專利名稱：：能與白介素-10(il-10)結(jié)合的肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般性地涉及能與白介素-10(IL-IO)結(jié)合的肽和其應(yīng)用。本發(fā)明特別涉及通過與IL-10直接結(jié)合的方式抑制IL-10生物學(xué)活性的肽，以及它們在治療與IL-10表達、特別是與IL-10高表達有關(guān)的臨床狀態(tài)和病理病癥中的用途。
背景技術(shù)：
：免疫應(yīng)答既包4舌細月包應(yīng)答又包4舌體'液應(yīng)答。細月包應(yīng)答主要由T細胞介導(dǎo)，而體液應(yīng)答由B細胞介導(dǎo)。淋巴細胞在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，包括指導(dǎo)病毒感染的細胞的死亡、細胞因子和抗體產(chǎn)生等。淋巴細胞也與急性和慢性炎性疾病有關(guān)。細胞因子是可溶蛋白，其介導(dǎo)細胞間的反應(yīng)并影響細胞的生長和分化。細胞因子通過與特異受體結(jié)合發(fā)揮其作用，導(dǎo)致激活所述細胞因子的特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)信號。白介素-10(IL-10)是由幾類細胞產(chǎn)生的多效細胞因子(pleiotropiccytokine),所述細胞類型如巨噬細胞、單核細胞、Th2型和調(diào)節(jié)性T細胞以及B細胞。IL-10是具有免疫抑制特性和抗炎特性的細胞因子；其調(diào)節(jié)許多髓樣細胞和淋巴樣細胞的活性，并直接抑制T細胞和NK(天然殺傷)細胞產(chǎn)生幾種炎性細胞因子。IL-10最初描述為Th2細胞所產(chǎn)生的細胞因子合成抑制因子(cytokinesynthesisinhibitoryfactor,CSIF),Th2纟田胞抑制Thl細月包產(chǎn)生促炎細胞因子，如Y-干擾素(IFN-力、白介素-l-a(IL-lot)、白介素-1-(3(IL-1卩)、白介素-2(IL-2)以及腫瘤壞死因子a(TNF-a)。已經(jīng)證明，除了抑制促炎細胞因子產(chǎn)生之外，IL-10可以抑制抗原特異性Thl細胞增殖，由此通過使這些細胞中主要組織相容性復(fù)合體(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)-II的表達失調(diào)節(jié)來降低單核細胞抗原呈遞能力。IL-10對Thl細胞的激活以及對促炎細胞因子的產(chǎn)生具有強烈的抑制作用這一發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生了IL-10是細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的強免疫抑制劑這一假說。其他的作者已經(jīng)提議使用這種細胞因子治療急性和慢性炎癥以及治療自身免疫病。基于這些原因，這種細胞因子已經(jīng)用于幾種自身免疫病中，如牛皮癬、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和克羅恩氏病(Crohn'sdisease)。然而，在其他疾病，如感染性過程或癌癥中，因為其阻礙了益于治療的Thl應(yīng)答的誘導(dǎo)，因而具有副作用。這些過程的實例包括，麻瘋病、肺結(jié)核、利什曼病和病毒感染。因此，IL-10在丙型肝炎病毒導(dǎo)致的慢性感染中大量表達，已有記載。作為用HCV抗原刺激的結(jié)果，這種細胞因子可以由Th2細胞產(chǎn)生。其也可以由抑制Thl型抗病毒效應(yīng)細胞形成的調(diào)節(jié)性T細胞(D4和CD8)產(chǎn)生。最后，與HCV蛋白接觸的感染的樹突細胞(DC)或單核細胞，比非感染的細胞產(chǎn)生更大量的IL-10,這有利于Th2應(yīng)答的發(fā)生，同時阻礙病毒的消除。如上文所述，IL-10發(fā)揮重要作用的另一個領(lǐng)域是抗肺瘤應(yīng)答。因此，除其他分子以外，腫瘤細胞或肺瘤滲透細胞還可以產(chǎn)生石皮壞DCs機能的IL-IO。腫瘤中完全的DC機能抑制是不發(fā)生抗腫瘤應(yīng)答的原因之一。鑒于IL-10的體內(nèi)和體外抑制導(dǎo)致白介素12(IL-12)產(chǎn)生的增力口，以及伴隨Thl應(yīng)答的增加，所述IL-10抑制在諸如慢性HCV感染的某些抗病毒治療以及抗腫瘤治療中非常有用，在這些治療中強大的Thl型應(yīng)答待被誘導(dǎo)。因此，據(jù)記載，阻礙IL-10和其受體間相互作用的非曱基化寡核苷酸(CpG)以及抗IL-10受體抗體的組合，允許誘導(dǎo)更有效的抗腫瘤應(yīng)答，比^U吏用CpG所達到的更強(VicariA.P.aa/.Reversaloftumor-induceddendriticcellparalysisbyCpGimmuno-stimulatoryoligonucleotideandanti隱interleukin10receptorantibody(CpG免疫刺激性寡核苷酸和抗白介素10受體抗體對肺瘤誘導(dǎo)的樹枝狀細胞麻痹的逆轉(zhuǎn)).J五;c;MW.2002Aug19;196(4):541-9)。通常用來抑制IL-10生物學(xué)活性的其他策略包括，使用特異性中和抗體或者使用阻斷IL-10表達的IL-10編碼基因的反義寡核苷酸(寡聚體)。盡管由于血液中外源免疫球蛋白的存在以及由于來自IL-10系統(tǒng)阻斷的作用導(dǎo)致副作用有所增加，但是，使用抗體可以完全并特異性地阻斷這種細胞因子(IL-IO)。而且，免疫球蛋白隨時間的穩(wěn)定性不允許對這種細胞因子的活性進行短時期的阻斷控制。反義寡核苷酸在基因表達水平抑制IL-10的產(chǎn)生，這在所有與該細胞因子有關(guān)的過程中產(chǎn)生重要的去調(diào)節(jié)作用。因此，需要鑒定特異性的、功效更強且可潛在地用于人類治療中的新的IL-10抑制劑。發(fā)明概述本發(fā)明通常所面臨的難題是尋找可以抑制IL-10生物學(xué)活性的新化合物。本發(fā)明所提供的解決方案基于以下事實本發(fā)明人已經(jīng)鑒定出不但可以與IL-10結(jié)合而且通過它們與IL-10自身直接結(jié)合抑制IL-10生物學(xué)活性的肽。通過使用與噬菌體文庫有關(guān)的技術(shù)，已經(jīng)鑒定出了這些肽，所述技術(shù)允許測定具有與IL-10高親和力結(jié)合的、通常包含6-15個氨基酸大小的肽，隨后通過體外測定，對不同肽抑制IL-10生物學(xué)活性的能力進行定量。可以與IL-10結(jié)合的肽，特別是通過與IL-10直接結(jié)合抑制IL-10生物學(xué)活性的肽，潛在地用于治療與IL-10表達特別是與IL-10高表達有關(guān)的臨床狀態(tài)和病理病癥。同樣，可以與IL-10結(jié)合的肽為研究IL-10的生物學(xué)作用提供了工具。因此，本發(fā)明一方面涉及能與IL-10結(jié)合的肽。在具體且優(yōu)選的實施方案中，所述肽還能抑制IL-10的生物學(xué)活性。本發(fā)明另一方面涉及包含至少一種所述肽的藥物組合物。本發(fā)明另一方面涉及治療與IL-10表達特別是與IL-10高表達有關(guān)的臨床狀態(tài)和病理病癥的所述肽。本發(fā)明另一方面涉及所述肽在制備用于治療與IL-10表達特別是與IL-10高表達有關(guān)的臨床狀態(tài)和病理病癥的醫(yī)藥產(chǎn)品中的用途。本發(fā)明另一方面涉及編碼所述肽的DNA序列。本發(fā)明另一方面涉及包含編碼本發(fā)明所提供的肽的DNA序列的DNA構(gòu)建體。本發(fā)明另一方面涉及包含所述DNA序列或所述DNA構(gòu)建體的載體。本發(fā)明另一方面涉及包含所述DNA序列或DNA構(gòu)建體或所述載體的宿主細胞，如轉(zhuǎn)化的宿主細胞。本發(fā)明另一方面涉及產(chǎn)生本發(fā)明所提供的肽的方法，其包括在允許所述肽表達的條件下，培養(yǎng)所述宿主細胞，以及如果需要，回收獲得的肽。本發(fā)明另一方面涉及治療與IL-10表達特別是與IL-10高表達有關(guān)的臨床狀態(tài)和病理病癥的所述DNA序列和DNA構(gòu)建體。本發(fā)明另一方面涉及所述DNA序列和DNA構(gòu)建體在制備用于治療與IL-IO表達特別是與IL-10高表達有關(guān)的臨床狀態(tài)和病理病癥的載體和細月包中的用途。附圖簡要說明圖1是表示具有15個氨基酸的肽(P15aa)的位置的示意圖，所述肽在絲狀噬菌體M13的表面與蛋白m基因融合。圖2表示通過生物淘洗4支術(shù)(biopanningtechnique)選擇肽的示意圖。將生物素化的IL-10固定于含有鏈霉抗生物素的平板中(經(jīng)由生物素-鏈霉抗生物素結(jié)合)?；贗L-10和噬菌體呈現(xiàn)的肽之間的相互作用，篩選噬菌體文庫。通過洗滌，除去對IL-10具有低親和力的噬菌體。通過降低pH,洗脫保留在平板中的噬菌體。在富集對IL-10具有高親和力的噬菌體三輪后，將噬菌體分離并測序(參閱實施例1)。圖3是表示在存在不同濃度的人IL-10和小鼠白介素-4(IL-4)時MC/9細^^增殖的圖。圖4由柱狀圖組成，表示以濃度為150、100和50pg/mL的每種肽獲得的人IL-10(hlL-10)和鼠IL-10(mIL-lO)的抑制百分比(從左到右)(圖4A)，以及毒性百分比(表示為粒細胞巨噬細胞菌落刺激因子(granulocytemacrophage-colonystimulatingfactor,GM隱CSF)對MC/9會田胞增殖抑制的百分比)(圖4B)。每個柱對應(yīng)于2或3次獨立實驗的平均值。圖5是柱狀圖，表示能與IL-10結(jié)合的幾種肽對y^^M細胞系(IL-10生產(chǎn)者)免疫抑制活性的影響。用這些細胞進行"混合淋巴細胞反應(yīng)"(mixedlymphocytereaction,MLR)測定，其中所產(chǎn)生的IFN-y水平測量為免疫應(yīng)答的量。具有顯著的IL-10抑制能力以及可以重建MLR的IFN-y水平的肽，以條紋柱表示。圖例PBL:外周血淋巴細胞，PBL1和PBL2:來自兩種不同健康供體的外周血淋巴細胞(從定義上來說，這些細胞的混合物通過經(jīng)由MHC和TLR間反應(yīng)的異源識別，誘導(dǎo)增殖的激活)，MLR:混合的淋巴細胞反應(yīng)，MLR+K:混合的淋巴細胞反應(yīng)+i^w^299細胞系，K:iTw;^299細胞系)。圖6是柱狀圖，表示肽P9(SEQIDNO:6)和PI3(SEQIDNO:8)在再刺激具有不同T輔助決定肽的淋巴細胞中的體外作用，其定量為IFN-y的產(chǎn)量。該系統(tǒng)中IL-10的抑制將有利于Thl細胞因子譜，因此增加IFN-y。肽FISEAG(SEQIDNO:38)是上清液中誘導(dǎo)可檢測的IL-10水平以及最高IFN-Y水平的唯一肽。肽P9(SEQIDNO:6)和P13(SEQIDNO:8)僅在此情況下增加IFN-y的產(chǎn)量。圖7是表示皮下接種5xl()S個腫瘤細胞(CT26)的不同組BALB/C小鼠中平均腫瘤生長的圖示。不同組顯示，沒有治療(對照組)、用多I:C和抗CD-40抗體(佐劑)治療、用肽P9(SEQIDNO:6)(腫瘤內(nèi))和P13(SEQIDNO:8)(腹膜內(nèi))(IL-10抑制劑)治療或佐劑和IL-10抑制劑組合(八*+11^10Inhib)治療的情況下平均腫瘤生長。圖8是表示通過表面等離子共振(SPR)分析獲得的生物分子相互作用特征的圖表，所述相互作用發(fā)生于IL-10和肽P9(SEQIDNO:6)之間，以及用對照肽[P301(SEQIDNO:54)]獲得的相互作用。圖9是表示由生物分子相互作用獲得的結(jié)果的柱狀圖，其通過SPR分析測量，所述相互作用發(fā)生于IL-10和肽P9(SEQIDNO:6)、P13(SEQIDNO:8)和其截短的和/或々務(wù)飾形式之間，所述截短的和/或修飾形式為P9(2隱15)(SEQIDNO:45)、P9(l-14)(SEQIDNO:46)、P9(l隱13)(SEQIDNO:47)、P9(2-14)(SEQIDNO:48)、P9(2-13)(SEQIDNO:49)、P9(3隱14)(SEQIDNO:50)、P9(l5Ala)(SEQIDNO:51)、9P9(14Ala)(SEQIDNO:52)、P9(l-13;1Ser)(SEQIDNO:53)。圖10表示肽P9(SEQIDNO:6)和PI3(SEQIDNO:8)對IL-10所誘導(dǎo)的STAT3磷酸化的影響。通過Western印跡技術(shù)，分析磷酸化的STAT3表達(圖10A)。柱狀圖(圖IOB)表示通過光密度分析法定量的磷酸化STAT3條帶的含量與獲得的每個樣品的肌動蛋白含量的比例。圖11表示柱狀圖中肽P9(SEQIDNO:6)、P13(SEQIDNO:8)、P15(SEQIDNO:10)、P16(SEQIDNO:11)、P31(SEQIDNO:22)和P34(SEQIDNO:25)誘導(dǎo)的細胞增殖的抑制百分比，以及對照肽P301(SEQIDNO:54)誘導(dǎo)的細胞增殖的抑制百分比。將它們都以200pg/ml的濃度進行檢測。所示結(jié)果對應(yīng)于一式三份進行的兩次測定的平均值和偏差。圖12是表示在用TLR9配體(CpG)刺激以及在存在丙型肝炎病毒核殼(HCV核心(HCVcore))蛋白時的外周血單核細胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)培養(yǎng)物中，肽P13(SEQIDNO:8)對IFN-a產(chǎn)生的影響。簡而言之，在有或無HCV核心(2.5pg/ml)以及在存在或缺少肽P13(SEQIDNO:8)的情況下，用TLR9配體(CpG,5i!g/ml)刺激來自健康供體的PBMCs。濃度為l|ig/ml的抗IL-10抗體(eBioscience,16-7108-81)用作陽性對照。37°C和5%C02下孵育48小時后，通過ELISA測量培養(yǎng)物上清液中IFN-a的產(chǎn)量。所示結(jié)果代表結(jié)果相似的4次實—瞼。發(fā)明詳述本發(fā)明一般性地涉及能與IL-10結(jié)合的肽和它們的應(yīng)用。因此，本發(fā)明一方面涉及能與IL-10結(jié)合的肽，下文稱為本發(fā)明的肽，其選自a)肽，其氨基酸序列選自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21;SEQIDNO:22;SEQIDNO:23;SEQIDNO:24;SEQIDNO:25;SEQIDNO:26;SEQIDNO:33;SEQIDNO:34;SEQIDNO:35和SEQIDNO:36,b)a)中限定的肽的變體；以及c)a)中限定的肽或b)中限定的變體的片段，包含5-15個連續(xù)氨基酸，以及其藥學(xué)上可接受的鹽。本文所用術(shù)語"肽'，包括其修飾物和衍生物，例如糖基化、磷酸化、乙?；被?。本說明書所用的術(shù)語"變體"指衍生于a)部分中所定義的肽的肽，其中氨基酸通過例如取代的方式進行了修飾，或者其具有一個或多個氨基酸的插入或缺失，條件是，其保留至少一種最初肽的功能，有利的是，保留至少一種與結(jié)合IL-10有關(guān)的功能。所述變體通常包括保守取代，其中最終肽的功能未被修飾。肽P9(SEQIDNO:6)的示例性的、非限制性的實例包括其中P9(SEQIDNO:6)第15位的氨基酸(Phe)已被Ala取代的肽P9(15Ala)(SEQIDNO:51),其中P9(SEQIDNO:6)第14位的氨基酸(Val)已經(jīng)被Ala取代的肽P9(14Ala)(SEQIDNO:52)及其它。本說明書中所用的術(shù)語"片段"指衍生于在前面a)或b)中所定義的肽的肽，其中，已經(jīng)從氨基端或羧基端或者兩端除去氨基酸，同時維持最初肽的一種或多種功能，優(yōu)選地，與IL-10結(jié)合有關(guān)的功能。肽P9(SEQIDNO:6)的示例性、非限制性的實例包括肽P9(2-15)(SEQIDNO:45)、P9(l誦14)(SEQIDNO:46)、P9(l-13)(SEQIDNO:47)、P9(2-14)(SEQIDNO:48)、P9(2-13)(SEQIDNO:49)、P9(3-14)(SEQIDNO:50)、P9(l-13;1Ser)(SEQIDNO:53)及其它。本發(fā)明的肽的藥學(xué)上可接受的鹽，落于本發(fā)明的范圍內(nèi)。本文所用術(shù)語"藥學(xué)上可接受的鹽，，包括通常用來形成金屬鹽或者酸加成鹽的鹽。鹽的特性并不重要，只要其是藥學(xué)上可接受的。本發(fā)明的肽的藥學(xué)上可接受的鹽，可以從有機或無機酸或堿中獲得。所述鹽可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的常規(guī)方法獲得。本發(fā)明的肽能與IL-10結(jié)合。一些所述的肽還能在體外和/或體內(nèi)抑制IL-10的生物學(xué)活性。本發(fā)明的肽與IL-10結(jié)合的能力，可以通過允許測定兩個分子間的結(jié)合的任何適宜的方法測定，例如通過親和力測定，所述親和力測定包括使IL-10與待測定的肽在允許所述肽與IL-10結(jié)合的條件下接觸，并評估所述肽和IL-10的結(jié)合。在具體實施方案中，利用例如放射性標記的IL-10進行所述親和力測定?？蛇x地，可以^皮標記的化合物是待測定的肽。這種類型的親和力測定通常包括將固定于用例如鏈霉抗生物素封閉的平板上的IL-10與IL-10結(jié)合能力待知的肽接觸，在孵育適當(dāng)?shù)臅r間后，分析該肽與IL-10的結(jié)合，如本說明書所附的實施例1所示。通過洗滌，去除低IL-10親和力的肽，而具有較高親和力的肽保持與IL-10結(jié)合，并可以通過破壞兩種分子間的相互作用釋放，這可以通過例如降低pH進行。通過測定針對不同濃度IL-10的肽，反之亦然，可獲得針對IL-10的所討論的肽的親和力。盡管本發(fā)明所有的肽都能與IL-10結(jié)合，但是，在具體實施方案中，能與IL-10結(jié)合的本發(fā)明的肽選自SEQIDNO:1、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:19、SEQIDNO:25、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52和SEQIDNO:53所示的肽、其變體或片段以及它們藥學(xué)上可接受的鹽。可以評估本發(fā)明的肽體外抑制IL-10生物學(xué)活性的能力，如果需要，通過抑制MC/9細胞系(CRL-8306,美國典型細胞培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCellCulture,ATCC),美國維吉尼亞(Virginia,UnitedStates))生長的測定定量，所述MC/9細胞系是衍生于大鼠肝臟的肥大細胞，其增殖受IL-10的誘導(dǎo)(參見實施例3)。在另一個具體的實施方案中，本發(fā)明的肽是能抑制IL-10生物學(xué)活性的肽，并選自SEQIDNO:1(Pl)、SEQIDNO:6(P9)、SEQIDNO:8(P13)、SEQIDNO:10(P15)、SEQIDNO:13(P19)、SEQIDNO:14(P20)、SEQIDNO:16(P22)、SEQIDNO:19(P25)和SEQIDNO:25(P34)所示的肽、其變體或片段，以及它們藥學(xué)上可接受的鹽。除了能與IL-10結(jié)合并抑制IL-10的生物學(xué)活性外，所述肽還具有共同的結(jié)構(gòu)特征。因此，所述肽(i)在其氨基酸序列上具有60%至90%的疏水氨基酸(Ala、Val、Leu、Ile、Gly和Pro)和堿性氨基酸(Arg、His和Lys)，比預(yù)期的百分比(約45%)高的多；(ii)具有至少一個芳香氨基酸，通常2個或3個，所述芳香氨基酸選自Phe、Trp和Tyr，優(yōu)選Phe。同樣，如所觀察的，以SEQIDNO:8(P13)所示的肽作為參考肽進行的氨基酸序列比對分析表明，在第2-5位存在具有堿性氨基酸(Arg、His、Lys)以及在第10-14位存在疏水氨基酸的傾向，這種模式維持于SEQIDNO:1(Pl)、SEQIDNO:6(P9)、SEQIDNO:8(P13)、SEQIDNO:13(P19)和SEQIDNO:25(P34)所示的肽中，這種位置對SEQIDNO:10(PI5)和SEQIDNO:16(P22)所示的肽是反向的，且在SEQIDNO:14(P20)和SEQIDNO:19(P25)所示的肽中是喪失的。在具體的實施方案中，人IL-10和肽P9(SEQIDNO:6)和P13(SEQIDNO:8)以及其一些4汙生物(平截的和/或修飾形式)間的生物分子相互作用，已通過表面等離子共振(SPR)分析進行了測定，證實了它們與IL-10結(jié)合的能力(實施例7)。同樣，肽P9(SEQIDNO:6)和P13(SEQIDNO:8)所發(fā)揮的抑制作用已通過它們對STAT3磷酸化的影響得以證實，在STAT3分子與其細胞受體結(jié)合后，STAT3分子與信號傳導(dǎo)有關(guān)(參閱實施例8)。在體外B16-F10黑素瘤細胞增殖測定中已經(jīng)證實本發(fā)明所提供的IL-10抑制肽的作用(參見實施例9)。此外，由于IL-10是一種可以測定由丙型肝炎病毒(HCV)導(dǎo)致的感染遷延化(chronification)的負因子，在體外模型中，已檢測了肽P13(SEQIDNO:8)的功效，在所述模型中，HCV核心蛋白(其能誘導(dǎo)IL-10)負責(zé)產(chǎn)生所檢測的低量IFN-o;;如圖12中所觀察的，所述肽P13(SEQIDNO:8)可以才爰z救IFN-a的產(chǎn)生。對于能與IL-10結(jié)合的肽的初始鑒定，本發(fā)明人已經(jīng)使用噬菌體文庫有關(guān)的技術(shù)，該技術(shù)允許測定具有與IL-10高親和力結(jié)合的肽，并隨后通過體外測定定量不同肽抑制IL-10生物學(xué)活性的能力。與IL-10結(jié)合的肽的序列，其體外抑制IL-10的生物學(xué)活性，可以在幾輪13生物淘洗通常是3輪后由相應(yīng)的DNA序列推導(dǎo)出。利用噬菌體文庫鑒定某些產(chǎn)物的抑制劑，已由例如Chirinos-RojasC丄.Ca/.，inImmunology,1999,Jan.96(1):109-113;McConnellS.J.,etal.,inGene1994,Dec.30,151(1畫2):115-118或SmithG.P.，Science,1985,Jun.14,228(4705):1315-1317記載。因此本發(fā)明提供了鑒定能與IL-10結(jié)合的肽的方法，包括(i)使用包含多個絲狀噬菌體的噬菌體文庫，每個所述噬菌體的基因組含有編碼不同肽的、與噬菌體包被蛋白基因連接的核苷酸序列，據(jù)此，每個噬菌體含有與噬菌體包被蛋白在基因上融合的不同肽；(ii)通過親和力測定選4奪含有以更高親和力與IL-10結(jié)合的肽的噬菌體；(iii)基于插入步驟(ii)中所選擇的噬菌體且編碼與IL-10結(jié)合的肽的相應(yīng)DNA序列，測定與IL-10結(jié)合的所述肽的序列。在具體實施方案中，為了獲得可以以高親和力與IL-10結(jié)合、長度為15個氨基酸且可能抑制所述細胞因子的生物學(xué)活性的肽，使用由多個絲狀噬菌體(M13)所形成的噬菌體文庫，所述多個絲狀噬菌體中的每個都含有長度為15個氨基酸、與噬菌體包被蛋白在基因上融合由此結(jié)合于包被蛋白III的N末端的肽。噬菌體因此在其表面上，在表面蛋白的5個分子中的每一個中都具有15個氨基酸的肽，而其內(nèi)部含有編碼所述肽序列的DNA。在噬菌體文庫中，肽編碼序列來自在15個位置中的每一個位置由20個天然氨基酸簡并的序列，這允許在不同噬菌體中顯示15個氨基酸的1.1xl0"個可能的序列。噬菌體中肽序列與編碼它的DNA的物理比(physicalratio)為1:1,允許從大量變體中選擇與IL-10特異性結(jié)合的序列。這個過程可以由親和力測定來進行。在具體的實施方案中，所述親和力測定由稱為生物淘洗的體外選擇方案組成。簡而言之，所述技術(shù)組成為，在加入生物素化的IL-10的、用鏈霉抗生物素封閉的平板內(nèi)孵育一組噬菌體，出于實踐的目的，所述一組噬菌體代表具有15個氨基酸的肽的所有變體(在此情況下)。生物素化的IL-10通過生物素-鏈霉抗生物素相互作用，錨定于平板上，據(jù)此，正確地展示了其與噬菌體所攜帶的肽的相互作用。孵育后，通200880015179.0過洗滌除去未結(jié)合的噬菌體，隨后通過降低pH由此破壞噬菌體所展示的IL-10和肽之間的相互作用而洗脫特異性結(jié)合的肽。隨后通過感染細菌菌株，擴增洗脫的噬菌體。該過程重復(fù)總共3輪，以便富集與IL-10特異性且以高親和力結(jié)合的噬菌體的量。在每一輪中，漸進性地減少用來封閉平板的生物素化的IL-IO，例如，從2.5至0.02pg/mL，以及最后0.002嗎/mL。因而在每一輪中所選擇的噬菌體具有更高程度的IL-10親和力。在該過程末，將已針對IL-10親和性選擇的噬菌體用《1物進行測序。這允許獲得噬菌體中所展示的肽的序列。本說明書所附的實施例1顯示，通過噬菌體文庫選擇與IL-10結(jié)合的肽、通過生物淘洗技術(shù)和測序選擇以高親和力與IL-10結(jié)合的肽。通過這種技術(shù)，已經(jīng)獲得SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25和SEQIDNO:26所示的肽。在另一個具體實施方案中，為了進行能與IL-10結(jié)合的肽的初始鑒定，本發(fā)明考慮了(IL-10)-(IL-10受體)復(fù)合體的結(jié)構(gòu)(JosephsonK,LogsdonNJ,WalterMR.CrystalstructureoftheIL-10/IL-10R1complexrevealsasharedreceptorbindingsite,/mmwm^y,2001Jul;15①35-46》通過這種方法(參見實施例2),本發(fā)明人觀察到，在所述結(jié)構(gòu)中，在IL-10中，存在具有o;螺旋構(gòu)型的區(qū)域，并進行了定位，以便可能認為它們與細胞因子與其受體的相互作用相關(guān)。因此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在IL-10中存在兩個a螺旋區(qū)域，具體來說，第一區(qū)域包含IL-10氨基酸序列的第19-35位氨基酸序列，另一第二區(qū)域包含IL-10氨基酸序列的第86-110位氨基酸序列，其是以反平行的方式定位的，因此，可以認為它們與細胞因子及其受體的相互作用可能相關(guān)。因此，鑒定LI-IO氨基酸序列的區(qū)域是可能的，所述區(qū)域可以用來合成具有IL-10抑制活性的肽，隨后，如上文所述，通過體外測定定量不同肽抑制IL-10生物學(xué)活性的能力。通過本文所述方法鑒定的、具有潛在IL-10抑制能力的肽的示例性、非限制性實例，顯示于表2(實施例2)中，并且包括SEQIDNO:30(F24)、SEQIDNO:31(F25)、SEQIDNO:32(F26)、SEQIDNO:33(F27)、SEQIDNO:34(F28)、SEQIDNO:35(F29)和SEQIDNO:36(F30)所示的肽。由所述表2可以看出，SEQIDNO:30(F24)所示的肽是包含天然的人IL-10(hlL-10)氨基酸序列的第86-97位氨基酸序列的肽，SEQIDNO:31(F25)所示的肽是包含天然反向hlL-10氨基酸序列的第23-34位氨基酸序列的肽；SEQIDNO:32(F26)所示的肽是包含天然hIL-10氨基酸序列的第23-34位氨基酸序列的肽；SEQIDNO:33(F27)所示的肽是包含互補的天然ML-10氨基酸序列的第23-34位氨基酸序列的肽，且能與IL-10結(jié)合；SEQIDNO:34(F28)所示的肽是包含互補反向的天然hlL-10氨基酸序列的氨基酸第23-34位的序列，且能與IL-10結(jié)合；SEQIDNO:35(F29)所示的肽是包含互補的天然hlL-10氨基酸序列的第99-107位氨基酸的序列，且能與IL-10結(jié)合;以及SEQIDNO:36(F30)所示的肽是包含互補的反向天然hlL-10氨基酸序列的氨基酸第99-107位的序列，且能與IL-10結(jié)合。本文所用術(shù)語"反向的，，意指氨基酸序列對應(yīng)于以反向方式閱讀的蛋白或天然蛋白片段的氨基酸序列。本文所用術(shù)語"互補的"涉及包含可以與天然蛋白氨基酸序列的其他互補殘基"主動地相互作用"的殘基的氨基酸序列。本文所用術(shù)語"主動地相互作用"涉及兩個氨基酸之間的相互作用通過靜電力、疏水相互作用、氫鍵等產(chǎn)生吸引力的情況。由于IL-10在許多生物學(xué)過程中的作用，本發(fā)明的肽的IL-10抑制活性的結(jié)果與潛在地研發(fā)新的藥物家族有關(guān)，所述新的藥物家族可以用來治療與IL-10表達特別是與IL-10高表達有關(guān)的臨床狀態(tài)和病理病發(fā)明的肽潛在地適用于IL-10增加與個體或患者臨床狀態(tài)惡化有關(guān)的任4可臨床狀態(tài)或病理病癥。本文所用術(shù)語"個體"涉及哺乳動物種類的任何成員，包括但不16限于家養(yǎng)動物、靈長類和人；個體優(yōu)選是任何年齡或種族的男人或女人。因此，本發(fā)明的肽可以用來治療與IL-10表達特別是與IL-10高表達有關(guān)的臨床狀態(tài)或病理病癥?？梢杂帽景l(fā)明的肽治療的所述臨床狀態(tài)或病理病癥的示例性實例包括病毒感染、細菌感染、真菌感染、寄生蟲感染、肺瘤、癌癥或急性損傷狀況，其中IL-10具有免疫抑制作用。在這些類型的感染過程、肺瘤、癌癥或急性損傷狀況中，因為IL-10阻止有利于治療的Thl應(yīng)答的誘導(dǎo)，因而具有副作用。實際上，可以用本發(fā)明的肽治療的病毒感染的示例性、非限制性的實例包括，病毒來源的任何感染，例如，皰滲病毒引起的感染，例如人皰滲病毒，如1型單純皰滲病毒(HSV-1)、2型單純皰滲病毒(HSV-2)、水痘-帶狀皰滲病毒(VZV)、巨細胞病毒(CMV)、人皰滲病毒6(HHV-6)、人皰滲病毒7(HHV-7)、EB病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)、卡波西氏皰滲病毒(HHV-8)等，以及任選地，伴有暴露于陽光后的皮膚再活化作用；引起肝炎的病毒引起的感染，例如丙型肝炎病毒(hepatitisCvims,HCV)等?？梢杂帽景l(fā)明的肽治療的細菌感染的示例性、非限制性實例包括但不限于，麻風(fēng)分枝桿菌(A(yco^"en'Mm/eprae)引起的感染、結(jié)核桿菌(JVf;ycofoaCehi/mZi/Zercw/osz、)引起的感染、鼠疫耶爾森菌(！^:s7'"/a;eW/力引起的感染、幽門螺旋桿菌(//e/z'co^"wpy/on〕引起的胃感染等?？梢杂帽景l(fā)明的肽治療的、真菌引起的感染的示例性非限制性實例包括但不限于，白色念珠菌(OmAWaa/Z^ca"勻引起的感染、紅色毛辨菌(7WcAo//y^own/Zn/m)引起的感染、曲霉(v457ergz'〃iws/7.)引起的感括但不限于，利什曼病，如內(nèi)臟利什曼病，惡性癥原蟲(尸/wmo&wm/hto》an/m)引起的感染、弓形體病等?？梢杂帽景l(fā)明的肽治療的腫瘤和癌癥的示例性非限制性實例包括但不限于霍奇金淋巴瘤(Hodgkin，slymphoma)、頭頸癌、黑素瘤、基底細胞癌(basalcellcarcinoma)和由被UV輻射突變的角質(zhì)細胞發(fā)展成的鱗狀細胞癌等?？梢杂帽景l(fā)明的肽治療的急性損傷狀況的示例性、非限制性實例包括但不限于，燒傷和有關(guān)的敗血癥等。通常，腫瘤發(fā)展、病毒、細菌、真菌或寄生蟲感染中的任何過程可以用本發(fā)明的肽治療，在所述過程中，IL-10的活性在個體臨床狀態(tài)的惡化或遷延中具有重要的免疫抑制作用。因此本發(fā)明另一方面涉及藥物組合物，其包含治療有效量的本發(fā)明的肽，以及至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑。本發(fā)明提供的藥物組合物可以含有一種或多種本發(fā)明的肽，以及任選地，一種或多種可選的IL-10抑制化合物。所述藥物組合物可以施用和/或應(yīng)用于人體或動物體，優(yōu)選人體。事實上，如果需要，除本發(fā)明的肽以外，任何IL-IO抑制化合物可以存在于本發(fā)明的藥物組合物中。除本發(fā)明的肽以外，可與本發(fā)明的肽一起使用的可選的IL-10抑制化合物的示例性、非限制性實例包括但不限于IFN-y、AS101三氯(二氧乙烯-O,O')碲酸銨鹽)、中和抗體、15d-PGJ2(15-脫氧-A-12，14-前列腺素J2)、嵌合鼠抗人CD20抗體(Ritubimax)等。利用肽如本發(fā)明的肽，而不是利用反義寡核苷酸或抗體，具有許多優(yōu)勢，因為它們是小分子，具有更大的擴散能力以及更短的半衰期。這些肽可以具有對IL-10的高親和力，但比抗體降解的更快，不利的副作用可以通過劑量控制。與其他類型的化合物相比，將肽運送至靶器官或組織更容易。給予本發(fā)明的肽來治療與IL-10表達、特別是與IL-10高(過量)表達有關(guān)的臨床狀態(tài)或病理病癥?？梢源嬖谟诒景l(fā)明提供的組合物中的肽、其衍生物或藥學(xué)上可接受的鹽的量可以在大范圍內(nèi)變動。用本發(fā)明的肽和/或藥物組合物治療與IL-10表達特別是與IL-10高表達有關(guān)的病理病癥或疾病的劑量，取決于許多因素，包括年齡、患者的狀況、病理病癥或疾病的嚴重性、給藥的途徑和頻率，以及取決于待給藥的本發(fā)明的肽。含有本發(fā)明的肽的藥物組合物可以以任何給藥形式存在，例如固體或液體形式，并且可以通過任何適宜的方法給藥，例如口服、腸道外、直腸或局部，為此，配置期望的給藥形式所需的藥學(xué)上可接受的賦形劑將包括在內(nèi)，所述期望的給藥形式如軟膏(脂凝膠、水凝膠等)滴目艮液、噴霧劑(sprays)、注射溶液、滲透泵(osmoticpumps)等。有關(guān)醫(yī)藥產(chǎn)品以及用于獲得它們的所需賦形劑的不同給藥劑型的綜述見于例如"TratadodeFarmaciaGal6nica",C.FauliiTrillo，1993,Luzdn5,S.A.Ediciones,Madrid。因此，本發(fā)明另一方面涉及用于治療與IL-10表達特別是與IL-10高表達有關(guān)的臨床狀態(tài)或病理病癥的本發(fā)明的肽。在具體的實施方案中，所述臨床狀態(tài)或病理病癥是呈現(xiàn)IL-10表達特別是IL-10高表達的臨床狀態(tài)或病理病癥。在具體實施方案中，所述呈現(xiàn)IL-10表達特別是IL-10高表達的臨床狀態(tài)或病理病癥包含Thl細胞受到抑制的臨床狀態(tài)?？梢灾委煹乃雠R床狀態(tài)或病理病癥的示例性實例包括前面提到的病毒感染、細菌感染、真菌感染、寄生蟲感染、腫瘤、癌癥或急性損傷情況。本發(fā)明的另外方面是，本發(fā)明的肽在制備所述藥物組合物中的用途。因此，本發(fā)明的另一方面涉及本發(fā)明的肽在制備用于治療與IL-10表達特別是與IL-10高表達有關(guān)的臨床狀態(tài)或病理病癥的醫(yī)藥產(chǎn)品中的用途。在具體的實施方案中，所述臨床狀態(tài)或病理病癥是呈現(xiàn)IL-IO表達特別是IL-10高表達的臨床狀態(tài)或病理病癥。在具體的實施方案中，所述呈現(xiàn)IL-10表達特別是IL-10高表達的臨床狀態(tài)或病理病癥包含Thl細胞應(yīng)答受到抑制的臨床狀態(tài)。可以治療的所述臨床狀態(tài)或病理病癥的示例性實例包括前面提到的病毒感染、細菌感染、真菌感染、寄生蟲感染、腫瘤、癌癥或急性損傷情況。測量樣品中IL-10表達水平的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。因此，就非限制性說明而言，所述方法包括，例如，通過例如ELISA技術(shù)測量血清、痰或精液樣本中IL-10的水平或濃度。所述技術(shù)允許定量樣品中與正常水平相比即與健康個體樣品中的il-IO水平相比的IL-10的水平。本發(fā)明的肽可以通過常規(guī)方法獲得，例如通過固相化學(xué)合成技術(shù)；通過常規(guī)方法純化，例如通過高效液相色譜(HPLC);并且，如果需要，其可以通過常規(guī)技術(shù)進行分析，例如通過測序和質(zhì)譜、氨基酸分析、核》茲共振等。就非限制性說明而言，才艮據(jù)利用AthertonFmoc變體(AthertonFmocvariant,Atherton,E.,Logan,J.C.andSheppard,R.C.191989.PeptidesynthesisII.Proceduresforsolidphasesynthesisusing7V-fluorenylmethoxycarbonylaminoacidsonpolyamidesupports-SynthesisofsubstancePandofacylcarrierprotein65—74decapeptide(肽的合成n，利用聚酰胺支持體上的n藥曱氧羰酰氨基酸固相合成方法，P物質(zhì)和酰基載體蛋白65-74十肽的合成).CAew.Perh'wTVaw.l:538)的常規(guī)方法(MerrifieldRB.JAmChemSoc1963;85:2149-2154)，本發(fā)明的肽可以通過肽合成獲得。所獲得的肽的純度可以通過例如反相HPLC色譜和/或質(zhì)譜測定?？蛇x地，本發(fā)明的肽可以通過重組DNA技術(shù)獲得。因此本發(fā)明的另一方面提供了編碼本發(fā)明的肽的DNA序列。所述DNA序列可以很容易地由本發(fā)明的肽的氨基酸序列推導(dǎo)。所述DNA序列可以包含于DNA構(gòu)建體中。因此，本發(fā)明另一方面提供了包含編碼本發(fā)明的肽的DNA序列的DNA構(gòu)建體。所述DNA構(gòu)建體可以結(jié)合調(diào)節(jié)編碼本發(fā)明肽的DNA序列表達的可才喿作地結(jié)合的序列。控制序列是控制和調(diào)節(jié)本發(fā)明的肽的轉(zhuǎn)錄以及如果合適翻譯的序列，且包括在包含所述DNA構(gòu)建體或序列的轉(zhuǎn)化的宿主細胞中發(fā)揮功能的啟動子序列和終止子序列等。在具體實施方案中，所述表達控制序列在細菌中發(fā)揮功能。有利的是，所述DNA構(gòu)建體還包含編碼允許用所述DNA構(gòu)建體選4奪轉(zhuǎn)化的宿主細胞的基元或表型的標記或基因。本發(fā)明提供的DNA構(gòu)建體可以通過利用本領(lǐng)域公知的4支術(shù)[Sambrooketal.,"Molecularcloning,aLaboratoryManual(分子克隆實驗室手冊)，，，第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,N.Y.，1989Vol.l-3]獲得?？梢詫⒈景l(fā)明提供的DNA序列或DNA構(gòu)建體插入適宜的載體。因此本發(fā)明另一方面涉及載體，如包含所述DNA構(gòu)建體或序列的表達載體。載體的選擇，取決于它將隨后被導(dǎo)入的宿主細胞。舉例來說，引入所述DNA序列的載體可以是質(zhì)?；蜉d體，當(dāng)引入宿主細胞時，其整合或不整合于所述細胞的基因組。所述載體可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法[上文提到的Sambroketal.,1989]獲得。本發(fā)明另一方面涉及包含本發(fā)明提供的DNA序列或DNA構(gòu)建體或之前提到的載體的宿主細胞，如轉(zhuǎn)化的宿主細胞。所述細胞可以是原核或真核細月包。本發(fā)明另一方面涉及包含本發(fā)明提供的DNA序列、本發(fā)明提供的DNA構(gòu)建體、本發(fā)明提供的載體或本發(fā)明提供的宿主細胞以及藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。在具體實施方案中，所述藥物組合物包含基因轉(zhuǎn)移載體中的本發(fā)明提供的DNA序列或本發(fā)明提供的DNA構(gòu)建體，所述載體如病毒或非病毒載體。使本發(fā)明的該實施方案付諸實施的適宜的病毒載體包括但不限于，腺病毒載體、腺相關(guān)載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體(lentiviralvector)、a病毒載體、皰滲病毒載體、冠狀病毒衍生載體等。使本發(fā)明的該實施方案付諸實施的適宜的非病毒類型載體包括但不限于，棵DNA、脂質(zhì)體、多胺、樹狀大分子(dendrimers)、陽離子含糖多聚體(glycopolymer)、脂質(zhì)體-聚陽離子復(fù)合物、蛋白、受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)等。因此，本發(fā)明另一方面涉及用于治療與IL-10表達特別是與IL-10高表達有關(guān)的臨床狀態(tài)或病理病癥的本發(fā)明提供的DNA序列，或涉及本發(fā)明提供的DNA構(gòu)建體，或涉及本發(fā)明提供的載體，或涉及本發(fā)明提供的宿主細胞。在具體實施方案中，所述臨床狀態(tài)或病理病癥是呈現(xiàn)IL-10表達特別是IL-10高表達的臨床狀態(tài)或病理病癥。在具體實施方案中，所述呈現(xiàn)IL-10表達特別是IL-10高表達的臨床狀態(tài)或病理病癥，包含Thl細胞應(yīng)答受到抑制的臨床狀態(tài)?？梢灾委煹乃雠R床狀態(tài)或病理病癥的示例性實例包括，之前提到的病毒感染、細菌感染、真菌感染、寄生蟲感染、腫瘤、癌癥或急性損傷情況。本發(fā)明另一方面涉及所述DNA序列和DNA構(gòu)建體在制備用于治療與IL-10表達特別是與IL-10高表達有關(guān)的臨床狀態(tài)和病理病癥的載體和細胞中的用途。根據(jù)本發(fā)明的這一方面，使所述DNA構(gòu)建體或序列與基因轉(zhuǎn)移載體如病毒載體或非病毒載體接觸。使此實施方案付諸實施的適宜病毒載體包括但不限于，腺病毒載體、腺相關(guān)載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、q;病毒載體、皰滲病毒載體、冠狀病毒衍生載體等。使此實施方案付諸實施的適宜非病毒載體包括但不限于，棵DNA、脂質(zhì)體、多胺、樹狀大分子、陽離子含糖多聚體、脂質(zhì)體-聚陽離子復(fù)合物、蛋白、受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)等。本發(fā)明另一方面涉及制備本發(fā)明的肽的方法，其包括在允許制備所述本發(fā)明的肽的條件下培養(yǎng)包含本發(fā)明提供的DNA構(gòu)建體、序列或載體的宿主細胞，以及，如果需要，回收所述本發(fā)明的肽。優(yōu)化培養(yǎng)所述宿主細胞的條件取決于所用的宿主細胞。如果需要，制備本發(fā)明的肽的方法還包括分離和純化所述肽。下面的實施例說明本發(fā)明，并且不得認為是對其范圍的限制。實施例1通過噬菌體文庫選擇與IL-10結(jié)合的肽為了獲得能夠以高親和力與IL-10結(jié)合且可能對該細胞因子生物學(xué)活性具有抑制活性的15個氨基酸的肽，利用體外選擇技術(shù)，其是基于由噬菌體文庫發(fā)展來的技術(shù)。這些文庫由含有肽的絲狀噬菌體(M13)組成，所述肽通?；蛉诤嫌诓《景坏鞍祝诖饲闆r下，與包被蛋白pIII的N末端結(jié)合(Figure1)。因此，噬菌體在其表面上，在該噬菌體表面具有的該蛋白的5個分子中的每一個中都具有帶有15個氨基酸的肽，而且其內(nèi)部含有編碼所述肽的DNA。在噬菌體文庫中，肽編碼序列來自由20個天然氨基酸在15個位置中的每一個簡并的序列。這允許在不同噬菌體中顯示15個氨基酸的1."1012個可能的序列。在細菌噬菌體中肽序列和編碼該肽的DNA之間的物理比值1:1,允許從大量變體中選擇與IL-10特異性結(jié)合的序列。該方法通過稱為"生物淘洗"的體外選擇實驗方案進行。用于進行本實施例的噬菌體文庫含有2x108個不同的克隆，并且由GeorgeP.Smith(UniversityofMissouri,USA)實驗室惠贈。有關(guān)該技術(shù)的其他信息，可見于下述網(wǎng)頁http:〃www.biosci.missouri.edu/smithgp/PhageDisplayWebsite/PhageDisplayWebsiteIndex.html選擇技術(shù)(生物淘洗)首先，在進行生物淘洗前，利用大腸桿菌C&c力en'c/n'aco/z')K91Kan菌林(由G.P.Smith提供，DivisionofBiologicalSciencesTuckerHall.著以聚乙二醇(PEG)/NaCl和CsCl梯度離心進行兩次沉淀而純化。由光譜測定法計算的噬菌體懸浮液的滴度是3.82xio14病毒體/ml，且感染性微粒的數(shù)量為1.3xl013TU/ml。在開始選擇測定前，將該噬菌體懸浮液的一部分進行測序，以便證實擴增并未影響克隆的多樣性。生物淘洗技術(shù)由在用鏈酶抗生物素封閉的平板中孵育代表所有具有15個氨基酸的變體的一組噬菌體組成(出于實施的目的)，所述平板用鏈酶抗生物素(IO^g/ml，溶解于0.1MNaHC03中，室溫下2小時)封閉，加入生物素化的IL-IO。生物素化的IL-10通過生物素-鏈酶抗生物素相互作用錨定于平板上，據(jù)此正確地顯示其與噬菌體所攜帶的肽的相互作用。使IL-10與濃度為3xl04病毒/ml的噬菌體所攜帶的肽接觸，并允許其孵育約12小時。孵育后，用PBS/Tween(phosphate-bufferedsaline/polyoxyalkylenederivativesofsorbitanfattyacidesters，磷酸緩沖鹽/山梨糖醇酐脂肪酸酯聚氧化亞烷基衍生物)洗滌5次，除去未結(jié)合的噬菌體，隨后，通過降低pH(洗脫緩沖液)，破壞IL-10和噬菌體所展示的肽之間分子相互作用，洗脫特異性結(jié)合的噬菌體。隨后通過在細菌菌4朱(五.co/z'K91Kan)中感染來擴增洗脫的噬菌體。該過程重復(fù)總計三輪，以便與IL-10特異性結(jié)合且具有高親和力的噬菌體的含量得以富集(圖3)。在每一輪中，漸進性地降低用來封閉平板的生物素化的IL-10的濃度，從2.5jig/ml至0.02pg/ml,最后為0.002^g/ml。因此，在每一輪中選擇的噬菌體具有程度逐漸增加的IL-10親和力。在該方法末，感染五.co"后，通過基因修飾的噬菌體提供的四環(huán)素抗性分離后，用引物對已經(jīng)基于對IL-10的親和力選擇的噬菌體進行測序。這允許在分離菌落獲得的眾多克隆的噬菌體中獲得展示的肽的序列。在總的已測序克隆中，對應(yīng)于每個克隆所攜帶的具有15個氨基酸的肽的序列重復(fù)的次數(shù)，給出了所述具有15個氨基酸的肽對IL-10的相對親和力程度。肽序列為了獲得由生物淘洗所獲得的噬菌體克隆，在存在這些噬菌體所感染的細菌菌落抗生素的情況下，進行選擇，所述細菌菌落的抗性由存在于噬菌體基因組中的四環(huán)素抗性基因賦予。利用此方法，僅被噬菌體感染的菌落生長。每個菌落因此含有單個噬菌體的基因組，在所述單個噬菌體表面展示的單個肽的序列與所述單個噬菌體基因組相對應(yīng)。從噬菌體感染的細菌菌落中提取DNA，所述噬菌體來自通過生物淘洗的最后一輪選擇，且利用與SEQIDNO:27確定的某區(qū)域緊密雜交的特異性引物，對含有該區(qū)域的基因組部分進行測序，所述區(qū)域?qū)?yīng)于噬菌體的蛋白pIII中展示的肽。由此獲得表1所顯示的序列，在表1中，還顯示了所述序列攜帶的菌落(克隆)的編號。表l:與IL-10相互作用的、來自噬菌體的氨基酸序列肽編號SEQIDNO:菌落編號Pl125P2229P532P741P81P963P102P1382P1494P15103P16113P18123P19132P20141P21151P22161P23171P24182P25191P26201P2921124<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>每個序列的克隆(菌落)編號給出了肽和IL-10之間相對親和力程度，即克隆編號越大，則結(jié)合親和力越強。然而，親和力程度并不對應(yīng)于阻斷IL-10活性的能力，因為，一些最具活性的肽，如SEQIDNO:6(P9)和SEQIDNO:17(P23)所示的肽，分別提供了3和1個克隆，而SEQIDNO:2所示的肽，提供了29個克隆，其在抑制測定(實施例3)中活性低的多。盡管不希望與任何理論相關(guān)，但此問題可以根據(jù)最具活性的肽可能阻斷IL-10與其受體結(jié)合來解釋。肽序列比4交利用/人互聯(lián)網(wǎng)上獲得Qittp:〃www.expasv.org/tools/dna.html)的"翁3譯工具(translatetool)"程序，分析所獲得的序列，該程序允許推導(dǎo)隨后用來工作的序列?？偣矞y序了143個克隆，這允許鑒定35種不同的肽(P1-P35)，其中所述肽的9種(P3、P4、P6、Pll、P12、P17、P27、P28和P30)也發(fā)現(xiàn)于利用其他蛋白的其他生物淘洗測定中，因此，認為它們不是特異的與IL-10結(jié)合，因此，可以丟棄它們。這些非特異性的結(jié)合可歸因于與選擇過程中存在的組分(塑料制品、生物素、鏈酶抗生物素等)的相互作用和/或歸因于噬菌體表面蛋白。實施例2基于人IL-10(hlL-10)和其受體的復(fù)合體的結(jié)構(gòu)設(shè)計肽在該實例中，考慮(ML-IO)-(ML-IO受體)復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，研發(fā)人IL-10(hlL-10)抑制劑。在所述結(jié)構(gòu)中，在ML-10的一級結(jié)構(gòu)中存在兩個a螺旋區(qū)(氨基酸19-35和氨基酸86-110),它們以反向平行的方式定位，并且與ML-10和其受體的相互作用有關(guān)。這些肽的序列顯示如下(SEQIDNO:28)LeuProAsnMetLeuArgAspLeuArgAspAlaPheSerArgValLysThr(hIL-10的氨基酸19-35)(SEQIDNO:29)AsplieLysAlaHisValAsnSerLeuGlyGluAsnLeuLysThrLeuArgLeuArgLeuArgArgCysHisArg(hIL-10的氨基酸86-110)?；谶@些序列，本發(fā)明人推測，下文表2所示且在其C末端(所述末端已酰胺化)具有修飾的肽，可能與ML-10的區(qū)域(或與ML-10受體的區(qū)域)結(jié)合，并阻止hlL-10和其受體間的相互作用。因此，預(yù)測表2中所示且SEQIDNO:30、SEQIDNO:31和SEQIDNO:32所示的肽將與ML-10受體結(jié)合，而SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35和SEQIDNO:36所示的肽將與hIL-10結(jié)合。表2:預(yù)測為ML-10潛在抑制劑的肽<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>Rev:反向閱讀的肽序列；以及comp:序列具有互補的殘基，換句話說，它們可以主動地與相關(guān)序列的殘基相互作用。因此，例如，限定為"comp99-107"(SEQIDNO:35)的肽，因為氨基酸Lys和Arg存在于所述肽99-107(下文粗體所示)中，其氨基酸序列與包含于氨基酸99和氨基酸107(肽99-107)的hIL-10片段的氨基酸序列互補，可以與所預(yù)測的肽的氨基酸Asp(也以粗體顯示)相互作用，并且其設(shè)計為"comp99-107":99-107LysThrLeuArgLeuArgLeuArgArgcomp99-107AspThrLeuAspLeuAspLeuAspAsp(SEQIDNO:35)。實施例3在用MC/9細胞進行的增殖測定中通過肽抑制IL-10的體外生物學(xué)活性MC/9細胞系(CRL-8306,美國典型細胞培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),美國維吉尼亞)是衍生于小鼠肝臟的肥大細胞，它們在懸浮液中生長，并且它們的增殖受外源性地加入至培養(yǎng)基中的IL-10的存在的誘導(dǎo)。為此，通過抑制所述細胞因子的合成肽抑制外源IL-10的作用，降低了MC/9細胞的生長，這允許體外測量所述肽的IL-10抑制活性。在此測定中，增殖間^換地測定為DNA合成過程中含氚的胸苷的并入。當(dāng)評估人IL-10(ML-IO)和小鼠IL-10(mlL-10)兩者的抑制時,進行該測定的最適宜條件如下。以在完全培養(yǎng)基中的初始密度為20,000個細胞/孔，向96孔板中加入MC/9細胞，所述培養(yǎng)基為具有10%FBS(10270-106Gibco)，50|Lig/mL鏈霉素和50U/mL青霉素(15140-122Gibco),2mM谷酰胺(BE17-605EBioWhittaker)和2巰基乙醇的DMEM(BE-12-604FBioWhittaker),如果合適，添加5%RAT-STIM(354115BectonDickinson)和0.5ng/mL小鼠IL隱4(PreprotechEC,London,UnitedKingdom)和1.25ng/mLhIL-10(e匿Bioscience)或mIL-10(e-Bioscience)，將它們在37。C和5%C02下孵育24小時。之后，每孔力口入1(iCi曱基-3H-胸苦(AmershamLifeScience,Buckinghamshire,UnitedKingdom),并將平板在相同的條件下孵育多于12小時。最后，收獲細胞，含氚的胸苷并入合成的DNA中，轉(zhuǎn)移至平板(UniFilter-96GF/C,PerkinElmer)，并在加入閃爍液(scintillationliuquid)后在閃爍計凄t器(TopCount,MicroplateScintillationCounter,Packard)中定量力文射性，并且測量每個孔每分鐘計數(shù)(cpm)的發(fā)射，對其進行定量。利用不同濃度(150、100和50lig/ml)的待測定的每種肽，測定肽的抑制能力。如果合適，將肽溶液與1.25ng/mlhlL-10或mlL-10—起孵育2小時，隨后加入MC/9細胞與小鼠IL-4，以1更IL-4的終濃度是0.5ng/ml。陰性增殖對照由與小鼠IL-4一起孵育的細胞構(gòu)成，而陽性增殖對照由與小鼠IL-4和IL-10—起孵育的細胞構(gòu)成。如果適當(dāng)，用4t入IL-10^^1(G畫BiosciGncG)《^L-'J、tIL-10^^#(e-Bioscience)(3ng/ml)作為抑制對照。每種肽一式三份進行分析。結(jié)果表示為通過下述公式計算的抑制百分比%抑制=(cpmmax-cpmexp)/(cpmmax—cpmmin)x100其中"cpmmax"是每分鐘的最大計數(shù)；"cpmexp"是肽的每分鐘的實驗計數(shù)；以及"cpmmin"是每分鐘的基線計數(shù)。利用AthertonFmoc變體(Atherton,E.,Logan,J.C.andSheppard,R.C.1989.PeptidesynthesisII.ProceduresforsolidphasesynthesisusingTV-fluorenylmethoxycarbonylaminoacidsonpolyamidesupports.SynthesisofsubstancePandofacylcarrierprotein65—74decapeptide(肽的合成n，'利用聚酰胺支持體上的n藥甲氧羰酰氨基酸固相合成方法，P物質(zhì)和?；d體蛋白65-74十肽的合成).,CAew.Peryb'w7>a"s.1:538)，根據(jù)常規(guī)方法，通過肽合成獲得測定的肽(圖4)。肽的純度通過反相高效液相色譜(HPLC)和/或質(zhì)語測定。就其抑制IL-10活性的能力而言，僅純度等于或大于80%的那些肽得以檢測。為了測量肽抑制IL-10的能力，必須將它們置于以MC/9細胞進行增殖測定的培養(yǎng)基中的溶液中。為此，首先試圖將肽以lmg/ml的濃度溶解于完全培養(yǎng)基中，由于在這些條件下表1的26種肽中僅10種是可溶的，且2種是部分可溶的(表3)這一事實，必須通過加入不同比例的二曱基亞砜(DMSO)或尿素來改善剩余肽的溶解性。還檢測了其他增溶劑，如鹽酸胍、乙醇、曱醇、異丙醇、二曱基曱酰胺(DMF)、丙酮、乙腈、氨和乙酸，但由于它們對于細胞不是非常有效或是有毒的這一事實，因而放棄使用它們。為了盡可能地限制DMSO或尿素的毒性，培養(yǎng)基中兩種試劑的濃度盡可能地低，且與體外測定相容。因此，首先確定允許進行MC/9細胞的體外增殖測定的、待加入的增溶劑的最大濃度。如上文所示，檢測了1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005和0.001%乙酸、氨、DMSO、DMF、丙酮、乙腈、異丙醇、曱醇和乙醇，以及2、1、0.5、0.250、0.125、0.062和0.031M的尿素和鹽酸胍。在所有檢測的濃度中，鹽酸胍的毒性非常強。乙酸、DMSO和DMF與測定相容的最終最大濃度為0.01或0.005%，該濃度不能使肽溶解。如果是尿素，界限濃度為125mM，對于氨，為0.2%(檢測的最大濃度)。就醇而言，它們高達1%(最大)是相容的，且丙酮和乙腈看起來誘導(dǎo)MC/9細胞增殖。DMSO:檢測用DMSO(1mg/mL母液的2%的終體積)和干凈培養(yǎng)基重懸浮的、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:9、SEQIDNO:12、SEQIDNO:15和SEQIDNO:16所示的肽。在將它們用超聲波降解后，除了SEQIDNO:16所示的肽外，所有的肽仍然都是渾濁的。曱醇/乙醇為了利用這些醇溶解肽，必須使用100%的它們，且在此濃度下，它們對MC/9細胞是有毒性的。即使在70%下，它們也是有毒的。尿素將SEQIDNO:6、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18和SEQIDNO:20所示的肽溶解于8M尿素(在lmg/mL中的終濃度為0.8M)和完全培養(yǎng)基中。相對來說，尿素是有毒性的(無尿素的cpm為1.128，120mM的尿素時，為109,80mM時，為308，20mM時，為800,但維持窗口)。用來溶解肽的條件概括于表3中。在所示的39種肽中，ll種(粗體顯示)不能用任何所述條件溶解，因此，它們不能在體外測定中得到檢測。表3:用于溶解lmg/mL的肽的條件<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>不能以任何所4企測的條件溶解的肽以粗體顯示。partS:部分可溶；S:可溶；I:不溶。由于IL-10促進MC/9細胞增殖這一事實，向已經(jīng)加入外源IL-10的MC/9細胞中加入能抑制IL-10活性的肽，具有抑制這些細胞增殖的作用。然而，向培養(yǎng)物中加入對MC/9細胞有毒性的肽或任何組分(用來改善肽的溶解性)，也具有抑制細胞增殖的作用。因此，為了確保肽真正地抑制IL-10,而不是由于對細胞的毒性抑制增殖，必須證明向培養(yǎng)物中加入的肽或其他試劑對細胞來說是非毒性的。為此，利用小鼠斗立細月包-單沖亥細月包集落刺5敫因子(mousegranulocyte-monocytecolony-stimulatingfactor,mGM-CSF，其也促進MC/9細胞增殖)代替IL-IO，進行肽的并行測定。所用的mGM-CSF的濃度為0.01ng/mL。在此情況下，不用IL-4作為共刺激物(co-stimulus)。將毒性表示為mGM-CSF所i秀導(dǎo)的增殖的抑制百分比。就溶解于尿素中的肽而言，當(dāng)分析IL-10抑制和毒性兩者時，包括陰性對照、陽性對照和具有存在于肽樣品中的尿素濃度(120mM、80mM和20mM)的抗體的對照，以及無尿素對照。將樣品的cpm值與含有相同濃度尿素的對照的值進行比較，計算肽在每一濃度下的抑制百分比。通過考慮圖4所示的肽[P1(SEQIDNO:1)、P2(SEQIDNO:2)、P7(SEQIDNO:4)、P9(SEQIDNO:6)、PIO(SEQIDNO:7)、P13(SEQIDNO:8)、P15(SEQIDNO:10)、P16(SEQIDNO:11)、P19(SEQIDNO:13)、P20(SEQIDNO:14)、P22(SEQIDNO:16)、P23(SEQIDNO:17)、P23-3(SEQIDNO:43)、P23-4(SEQIDNO:44)、P24(SEQIDNO:18)、P25(SEQIDNO:19)、P26(SEQIDNO:20)、P31(SEQIDNO:22)、P32(SEQIDNO:23)、P33(SEQIDNO:24)、P34(SEQIDNO:25)、P35(SEQIDNO:26)、F24(SEQIDNO:30)、F25(SEQIDNO:31)、F27(SEQIDNO:33)、F28(SEQIDNO:34)、F29(SEQIDNO:35)和F30(SEQIDNO:36)]導(dǎo)致的IL-10的抑制百分比，以及它們的毒性，觀察到-在表3的12種肽中，其在完全培養(yǎng)基中是可溶的或部分可溶的，P7(SEQIDNO:4)、P10(SEQIDNO:7)和P20(SEQIDNO:14)(圖4)所示的肽不具有顯著的ML-10或mlL-10抑制活性(值為約10%-20%抑制)；剩余的肽具有30%至50%的IL-10抑制活性。P15(SEQIDNO:10)、P19(SEQIDNO:13)、P25(SEQIDNO:19)和P34(SEQIDNO:25)所示的肽活性最強。-對于利用尿素而溶解的肽[P9(SEQIDNO:6)、P22(SEQIDNO:16)、P23(SEQIDNO:17)、P23-3(SEQIDNO:43)、P23-4(SEQIDNO:44)、P24(SEQIDNO:18)和P26(SEQIDNO:20)所示的肽]而言,P9(SEQIDNO:6)和P22(SEQIDNO:16)所示的肽活性很強，其IL-10抑制活性為約60%;該組剩余的肽是無活性的，且P24(SEQIDNO:18)和P26(SEQIDNO:20)所示的肽對MC/9細胞有部分毒性；以及-在基于與IL-10序列區(qū)"互補"的考慮預(yù)測的肽組(實施例2)[F24(SEQIDNO:30)、F25(SEQIDNO:31)、F27(SEQIDNO:33)、F28(SEQIDNO:34)、F29(SEQIDNO:35)和F30(SEQIDNO:36)所示的肽中]中，F(xiàn)28(SEQIDNO:34)、F29(SEQIDNO:35)和F30(SEQIDNO:36)所示的肽也顯示了一些IL-IO抑制活性。實施例4在抑制混合淋巴細胞應(yīng)答(mixedlymphocyteresponse,MLR)測定中，通過能與IL-10結(jié)合的肽，體外抑制Karpas調(diào)節(jié)T細胞(Xfl"^regulatoryTcells)的生物學(xué)活性有文獻最近描述了具有產(chǎn)生IL-10和調(diào)節(jié)T細胞特征的、衍生于人淋巴細胞的Karpas299細胞系(DSMZACC3l)的存在。用這些細胞進行"混合的淋巴細胞反應(yīng)，，或MLR。這種技術(shù)基于在具有不同組織相容性的不同來源的淋巴細胞共培養(yǎng)物中產(chǎn)生IFN-y,所述不同來源的淋巴細胞將彼此識別為外源的。這種反應(yīng)使淋巴細胞增殖，分泌包括IFN-y在內(nèi)的細胞因子。對于該測定而言，將每個供體的100,000個細胞(MLR陽性對照)單獨或與數(shù)量漸增的Karpas299細胞(O-IOO,OOOKaww299)—起培養(yǎng)于96孔板中。為了測量肽的活性，每孔加入100|ig/mL的每種肽。48小時后，移走上清液的等分試樣以測量IFN-y。在此情況下，由于^z^os"9細胞系的存在在MLR增值中掩蓋了任何可能的作用這一事實，因此不可能測量細胞增殖。IFN-y的測量結(jié)果顯示于圖5中。在本測定中，肽Pl(SEQIDNO:1)、P13(SEQIDNO:8)、P15(SEQIDNO:10)、P19(SEQIDNO:13)、P20(SEQIDNO:14)、F24(SEQIDNO:30)、F25(SEQIDNO:31)、F28(SEQIDNO:34)和F29(SEQIDNO:35)作為IL-10活性抑制劑的作用顯著。實施例5用Th0決定子免疫后，體外再刺激淋巴細胞，通過定量上清液中所產(chǎn)生的干擾素-7(lFN-7)，能與IL-10結(jié)合的肽「P9(SEOIDNO:6)和PI3(SEQIDNO:8)l對體外Thl應(yīng)答的誘導(dǎo)作用取決于序列的特征，通過肽(抗原)誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)的應(yīng)答，產(chǎn)生特異性的細胞因子譜。輔助決定子肽誘導(dǎo)衍生于Thl特征(細胞毒性應(yīng)答)或Th2(體液應(yīng)答)的Th0應(yīng)答，Thl或Th2的特征均為特異性的細胞32因子譜。存在抑制Thl特征且導(dǎo)致針對Th2特征的免疫應(yīng)答的IL-IO，利于最佳Th2特征(由IL-4的存在限定)。在此情況下，在誘導(dǎo)Th0型應(yīng)答過程中，用IL-10抑制劑治療，具有Thl型細胞因子誘導(dǎo)作用(IFN-力。就本項研究而言，已選才奪6種優(yōu)化的肽作為Th0決定子，其中3種衍生于卵白蛋白(OVA)，3種衍生于抹香鯨(FISEA)的肌紅蛋白(MIO)(表4)。表4:衍生于OVA和FISEA的Th0決定子肽<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>用來進行本次測定的IL-10抑制肽是不溶的肽P9(SEQIDNO:6)和可溶的P13(SEQIDNO:8)。簡而言之，用200弗氏不完全佐劑(Freund，sincompleteadjuvant)和含有50納摩爾的相應(yīng)Th0決定子肽的含水溶液的1:1乳劑，皮下免疫4-6周齡的雌性BALB/c小鼠。免疫10天后，處死小鼠，提取腹股溝、主動脈周和腿彎部的淋巴結(jié)以及脾。在96孔U底板中，在存在或不存在免疫中所用的濃度為30mg/ml的肽，以及在存在或不存在IL-10抑制肽[P9(50mg/ml)和P13(100mg/ml)]的情況下，將提取的淋巴細胞在終體積為200pl的完全培養(yǎng)基(MC;RPMI1640，10%FBS;2mM谷酰胺，100U/ml青霉素；100ng/mL鏈霉素；5x105M2/3-巰基乙醇；25mMHepes以及0.5%(v/v)丙酮酸鈉)中培養(yǎng)48小時。37。C和5。/。C02下培養(yǎng)48小時后，每孔取100上清液(50用于定量IFN-y+50|iL用于定量IL-IO)。將上清液水凍于-20。C,直到通過ELISA才支術(shù)測定細胞因子。在本次測定中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，來自用肽FISEAG(SEQIDNO:38)免疫的動物的淋巴細胞，在用該肽體外再刺激后，相對所^r測的其他肽，產(chǎn)生的IFN-y的水平最高(圉6)。而且，這些IFN-y的水平過與IL-10抑制相容的機制，在存在肽P9(SEQIDNO:6)和P13(SEQIDNO:8)的情況下，明顯增加。事實上，該肽[FISEAG(SEQIDNO:38)]是在上清液中誘導(dǎo)可檢測的IL-10水平(70pg/mL)的唯一肽。實施例6皮下接種CT26細胞后，能與IL-10結(jié)合的肽「P9(SEOIDNO:6)和P13(SEQIDNO:8)l對誘導(dǎo)抗腫瘤應(yīng)答的影響IL-10是具有強有力的有關(guān)肺瘤生長的免疫抑制作用的細胞因子。因此，其是許多腫瘤產(chǎn)生的、作為預(yù)防有效的免疫學(xué)應(yīng)答機制的細胞因子。在本實施例中，在用佐劑免疫進行腫瘤內(nèi)免疫治療或不進行腫瘤內(nèi)免疫治療的情況下，皮下接種CT26細胞[小鼠結(jié)腸腺癌細胞系(Fearon,E.R.，Vogelstein,B.1990.Ageneticmodelforcolorectaltumorigenesis.Cell61:759)]，隨后誘導(dǎo)抗肺瘤細胞毒性應(yīng)答，之后，在肺瘤生長模型中檢測肽P9(SEQIDNO:6)和PI3(SEQIDNO:8)的作用，所述佐劑為激活樹突細胞、NK細胞和T細胞的聚肌苷-聚胞香酸(polyinosinic-polycytidylicacid)和抗-CD40激動劑抗體。在本次測定中，將Balb/C小鼠用5x105CT26腫瘤細胞激發(fā)，用200^LPBS皮下接種，分成4組(1)對照組用CT26細^>接種的小鼠。(2)佐劑組通過腫瘤內(nèi)途徑用100iiLPBS中的50polyI:C和50pg抗-CD40處理0、7和14天的小鼠。(3)抑制劑組每只小鼠僅用在PBS中的IL-10抑制劑即50P9(SEQIDNO:6)通過腫瘤內(nèi)途徑以及50貼P9(SEQIDNO:6)通過腹膜內(nèi)途徑每周處理三次共處理三周的小鼠。(4)完全組用佐劑外加IL-10抑制劑處理的小鼠。當(dāng)胂瘤直徑達到5-6mm時，視為"0"天。用IL-10抑制肽處理能保護6.6%的動物，并對腫瘤生長產(chǎn)生很大程度的延遲(圖7)。佐劑保護53%的動物，并顯著降低腫瘤生長的平均水平(圖7)。佐劑和IL-10抑制劑的組合相對僅用佐劑處理的組而言輕微限制肺瘤生長的平均水平(圖7)，但增加了針對肺瘤保護的百分比，高達76.6%。本實施例清楚地表明，IL-10抑制肽在該因子介導(dǎo)的免疫抑制背景下在腫瘤發(fā)展中的適用性。實施例7人IL-10和能與IL-10結(jié)合的肽「P9(SEQIDNO:6)和P13(SEOIDNO:8)l之間的生物分子相互作用，以及通過表面等離子共振分析測定的其衍生物通過表面等離子共振(SPR)分析，測量人IL-10與肽P9(SEQIDNO:6)和P13(SEQIDNO:8),以及下述截短的和/或修飾形式的P9之間的生物分子相互作用表5<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>*)單字母代碼的氨基酸命名由表5可以看出SEQIDNO:45[P9(2匿15)]是包含肽P9(SEQIDNO:6)第2-15位氨基酸序列的肽；SEQIDNO:46[P9(l-14)]是包含肽P9(SEQIDNO:6)第1畫14位氨基酸序列的肽；SEQIDNO:47[P9(l-13)]是包含肽P9(SEQIDNO:6)第1-13位氨基酸序列的肽；SEQIDNO:48[P9(2-14)]是包含肽P9(SEQIDNO:6)第2-14位氨基酸序列的肽；SEQIDNO:49[P9(2-13)]是包含肽P9(SEQIDNO:6)第2-13位氨基酸序列的肽；SEQIDNO:50[P9(3-14)]是包含肽P9(SEQIDNO:6)第3-14位氨基酸序列的肽；SEQIDNO:51[P9(15Ala)]是包含肽P9(SEQIDNO:6)的氨基酸序列的肽；其中在第15位(Phe)的氨基酸已經(jīng)被Ala取代；SEQIDNO:52[P9(14Ala)]是包含肽P9(SEQIDNO:6)的氨基酸序列的肽；其中在第14位(Val)的氨基酸已經(jīng)被Ala取代；以及SEQIDNO:53[(1畫13;1Ser)]是包含肽P9(SEQIDNO:6)第1-13位氨基酸序列的肽；其中第13位(Ala)的氨基酸已經(jīng)被Ser取代。為了進行本次測定，使用BiosensorBIAcoreX(BIAcore,AB,Uppsala,Sweden)。簡而言之，如DeCresce畫"a/.2001(JBC,Vol276;29632-29643)中所述，將人重組蛋白IL-10(R&DSystems,catNo.217-IL/CF)共價固定于CM5芯片(BIAcore)的流式細胞2(flowcell,FC2)的表面。用在表面沒有固定IL-10的流式細月包l(FCl)作為對照流式細胞。以30pl/分鐘的流速，注射至少兩次肽溶液(10pM)，所述肽溶液在10mMHepes緩沖液pH7.4,150mMNaCl,0.005%Tween20(PolyoxyethyleneSorbitanMonolaurate,聚氧乙烯山梨醇單月桂酸酯)中。從在FC2獲得的應(yīng)答減去在FC1中獲得的應(yīng)答，處理結(jié)合曲線。將平衡時的應(yīng)答在檢測肽和相同長度的不相關(guān)對照肽之間進行比較。所用的對照肽是肽P301(SEQIDNO:54)(源自HIV-1包被，gpl20(301-315):NNTRKRIRIQRGPGR)。以質(zhì)量修正因子(masscorrectionfactor)MW(PX)/MW(P)乘每次應(yīng)答，其中，MW(PX)是檢測肽P的分子量，MW(P)是對照肽(P301)的分子量。觀察到所檢測的不同肽都產(chǎn)生陽性信號，這清楚地表明，它們能與IL-10特異性結(jié)合。圖8表示通過SPR分析獲得的生物分子相互作用特征的實例，所述生物分子相互作用發(fā)生于IL-10和肽P9(SEQIDNO:6)之間，以及用對照肽[P301(SEQIDNO:54)]獲得的生物分子相互作用。圖9表示由SPR分析所測量的生物分子相互作用獲得的結(jié)果，所述生物分子相互作用存在于IL-10和肽P9(SEQIDNO:6),P13(SEQIDNO:8)以及它們平截的和/或修飾的形式P9(2-l5)(SEQIDNO:45)、P9(l-14)(SEQIDNO:46)、P9(l-13)(SEQIDNO:47)、P9(2-14)(SEQIDNO:48)、P9(2-13)(SEQIDNO:49)、P9(3-14)(SEQIDNO:50)、P9(15Ala)(SEQIDNO:51)、P9(14Ala)(SEQIDNO:52)、P9(l-13;1Ser)(SEQIDNO:53)之間?？傊?，良好的相互作用發(fā)現(xiàn)存在于IL-10和測定的肽之間。當(dāng)分析衍生于P9(SEQIDNO:6)的肽時，觀察到，對羧基端的氨基酸進行修飾，不影響其與IL-10結(jié)合的能力；然而，如果肽在其氨基端或羧基端是截短的，則發(fā)現(xiàn)肽與IL-10結(jié)合的能力是改善的。實施例8能與IL-10結(jié)合的肽P9(SEOIDNO:6)和P13(SEQIDNO:8)對IL-10與其膜受體結(jié)合所誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子STAT3磷酸化的影響。IL-10的活性受特異性膜受體IL-10R結(jié)合的介導(dǎo)，所述受體在種類繁多的免疫細胞中表達。IL-10/IL-10R相互作用吸引并捕獲磷酸化和激活轉(zhuǎn)錄因子STAT3(SignalTransducerandActivatorofTranscription3，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物和轉(zhuǎn)錄激活劑3)的2種激酶(Jakl和Tyk2),STAT3以非活性形式見于細胞質(zhì)中，并且是IL-10所有已知功能所必需的(DonnellydaZ.，JournalofInterferon&CytokineResearch.June1，1999，19(6):563-573)。檢測肽P9(SEQIDNO:6)和P13(SEQIDNO:8)能與IL-10結(jié)合抑制IL-10誘導(dǎo)的STAT3磷酸化的能力。利用對人和鼠IL-10應(yīng)答的MC/9細胞(CRL-8306,美國典型細胞培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，美國維吉尼亞)進行測定。在96孔U底板(TPP,92097)中，且在與細胞接觸前，將肽P9(SEQIDNO:6)和P13(SEQIDNO:8)以50pg/ml的濃度，與濃度為0.15ng/ml的IL-10在37。C和5%C02T、在體積為100^1的完全培養(yǎng)基(RPMI1640,10。/。胎牛血清(FBS);2mM谷酰胺，100U/ml青霉素；100pg/mL鏈霉素；5xl05M/3-巰基乙醇；25mMHepes和0.5。/。(v/v)丙酮酸鈉)中，孵育2小時。隨后，每孔加入2xl05個，并在37。C和5。/。C02下再孵育2小時，終體積為200fil/孔。以1,500rpm離心細胞5分鐘并棄掉上清液后，將沉淀重懸浮于150加樣緩沖液(10%甘油、5%2-巰基乙醇、2%十二烷基硫酸鈉、Tris-HCl62.5mM[pH6.8]、0.006%溴酚藍)，進行電泳，并將樣品在-80。C下水凍。由這些樣品進行Western印跡，測定在所測定的不同條件下磷酸化的STAT-3的量，包括陰性對照(僅細胞)和陽性對照(細胞+IL-10)。也測定每個樣品中肌動蛋白的量，作為分析對照。在密度計中分析Western印跡中所獲得的條帶，以便定量它們中每一個的含量。用相應(yīng)的肌動蛋白對照校正所獲得的每個樣品的密度計讀數(shù)。圖10表示肽P9(SEQIDNO:6)和P13(SEQIDNO:8)對IL-10所誘導(dǎo)的STAT3磷酸化的抑制作用。通過Western印跡(圖10A),分析磷酸化的STAT3表達。圖10B表示通過密度計定量的每個樣品的磷酸化的STAT3條帶的量和獲得的肌動蛋白對照的量的比值。實施例9在用B16-F10腫瘤細月包進^f亍的增殖測定中，IL-10抑制肽的作用IL-10免疫抑制作用與肺瘤生長相關(guān)，此類IL-10是許多腫瘤產(chǎn)生的細胞因子，用來逃避有效的免疫應(yīng)答。實際上，某些腫瘤細胞組成型地分泌IL-IO,其是惡性細胞增殖所必需的，已經(jīng)證明，它們的中和降低腫瘤細胞的生長。B16-F10(B16)黑素瘤系就是如此，其分泌相當(dāng)數(shù)量的IL-10,并且其增殖在存在IL-10中和抗體時受到抑制。在本次測定中，檢測IL-10抑制肽對生長需要該細胞因子的B16細胞增殖的活性。為了進行本測定，在存在或不存在肽P9(SEQIDNO:6)、P13(SEQIDNO:8)、P15(SEQIDNO:10)、P16(SEQIDNO:11)、P31(SEQIDNO:22)和P34(SEQIDNO:25)的情況下，將添加了2%PBS的RPMI培養(yǎng)基中的5,000個細胞/孔，培養(yǎng)于96孔板(組織培養(yǎng)板，96W,平底，具蓋，無菌，CELLSTARN。655180)中；用肽P301(SEQIDNO:54)作為陰性對照。所測定的肽的濃度為200pg/ml。因此在37°C和5%C02下將細胞孵育24小時。孵育時間結(jié)束后，用結(jié)晶紫染色細^>,通過用10%乙酸洗滌定量染沖牛，并在570nm下在ELISA讀數(shù)器中測量。在200貼/ml濃度下，檢測所有的肽。所獲得的結(jié)果包括于圖11中，并對應(yīng)于一式三份所進行的測定的平均值和偏差。實施例10當(dāng)在外周血單核細胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生IFN-a時，肽P13(SEOIDNO:8)對丙型肝炎病毒核殼(HCV核心)蛋白抑制活性的影響漿細胞樣樹突細胞(plasmacytoiddendriticcells,pDC)產(chǎn)生IFN-a對抗病毒免疫應(yīng)答非常關(guān)鍵。在丙型肝炎病毒(HCV)的情況下，所述病毒具有長期性傾向，逃避這種應(yīng)答的機制之一可能受單核細胞在與HCV核心蛋白通過受體TLR2(Toll樣受體2)結(jié)合后的激活介導(dǎo)，單核細胞激活后刺激諸如IL-10的細胞因子產(chǎn)生，諸如IL-10的細胞因子反過來才中制pDCs'產(chǎn)生IFN-a;(Dolganiuc&a/.，TheJournalofImmunology,2006,177:6758-6768)。用TLR9配體刺激外周血單核細胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMC)，誘導(dǎo)pDCs產(chǎn)生IFN-ce,且HCV核心的存在抑制IFN-o;的產(chǎn)生。這種抑制至少部分受單核細胞產(chǎn)生的IL-10的介導(dǎo)，因此決定檢測本發(fā)明提供的能與IL-10結(jié)合的肽在本系統(tǒng)中的作用。為此，從不同健康供體中獲得血液樣品，從該血樣樣品中通過Ficoll梯度(Ficollgradient,GEHealthcare,17-1440-03)分離PBMCs。在96孑LU底板中，每孔加入2x105個細胞，將細胞在RPMI培養(yǎng)基中孵育，所述培養(yǎng)基添加有10%FBS，以及濃度為5pg/ml的TLR9配體CpG(Genosys,ODN2216)、濃度為2.5pg/ml的重組HCV核心(BioDesign,R8A115)和肽P13(SEQIDNO:8)。用濃度為1貼/ml的抗IL-10抗體(eBioscience,16-7108-81)作為陽性對照。將細胞在37。C和5%C02下孵育48小時。孵育時間結(jié)束后，從每個孔中取上清液，利用商業(yè)試劑盒(MabTech，3424-1H-6),通過ELISA技術(shù)，測定產(chǎn)生的IFN-a。圖12以柱狀圖顯示了如前所述的在存在HCV核心的情況下，肽P13(SEQIDNO:8)對用CpG刺激的PBMC培養(yǎng)物中IFN-a產(chǎn)生的影響。顯示的結(jié)果代表了四次結(jié)果相似的實驗。權(quán)利要求1.能與IL-10結(jié)合的肽，選自a)肽，其氨基酸序列選自SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO9、SEQIDNO10、SEQIDNO11、SEQIDNO12、SEQIDNO13、SEQIDNO14、SEQIDNO15、SEQIDNO16、SEQIDNO17、SEQIDNO18、SEQIDNO19、SEQIDNO20、SEQIDNO21；SEQIDNO22；SEQIDNO23；SEQIDNO24；SEQIDNO25；SEQIDNO26；SEQIDNO33；SEQIDNO34；SEQIDNO35和SEQIDNO36，b)a)中限定的肽的變體；以及c)a)中限定的肽或b)中限定的變體的片段，包含5-15個連續(xù)的氨基酸；以及其藥學(xué)上可接受的鹽。2.如權(quán)利要求1所述的肽，選自SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52和SEQIDNO:53所示的肽以及它們藥學(xué)上可接受的鹽。3.如權(quán)利要求1所述的肽，其中所述肽能在體外和/或體內(nèi)抑制IL-10的生物學(xué)活性。4.如^又利要求3所述的肽，選自SEQIDNO:1、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:19和SEQIDNO:25所示的肽、其變體或片段以及它們藥學(xué)上可接受的鹽。5.核酸序列，編碼權(quán)利要求1-4中任一項所述的肽。6.基因構(gòu)建體，包含權(quán)利要求5所述的核酸序列。7.載體，包含權(quán)利要求5所述的核酸序列或權(quán)利要求6所述的基因構(gòu)建體。8.宿主細胞，包含權(quán)利要求5所述的核酸序列或權(quán)利要求6所述的基因構(gòu)建體或權(quán)利要求7所述的載體。9.藥物組合物，包含治療有效量的權(quán)利要求1-4中任一項所述的肽，以及至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑；或權(quán)利要求5所述的核酸序列，或權(quán)利要求6所述的基因構(gòu)建體，或權(quán)利要求7所述的載體，或權(quán)利要求8所述的宿主細胞，和藥學(xué)上可接受的載體。10.如權(quán)利要求6所述的藥物組合物，包含至少一種權(quán)利要求1-4中任一項所述的肽，以及任選地一種或多種不同的IL-IO抑制化合物。11.用于治療呈現(xiàn)IL-10表達的臨床狀態(tài)或病理病癥的產(chǎn)品，選自權(quán)利要求1-4中任一項所述的肽、權(quán)利要求5所述的核酸序列、權(quán)利要求6所述的基因構(gòu)建體、權(quán)利要求7所述的載體以及權(quán)利要求8所述的宿主細胞。12.如權(quán)利要求11所述的產(chǎn)品，用于治療包含Thl細胞應(yīng)答受到抑制的臨床狀態(tài)或病理病癥的呈現(xiàn)IL-10表達的臨床狀態(tài)或病理病癥。13.如權(quán)利要求11所述的產(chǎn)品，用于治療選自感染性疾病、腫瘤、癌癥和急性損傷情況的呈現(xiàn)IL-10表達的臨床狀態(tài)或病理病癥。14.如權(quán)利要求13所述的產(chǎn)品，用于治療由麻風(fēng)分枝桿菌(Myco6ac化n'畫/e/rae)、結(jié)核桿菌(M3;c0^cZm-謂勵erc"/as7i)、鼠疫耶爾森菌(yera/m'apesto)、幽門螺力走桿菌(//e/z'co6a"er/;;/on')、白色念珠菌(C朋^/aa/Zj/c朋力、紅色毛褲菌(7WcAo;一own/Zr謂)、曲霉(y^/erg/〃iw5"/.)或由惡'l"生癡原蟲(^P/fiwmod/i/W2/a/cz》an/m)、利4十曼病、弓形體病引起的感染；或用于治療霍奇金淋巴瘤、頭頸癌、黑素瘤或基底細胞瘤和由被UV突變的角質(zhì)細胞發(fā)展的鱗狀細胞癌；或用于治療燒傷和相關(guān)敗血癥。15.產(chǎn)生權(quán)利要求1-4中任一項所述的肽的方法，其包括，在允許產(chǎn)生所述肽的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求8所述的宿主細胞，以及如果需要，回收所述肽。全文摘要本發(fā)明涉及能與白介素-10(IL-10)結(jié)合的肽和其在治療與IL-10表達特別是與IL-10高表達有關(guān)的臨床狀態(tài)和病理病癥如感染性疾病、腫瘤、癌癥和急性損傷狀況中的用途。文檔編號C07K7/08GK101679488SQ200880015179公開日2010年3月24日申請日期2008年3月27日優(yōu)先權(quán)日2007年3月27日發(fā)明者伊尼斯·諾麗亞·凱撒瑞斯拉賈爾,勞瑞·曼特羅拉卡瑞阿卡,南?！さ蟻喫?瓦爾蒂斯法雷,哈維爾·多托爾德拉斯埃雷里亞斯,帕布魯·薩羅韋烏加里薩,弗朗西斯科·博拉斯奎斯塔,胡安·何塞·拉薩爾特薩加斯蒂韋爾薩,赫蘇斯·普列托巴爾圖埃納申請人:西瑪生物醫(yī)學(xué)信息公司