專利名稱：用于熔解分析的引物的制作方法
用于熔解分析的引物優(yōu)先權(quán)本申請要求2007年3月8日提交的題為“用于熔解分析的引物”的美國臨時申請 60/905，721的優(yōu)先權(quán)，其全文在此通過引入的方式納入本文。
背景技術(shù)：
人類基因組計劃已經(jīng)成功地測序了人類DNA的大部分區(qū)域。鑒定與疾病相關(guān)的基 因和序列變異的工作以飛快的速度持續(xù)著。連鎖分析被用于建立表型與諸如簡單序列重復(fù) 或單核苷酸多態(tài)性(SNPs)的遺傳標記之間的聯(lián)系，以鑒定候選基因。序列變異包括導(dǎo)致錯 義、移碼或剪切突變的SNPs、插入以及缺失，并可用于精確定位相應(yīng)突變的基因和頻譜。然而，即使遺傳信息為人所知，仍難以將這些知識應(yīng)用在常規(guī)醫(yī)療實踐中，很大程 度是因為分析DNA的方法昂貴且復(fù)雜。當費用顯著降低并且方法明顯簡化時，可以預(yù)期DNA 分析適宜用在日常臨床實踐以有效檢測疾病及更好地治療。理想的DNA分析是快速、簡單 并且廉價的。當疾病是由有限數(shù)量的突變導(dǎo)致，或少數(shù)序列改變構(gòu)成大比例的病例時，直接基 因分型是可行的。傳統(tǒng)的方法包括經(jīng)典的PCR產(chǎn)物限制性消化到封閉管熒光方法。DNA分 析的封閉管方法可簡單地施行。一旦PCR起始，不再需要加入或分離其它的試劑。然而，封 閉管方法傳統(tǒng)上是昂貴的，很大程度上歸結(jié)于所使用的熒光探針的費用。盡管有很多精巧 的設(shè)計，這些探針通常與多個熒光染料和/或功能團復(fù)合。例如，一個流行的方法應(yīng)用熒光 染料和淬滅劑，其每一個共價地連接至等位基因特異的探針(1)。分型一個SNP需要兩個這 樣的“TaqMan ”探針。不僅僅是這些探針昂貴，雜交以及核酸外切酶切割所需的時間同樣 限制了 PCR施行的速度。封閉管基因分型的另一個例子應(yīng)用了Scorpion 引物，其可從DxS Ltd(DxS有限 公司)獲得。最初在1 999年描述過，Scorpion 引物，或“自探測擴增子”在PCR中從包 括包含探針元件的5’延伸物的引物、一對自補莖序列、一對熒光團/淬滅團以及阻止5’延 伸物復(fù)制的封閉單體中形成(2)。如

圖1所示，在起始的莖環(huán)形式中，探針元件形成環(huán)，莖部 分使熒光團和淬滅團緊密靠近。在PCR后，探針元件與延伸產(chǎn)物的一部分雜交，打開莖并將 熒光團和淬滅團分開。隨后形成圖1所示的附加的二聚體形式，其中Scorpion 引物上的 熒光團被在PCR之前形成二聚物的獨立互補探針上的淬滅團淬滅(3)。在PCR之后，成為擴 增子的一部分的探針元件，從淬滅探針中分離并雜交至擴增子。在這兩種情況中，探測是分 子內(nèi)的反應(yīng)。分子內(nèi)反應(yīng)相對于分子間反應(yīng)有幾個優(yōu)點。首先，分子內(nèi)反應(yīng)迅速且不是限制步 驟，即使與目前最快速的PCR方案一起也是如此(4)。探針元件通過分子內(nèi)反應(yīng)穩(wěn)定，增加 了探針熔解溫度約5-15°C，使得可應(yīng)用更短的探針在例如具有高序列變異的區(qū)域。在莖環(huán) 形式中，單個的寡核苷酸既充當引物之一，又充當探針。然而，這些探針可能是復(fù)雜并且昂 貴的。高成本是由生產(chǎn)某些探針的高度復(fù)雜性造成的。例如，每個Scorpion 引物需要對寡核苷酸引物進行三個修飾(熒光團、淬滅團以及封閉體)。保留Scorpion 引物的優(yōu)點但 消除了其復(fù)雜性和花費的封閉管熒光基因分型系統(tǒng)是可取的。還有另一種用于基因分型的方法，“回轉(zhuǎn)單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測，或SSCP”已經(jīng)被應(yīng) 用。SSCP應(yīng)用將二級結(jié)構(gòu)引入隨后通過電泳分離以揭示單鏈構(gòu)象多態(tài)性(“SSCP”)的PCR 產(chǎn)物的特異序列引物(5)。在回轉(zhuǎn)SSCP中，互補的8-llbp的引物尾端在延伸產(chǎn)物中的互補 序列上環(huán)回，在單鏈擴增子上產(chǎn)生一個發(fā)夾，其隨后通過凝膠分離檢測。如同上面所討論的，回轉(zhuǎn)引物(Snapback primer)可用于在延伸產(chǎn)物中引入二級 環(huán)結(jié)構(gòu)。然而，回轉(zhuǎn)引物以及本發(fā)明所討論的其它現(xiàn)有技術(shù)的方法依賴于擴增后的凝膠分 離，或應(yīng)用昂貴的熒光標記的引物。相反，本發(fā)明的方法應(yīng)用dsDNA染料以及熔解分析來監(jiān) 測發(fā)夾的雜交。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，在PCR之后，闡述性地而不限于非對稱PCR，發(fā)夾 的分子內(nèi)熔解使得可以基因分型。分子內(nèi)雜交展示在圖2中。該方法簡單，因為僅需要兩 個PCR引物，僅在至少一個引物的核苷酸上附加5’尾。不需要共價的熒光團、淬滅團或封 閉體，極大地削減了合成和分析開發(fā)的費用。因此，在一個示范性的具體實施方式
中，dsDNA 染料是無束縛的并自由地結(jié)合以及基于熔解獨自地從核酸釋放。一個阻止了更好的基因分型的方法的問題是大多數(shù)遺傳疾病是復(fù)雜的這個事實。 在相同或不同基因中的許多不同的序列變異可能促成疾病表型。最初希望大多數(shù)疾病由少 數(shù)序列變異所導(dǎo)致已經(jīng)被證明是不正確的。很多基因可以促成特定的表型，并且一個基因 內(nèi)的許多不同突變可以導(dǎo)致相同或相似的疾病模式。因而，為確定基因型及其產(chǎn)生的表型 之間的聯(lián)系，遺傳檢測通常要求平行分析很多編碼和調(diào)節(jié)區(qū)域。有幾種可用的篩選DNA異 常的方法并作為“掃描”方法為人所知。雖然“基因分型”重點于檢測特異序列突變，但突 變掃描可以標簽異常的存在，所述的異常隨后可通過諸如基因分型或測序的方法鑒定。測序是目前鑒定序列變異的黃金標準。即使費用在下降，當應(yīng)用于特異遺傳診斷 或藥物遺傳學(xué)時，測序仍然是復(fù)雜的過程，不是快速、簡單或廉價的。應(yīng)用polonies PCR(6) 或乳化PCR(7)的方法也是如此。標準測序要求七步1)PCR擴增，2)清理PCR產(chǎn)物，3)循 環(huán)測序試劑的添加，4)雙脫氧末端終止的循環(huán)測序，5)終止產(chǎn)物的清理，6)通過毛細管電 泳分離，以及7)數(shù)據(jù)分析。復(fù)雜度是自動的并存在于一些測序中心，但測序仍舊比本發(fā)明 的方法更復(fù)雜。進一步地，當分析大基因或多個基因時，超過90%的測序產(chǎn)物正常返回。能 夠識別正常序列以及常規(guī)突變的簡單方法將消除大部分的時間、費用以及測序努力。本發(fā)明的回轉(zhuǎn)引物可用于在同一反應(yīng)中整合突變掃描以及基因分型。掃描可以通 過同一反應(yīng)中的高分辨率擴增子熔解(8)來實施，并應(yīng)用相同的熔解曲線作為回轉(zhuǎn)基因分 型。用于回轉(zhuǎn)基因分型的非對稱PCR產(chǎn)生兩種具有不同熔解轉(zhuǎn)換的類型，即成發(fā)夾構(gòu)型的 多余單鏈以及雙鏈PCR產(chǎn)物，優(yōu)選地每種類型在不同溫度熔解。示范性地，回轉(zhuǎn)發(fā)夾在低溫 下熔解，全長擴增子在高溫下熔解。發(fā)夾提供了常規(guī)突變的靶向分型，而全長擴增子允許掃 描PCR產(chǎn)物內(nèi)的任意序列突變。相似地，應(yīng)用兩個回轉(zhuǎn)引物的對稱PCR可用于在一個反應(yīng) 中掃描以及分型兩個已知的多態(tài)性。在一個具有精確擴增熔點的已良好表征的基因中，據(jù) 信回轉(zhuǎn)基因分型一般可以消除至少90%以及可能高達99%的在復(fù)雜遺傳疾病分析中的測 序需求。掃描以及基因分型與回轉(zhuǎn)引物的組合是有吸引力的，因為其僅僅需要PCR試劑和 dsDNA染料。不需要昂貴的修飾寡核苷酸、分離、純化或添加試劑的步驟。封閉管分析消除了 PCR污染的風(fēng)險。此外，回轉(zhuǎn)引物退火迅速并且與最快速的PCR方案兼容。發(fā)明概述因此，本發(fā)明描述了不同構(gòu)型的回轉(zhuǎn)引物。本發(fā)明一個方面提供了用于核酸分析的方法，所述的方法包括以下步驟混合靶 核酸與第一引物和第二引物以形成混合物，所述引物被設(shè)計成用于擴增靶核酸，其中第一 引物包含特異于靶核酸一個位點的探針元件和模板特異的引物區(qū)域，其中所述探針元件在 模板特異引物區(qū)域的5’端，擴增靶核酸以產(chǎn)生擴增子，使得探針元件雜交至所述位點以形 成發(fā)夾，當混合物被加熱時通過測量結(jié)合dsDNA的染料的熒光生成探針元件的熔解曲線， 其中所述染料非共價結(jié)合至第一引物，并分析熔解曲線的形態(tài)。本發(fā)明提供了這種方法的 多種變化。本發(fā)明的第二個方面提供了用于同時掃描并基因分型靶核酸的方法，所述方法包 括以下步驟混合靶核酸與第一引物和第二引物以形成混合物的步驟，該引物被設(shè)計成用 于擴增靶核酸，其中第一引物包含特異于靶核酸一個位點的探針元件和模板特異的引物區(qū) 域，其中所述探針元件在模板特異引物區(qū)域的5’端，擴增靶核酸以產(chǎn)生擴增子，當混合物被 加熱時通過測量結(jié)合dsDNA的染料的熒光生成擴增子的熔解曲線，通過探針元件分子內(nèi)結(jié) 合至靶核酸調(diào)節(jié)混合物以促成發(fā)夾形成，和當混合物被加熱時通過測量結(jié)合dsDNA的染料 的熒光生成探針元件的熔解曲線。在本發(fā)明的第三個方面，提供了一種用于核酸分析的試劑盒，所述的試劑盒包含 有第一引物和第二引物，所述引物被設(shè)計成用于擴增靶核酸，其中第一引物包含特異于靶 核酸一個位點的探針元件和模板特異的引物區(qū)域，并且所述探針元件在模板特異引物區(qū)域 的5’端，以及dsDNA結(jié)合染料。在一個示范性的實施例中，所述dsDNA結(jié)合染料是飽和染 料。在另一個示范性的實施例中，試劑盒還包含熱穩(wěn)定的聚合酶和dNTPs。在考慮以下例證實施本發(fā)明最佳模式的優(yōu)選具體實施方式
的詳細描述后，本發(fā)明 的附加特征對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將會是顯而易見的。發(fā)明簡述圖1顯示了Scorpion 引物作用的示意圖。黑色環(huán)是封閉體，紅色環(huán)是淬滅團，小
綠色環(huán)是淬滅的熒光團，大綠色環(huán)是未淬滅的熒光團。圖2顯示了回轉(zhuǎn)引物的分子內(nèi)雜交。圖3顯示了應(yīng)用飽和染料以及未標記寡核苷酸探針的SNP基因分型。圖4是應(yīng)用回轉(zhuǎn)引物的基因分型示意圖。圖5A顯示了對稱PCR之后的應(yīng)用回轉(zhuǎn)引物的基因分型?；蛐惋@示為C/C(藍 色)，A/A (黑色)以及A/C (紅色)。圖5B顯示了應(yīng)用具有延伸封閉體的回轉(zhuǎn)引物的基因分型。圖6A圖解了具有不同長度探針元件的回轉(zhuǎn)引物。圖6B是圖6A探針元件的擴增產(chǎn)物的熔解導(dǎo)數(shù)圖(derivative meltingplot)。圖6C-F顯示了應(yīng)用具有不同探針元件長度的回轉(zhuǎn)引物的SNP分型的熔解導(dǎo)數(shù)圖 圖6C具有8堿基探針元件；圖6D具有14堿基探針元件；圖6E具有20堿基序列；圖6F具 有24堿基序列。圖6G顯示了 6到28個堿基對的不同發(fā)夾二聚體長度的預(yù)測及觀測到的熔解溫度。堿基錯配不存在于回轉(zhuǎn)引物的5’末端。預(yù)測的熔解溫度(實心方塊)通過標準的最 鄰近計算確定，包括兩邊的懸掛末端，但不考慮發(fā)夾環(huán)。在非對稱PCR和熔解之后，觀測到 的Tms (實心圓圈)通過如歸一化以及指數(shù)背景減法之后的負導(dǎo)數(shù)圖上的最大峰高確定。發(fā) 夾二聚體的6(%在8. 3-32. 變動。圖7A-B圖解了應(yīng)用回轉(zhuǎn)引物的PCR抑制的可能機制，圖7A顯示了小鏈3’末端的 可能延伸，圖7B顯示了兩個堿基錯配是如何阻止延伸的。圖7C顯示了應(yīng)用具有圖7B中圖解類型的雙堿基錯配的回轉(zhuǎn)引物的一百個臨床樣 品的標準化導(dǎo)數(shù)熔解圖?；蛐蜑榧兒献右吧?黑色)、雜合子(淺灰色)以及純合突變 子(深灰色)。圖8A顯示了具有阻止從發(fā)夾延伸的雙堿基錯配的回轉(zhuǎn)弓丨物中8、12、16、20堿基探 針元件的熔解導(dǎo)數(shù)圖。圖8B顯示了以純合子和匹配的雜合子模板非對稱擴增后的12以及16堿基探針 元件的熔解導(dǎo)數(shù)圖。圖9A圖解了不同長度的回轉(zhuǎn)擴增子，其中擴增子的長度是1 = 120bp，2 = 180bp，3 = 221bp，4 = 271bp 以及 5 = 321bp。圖9B顯示了圖9A中擴增子的熔解導(dǎo)數(shù)圖，黑色(120bp)，紅色(180bp)，藍色 (221bp)，綠色(271bp)以及黃色(321bp)。圖IOA圖解了具有不同環(huán)大小的回轉(zhuǎn)擴增子。環(huán)長度是0R = 17堿基，IR = 34 堿基，2R = 88堿基，3R= 135堿基，4R= 177堿基以及5R = 236堿基。圖IOB顯示了圖IOA擴增子的熔解導(dǎo)數(shù)圖。沒有應(yīng)用指數(shù)背景減法，解釋了導(dǎo)數(shù) 曲線的下行。圖IlA顯示了其中回轉(zhuǎn)引物用于擴增四種不同純合子模板的熔解導(dǎo)數(shù)圖，每種純 合子唯一不同的是在可變位點上具有一個不同的堿基。圖IlB顯示了其中回轉(zhuǎn)引物用于擴增一個配對純合子模板以及三個共享一個配 對等位基因的不同雜合子模板時的熔解導(dǎo)數(shù)圖。圖IlC顯示了其中回轉(zhuǎn)引物用于擴增一個配對純合子模板以及具有兩個錯配至 探針元件的等位基因的三個不同雜合子模板時的熔解導(dǎo)數(shù)圖。圖12A-B顯示了當回轉(zhuǎn)引物具有一個鄰近22堿基探針元件末端的錯配時的熔解 導(dǎo)數(shù)圖。圖12A證明了位置2的一個錯配，而圖12B在位置20具有錯配。圖12C-D顯示了其中回轉(zhuǎn)引物具有鄰近22堿基探針元件中間的錯配時的熔解導(dǎo) 數(shù)圖。圖12C在位置8有錯配，而圖12D在位置14有錯配。圖13顯示了應(yīng)用回轉(zhuǎn)引物的囊性纖維變性G542X突變的熔解導(dǎo)數(shù)圖?；蛐惋@ 示為純合野生型(藍色)，雜合子(黑色)以及純合突變子(紅色)。圖14A-B顯示了詢問CFTR外顯子10的F507-F508區(qū)域的回轉(zhuǎn)引物探針元件的 導(dǎo)數(shù)圖(圖14A)以及標準化熔解曲線(圖14B)野生型(黃色)，F(xiàn)507del het (黑色)， F508del het (藍色)，F(xiàn)508C het (紅色)以及 F508del homo (綠色)。圖15顯示了應(yīng)用詢問CFTR外顯子10的雙向回轉(zhuǎn)引物的多位點基因分型的導(dǎo)數(shù) 圖野生型(圓)，化合物F508del/Q493X雜合子(連接的小菱形)，I506V雜合子(小菱 形)，F(xiàn)508C雜合子(小方塊)，I507del雜合子(大方塊)，F(xiàn)508del雜合子(連接的大菱
8形)以及F508del純合子(連接的方塊)。圖16顯示了應(yīng)用5，-LCRed640標記的回轉(zhuǎn)引物(在72 °C紅跟蹤熔解)的從 LCGreen Plus至LCRed640的共振能量轉(zhuǎn)移的導(dǎo)數(shù)圖。相比較地，非粘附LCRed640標記的 探針的熔解曲線以藍色顯示，在63 °C具有熔解轉(zhuǎn)換。圖17是應(yīng)用回轉(zhuǎn)引物的基因分型和掃描的示意圖。圖18A-B顯示了應(yīng)用對稱PCR以及一個回轉(zhuǎn)引物的CFTR外顯子4的同時突變掃 描和基因分型。圖18A顯示了在以水稀釋前全長擴增子的熔解曲線，而圖18B顯示了在以 水10倍稀釋后的導(dǎo)數(shù)曲線。在稀釋后，在熔解前樣品通過加熱變性并冷卻野生型(黑色) 以及R117H雜合子(紅色)。發(fā)明詳述SYBR Green I (英杰生命技術(shù)有限公司(Invitrogen Corp)，加利福尼亞州 的爾斯巴德)是一種廣泛用于熔解分析的染料，原因是其在PCR過程顯示出巨大的熒光改 變(10，15)。SYBR Green I首先被用于熔解分析以區(qū)分在Tm上有2°C或更多差異的 不同PCR產(chǎn)物(21)。隨后，SYBR GreenI被用于鑒別缺失( 16)，二核苷酸重復(fù)序列基 因型(17)，以及鑒別各種序列變異(18-21)。然而，基因型之間的Tm差異可以很小并可以 挑戰(zhàn)現(xiàn)有設(shè)備的分辨率。實際上，有人建議SYBR Green I“不應(yīng)當用于常規(guī)基因分型應(yīng) 用”(22)。一般地應(yīng)用雙鏈特異DNA染料的熔解曲線基因分型可導(dǎo)致具有擴大熔解轉(zhuǎn)換的 升高的Tm(23)，以及基因型間Tm差異的壓縮。這些因素降低了SYBR Green I用于基因 型區(qū)別的可能性。雜合子DNA由四種不同的在變性以及冷卻時可產(chǎn)生兩種同源二聚體以及兩種 異源二聚體產(chǎn)物的單鏈組成。理論上，所有具有不同Tms以及熔解曲線的四種產(chǎn)物應(yīng)當 是所有四種雙鏈至單鏈轉(zhuǎn)換的復(fù)合體。然而，雙鏈特異DNA染料在熔解過程中可重新 分布(24)，導(dǎo)致染料從低熔解異源二聚體釋放并重新分布于高熔解同源二聚體。因為 SYBR Green I在PCR兼容濃度中是不飽和的(10)，這種重新分布是似是而非的，并且與 所觀察到的異源二聚體轉(zhuǎn)換的缺席相符合。最近，LCGreen I和LCGreen Plus(愛德霍技術(shù)有限公司(idahoTechnology， Inc.)，猶他州的鹽湖城)以及各種其它的飽和染料已被開發(fā)用于高分辨率應(yīng)用，包括用 于基因分型和掃描(參見共同未決美國專利申請10/531，996，10/827，890，11/485，851， 11/931，174，在此將其全文以引入的方式納入本文)。當僅有一個PCR產(chǎn)物被擴增，并且序 列是純合子時，僅有同源二聚體形成。應(yīng)用飽和染料，不同同源二聚體基因型之間的Tm值 差異未被縮小，基因型間的明確區(qū)分是可能的，甚至對于SNPs也是如此。這種飽和染料也 可以用于鑒定和區(qū)分一個反應(yīng)中存在的多個產(chǎn)物，例如多位點或多靶點擴增中生成的同源 二聚體(純合子)。相反，大多數(shù)情況下僅有一些產(chǎn)物可采用SYBR Gi"een I觀察到，這大 概是由于染料再分布導(dǎo)致。當一個或多個雜合子靶被擴增時，應(yīng)用飽和染料可容易觀察到異源二聚體產(chǎn)物。 檢測和鑒定異源二聚體的能力對檢測雜合子基因型以及掃描未知突變特別有用。在很多情 況下，在實時PCR中應(yīng)用傳統(tǒng)dsDNA染料(諸如SYBR Green I，SYBR Gold，以及溴 化乙錠)是不可能的，其中異源二聚體產(chǎn)物通常不可觀測。
應(yīng)用飽和染料，將所有單堿基雜合子從純合子中區(qū)分出來是可能的。在雜合子的 檢測中，絕對熔解溫度以及DNA濃度的影響不如在涉及純合子基因型區(qū)分方法中的重要。 異源二聚體影響熔解曲線的形態(tài)，特別是在“早期”，轉(zhuǎn)換的低溫部分。不同的熔解曲線可以 是通過轉(zhuǎn)換X軸為疊加“后期”轉(zhuǎn)換高溫部分而匹配的溫度。然后異源二聚體的存在與否 可以以更高的正確率推斷出來。未標記的寡核苷酸可與飽和染料相組合用于通過封閉管熔解分析的基因分型 (11)。示范性的，互補于未標記探針的產(chǎn)物鏈通過非對稱PCR過量產(chǎn)生，示例性地，互補引 物為5-10倍的過量。未標記探針可在3’末端封閉以阻止延伸，但不需要其它的修飾。基 因組DNA未標記探針基因分型的典型結(jié)果如圖3所示。帶有囊性纖維變性SNP G542X突變 的片段在28聚體的未標記探針存在下擴增(11)。顯示了應(yīng)用匹配野生型(頂部)或突變 型(底部)的探針的所有三種基因型(純合野生型-黑色實線，雜合子-紅線，以及純合突 變體-虛線)。應(yīng)用未標記探針可以分型探針下的區(qū)域，如圖3所示的，并且可以應(yīng)用完整 擴增子的熔解曲線掃描擴增子其它位置的突變，所述擴增子通常具有更高的熔解轉(zhuǎn)換。然而，封閉未標記探針的3’末端以阻止延伸通常是所希望的。封閉體是額外費用。 此外，未標記探針基因分型需要三個寡核苷酸兩個引物以及額外的未標記探針。此外，當 未標記探針相對較長(通常為25-35堿基)時能給出最佳信號(11)。最后，分子間雜交要 求未標記探針可以被靶序列的二級結(jié)構(gòu)所封閉，因為分子間雜交通常比二級結(jié)構(gòu)的分子內(nèi) 雜交要慢。本發(fā)明公開的回轉(zhuǎn)引物解決了很多這樣的問題。首先，僅需要兩個寡核苷酸，示例 性地，一個標準引物以及一個帶有作為整合探針元件的短尾的引物。其次，不需要封閉3’ 末端，因為探針元件是引物5’末端的一部分，并且引物的延伸是期望的。最后，回轉(zhuǎn)引物雜 交是分子內(nèi)的，因此雜交迅速并且?guī)缀醪簧婕皟?nèi)部結(jié)構(gòu)。當應(yīng)用飽和染料時，飽和染料可在 擴增中以足量濃度存在以檢測擴增子熔解后的異源二聚體。因此，回轉(zhuǎn)引物和飽和染料的 組合提供了一種封閉管溶液核酸分析方法。然而，盡管本發(fā)明實施例應(yīng)用飽和染料，但應(yīng)當 理解所述的回轉(zhuǎn)引物可以與其它染料一起使用，特別是不需要高分辨率或染料在擴增之后 加入不成為問題時。示例性回轉(zhuǎn)基因分型方案在圖4中做了圖解?；剞D(zhuǎn)引物顯示于左側(cè)，其具有不雜 交至靶核酸20的尾8。標準引物12顯示于右側(cè)。示例性地，核酸通過非對稱PCR擴增，從 回轉(zhuǎn)引物10延伸出比互補片段16更多的鏈14。然后冷卻擴增產(chǎn)物，生成來自回轉(zhuǎn)引物 10的分子內(nèi)發(fā)夾產(chǎn)物30與一些雙鏈全長擴增子40的混合物。擴增混合物的導(dǎo)數(shù)熔解物 (derivativemelt)產(chǎn)生代表發(fā)夾結(jié)構(gòu)35熔解的低溫峰，以及代表全長擴增子40熔解的高 溫峰。盡管本發(fā)明的實施例采用PCR作為擴增方法，但應(yīng)當理解任何整合了引物的擴增 方法都是合適的。這些合適的方法包括聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)；鏈置換擴增(SDA)基于核酸 序列的擴增(NASBA)；級聯(lián)滾環(huán)擴增(CRCA) ；DNA的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)；等溫以及嵌合 引物起始的核酸擴增(ICAN)；基于靶的解旋酶依賴擴增(HAD)；轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增(TMA)等 等。因此，當應(yīng)用術(shù)語“PCR”時，應(yīng)當理解其包括其它替代擴增方法。此外，盡管針對擴增后基因分型進行參考，但應(yīng)當理解本發(fā)明所描述的引物可用 于檢測和/或定量。在這些方法中，回轉(zhuǎn)引物既作為引物也作為探針，如同本領(lǐng)域所熟知的那樣。實施例1.在對稱PCR之后采用回轉(zhuǎn)引物基因分型應(yīng)用具有40% GC含量的M13序列的工程質(zhì)粒模板作為模板(25)。不然，在一個 位點上具有A、C、G或T的相同質(zhì)粒可用于研究。研究了 “A”模板和“C”模板，以及通過混 合等量“A”和“C”模板形成的“A/C”雜合子。每種質(zhì)粒的濃度通過260nm(A26tl)處的吸光 度測定，假設(shè)1. 0的A26tl是50 μ g/mL。采用的Ml3引物是正向5 ‘ -AATCGTCATAAATATTCAT TGAATCCCCtcattctcgttttctgaactg-3' (SEQID NO. 1，在帽端具有尾并且以粗體顯示回轉(zhuǎn)發(fā) 夾形成后模板上的可變位置)，反向5 ‘ -atgtttagactggatagcgt-3 ‘ (SEQ ID NO. 2)，其形 成一個約130bp的PCR產(chǎn)物。PCR在10 μ 1反應(yīng)容積中實施，所述反應(yīng)體積具有50mM Tris (pH8. 3)，500 μ g/ml 牛血清白蛋白，3mM MCl2, 200 μ M的各種脫氧核苷三磷酸，0.4U的Klen Taq聚合酶(AB肽)， 0. 5Χ的LCGreen Plus (愛德霍技術(shù)有限公司)，0· 5 μ M的引物以及IO6拷貝數(shù)的“Α”質(zhì) ?；蛳嗤瑵舛鹊摹唉　焙汀癈”質(zhì)粒1 1的混合物。PCR在LightCycler (羅氏)中循環(huán) 35次，在95°C變性(保持0秒)，在50°C退火(保持0秒)，以2°C /s的速度上升至72°C 的延伸溫度并在72°C保持8秒。PCR之后，毛細管樣品在94°C變性(保持0秒)并冷卻至 40°C。除非另外指出，所有溫度間的轉(zhuǎn)換速率設(shè)定為20°C/s。從LightCycler移出樣品， 放置入高分辨率熔解儀器HR-1 (愛德霍技術(shù)有限公司)，以0. 3°C /s的速率從50°C升高至 87°C熔解。通常，從熔解曲線中扣除指數(shù)背景，示例性地如描述于PCT/US2006/036605中的 那樣，本文將其全文在此以引用的方式納入，曲線被歸一化并通常以導(dǎo)數(shù)圖展示。由此所得 的導(dǎo)數(shù)熔解曲線見圖5A。圖5A顯示了 A/C SNP所有基因型的導(dǎo)數(shù)熔解曲線。擴增子(78_82°C )和回轉(zhuǎn)探 針(66-73°C )的熔解轉(zhuǎn)換都是明顯的。首先就擴增子區(qū)域而言，C純合子的峰比A純合子 具有更高的溫度，如同所預(yù)期的那樣。此外，由于異源二聚體的影響，AC雜合子顯示出更低 溫度下的寬廣轉(zhuǎn)換(12)。回轉(zhuǎn)引物中探針元件的熔解取決于基因型。配對完好的A模板在 最高的溫度(71°C)熔解，錯配的C模板在68°C熔解，而雜合子顯示兩種溫度的熔解峰。盡 管信號強度低，通過觀測回轉(zhuǎn)引物探針元件的熔解來基因分型的能力還是顯而易見的。實施例2.應(yīng)用對稱PCR的具有延伸封閉體的回轉(zhuǎn)引物基因分型為增加回轉(zhuǎn)引物環(huán)的形成以及導(dǎo)數(shù)圖上回轉(zhuǎn)基因分型峰(低溫峰)的高度，在模 板特異引物以及回轉(zhuǎn)引物的探針元件之間整合入延伸封閉體。如正向引物中的“X”所顯示 的，應(yīng)用的封閉體是可從革蘭研究公司(GlenResearch)獲得的作為dSpacer CE磷酰胺整 合的脫堿基四氫呋喃(貨號10-1914-90)。整合十個連續(xù)的dSpacer單元以確保聚合酶的 封閉。應(yīng)用的引物是正向 5 ‘ -AATCGTCATAAATATTCATTGAATCCCC (X) 10tcattctcgttttctgaa ctg-3' (SEQ ID NO. 3，在帽端具有尾并且以粗體顯示回轉(zhuǎn)發(fā)夾形成后模板上的可變位置)，
5' -atgtttagactggatagcgt-3‘ (SEQ ID NO· 4)。研究了實施例1中的“Α”模板以及“A/C”雜合子。PCR以及熔解如實施例1所述 那樣施行。圖5B顯示了 A與A/C基因型的導(dǎo)數(shù)熔解曲線圖。擴增子(78-82°C )和回轉(zhuǎn)探 針(68-75°C )的熔解轉(zhuǎn)換都是明顯的。就擴增子區(qū)域而言，相比純合子，AC雜合子具有在 更低溫度下的寬廣轉(zhuǎn)換。回轉(zhuǎn)引物中探針元件的熔解取決于基因型。配對完好的A模板以 一個轉(zhuǎn)換在高溫(73°C )熔解，而雜合子轉(zhuǎn)換是雙峰。相比于實施例1，探針元件信號強度
11相對增加。應(yīng)用對稱PCR進行回轉(zhuǎn)引物基因分型的一個優(yōu)點是，可使用兩個回轉(zhuǎn)引物(每端 各一個)以探查PCR產(chǎn)物內(nèi)兩個不同位點。每個尾互補于一個位點，并且探針元件可在長 度和/或GC含量上變化以區(qū)分兩個探針元件等位基因的Tm。另一個示范性探查遠處位點 (被諸如這樣的距離所隔開，所述距離即一個探針元件將是不方便的)的途徑是，僅使用一 個具有單個探針元件的回轉(zhuǎn)引物，但將所述探針元件分為兩段或更多段，每一段互補于一 個位點。模板DNA在位點和單體型間形成環(huán)是可能的(13)。備選地，可使用一個回轉(zhuǎn)引物 以及一個未標記探針(11)，示例性地應(yīng)用非對稱PCR。另外一個選擇是，將數(shù)種回轉(zhuǎn)引物混 合在一起，每種都具有相同的模板特異引物區(qū)域及靶向不同位點的不同探針元件。實施例3.滯元般棘 碰PCR少后測朗丨■向應(yīng)用非對稱PCR研究了不同探針元件長度。使用的M13引物如表1所示，其中大 寫字體標明探針元件尾，小寫字體限定了模板特異引物區(qū)域，并且粗體堿基標明了回轉(zhuǎn)發(fā) 夾形成后模板上的可變位點。表1
名稱限制I性正向弓丨物(0,05 UMIIFteattctcgttttctgaactg (SEQ ID NO:5)回 Γ反向引物 θ.51R6尾G;\ATATalgtttagactggatagcgi (SEQ ID NO:6}1R8尾TGAATATTalgtttagactggatagcgt (SEQ ID NO: )IRlO 尾ATGAATATTTatgIttagactggatagcgt (SEQ ID NO:8)1RI2 尾AATGAATATTTAatgtttagactggatagcgt (SEQ ID N0:9)1R14 尾CAATGAATATTTATatgittagactggatagcgt (SEQ ID NO: 10)1R16 尾'IX-AATOAATA'nTATOatgtttagactggatagcgt (SEQ ID NO: 11}1R18 尾TTCAATGAATATTTATGAatgtttagactggaiagcgt (SEQ ID NO: 12)1R20 尾ATTCAATGAATATTTATGACatgtttagactggatagcgt (SEQ ID NO:D)1R22 尾GATTCAATGAATATTTATGACGatgtttagactggatagcgt (SEQ ID NO: 14)1R24 尾GGATTCAATGAATATTTATGACGAalgwtagactggatagcgt (SEQ ID NO 15)1R26 尾GGGATTCAATGAATATTTATGACGATatgtttagactggatagcgt (SEQ ID NO; 16)除應(yīng)用45個循環(huán)外，PCR以及熔解如實施例1施行，限制性正向引物濃度為 0. 05 μ M且回轉(zhuǎn)反向引物濃度為0.5 μ M。盡管使用了 10 1的比例，但應(yīng)當理解其它 的引物比例也是合適的，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的，例如從2 1至20 1，或更高至 100 1。為確定探針元件長度對回轉(zhuǎn)引物方法的影響，測試了 6到28個堿基長度的探針區(qū) 域(圖6Α)。得到熔解曲線如圖6Β所示。即使使用小到6堿基長度的探針區(qū)域，回轉(zhuǎn)引物 的熔解曲線仍是可見的。能看到小至6堿基對的二聚體熔解轉(zhuǎn)換的能力讓人驚訝。與具有 相同序列的未標記探針相比(11)，熔解轉(zhuǎn)換似乎在5-10°C或更大范圍是穩(wěn)定的。應(yīng)用IF正 向引物和1R26尾回轉(zhuǎn)反向引物生成的擴增子的熔解，與應(yīng)用具有與1R26尾探針元件相同 序列的未標記探針的熔解相比較，證實了約10°C的穩(wěn)定性，這是由于分子內(nèi)的雜交的緣故。 這種穩(wěn)定性在具有導(dǎo)致更短發(fā)夾二聚體的更短探針元件的回轉(zhuǎn)引物中甚至更大。例如，6bp 回轉(zhuǎn)二聚體的Tm比通過近鄰分析所預(yù)測的要高40°C，Sbp回轉(zhuǎn)二聚體要高35°C。圖6G所 示的二聚體長度和Tm之間的線性關(guān)系提示熔解溫度可通過二聚體長度來精確預(yù)測。發(fā)夾二聚體的Tm也可以通過有意引入錯配、堿基類似物或穩(wěn)定基序至回轉(zhuǎn)引物 的探針元件來調(diào)整。例如，導(dǎo)致與模板錯配的堿基可用來降低發(fā)夾二聚體的總體Tm。G:T錯
12配(通過在探針元件中以T代替C來獲得)具有特別的吸引力，因為它們能通過干擾穩(wěn)定 的C:G對來減少發(fā)夾二聚體Tm，但G:T二聚體足夠穩(wěn)定，其不能顯著地降低來自飽和染料的 熒光。錯配也可以用來隱藏最好忽略的序列變異，諸如良性多態(tài)性(26)。如果需要更大的 發(fā)夾二聚體穩(wěn)定性，可將封閉的核酸整合入探針元件，或粘附小溝結(jié)合劑以增加熔解溫度。選擇8、14、20以及24bp的探針區(qū)域用于SNP基因分型。雜合子通過以1 1的 比例混合合適的質(zhì)粒形成。SNP分型的結(jié)果如圖6C-F所示。可以采用所有的回轉(zhuǎn)引物分 型，包括那些具有短至8堿基長度探針元件的引物(圖6C)。實施例4.應(yīng)用雙堿某末端錯配以 曾強探針元件信號非對稱PCR后探針元件長度 的影響基因組DNA回轉(zhuǎn)分型的一些最初嘗試進行得不是特別好。應(yīng)用非對稱PCR，擴增似 乎被抑制了，僅多個循環(huán)之后出現(xiàn)低微信號，示例性地60或更多個循環(huán)。進一步考慮形成 的大鏈和小鏈，提供了一種可能的解釋和解決方案。在圖7Α中，非對稱PCR后產(chǎn)生的大鏈 和小鏈均以回轉(zhuǎn)構(gòu)象顯示。盡管大鏈不能從其5’端延伸，但小鏈具有能雜交并形成聚合酶 底物的3’末端。延伸可以從這一 3’末端發(fā)生，抑制引物退火并阻止大鏈形成。這個問題 的一個解決方案是錯配回轉(zhuǎn)引物5’末端的最后兩個堿基使得不可能從小鏈延伸(圖7Β)。 盡管將兩個堿基用于示例性錯配，但應(yīng)當理解一個堿基錯配可抑制部分延伸，并且如果需 要，可加入更多的堿基錯配。錯配可以在連續(xù)幾輪擴增中進行。在回轉(zhuǎn)引物探針元件5，末端整合2堿基錯配導(dǎo)致強烈的探針熔解信號。如上面所 討論的，這樣的錯配阻止PCR抑制，否則所述PCR抑制可能發(fā)生在PCR期間小鏈3’末端延伸 之后。應(yīng)用非對稱PCR研究了具有2-bp末端錯配的不同探針元件長度。所應(yīng)用的M13引 物如表2所示，其中大寫字體表示探針元件或尾部，小寫字體限定了模板特異引物區(qū)域，小 寫字體斜體表明了錯配至靶的堿基，粗體堿基標明了回轉(zhuǎn)發(fā)夾形成后模板上的可變位點。表 2
名稱限制性正向引物 ms uM}IFlcalictcgttttctgaactg (SEQ ID NO:5) 回轉(zhuǎn)反向引物 muM}IREtailM IRUtailM lR!6tailM IRlOtailMccTOAATATTatgtttagactggatagcgt (SEQ ID N0:1 ) grAATGAATATTTAatgtttagactggatagcgt (SEQ ID NO; 18) cgTCAATGAATATTTATGatgtttagactggaiagcgt (SEQ ID NO; 19) fcATTCAATGAATATTTATGACaigtttagactggatagcgt (SEQ ID N0:20)PCR以及熔解如實施例3施行。研究了 8、12、16以及20堿基長度的探針元件，每 種均具有雙堿基末端錯配。圖8A顯示了使用完全配對的“A”模板在非對稱PCR之后的導(dǎo) 數(shù)熔解形態(tài)。所有探針元件峰都是大且容易鑒別的。令人驚奇地是，8堿基探針元件下的面 積與更長探針元件的一樣大?；蚍中偷哪芰φ故驹趫D8B中，應(yīng)用了 “A”和“A/G”(雜合子)模板?！癆”模板 形成了與探針元件的完全配對，而“G”模板形成A/C錯配，導(dǎo)致比完全配對的低6-8°C的熔 解峰。在384孔板上PCR擴增一百種已分型臨床樣品，并在384孔LightScanner (愛 德霍技術(shù)有限公司)上熔解。具有16堿基探針元件以及雙堿基5’末端錯配的回轉(zhuǎn)引物用于非對稱PCR，生成169bp PCR產(chǎn)物以及具有99堿基環(huán)的發(fā)夾。在標準化以及消除發(fā)夾二 聚體區(qū)域的背景之后，曲線展示在負導(dǎo)數(shù)圖上并自動聚集。探針元件具有對突變等位基因 的G:T錯配。圖7C顯示，基因型容易被區(qū)分。圖7C中所有樣品的基因型與之前通過小擴 增子高分辨率熔解所確定的相一致。實施例5.擴增子長度對應(yīng)用非對稱PCR的在探針元件5’末端具有雙堿基錯配的 回轉(zhuǎn)引物信號的影響將如實施例4的具有雙堿基末端錯配的回轉(zhuǎn)引物用于研究不同的擴增子長度?；?轉(zhuǎn)引物至SNP位點之間的距離保持恒定(二級結(jié)構(gòu)環(huán)保持不變)，但擴增子的長度是變化 的。非對稱PCR如實施例3施行。所應(yīng)用的M13引物如表3所示，其中大寫字體表示探針 元件或尾部，小寫字體限定了模板特異引物區(qū)域，小寫字體斜體表明了錯配至靶的堿基，粗 體堿基標明了回轉(zhuǎn)發(fā)夾形成后模板上的可變位點。表3
名稱限制性IE (51引物細_IFtcattctcgtttfctgaactg (SEQ ID NO;5)2Fgcaatocgctttgcttctga (SEQ ID N0;2I)3Fgatatttgaagtcittcggg (SEQ ID NO:22}4Fgltggagtttgcttocggic (SEQ ID MO:23}5Fatgacctcitatcaaaagga (SEQ Π>Ν :24)回轉(zhuǎn)反向引物 f(KS[l]vnlR22milMfcGATTCAATGAATATTTATGACOatgtttagactggaiagcgt (SEQ ID NO;25)實驗設(shè)計圖解于圖9A中。在所有情況中，回轉(zhuǎn)引物是相同的，因而在探針元件退 火至擴增子時形成相同大小的環(huán)，引物在5’末端具有相同的2bp錯配。然而，擴增子的長 度在120bp至321bp變化。結(jié)果如圖9B所示。擴增子越長，則相比于擴增子信號探針元件信號就越小。亦即 更短的擴增子通常導(dǎo)致相對更強的源自探針元件的信號。實施例6.環(huán)長度對探針元件信號的影響通過改變回轉(zhuǎn)引物和待探查位點之間的距離研究不同環(huán)長度的影響。非對稱PCR 如實施例3施行。所應(yīng)用的M13引物如表4所示，其中大寫字體表示探針序列尾部，小寫字 體限定了模板特異引物區(qū)域，粗體堿基標明了回轉(zhuǎn)發(fā)夾形成后模板上的可變位點。在這個 例子中，不使用緊鄰探針元件的2bp 5’錯配。表 4P^ ■ Ii 江 IH) 切 m.OS uM)
tcanctcgmtcigaactg (SEQ ID NO: 5)
限制性正向引物
時細舊 (0.5 uM>
0R24 尾 1R24 尾 2R24 尾 .3R24 尾 4R24 尾 5R24 尾
GGATTCAATGAATATTTATGACGAcgtccaatactgcggaa (SEQ ID NO:26) GGATTCAATQAATATTTATGACGAatgtnagactggatagcgl (SEQ ID NO: 15)
CjGATTCAATGAATATTTATGACGAaaaatagcgagaggcttttgc (SEQ ID NO:27) GGATTCAATGAATATTTATGACGAtaagagcaacactateitaa (SEQ ID NO;28) CKjATTCAATGAATATTTATGACGAaatgcagaUicaUiacgcca ^EQ ID NO:29) GGATTCAATGAATA'ITrATGACOAacaacattattacaggtaga (SEQ ID N0:30)實驗設(shè)計圖解于圖IOA中。PCR之前引物的相對位置在頂端標明。PCR以及熔解 如實施例3所述施行。非對稱PCR之后延伸的回轉(zhuǎn)引物的環(huán)形成如圖IOA底部所示。環(huán)大 小在17-236bp間變化。六種不同產(chǎn)物的導(dǎo)數(shù)熔解曲線如圖IOB所示。應(yīng)當注意，全長擴增子的Tm與擴增 子大小正相關(guān)。對于回轉(zhuǎn)探針尾熔解，其中所有探針尾具有相同的大小，更小的環(huán)導(dǎo)致更高 的熔解溫度，表明分子內(nèi)雜交的穩(wěn)定性與環(huán)大小反相關(guān)，至少在17-236堿基之間如此。反 向關(guān)系在17至150堿基間似乎是對數(shù)的，Tm與大小對數(shù)的對數(shù)成反比。空間位阻可能成為 小于17堿基的環(huán)的問題，但由于最小環(huán)尺寸通常由引物大小所限定，因而其不可能涉及大 部分的情況。形成更大環(huán)的回轉(zhuǎn)引物的信號強度可能相對擴增子信號降低，如實施例5以 及使用未標記探針所見(11)。例如，具有236bp(5R)環(huán)長度的熔解曲線是微弱的。對于此 示例性擴增子，最好的信號在17至177堿基的環(huán)大小間獲得，并可預(yù)計好的信號在具有少 于200堿基環(huán)獲得。由于探針元件的穩(wěn)定性以及通常優(yōu)選相對大的信號，預(yù)計20至50堿 基間大小的環(huán)能很好地工作。實施例7.應(yīng)用單個回轉(zhuǎn)引物分型所有可能的單堿基變異單個回轉(zhuǎn)引物被用于擴增不同質(zhì)粒模板以證明探針元件熔解曲線的形狀取決于 被擴增的序列。應(yīng)用四種不同M13質(zhì)粒作為靶，其中每種質(zhì)粒僅在一個位點上有A、C、G或 T的差異。在這個實施例中，為模擬純合子基因分型，僅使用了一個配對或錯配質(zhì)粒，然而模 擬雜合子時使用了等比例混合的兩種質(zhì)粒。非對稱PCR如實施例3施行。應(yīng)用的M13引物 是IF tcattctcgttttctgaactg(SEQ ID NO 5)以及 lR22Tmisl0tcATTCAATGAATATTTATGAC GAatgtttagactggatagcgt (S EQ ID NO :31)，其中大寫字母標明探針元件或尾，小寫字體限 定了模板特異引物區(qū)域，小寫字母斜體表明了錯配至靶的堿基，粗體堿基標明了回轉(zhuǎn)發(fā)夾 形成后模板上的可變位點。PCR產(chǎn)物為120bp長度。應(yīng)用在可變位置具有“A”的回轉(zhuǎn)引物，研究了所有可能的配對、部分配對以及完全 錯配模板。使用純合子模板，形成了一個配對的以及三個錯配的二聚體(圖11A)，均顯示出 單一熔解轉(zhuǎn)換。在擴增子轉(zhuǎn)換中，G以及C的PCR產(chǎn)物比A以及T的PCR產(chǎn)物稍稍更穩(wěn)定。 具有A:T配對的探針元件轉(zhuǎn)換最穩(wěn)定、隨后是A:G錯配、A:A錯配以及最后是A:C錯配。圖IlB顯示了一個配對模板以及所有三個部分配對雜合子。如圖IlA所示，配對 模板在68°C附近顯示出單個探針元件熔解峰。所有三個雜合子顯示出一個等位基因配對、 另一個錯配的組合探針元件熔解峰，通常解析為兩個不同的峰一個68°C附近的峰以及另 一個取決于特定錯配的峰。圖IlC顯示了一個配對模板以及兩個等位基因均錯配的三個雜合子。配對的二聚
15體最穩(wěn)定，而錯配雜合子形成不那么穩(wěn)定的具有探針元件的二聚體。每個雜合子在一個獨 特、寬廣、明顯的由兩個不解析為不同峰的錯配成分組成的單個轉(zhuǎn)化中熔解。實施例8.回轉(zhuǎn)引物探針元件內(nèi)錯配位置的影響應(yīng)用具有不同探針元件的回轉(zhuǎn)引物擴增同樣的靶序列。探針元件設(shè)計為沿著探針 元件的不同位點放置可變堿基，具有相同長度擴增子。探針元件的長度為22堿基，可變堿 基放置在位點2、8、14或20，導(dǎo)致環(huán)長度為26至44堿基以及120bp的擴增子。盡管環(huán)長度 變動最多達到了 18個堿基的差異，這應(yīng)當僅僅影響絕對Tm，而不影響區(qū)分純合子與雜合子 的能力。非對稱PCR如實施例3施行。所應(yīng)用的M13引物如表5所示，其中大寫字體表示探 針元件或尾部，小寫字體限定了模板特異引物區(qū)域，小寫字體斜體表明了錯配至靶的堿基， 粗體堿基標明了回轉(zhuǎn)發(fā)夾形成后模板上的可變位點。表 5
名稱
IF
1 Rt 2· ‘丁 on Sij. lR22Tniis8
限制性IE向引物
tcattcicgttitctgaactg (SEQ ID NO:5) 回轉(zhuǎn)反向引物
flcAATATTTATGACGATTCCGCAGatgtltagactggatagcgt (SEQ ID NO:32) gcTCAATGAATATTTATQACCiATTatgHtagactggatagcgt (SEQ ID NO:33) !R22TmisI4 ^OGGOAlTCAATGAATATTrATGatgtttegactggalagcgt (SEQ ID NO:34) lR22Tmis20 jflglTI-OAGGGGGATlCAATGAA'I'Aatgtttagactggatagcgt (SHQ ID NO:35)分別擴增純合“A”模板以及雜合“A/G”模板以測試在探針元件的不同位置檢測雜 合子的能力。當可變堿基放置在鄰近22堿基探針元件末端的2位點或20位點，很難將雜 合子從純合子區(qū)分開(圖12A-B)。相反，當可變堿基靠近中間的位點8或14時，雜合子很 容易被鑒別(圖12C-D)。這些結(jié)果提示在與本實施例相似的條件下，如果需要最佳區(qū)分，探 針應(yīng)當在靠近變異序列中心的位置。可能無法檢測靠近探針元件任一個末端的序列變異。實施例9.使用回轉(zhuǎn)引物基因分型囊性纖維變性G542X突變回轉(zhuǎn)引物基因分型CFTR突變G542X，其在外顯子11有G到T的單堿基突變。分 型的人基因組 DNA 樣品從 Coriell Institute for MedicalResearch (Camden，NJ)獲得， 并以 50ng/μ 1 用于 PCR。限制性正向引物是 tgtgcctttcaaattcagattg(SEQ ID NO 36) (0. 05 μ M)，反向回轉(zhuǎn)引物是 ctGAAAGACAATATAGTTCTTGGAGAcagcaaatgcttgctagacc (SEQ ID NO 37) (0. 5μΜ)。探針元件的序列與野生型靶序列配對。擴增子為228bp。PCR如實施 例3施行，除了在95°C起始變性20秒，退火溫度為53°C，55個循環(huán)，熔解分析從55至88°C 以0. 2V /s的速率完成。回轉(zhuǎn)引物環(huán)為88堿基，探針元件為24堿基。得到的回轉(zhuǎn)引物基因分型如圖13所示。具有較高溫度擴增子熔解峰的導(dǎo)數(shù)熔解 曲線在右側(cè)，較低溫度探針元件峰的在左側(cè)。錯配模板探針元件的熔解發(fā)生在約63°C，而配 對模板熔解于約68°C。所有三種基因型均容易辨別。實施例10.應(yīng)用回轉(zhuǎn)引物的囊性纖維變性外顯子10序列變異(F508del、F507del 以及F508C)的基因分型回轉(zhuǎn)引物基因分型在外顯子10內(nèi)的CFTR突變熱點(hotspot)施行，包括 F508del、F507del 以及 F508C。已分型的人基因組 DNA 樣品從 CoriellInstitute forMedical Research (Camden, NJ)獲得，并以50ng/ μ 1用于PCR。限制性正向引物是 acttctaatgatgattatggg (SEQ ID NO 38) (0. 05 μ M)，反向回轉(zhuǎn)引物是 tcAATATCATCTTTGGTG TTTCCTATGATGacatagtttcttacctcttc (SEQ ID NO 39) (0. 5 μ M)。探針元件的序列與野生型 序列配對。擴增子為231bp，回轉(zhuǎn)引物環(huán)為58堿基。得到的回轉(zhuǎn)引物探針元件熔解曲線如圖14A-B所示，其為導(dǎo)數(shù)(圖14A)及標準化 的熔解曲線圖(圖14B)兩者。野生型模板來源的探針元件的熔解發(fā)生在約72°C，而錯配模 板在較低溫度熔解，每種基因型具有一個特征明顯的熔解曲線。所有基因型均容易辨別。實施例11.應(yīng)用雙向回轉(zhuǎn)引物的多位點基因分型類似于其它熔解技術(shù)，回轉(zhuǎn)基因分型可以沿著溫度軸多重實施(9)。例如，可應(yīng)用 兩套或多套引物(每套均具有一個回轉(zhuǎn)引物)擴增及分型多個位點，示例性地，根據(jù)它們各 自的探針元件在熔解溫度分離等位基因。備選地，擴增子內(nèi)的多個位點可通過應(yīng)用兩個回 轉(zhuǎn)引物、或一個回轉(zhuǎn)引物與一個未標記探針來擴增分型，每種均可通過在恒定區(qū)域間環(huán)出 模板來探查一個以上的位點(13)。當應(yīng)用兩個回轉(zhuǎn)引物擴增單個靶核酸時，示例性地，可應(yīng)用對稱PCR生成足夠濃 度的兩種產(chǎn)物鏈。在本實施例中，應(yīng)用對稱PCR擴增CFTR基因，每種引物的濃度為0. 5μΜ。 引物包括雙堿基5，末端錯配以及分別產(chǎn)生CFTR外顯子10的、具有69堿基和66堿基發(fā)夾 環(huán)的249bp PCR產(chǎn)物的17堿基(回轉(zhuǎn)1)或28堿基(回轉(zhuǎn)2)探針元件。模板DNA濃度為 5ng/y L·以10-15 μ 1礦物油(西格瑪公司(Sigma))覆蓋96孔板內(nèi)2μ 1的反應(yīng)體積，離 心平板(1500g離心3-5分鐘)，在PTC-200themal cycler (生物拉德公司(Bio-Rad))上 實施PCR。在95°C起始變性3分鐘，隨后是95°C 15秒，55°C 10秒以及72°C 15秒，循環(huán)35 次。由于雙鏈全長擴增子形成是取決于濃度的分子間反應(yīng)，并且回轉(zhuǎn)發(fā)夾環(huán)形成通常 不依賴濃度的分子內(nèi)反應(yīng)，相對于同樣未稀釋的PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物的稀釋有利于回轉(zhuǎn)環(huán)形 成。因此，在這一示范性的實施例中，在PCR之后，CFTR樣品以水稀釋(18μ1 10倍稀釋)、 離心，在LightScanner 中加熱至95°C (在全長擴增子熔解溫度之上)，從該儀器上取下來 冷卻至< 40°C以下(室溫，其在本實施例發(fā)夾的熔解溫度之下)，之后在LightScanner 上以0. 15°C /s的速率加熱期間采集熒光數(shù)據(jù)。已發(fā)現(xiàn)稀釋之后以及采集熔解熒光數(shù)據(jù)之 前的加熱和冷卻，例證性地快速冷卻(示范性地，至少為2V /s，更為示范性地至少為5°C / s)，生成源自回轉(zhuǎn)發(fā)夾的優(yōu)良信號。對稱PCR中，⑴未稀釋，或(ii)稀釋并在熔解期間采 集熒光數(shù)據(jù)之前沒有加熱和冷卻時，僅觀察到微弱的發(fā)夾熔解轉(zhuǎn)換。應(yīng)當理解，其它方法也 可用于形成回轉(zhuǎn)分子內(nèi)環(huán)，如調(diào)節(jié)PH。回轉(zhuǎn)1在46-60°C之間以熔解轉(zhuǎn)換覆蓋了 F508del、F507del、F508C以及I506V變 體。較長的回轉(zhuǎn)2覆蓋了 Q493X變體并在66-72°C之間熔解。數(shù)據(jù)在標準化以及扣除背景 后以負導(dǎo)數(shù)圖展示于圖15。野生型(圓)、組合F508del/Q493X雜合子(連接的小菱形)、 I506V雜合子(小菱形)、F508C雜合子(小方塊)、I507del (大方塊)、F508del雜合子(連 接的大菱形)以及F508del純合子(連接的方塊)均是可區(qū)分的。盡管在本實施例使用十倍稀釋，但應(yīng)當理解可應(yīng)用其它的稀釋比，取決于需要的 源自全長擴增子的最小信號的范圍。如果僅需要基因分型，較高稀釋比是合適的，而如果需 要基因分型以及掃描，較低稀釋比是合適的。備選地，樣品可不稀釋用于熔解掃描，然后稀釋后再次熔解用于基因分型。進一步地，盡管本實施例中稀釋PCR擴增產(chǎn)物，通過在平臺期 之前停止PCR擴增從而限制全長擴增子的量，得到較低的擴增子濃度，從而也可能獲得相 似的結(jié)果。已經(jīng)驗證了對稱PCR之后有利于在全長擴增子二聚體上形成回轉(zhuǎn)環(huán)的其它方法。 例如，變性之后的快速冷卻有利于這一發(fā)夾形成。這可以通過在LightCycler上的毛細管 內(nèi)通過以設(shè)定的-20°C /s的速率冷卻而獲得，也可以在-10°C /s和-5°C /s觀察到?；蛘?， 足以有利于發(fā)夾的快速冷卻可通過在諸如MJ PTC-200的塊溫度循環(huán)器上冷卻而獲得，其中 變性樣品在60秒內(nèi)冷卻至< 35°C。通過將毛細管內(nèi)的變性樣品置于冰水中冷卻非常有利 于變性后的發(fā)夾形成，其中可在2秒內(nèi)獲得< 5°C的溫度。如果樣品被快速冷卻，不必要在 對稱PCR之后稀釋，其取決于發(fā)夾的以及所需的全長擴增子二聚體的量。高pH，示例性地從8. 5至11.0，也有利于在全長二聚體擴增子上形成發(fā)夾?；蛘?在高PH實施PCR，或者在PCR之后增加pH，示例性地，通過添加NaOH或高pH緩沖液的稀釋 液。例如，PCR擴增之后在pH8. 9至10. 8的AMP (氨甲基丙醇)緩沖液中有利于發(fā)夾形成。 備選地，可在pH8. 5的IOmM Tris緩沖液中進行PCR，并在PCR之后添加pH9至11之間的 IOmM AMP緩沖液以使得溶液更為堿性。稀釋的非緩沖NaOH也可以直接加入，例如，可在以 ρΗ8· 5的IOmM Tris緩沖的10 μ 1 PCR反應(yīng)產(chǎn)物中加入1-9 μ 1 0. OlM的NaOH0總之，擴增 產(chǎn)物可通過一個或多個下述有利于發(fā)夾形成而不是分子間雜交的組合來調(diào)節(jié)1)較低的 產(chǎn)物濃度，示例性地，由限制PCR產(chǎn)物產(chǎn)生的量(循環(huán)次數(shù)少或低引物濃度)或者通過PCR 后的稀釋獲得；2)變性后的快速冷卻；以及3)通過在高pH下運行PCR或者通過在PCR結(jié) 束后添加堿性溶液獲得的高ρΗ(示例性地，8. 5-11. 0)。實施例12.回轉(zhuǎn)引物作為多色基因分型的能量轉(zhuǎn)移供體如果不同的探針元件能夠以不同的熒光團“著色”，甚至較大的多重測定 (multiplexing)也是可以的。該進展已采用iFRET (誘導(dǎo)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移)所展示，其 中有DNA 二聚體存在的dsDNA染料溶液(SYBR GreenI)將熒光供體提供給共價結(jié)合到二聚 體的一條鏈上的受體染料(14)。為證實共振能量轉(zhuǎn)移以及應(yīng)用回轉(zhuǎn)引物的多色測定(colormultiplexing)的 可行性，將具有5，末端的共價結(jié)合染料LCRed640(羅氏診斷公司(Roche Diagnostic)) 的回轉(zhuǎn)引物與具有相同序列的5’標記探針相比較。用于回轉(zhuǎn)擴增的正向引物序列是 IF (tcattctcgttttctgaactg (SEQ IDNO :5))，回轉(zhuǎn)引物是 Red640_GGATTCAATGAATATTTATGA CGAatgtttagactggatagcgt (SEQ ID N0:15)。用于作為對照的標記探針反應(yīng)的正向引物仍 然是1F，反向引物是lR(atgtttagactggatagcgt (SEQ ID NO :40))，并且標記的探針是Red 640-GGATTCAATGAATATTTATGACGA-P(S EQ IDNO :41)，其中 “P” 是 3，磷酸。除了延伸溫度 是74°C外，PCR如實施例3中所描述的在0. 5X LCGreen Plus存在下實施，50個循環(huán)，正向 引物濃度為0.1 μ M，反向引物(回轉(zhuǎn)的或正常的)濃度為0.5μΜ，標記探針(如果有)為
0.5 μ M0 熔解分析在 LightCycler 的 F2 (LCRed640)通道內(nèi)以 0. 20C /s 的速率從 50-87°C施行。圖16顯示了 LCRed640通道內(nèi)的導(dǎo)數(shù)熔解圖，其證實了 LCGreen Plus與共價結(jié)合 的LCRed640之間的共振能量轉(zhuǎn)移。應(yīng)用回轉(zhuǎn)引物或標記探針時，LCRed640熔解轉(zhuǎn)換是明 顯的，盡管相對于分子間二聚體分子內(nèi)的環(huán)穩(wěn)定了回轉(zhuǎn)二聚體約9°C。通過以不同的被相同dsDNA 染料(如 LCGreenPlus)所激發(fā)的熒光團來標記不同的回轉(zhuǎn)引物，可以完成多色測定。應(yīng)用顏色補償 技術(shù)，優(yōu)選應(yīng)用溫度對通道間串擾的影響的方法(9)，破解復(fù)雜光譜信號為個別成分。在圖16中，標記探針對照反應(yīng)展示了在63°C的熔解峰，它是結(jié)合LCGreen Plus與 標記探針之間FRET的結(jié)果。由分子間結(jié)合穩(wěn)定了約9°C的標記回轉(zhuǎn)探針，具有約72°C的熔
解溫度。實施例13.組合回轉(zhuǎn)基因分型與擴增子掃描應(yīng)用回轉(zhuǎn)引物的非對稱PCR產(chǎn)生了用于基因分型的發(fā)夾以及用于擴增子掃描的 雙鏈產(chǎn)物。因此，源于相同熔解曲線的基因分型以及掃描均可應(yīng)用回轉(zhuǎn)引物。這種方法的 圖解如圖17所示。因為回轉(zhuǎn)基因分型通常以非對稱PCR完成，擴增子信號不如對稱擴增的 強，并且當前也不清楚雜合子掃描的精確率。然而，在一個方法中篩選突變以及分型特異序 列變異的潛力是吸引人的，并且可能消除整個基因分析中99%的測序負擔(dān)。由于異源二聚 體的形成，引物間在序列中的任何序列差異使擴增子熔解轉(zhuǎn)換偏至較低溫度。此外，應(yīng)用回 轉(zhuǎn)發(fā)夾，探針元件下的普通變異可最終確定。純合子變異也可通過探針元件鑒定，但可能不 改變擴增子熔解。最后，如果擴增子轉(zhuǎn)換表明有雜合子變異但回轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換是正常的，提示探針 區(qū)域外有稀有變異或新變異，并且可能需要測序來鑒定。作為非對稱PCR的替代選擇，掃描和基因分型可應(yīng)用回轉(zhuǎn)引物和非對稱PCR在稀 釋或不稀釋情況下分兩步完成。如上所討論的，對稱PCR至平臺期(plateau phase)有利 于全長雙鏈擴增子形成，而稀釋有利于回轉(zhuǎn)環(huán)形成。引物是tctcagggtattttatgagaaataa atgaa (SEQ ID NO 42)以及 gtAAGGAGGAACGCTCTATCtcctcacaataataaagagaaggca(SEQ ID NO 43)，并擴增一個包含CFTR外顯子4的21 Ibp的PCR產(chǎn)物。發(fā)夾環(huán)為46堿基長度，具 有18bp的發(fā)夾二聚體。PCR如實施例11施行，但應(yīng)用2mM Mg++以及0. 25 μ M各種引物的 5 μ 1體積。溫度循環(huán)包括95°C起始變性5分鐘，隨后是36個循環(huán)的95°C 30s,62°C IOs以 及72°C30s。在任何添加或稀釋之前，從60至95°C采集掃描用的熔解數(shù)據(jù)。圖18A顯示 了數(shù)種野生型樣品以及由G至A堿基變換導(dǎo)致的單個R117H雜合子的掃描熔解曲線。單個 R117H雜合子清晰可見，說明這種未稀釋的對稱熔解曲線可用于掃描。圖18B顯示了相同擴 增子產(chǎn)物以45 μ 1水稀釋(10倍稀釋)后并如上所述在熔解數(shù)據(jù)采集前加熱以及冷卻的導(dǎo) 數(shù)圖。再次地，通過回轉(zhuǎn)引物分型，R117H雜合子容易被區(qū)分，可用于特異性鑒定。當相同 的雜合子在兩種曲線上可見時，這證明了可以應(yīng)用使用回轉(zhuǎn)引物的相同PCR擴增來掃描和 分型。實施例14.應(yīng)用回轉(zhuǎn)引物的單體型分析通過組合等位基因特異擴增與回轉(zhuǎn)引物基因分型，提供了單體型分析的簡單方 法?？紤]兩個遺傳位點A和B，每個都具有兩個等位基因，Al、Α2以及Bi、Β2?；剞D(zhuǎn)引物的 引物單元設(shè)計為退火至A位點，回轉(zhuǎn)引物的探針元件設(shè)計為退火至B位點，第二引物設(shè)計在 B位點側(cè)翼，使得B位點可以被兩個引物所擴增。如果回轉(zhuǎn)引物設(shè)計為僅延伸A位點的等 位基因1(示例性地，通過在A位點的可變位置放置3’末端)，則通過熔解探針元件鑒別的 B位點類型必須與Al等位基因相關(guān)(相同的單體型)。因此，如果引物單元延伸Al，探針 元件配對Bi，并且探針熔解曲線表明配對，則存在AlBl單體型。如果探針熔解曲線表明錯 配，則存在Α1Β2單體型。如果引物單元延伸Α2，探針元件配對Bi，并且探針熔解曲線表明配對，則存在A2B1單體型。如果探針熔解曲線表明錯配，則存在A2B2單體型。參考文獻(其全文以引入的方式納入本文)1.Lee LG，Connell CR, Bloch W. 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做了詳細描述，本發(fā)明范圍以及精神內(nèi)的 變化和修改如后續(xù)的權(quán)利要求書中所描述及限定。
2權(quán)利要求
核酸分析方法，包括以下步驟將靶核酸與第一引物和第二引物混合以形成混合物，所述引物設(shè)計用于擴增靶核酸，其中所述第一引物包含特異于靶核酸的一個位點的探針元件和模板特異引物區(qū)域，其中所述探針元件在所述模板特異引物區(qū)域的5’末端，擴增靶核酸以產(chǎn)生擴增子，允許探針元件雜交至所述位點以形成發(fā)夾，以及通過測定加熱混合物時源自結(jié)合dsDNA的染料的熒光，生成探針元件的熔解曲線，其中所述染料非共價結(jié)合至第一引物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一引物以大于第二引物的濃度提供，用于非對稱擴增。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述擴增步驟是通過PCR擴增。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一引物還包含探針元件5’端的錯配區(qū)域。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述錯配區(qū)域是兩個堿基。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一引物是不具有任何共價結(jié)合染料或淬滅團的寡核苷酸。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述第一引物不含有延伸封閉體。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述染料存在于擴增期間的混合物中。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述染料是飽和染料。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述染料以足以區(qū)分熔解曲線中的雜合子的濃度存在。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一和第二引物以基本上相同的濃度提供。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述第二引物包含特異于靶核酸第二位點的探針元件和 模板特異引物區(qū)域，其中所述第二引物的探針元件在模板特異引物區(qū)域的5’端。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述第一引物探針元件在不同于第二引物探針元件的溫 度熔解。
14.權(quán)利要求12的方法，進一步包含在生成熔解曲線前稀釋擴增子的步驟。
15.權(quán)利要求13的方法，進一步包含在生成熔解曲線前，加熱稀釋的擴增子至少至擴 增子的變性溫度并冷卻被加熱稀釋的擴增子至發(fā)夾變性溫度以下的溫度的步驟。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述冷卻是快速冷卻。
17.權(quán)利要求11的方法，其中所述第一引物包含在探針元件與模板特異引物區(qū)域之間 的延伸封閉體。
18.權(quán)利要求1的方法，其中所述發(fā)夾具有少于200個堿基的環(huán)。
19.權(quán)利要求1的方法，其中所述發(fā)夾具有20至50個堿基的環(huán)。
20.權(quán)利要求1的方法，其中所述探針元件少于20個堿基。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述探針元件少于10個堿基。
22.權(quán)利要求1的方法，其中所述混合物還包含第三引物，所述第三引物包含特異于靶 核酸第三位點的探針元件和模板特異引物區(qū)域，其中所述第三引物的模板特異引物區(qū)域與 第一引物的模板特異引物區(qū)域相同，但第三引物的探針元件所特異的位點不同于第一引物 所特異的位點。
23.權(quán)利要求1的方法，其中所述位點具有已知的單核苷酸多態(tài)性，并且所述單核苷酸多態(tài)性位于距探針元件末端不少于8個堿基的位置。
24.權(quán)利要求1的方法，其中所述混合物進一步包含設(shè)計為雜交至靶核酸不同位點的 未標記探針。
25.權(quán)利要求1的方法，其中所述第二引物包含特異于靶核酸第二位點的探針元件、模板特異引物區(qū)域以及可以與 dsDNA結(jié)合染料共振能量轉(zhuǎn)移的共價結(jié)合染料，其中所述第二引物的探針元件在模板特異 引物區(qū)域的5’端，并且dsDNA結(jié)合染料的熒光在第一波長測量，并且生成步驟進一步包含在第二波長測量源 自共價結(jié)合染料的熒光。
26.權(quán)利要求1的方法，其中所述靶核酸進一步包含第二位點，并且第一引物的模板特異引物區(qū)域被設(shè)計為僅在第二位點的特定等位基因存在時擴增所 述靶核酸。
27.權(quán)利要求1的方法，進一步包含分析所述熔解曲線形態(tài)的步驟。
28.權(quán)利要求1的方法，其中所述混合物在生成熔解曲線之前被調(diào)節(jié)為有利于探針元 件發(fā)夾形成。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述混合物通過稀釋、變性后的快速冷卻或增加pH值來調(diào)節(jié)。
30.權(quán)利要求1的方法，其中所述擴增在到達平臺期之前終止，以限制擴增子濃度。
31.用于核酸分析的試劑盒，包含第一引物和第二引物，所述引物設(shè)計用于擴增靶核酸，其中所述第一引物包含特異于 靶核酸一個位點的探針元件和模板特異引物區(qū)域，并且探針元件在模板特異引物區(qū)域的5’ 端，以及dsDNA結(jié)合染料。
32.權(quán)利要求31的試劑盒，其中所述dsDNA結(jié)合染料是飽和染料。
33.權(quán)利要求31的試劑盒，其中所述第一引物以大于第二引物的濃度提供。
34.權(quán)利要求31的試劑盒，其中所述第一引物進一步包含探針元件5’端的錯配。
35.權(quán)利要求31的試劑盒，其中所述第一引物和第二引物均不具有任何共價結(jié)合染料 或淬滅團。
36.權(quán)利要求31的試劑盒，進一步包含熱穩(wěn)定聚合酶和dNTPs。
37.一種同時掃描和基因分型靶核酸的方法，包括以下步驟將靶核酸與第一引物和第二引物混合以形成混合物，所述引物設(shè)計用于擴增靶核酸， 其中所述第一引物包含特異于靶核酸的一個位點的探針元件和模板特異引物區(qū)域，其中所 述探針元件在模板特異引物區(qū)域的5’末端， 擴增靶核酸以產(chǎn)生擴增子，通過測定加熱混合物時源自dsDNA結(jié)合染料的熒光，生成擴增子的熔解曲線， 調(diào)節(jié)混合物以有利于通過探針元件分子內(nèi)結(jié)合至靶核酸的發(fā)夾形成，并且 通過測定加熱混合物時源自dsDNA結(jié)合染料的熒光，生成探針元件的熔解曲線。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述調(diào)節(jié)是稀釋擴增子。
39.權(quán)利要求38的方法，進一步包括以下步驟在生成探針元件的熔解曲線之前，加熱稀釋的擴增子至少至擴增子的變性溫度并冷卻 加熱的稀釋擴增子至探針變性溫度之下的溫度。
40.權(quán)利要求37的方法，其中所述調(diào)節(jié)是之后快速冷卻的加熱。
41.權(quán)利要求37的方法，其中所述調(diào)節(jié)是增加pH值。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于核酸分析的方法和試劑盒。在一個例證性的方法中，應(yīng)用第一引物和第二引物擴增靶核酸，其中第一引物包含特異于靶核酸的一個位點的探針元件以及模板特異的引物區(qū)，并且所述的探針元件在模板特異引物區(qū)的5’端，從而使得探針元件雜交至所述位點以形成發(fā)夾，當混合物被加熱時通過測量結(jié)合染料的dsDNA的熒光生成探針元件的熔解曲線，其中所述的染料非共價結(jié)合至第一引物，并分析熔解曲線的形狀。試劑盒可以包括一個或多個第一和第二引物、結(jié)合dsDNA的染料、聚合酶以及dNTPs。
文檔編號C07H21/02GK101918587SQ200880014841
公開日2010年12月15日 申請日期2008年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月8日
發(fā)明者C·T·威特沃, L·周, M·A·普瑞茨 申請人:愛達荷州技術(shù)股份有限公司;猶他大學(xué)研究基金會