C) IL-17A/IL-17F 異二聚體的檢測(cè)特異性的ELISA測(cè)定，對(duì)從經(jīng)歷初始激活(CMl)或再次激活(CM2)的T細(xì)胞得到的未稀釋的(純凈的)或稀釋的(1 10)培養(yǎng)基(χ-軸)中的IL-17A同二聚體、IL-17F 同二聚體、或IL-17A/IL-17F異二聚體的檢測(cè)(0D 450nm ；y-軸)。圖15顯示了用多克隆兔抗-人IL-17F抗體進(jìn)行的蛋白印跡分析，用于檢測(cè)來(lái)自從經(jīng)歷二次激活的T細(xì)胞得到的500 μ 1條件培養(yǎng)基的抗-人IL-17F-01免疫沉淀物。對(duì)照由如實(shí)施例5. 3所述制備的IL-17F同二聚體(第2泳道)或購(gòu)自R&D Systems (Minneapolis, MN)的IL-17A同二聚體(第5泳道)組成。第1泳道顯示了分子量標(biāo)準(zhǔn)。用箭頭指示了 IL-17A和IL-17F同二聚體和IL-17F/IL-17A異二聚體的位置。圖16是用生物素-綴合的山羊抗-人IL-17A抗體進(jìn)行蛋白印跡分析結(jié)果，用于檢測(cè)來(lái)自從經(jīng)歷二次激活的T細(xì)胞得到的500 μ 1條件培養(yǎng)基的抗-人IL-17F-02免疫沉淀物。對(duì)照(泳道2)由如實(shí)施例5. 3所述制備的IL-17F同二聚體組成。第1泳道顯示了分子量標(biāo)準(zhǔn)。用箭頭指示了 IL-17A和IL-17F同二聚體和IL-17F/IL-17A異二聚體的位置。圖17Α顯示了用抗IL-17F抗體免疫探測(cè)的抗IL-17F免疫沉淀物(泳道2_7)或抗 IL-17A免疫沉淀物(泳道8-10)。免疫沉淀物來(lái)自過(guò)表達(dá)IL-17A (泳道2和8)、IL-17F (泳道3和10)、IL-17A和IL-17F (泳道4和9)、純化的IL-17A同二聚體(泳道5)、或純化的 IL-17F同二聚體(泳道6和7)的COS細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(CM)。對(duì)照(“A/A純化的，，，泳道5和"F/F純化的，，，泳道6-7)由實(shí)施例5. 4所述純化的重組IL-17A和IL-17F同二聚體組成。分子量標(biāo)準(zhǔn)顯示在泳道1。用箭頭指示了 IL-17A和IL-17F同二聚體和IL-17F/ IL-17A異二聚體的位置。圖17B顯示用抗IL-17A抗體免疫探測(cè)的抗IL-17A免疫沉淀物(泳道2_4)或抗 IL-17F免疫沉淀物(泳道5-7)。免疫沉淀物來(lái)自過(guò)表達(dá)IL-17A (泳道3和5)、IL-17F (泳道2和7)，或IL-17A和IL-17F (泳道4和6)的COS細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(CM)。分子量標(biāo)準(zhǔn)顯示在泳道1。用箭頭指示了 IL-17A和IL-17F同二聚體和IL-17F/IL-17A異二聚體的位置。圖18是顯示純化基本上不含有IL-17A和IL-17F同二聚體的重組IL-17F/IL-17A 異二聚體的方法的簡(jiǎn)圖。該方法采用具有2種不同親和標(biāo)記物的IL-17A和IL-17F，并使用 2個(gè)分開(kāi)的且連續(xù)的親和層析柱來(lái)分離IL-17F/IL-17A異二聚體。圖19A表明，類(lèi)似于IL_17A(^)和IL_17F(D)同二聚體，重組的純化的IL-17F/ IL-17A異二聚體(X)會(huì)刺激BJ細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中的GRO-α水平(pg/ml)。圖19B 表明，用抗IL-17A抗體(■)或抗IL-17A與抗IL-17F抗體的組合(▲)共處理BJ培養(yǎng)物，會(huì)消除11^-17 /11^-174異二聚體對(duì)61 0-(1水平的刺激，但是單獨(dú)的IL-17F抗體(口) 不能。對(duì)照由缺少I(mǎi)L-17F和IL-17A抗體的培養(yǎng)基提供的培養(yǎng)物組成(X)。圖20的表總結(jié)了通過(guò)消化IL-17F同二聚體、IL-17A同二聚體、和IL-17F/IL-17A 異二聚體制備的胰蛋白酶消化的肽質(zhì)量的MALDI-T0F質(zhì)譜數(shù)據(jù)。該表的第1列顯示了分析的肽片段的來(lái)源，第2列(結(jié)構(gòu))顯示了肽片段序列，第3列(MW Cal)顯示了片段的計(jì)算分子量，第4列顯示了片段的計(jì)算質(zhì)荷比(m/z值)(計(jì)算值)，第5列顯示了通過(guò)質(zhì)譜測(cè)得的實(shí)際質(zhì)荷比(m/z值)(實(shí)測(cè)值)。圖21表明，抗-人IL-17F抗體可以部分地抑制靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物IL-17F的生物活性。圖21A和21B表明，用人或靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(獼猴)IL-17F刺激的BJ細(xì)胞會(huì)反應(yīng)于遞增水平的IL-17F，表現(xiàn)出提高水平的GRO- α。圖21Α表明，抗IL-17F-01 ( □)和抗 IL-17F-07(X)抗體會(huì)降低人IL-17F( )的刺激GRO-α水平的能力。類(lèi)似地，圖21Β表明，抗IL-17F-01 (口 )和抗IL-17F-07(X)抗體會(huì)降低靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物IL_17F( )的刺激 GRO-α水平的能力，盡管達(dá)到比該抗體減少人IL-17F生物活性更低的程度。圖22表明，IL-17F處理會(huì)增加ADAMTS-4(聚集蛋白聚糖酶1)在從人供體得到的軟骨細(xì)胞中的表達(dá)，抗IL-17F抗體處理會(huì)消除該刺激。用250ng/ml IL-17F, 250ng/ mlIL-17F 和 25 μ g/ml 抗 IL-17F，25 μ g/ml 抗 IL-17F，250ng/mlIL_17F 和 25 μ g/ml 對(duì)照 IgGl，或25 μ g/ml對(duì)照IgGl (χ-軸)處理培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞，通過(guò)實(shí)時(shí)PCR測(cè)量聚集蛋白聚糖酶1的轉(zhuǎn)錄物水平(表達(dá)為T(mén)AQMAN 單位；y-軸)。GAPDH表達(dá)水平用作標(biāo)準(zhǔn)。圖23表明，用針對(duì)IL-17R和IL-17RC的轉(zhuǎn)錄物的siRNA處理BJ細(xì)胞，會(huì)減少 IL-17F和IL-17A的增加GRO- α水平的能力。圖23Α =Taqman =用IL-17R的siRNA處理的細(xì)胞中，IL-17R轉(zhuǎn)錄物水平的％減少；IL-17F =用IL-17R的siRNA處理的細(xì)胞中，IL-17F 刺激GRO-α水平的能力的％減少；IL-17A =用IL-17R的siRNA處理的細(xì)胞中，IL-17A刺激GRO-a水平的能力的％減少。圖2 表明，用針對(duì)IL-17RC的轉(zhuǎn)錄物的siRNA處理BJ 細(xì)胞，會(huì)減少I(mǎi)L-17F禾口 IL-17A的增加GRO-a水平的能力。Taqman =用IL-17RC的siRNA 處理的細(xì)胞中，IL-17RC轉(zhuǎn)錄物水平的％減少；IL-17F =用IL-17RC的siRNA處理的細(xì)胞中，11^-17 刺激61 0-0水平的能力的％減少；IL-17A =用IL-17RC的siRNA處理的細(xì)胞中，11^-174刺激61 0-(1水平的能力的％減少。圖23C公開(kāi)了本發(fā)明的幾種siRNA分子(SEQ ID NO :17-32)，它們靶定發(fā)明的mRNA多核苷酸(即IL-17R和IL-17RC)。圖M顯示了來(lái)自銀屑病患者的48對(duì)組織活檢樣品中IL-17F和IL-17A轉(zhuǎn)錄物表達(dá)的平均倍數(shù)變化(有病變的/無(wú)病變的(不受影響的)組織)。銀屑病病變組織中 IL-17A和IL-17F轉(zhuǎn)錄物水平都比不受影響的組織增加。配對(duì)t檢驗(yàn)的P-值如下IL_17A ρ = 2. 8xl0_13，IL-17F ρ = 1. 1χ1θΛ圖25顯示了來(lái)自潰瘍性結(jié)腸炎(UC)患者(口)(12對(duì))或克隆氏病(CD)患者 (■ ) (16對(duì))的成對(duì)組織活檢樣品中IL-17F和IL-17A轉(zhuǎn)錄物表達(dá)的平均倍數(shù)變化(受影響的/不受影響的組織)。在2組IBD樣品中，受影響的組織中IL-17A和IL-17F轉(zhuǎn)錄物水平都比不受影響的組織增加。配對(duì)t檢驗(yàn)的P-值如下:IL-17A(UC),p = 0. 309 ； IL-17A (CD)， P = O. 069 ； IL-17F (UC)，ρ = 0. 406 ； IL-17F (CD)，ρ = 0. 206。圖沈顯示了 IL-17F的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色。在用完全弗氏佐劑乳化的IOOyg 卵白蛋白免疫的C57BL/6小鼠的(淋巴結(jié))LN細(xì)胞上，進(jìn)行IL-17F染色。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行⑶4 表面，固定，透化，并用抗-IgGl同種型對(duì)照或大鼠抗-鼠IL-17F(克隆15-1)染色。數(shù)字指明了陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。
具體實(shí)施例方式白介素-17F(IL_17F)是一種細(xì)胞因子，它屬于IL-17家族蛋白，并誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，例如，IL-6，IL-8, GM-CSF, G-CSF, GRO-α，MCP-I, IL-I β， TNF-α，TGF-β，等。IL-17F的表達(dá)與中性粒細(xì)胞增多和多種自身免疫病相關(guān)聯(lián)(Bettelli 和Kuchroo，同上)。例如，IL-17F與關(guān)節(jié)軟骨的增加的蛋白聚糖分解和減少的蛋白聚糖合成(Hymowitz，同上)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫(Langrish，同上)、變態(tài)反應(yīng)和哮喘反應(yīng)(Kawaguchi，同上)和炎性腸病(Gurney，同上)相關(guān)。因而，認(rèn)為IL-17F信號(hào)傳遞參與病癥，包括但不限于，炎性病癥，例如自身免疫病(例如，關(guān)節(jié)炎(包括類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎)、銀屑病，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，多發(fā)性硬化)、呼吸系統(tǒng)疾病(例如，C0PD，囊性纖維化，哮喘，變態(tài)反應(yīng))、移植排斥(包括實(shí)體器官移植排斥)、和炎性腸病(例如，潰瘍性結(jié)腸炎，克隆氏病)。作為本發(fā)明的一部分，發(fā)明人已經(jīng)通過(guò)證實(shí)對(duì)施用IL-17F的下述反應(yīng)，證實(shí)了 IL-17F參與炎性病癥例如，中性粒細(xì)胞流入腹膜(實(shí)施例1. 1)，炎性細(xì)胞因子的起始轉(zhuǎn)錄因子的激活與原代軟骨細(xì)胞增加分泌炎性細(xì)胞因子相關(guān)聯(lián)(實(shí)施例1.2)，與肺成纖維細(xì)胞增加分泌炎性細(xì)胞因子相關(guān)聯(lián)(實(shí)施例1.3)，與原代人軟骨細(xì)胞增加的聚集蛋白聚糖酶水平相關(guān)聯(lián)(實(shí)施例7)。發(fā)明人還已經(jīng)確認(rèn)，IL-17F和IL-17A兩者都可以參與自身免疫關(guān)節(jié)炎(實(shí)施例7)、銀屑病(實(shí)施例9)和炎性腸病(IBD)(實(shí)施例9)。發(fā)明人還已經(jīng)將 IL-17R和IL-17RC鑒別為IL-17F的受體(實(shí)施例2)，從而提供了抑制IL-17F信號(hào)傳遞途徑的新靶。發(fā)明人還已經(jīng)制備了抗IL-17F抗體，并表征了每種抗體的結(jié)合特異性、親和力和抑制IL-17F信號(hào)傳遞的能力，即IL-17F生物活性(實(shí)施例3和5)。在一個(gè)實(shí)施方案中， 抗體有助于表征IL-17R和/或IL-17RC識(shí)別可能需要的IL-17F表位；即5/6的鼠抗-人 IL-17F抗體能干擾IL-17F與IL-17R的結(jié)合，2/5還能干擾IL-17F與IL-17RC的結(jié)合。發(fā)明人還已經(jīng)證實(shí)了有些這樣的抗體的抑制(即降低、限制、阻斷或減少)IL-17F生物活性的能力，例如，IL-17F-介導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子的起始轉(zhuǎn)錄因子的激活，和隨后的原代成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞分泌IL-17F-介導(dǎo)的細(xì)胞因子(實(shí)施例4)。本文還公開(kāi)了抑制性多核苷酸， 其通過(guò)IL-17R和IL-17RC降低IL-17A和IL-17F信號(hào)傳遞(實(shí)施例8)。發(fā)明人還已經(jīng)證實(shí)了 IL-21和IL-17F之間的直接關(guān)系，即IL-21通過(guò)激活的T細(xì)胞增強(qiáng)IL-17A和IL-17F 的生產(chǎn)的能力。因而，推理出，IL-17F信號(hào)傳遞的抑制還可能抑制至少一種與IL-21結(jié)合并激活I(lǐng)L-21R相關(guān)的作用，例如，抑制IL-17F信號(hào)傳遞的方法可以用于治療IL-17F相關(guān)病癥和/或與IL-21結(jié)合并激活I(lǐng)L-21R相關(guān)的病癥的方法中。發(fā)明人還從細(xì)胞因子的天然來(lái)源中首次分離了 IL-17A和IL-17F。發(fā)明人還已經(jīng)證實(shí)和純化了新的IL-17A/IL-17F 異二聚體(例如，分別在T細(xì)胞和HEK-293和COS細(xì)胞中)，并已經(jīng)證實(shí)，異二聚體會(huì)轉(zhuǎn)導(dǎo) IL-17F信號(hào)傳遞，例如，通過(guò)誘導(dǎo)GRO-α水平的表達(dá)(實(shí)施例5)。因而，發(fā)明人已經(jīng)提供了異二聚體，作為抑制IL-17F-信號(hào)傳遞途徑和/或治療炎性病癥和/或與IL-21結(jié)合并激活I(lǐng)L-21R相關(guān)的病癥的新靶。這樣，本發(fā)明提供了 IL-17F信號(hào)傳遞拮抗劑(例如，IL-17F，IL-17R、和/或 IL-17RC抑制性多核苷酸；可溶的IL-17R和/或IL-17RC多肽(包括片段(例如，IL-17F 結(jié)合片段)和/或其融合蛋白)；抑制性抗IL-17F、抗IL-17R、或IL-17RC抗體；和/或拮抗性小分子)，它們可以用于體內(nèi)抑制IL-17F-介導(dǎo)的(包括IL-17F同二聚體-和IL-17A/ IL-17F異二聚體介導(dǎo)的)炎癥反應(yīng)，因此，它們可以用于診斷、預(yù)后、監(jiān)測(cè)和/或治療與增強(qiáng)的IL-17F信號(hào)傳遞相關(guān)的病癥，即IL-17F相關(guān)病癥和/或與IL-21結(jié)合并激活I(lǐng)L-21R相關(guān)的病癥。新的IL-17A/IL-17F異二聚體的鑒別和分離表明，與IL-17F信號(hào)傳遞相關(guān)的病癥可能由IL-17F同二聚體和/或IL-17F異二聚體介導(dǎo)。因而，本文使用的術(shù)語(yǔ)“IL-17F” 在適當(dāng)時(shí)指IL-17F同二聚體或IL-17A/IL-17F異二聚體，例如，IL-17F信號(hào)傳遞途徑包括可能包含IL-17F同二聚體和IL-17A/IL-17F異二聚體中的任一種或兩種的信號(hào)傳遞途徑。
因此，本申請(qǐng)?zhí)峁┝?IL-17F信號(hào)傳遞相關(guān)的多核苷酸和多肽，包括IL-17R和 IL-17RC多核苷酸和多肽。本發(fā)明還提供了抗體，即完整抗體及其抗原結(jié)合片段，它們結(jié)合 IL-17F，更具體地人IL-17F，包括但不限于，IL-17F同二聚體和IL-17A/IL-17F異二聚體。 在一個(gè)實(shí)施方案中，抗IL-17F抗體抑制或拮抗至少一種IL-17F相關(guān)的(例如，IL-17F同二聚體和/或IL-17A/IL-17F異二聚體)活性。例如，抗IL-17F抗體可以結(jié)合IL-17F和干擾，例如阻斷，IL-17F和IL-17F受體復(fù)合物之間的相互作用，例如，包含IL-17R和/或 IL-17RC的復(fù)合物。因而，本發(fā)明的抗體可以用于檢測(cè)和任選地抑制(例如，降低、限制、阻斷或減少)IL-17F生物活性，例如，IL-17F和IL-17F受體復(fù)合物或其亞基之間的結(jié)合。因而，本發(fā)明的抗IL-17F抗體可以用于診斷、預(yù)后、監(jiān)測(cè)和/或治療或預(yù)防與IL-17F信號(hào)傳遞相關(guān)的病癥和/或與IL-21結(jié)合并激活I(lǐng)L-21R相關(guān)的病癥。IL-17F, IL-17R和IL-17RC的多核苷酸和多肽本發(fā)明提供了 IL-17F信號(hào)傳遞途徑的其它表征，即確定IL-17R和/或IL-17RC作為IL-17F受體，說(shuō)明了使用抑制性分子(例如，抗體，受體融合蛋白和siRNA)干擾IL-17F 結(jié)合IL-17R和/或IL-17RC的作用，并純化了 IL-17A/IL-17F異二聚體。這樣，本發(fā)明涉及IL-17F，IL-17R和IL-17RC多核苷酸和多肽，包括抑制性IL-17F，IL-17R和IL-17RC多核苷酸和多肽。IL-17F核苷酸和氨基酸序列是本領(lǐng)域已知的，并已經(jīng)提供。人IL-17F的核苷酸序列顯示為SEQ ID N0:1。該核苷酸序列編碼的全長(zhǎng)IL-17F蛋白的氨基酸序列顯示為SEQ ID NO :2。成熟IL-17F的氨基酸序列對(duì)應(yīng)著從SEQ ID NO 2的約氨基酸31處開(kāi)始的蛋白 (參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0/102，080，在本文中整體引作參考)。IL-17A核苷酸和氨基酸序列是本領(lǐng)域已知的，并已經(jīng)提供。人IL-17A的核苷酸序列顯示為SEQ ID NO :3，它包含一個(gè)聚(A)尾。與該核苷酸序列相對(duì)應(yīng)的全長(zhǎng)IL-17A蛋白的氨基酸序列顯示為SEQ IDNO :4。IL-17R核苷酸和氨基酸序列是本領(lǐng)域已知的，并已經(jīng)提供。人IL-17R的核苷酸序列顯示為SEQ ID NO :5，它包含一個(gè)聚(A)尾。與該核苷酸序列相對(duì)應(yīng)的全長(zhǎng)IL-17R蛋白的氨基酸序列顯示為SEQ IDNO :6。IL-17RC核苷酸和氨基酸序列是本領(lǐng)域已知的，并已經(jīng)提供。包含聚㈧尾的幾種人IL-17RC多核苷酸的核苷酸序列顯示為SEQ ID NO :7，9，11，13和15。與這些核苷酸序列相對(duì)應(yīng)的幾種全長(zhǎng)人IL-17RC蛋白的氨基酸序列顯示為SEQ ID NO :8，10，12，14和16。本發(fā)明的核酸可以包含DNA或RNA，且可以是完全或部分地合成的。本文所述的核苷酸序列包括具有指定序列的DNA分子(或其補(bǔ)體)，且包括具有指定序列的RNA分子，其中U置換為T(mén)，除非上下文另有要求。本發(fā)明的分離的多核苷酸可以用作雜交探針和引物，用于鑒別和分離具有與本文公開(kāi)的多核苷酸的編碼序列相同或類(lèi)似的序列的核酸。用于鑒別和分離核酸的雜交方法包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) ,DNA印跡雜交、原位雜交和RNA印跡雜交，且是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。雜交反應(yīng)可以在不同嚴(yán)格性條件下進(jìn)行。雜交反應(yīng)的嚴(yán)格性包括任意兩種核酸分子彼此雜交的難度。優(yōu)選地在降低的嚴(yán)格條件，更優(yōu)選嚴(yán)格條件，最優(yōu)選高度嚴(yán)格的條件下，每個(gè)雜交多核苷酸與它的對(duì)應(yīng)多核苷酸雜交。嚴(yán)格條件的實(shí)例顯示在下面的表1中高度嚴(yán)格的條件是至少像例如條件A-F —樣嚴(yán)格的那些；嚴(yán)格的條件至少像例如條件G-L — 樣嚴(yán)格；降低的嚴(yán)格條件至少象例如條件M-R —樣嚴(yán)格。表1.嚴(yán)格條件
權(quán)利要求
1.IL-17F信號(hào)傳遞拮抗劑在制備用于治療具有患與增強(qiáng)的IL-17F信號(hào)傳遞相關(guān)的病癥的危險(xiǎn)或診斷出患有這樣的病癥的受試者的藥物中的用途。
2.權(quán)利要求1的用途，其中IL-17F信號(hào)傳遞是由IL-17F同二聚體、IL-17F異二聚體、 或IL-17F同二聚體和IL-17F異二聚體兩者介導(dǎo)。
3.權(quán)利要求2的用途，其中IL-17F信號(hào)傳遞至少部分地是由IL-17F異二聚體介導(dǎo)，且其中所述IL-17F異二聚體是IL-17A/IL-17F。
4.權(quán)利要求1的用途，其中所述IL-17F信號(hào)傳遞拮抗劑選自IL-17F抑制性多核苷酸，IL-17R抑制性多核苷酸，IL-17RC抑制性多核苷酸，包含IL-17R或其IL-17F結(jié)合片段的可溶多肽，包含IL-17RC或其IL-17F結(jié)合片段的可溶多肽，抑制性抗IL-17F抗體，抑制性抗IL-17R抗體，抑制性抗IL-17RC抗體和拮抗性小分子。
5.權(quán)利要求4的用途，其中所述IL-17F信號(hào)傳遞拮抗劑是IL-17R抑制性多核苷酸。
6.權(quán)利要求4的用途，其中所述IL-17F信號(hào)傳遞拮抗劑是IL-17RC抑制性多核苷酸。
7.權(quán)利要求5的用途，其中所述抑制性多核苷酸是選自SEQIDNO :17- 所述的核苷酸序列的siRNA。
8.權(quán)利要求6的用途，其中所述抑制性多核苷酸是選自SEQIDNO :25-32所述的核苷酸序列的siRNA。
9.權(quán)利要求4的用途，其中所述IL-17F信號(hào)傳遞拮抗劑是包含IL-17R或其IL-17F結(jié)合片段的可溶多肽。
10.權(quán)利要求4的用途，其中所述IL-17F信號(hào)傳遞拮抗劑是包含IL-17RC或其IL-17F 結(jié)合片段的可溶多肽。
11.權(quán)利要求9的用途，其中所述可溶多肽具有SEQID NO :34所述的氨基酸序列。
12.權(quán)利要求10的用途，其中所述可溶多肽具有SEQID NO :35所述的氨基酸序列。
13.權(quán)利要求4的用途，其中所述IL-17F抑制性多核苷酸包含SEQIDNO :1所述的核苷酸序列、或與SEQ ID NO 1所述的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，或SEQ ID NO 1的片段， 或其RNA等同物，且其中所述抑制性多核苷酸在細(xì)胞中的表達(dá)，導(dǎo)致IL-17F的表達(dá)降低。
14.權(quán)利要求4的用途，其中所述IL-17R抑制性多核苷酸包含SEQIDNO :5所述的核苷酸序列、或與SEQ ID NO :5所述的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，或SEQ ID NO :5的片段， 或其RNA等同物，且其中所述抑制性多核苷酸在細(xì)胞中的表達(dá)，導(dǎo)致降低的IL-17R表達(dá)。
15.權(quán)利要求4的用途，其中所述IL-17RC抑制性多核苷酸包含選自SEQID NO :7、SEQ ID NO :9, SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO :13 禾口 SEQID NO :15 所述的核苷酸序列，或與選自 SEQ ID NO 7,SEQ ID NO :9、SEQ ID NO =IUSEQ ID NO :13 禾口 SEQ ID NO 15 所述的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，或選自 SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :13 禾口 SEQ ID NO :15所述的核苷酸序列的片段，或其RNA等同物，且其中所述抑制性多核苷酸在細(xì)胞中的表達(dá)，導(dǎo)致降低的IL-17RC表達(dá)。
16.權(quán)利要求1的用途，其中與增強(qiáng)的IL-17F信號(hào)傳遞相關(guān)的病癥是炎性病癥。
17.權(quán)利要求16的用途，其中所述炎性病癥選自自身免疫病，呼吸系統(tǒng)疾病和炎性腸病。
18.權(quán)利要求17的用途，其中所述炎性病癥是自身免疫病，所述自身免疫病選自關(guān)節(jié)炎，銀屑病，系統(tǒng)性紅斑狼瘡和多發(fā)性硬化。
19.權(quán)利要求18的用途，其中所述自身免疫病是類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。
20.權(quán)利要求17的用途，其中所述炎性病癥是呼吸系統(tǒng)疾病，所述呼吸系統(tǒng)疾病是囊性纖維化。
21.權(quán)利要求17的用途，其中所述炎性病癥是炎性腸病。
22.權(quán)利要求1的用途，其中所述藥物與治療有效量的至少一種其它治療劑聯(lián)合。
23.權(quán)利要求22的用途，其中所述至少一種其它治療劑選自細(xì)胞因子抑制劑，生長(zhǎng)因子抑制劑，免疫抑制劑，抗炎劑，代謝抑制劑，酶抑制劑，細(xì)胞毒性劑和細(xì)胞抑制劑。
24.權(quán)利要求22的用途，其中所述至少一種其它治療劑選自TNF拮抗劑，抗TNF齊IJ， IL-12拮抗劑，IL-15拮抗劑，IL-17拮抗劑，IL-18拮抗劑，IL-22拮抗劑，T細(xì)胞消除劑，B 細(xì)胞消除劑，環(huán)孢菌素，Π -506，CCI-779，依那西普，英夫單抗，利妥?，?，阿達(dá)木單抗，潑尼松龍，硫唑嘌呤，金，柳氮磺胺吡啶，氯喹，羥氯喹，米諾環(huán)素，阿那白滯素，阿巴他塞，甲氨蝶呤，來(lái)氟米特，雷帕霉素，雷帕霉素類(lèi)似物，Cox-2抑制劑，cPLA2抑制劑，NSAIDs, p38抑制劑，B7. 1、B7. 2、ICOSL、ICOS和/或CD28的拮抗劑和CTLA4激動(dòng)劑。
25.篩選能拮抗IL-17F信號(hào)傳遞的測(cè)試化合物的方法，其包含下述步驟使含有IL-17F和IL-17RC的樣品接觸化合物；和確定樣品中IL-17F與IL-17RC的相互作用相對(duì)于未接觸該化合物的樣品中IL-17F與 IL-17RC的相互作用是否降低，由此，接觸該化合物的樣品中IL-17F與IL-17RC的相互作用的降低，將該化合物鑒別為能抑制IL-17F與IL-17RC的相互作用且能拮抗IL-17F信號(hào)傳遞的化合物。
26.IL-17F信號(hào)傳遞基因產(chǎn)物在制備用于診斷受試者中與增強(qiáng)的IL-17F信號(hào)傳遞相關(guān)的病癥的試劑盒中的用途。
27.權(quán)利要求沈的用途，其中IL-17F信號(hào)傳遞是由IL-17F同二聚體、IL-17F異二聚體、或IL-17F同二聚體和IL-17F異二聚體兩者介導(dǎo)。
28.權(quán)利要求27的用途，其中IL-17F信號(hào)傳遞至少部分地是由IL-17F異二聚體介導(dǎo)， 且其中所述IL-17F異二聚體是IL-17A/IL-17F。
29.權(quán)利要求沈的用途，其中所述病癥選自自身免疫病，呼吸系統(tǒng)疾病和炎性腸病。
30.權(quán)利要求四的用途，其中所述IL-17F信號(hào)傳遞基因產(chǎn)物是IL-17F基因產(chǎn)物。
31.權(quán)利要求四的用途，其中所述IL-17F信號(hào)傳遞基因產(chǎn)物是IL-17R基因產(chǎn)物。
32.權(quán)利要求四的用途，其中所述IL-17F信號(hào)傳遞基因產(chǎn)物是IL-17RC基因產(chǎn)物。
33.IL-17F信號(hào)傳遞拮抗劑在制備用于抑制細(xì)胞群體或受試者中NF-kB的激活 NF-kB反應(yīng)性啟動(dòng)子的能力的藥物中的用途。
34.權(quán)利要求33的用途，其中所述IL-17F信號(hào)傳遞拮抗劑選自IL_17F抑制性多核苷酸，IL-17R抑制性多核苷酸，IL-17RC抑制性多核苷酸，包含IL-17R或其IL-17F結(jié)合片段的可溶多肽，包含IL-17RC或其IL-17F結(jié)合片段的可溶多肽，抑制性抗IL-17F抗體，抑制性抗IL-17R抗體，抑制性抗IL-17RC抗體和拮抗性小分子。
35.IL-17F信號(hào)傳遞拮抗劑在制備用于抑制細(xì)胞群體或受試者中IL-17F生物活性的藥物中的用途。
36.權(quán)利要求35的用途，其中所述IL-17F生物活性是由IL-17F同二聚體、IL-17F異二聚體、或IL-17F同二聚體和IL-17F異二聚體兩者介導(dǎo)。
37.權(quán)利要求36的用途，其中所述IL-17F生物活性至少部分地是由IL-17F異二聚體介導(dǎo)，且其中所述IL-17F異二聚體是IL-17A/IL-17F。
38.權(quán)利要求35的用途，其中所述IL-17F信號(hào)傳遞拮抗劑選自IL_17F抑制性多核苷酸，IL-17R抑制性多核苷酸，IL-17RC抑制性多核苷酸，包含IL-17R或其IL-17F結(jié)合片段的可溶多肽，包含IL-17RC或其IL-17F結(jié)合片段的可溶多肽，抑制性抗IL-17F抗體，抑制性抗IL-17R抗體，抑制性抗IL-17RC抗體和拮抗性小分子。
39.權(quán)利要求35的用途，其中所述IL-17F生物活性選自中性粒細(xì)胞分化、中性粒細(xì)胞募集和細(xì)胞因子誘導(dǎo)。
40.藥物組合物，其包含IL-17F信號(hào)傳遞拮抗劑和藥學(xué)上可接受的載體。
41.權(quán)利要求40的藥物組合物，其中所述IL-17F信號(hào)傳遞拮抗劑拮抗IL-17F同二聚體、IL-17F異二聚體、或IL-17F同二聚體和IL-17F異二聚體兩者。
42.權(quán)利要求40的藥物組合物，其中所述IL-17F信號(hào)傳遞拮抗劑選自IL_17F抑制性多核苷酸，IL-17R抑制性多核苷酸，IL-17RC抑制性多核苷酸，包含IL-17R或其IL-17F 結(jié)合片段的可溶多肽，包含IL-17RC或其IL-17F結(jié)合片段的可溶多肽，抑制性抗IL-17F抗體，抑制性抗IL-17R抗體，抑制性抗IL-17RC抗體和拮抗性小分子。
43.疫苗佐劑，其包含IL-17F信號(hào)傳遞拮抗劑和選自下述的抗原自身抗原，變應(yīng)原， 同種異體抗原及其片段。
44.權(quán)利要求43的疫苗佐劑，其中所述IL-17F信號(hào)傳遞拮抗劑拮抗IL-17F同二聚體、 IL-17F異二聚體、或IL-17F同二聚體和IL-17F異二聚體兩者。
45.權(quán)利要求43的疫苗佐劑，其中所述IL-17F信號(hào)傳遞拮抗劑選自IL_17F抑制性多核苷酸，IL-17R抑制性多核苷酸，IL-17RC抑制性多核苷酸，包含IL-17R或其IL-17F結(jié)合片段的可溶多肽，包含IL-17RC或其IL-17F結(jié)合片段的可溶多肽，抑制性抗IL-17F抗體， 抑制性抗IL-17R抗體，抑制性抗IL-17RC抗體和拮抗性小分子。
46.分離的抗體，其能特異性地結(jié)合SEQID NO :6所述的氨基酸序列。
47.分離的抗體，其能特異性地結(jié)合選自SEQID N0:8、SEQ IDNO :10、SEQ ID N0:12、 SEQ ID NO :14 JPSEQ ID NO :16所述氨基酸序列的氨基酸序列。
48.權(quán)利要求46的抗體，其中所述抗體拮抗IL-17F信號(hào)傳遞。
49.權(quán)利要求47的抗體，其中所述抗體拮抗IL-17F信號(hào)傳遞。
50.分離的抗體，其能特異性地結(jié)合IL-17F蛋白。
51.權(quán)利要求50的抗體，其中所述IL-17F蛋白源自人或靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物。
52.權(quán)利要求50的抗體，其中所述IL-17F蛋白是多聚體。
53.權(quán)利要求52的抗體，其中所述IL-17F蛋白是IL-17F同二聚體或IL-17F異二聚體。
54.權(quán)利要求53的抗體，其中所述IL-17F蛋白是異二聚體，且其中所述IL-17F異二聚體是 IL-17A/IL-17F。
55.權(quán)利要求50的抗體，其中所述抗體抑制IL-17F生物活性。
56.抑制至少一種與IL-21信號(hào)傳遞相關(guān)的活性的方法，其包含拮抗IL-17F信號(hào)傳遞。
57.抑制至少一種與IL-23信號(hào)傳遞相關(guān)的活性的方法，其包含拮抗IL-17F信號(hào)傳遞。
58.權(quán)利要求56的方法，其中IL-17F信號(hào)傳遞是由IL-17F同二聚體、IL-17F異二聚體、或IL-17F同二聚體和IL-17F異二聚體兩者介導(dǎo)。
59.權(quán)利要求58的方法，其中IL-17F信號(hào)傳遞至少部分地是由IL-17F異二聚體介導(dǎo)， 且其中所述IL-17F異二聚體是IL-17A/IL-17F。
60.純化天然IL-17A蛋白的方法，其包含a)激活培養(yǎng)基中的T細(xì)胞；和b)從培養(yǎng)基中免疫沉淀IL-17A蛋白。
61.權(quán)利要求60的方法，其中所述IL-17A蛋白是IL-17A同二聚體、IL-17A異二聚體、 或IL-17A同二聚體和IL-17A異二聚體兩者。
62.權(quán)利要求61的方法，其中所述IL-17A蛋白是異二聚體，且其中所述IL-17A異二聚體是 IL-17A/IL-17F。
63.權(quán)利要求60的方法，其中所述培養(yǎng)基包含IL-21。
64.純化天然IL-17F蛋白的方法，其包含a)激活培養(yǎng)基中的T細(xì)胞；和b)從培養(yǎng)基中免疫沉淀IL-17F蛋白。
65.權(quán)利要求64的方法，其中所述IL-17A蛋白是IL-17A同二聚體、IL-17A異二聚體、 或IL-17A同二聚體和IL-17A異二聚體兩者。
66.權(quán)利要求65的方法，其中所述IL-17F蛋白是異二聚體，且其中所述IL-17F異二聚體是 IL-17A/IL-17F。
67.權(quán)利要求64的方法，其中所述培養(yǎng)基包含IL-21。
68.分離的IL-17F蛋白，其中所述IL-17F蛋白是IL-17F同二聚體或IL-17F異二聚體。
69.權(quán)利要求68的IL-17F蛋白，其中所述IL-17F蛋白分離自天然來(lái)源。
70.權(quán)利要求69的IL-17F蛋白，其中所述天然來(lái)源是至少一個(gè)T細(xì)胞。
71.分離的IL-17A蛋白，其中所述IL-17A蛋白是IL-17A同二聚體或IL-17A異二聚體。
72.權(quán)利要求71的IL-17A蛋白，其中所述IL-17A蛋白分離自天然來(lái)源。
73.權(quán)利要求72的IL-17A蛋白，其中所述天然來(lái)源是至少一個(gè)T細(xì)胞。
74.IL-17F拮抗劑在制備用于抑制至少一種與IL-17A信號(hào)傳遞相關(guān)的活性的藥物中的用途。
75.分離基本上不含有IL-17A同二聚體和IL-17F同二聚體的IL-17A/IL-17F異二聚體的方法，其包含a)在培養(yǎng)基培養(yǎng)的宿主細(xì)胞中表達(dá)IL-17A融合蛋白和IL-17F融合蛋白，其中所述IL-17A融合蛋白包含融合到第一親和標(biāo)記物上的IL-17A蛋白或其片段，且其中所述 IL-17F融合蛋白包含融合到第二親和標(biāo)記物上的IL-17F蛋白或其片段；b)使宿主細(xì)胞將IL-17A融合蛋白和IL-17F融合蛋白分泌進(jìn)培養(yǎng)基中；c)在非還原條件下，將培養(yǎng)基加入第一親和層析柱，以便所述IL-17A融合蛋白結(jié)合第一親和層析柱；d)在非還原條件下，從第一親和層析柱洗脫結(jié)合的蛋白；e)在非還原條件下，將從步驟d)得到的洗脫液加入第二親和層析柱，以便所述IL-17F融合蛋白結(jié)合第二親和層析柱；和f)在非還原條件下，從第二親和層析柱洗脫結(jié)合的蛋白，其中從步驟f)得到的洗脫液含有IL-17A/IL-17F異二聚體形式的IL-17A融合蛋白和 IL-17F融合蛋白。
76.分離基本上不含有IL-17A同二聚體和IL-17F同二聚體的IL-17A/IL-17F異二聚體的方法，其包含a)在培養(yǎng)基培養(yǎng)的宿主細(xì)胞中表達(dá)IL-17A融合蛋白和IL-17F融合蛋白，其中所述IL-17F融合蛋白包含融合到第一親和標(biāo)記物上的IL-17F蛋白或其片段，且其中所述 IL-17A融合蛋白包含融合到第二親和標(biāo)記物上的IL-17A蛋白或其片段；b)使宿主細(xì)胞將IL-17A融合蛋白和IL-17F融合蛋白分泌進(jìn)培養(yǎng)基中；c)在非還原條件下，將培養(yǎng)基加入第一親和層析柱，以便所述IL-17F融合蛋白結(jié)合第一親和層析柱；d)在非還原條件下，從第一親和層析柱洗脫結(jié)合的蛋白；e)在非還原條件下，將從步驟d)得到的洗脫液加入第二親和層析柱，以便所述IL-17A 融合蛋白結(jié)合第二親和層析柱；和f)在非還原條件下，從第二親和層析柱洗脫結(jié)合的蛋白，其中從步驟f)得到的洗脫液含有IL-17A/IL-17F異二聚體形式的IL-17A融合蛋白和 IL-17F融合蛋白。
77.根據(jù)權(quán)利要求75或76的方法分離的IL-17A/IL-17F異二聚體。
全文摘要
本發(fā)明涉及白介素-17F抗體及其它IL-17F信號(hào)傳遞拮抗劑和它們的用途。本發(fā)明提供了分離的和純化的與IL-17F信號(hào)傳遞途徑相關(guān)的多核苷酸和多肽。本發(fā)明還提供了IL-17F同二聚體和IL-17A/IL-17F異二聚體的抗體，和從天然來(lái)源分離和純化IL-17家族成員(包括IL-17A/IL-17F異二聚體)的方法。本發(fā)明還涉及用于診斷、預(yù)后、監(jiān)測(cè)與IL-17F信號(hào)傳遞相關(guān)的病癥(即IL-17F相關(guān)病癥)的進(jìn)展、和治療和/或預(yù)防所述病癥的新方法。本發(fā)明還涉及新的治療劑和治療靶，和篩選和評(píng)估用于干預(yù)(治療)和預(yù)防與IL-17F信號(hào)傳遞相關(guān)的病癥的測(cè)試化合物的方法。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102178953SQ20111003615
公開(kāi)日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2006年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月14日
發(fā)明者B·M·卡雷尼奧, J·F·賴(lài)特, K·雅各布斯, M·科林斯, M·阿賴(lài), N·M·沃爾夫曼, 盧志堅(jiān), 邱永成, 郭永金 申請(qǐng)人:惠氏公司