專利名稱：豬的snp分子標(biāo)記及其引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因生物工程領(lǐng)域；進(jìn)一步來說利用豬的PSMB6的基因，在商品豬廣 泛使用的豬種中鑒定到新的SNP分子標(biāo)記，將此分子標(biāo)記可用于豬肉產(chǎn)品的DNA溯源。
背景技術(shù)：
民以食為天，隨著生活水平和保健意識(shí)的提高，人們?cè)絹碓阶⒅厥称钒踩珕栴}。豬 肉制品作為人膳食中重要的蛋白質(zhì)來源，成為食品安全的重要組成部分。肉制品的安全隱 患主要是藥物殘留超標(biāo)和人畜共患病攜帶。因此實(shí)現(xiàn)對(duì)肉制品的可追溯管理，包括養(yǎng)殖、運(yùn) 輸、屠宰、分割、銷售等各個(gè)環(huán)節(jié)。通過對(duì)肉制品的溯源管理，能夠?yàn)橄M(fèi)者提供準(zhǔn)確而詳細(xì) 的有關(guān)產(chǎn)品的信息，有利于生產(chǎn)經(jīng)營管理者及時(shí)發(fā)現(xiàn)各環(huán)節(jié)中存在的不安全隱患，為消費(fèi) 者提供一個(gè)獲取有效可靠信息的途徑，更為重要的是，大大加強(qiáng)了政府部門對(duì)肉質(zhì)品質(zhì)量 安全的監(jiān)管，為國家迅速建立食品安全風(fēng)險(xiǎn)的應(yīng)對(duì)機(jī)制提供有效信息，將有助于社會(huì)的安 定。 肉制品的溯源方法可以分為物理方法(標(biāo)簽溯源技術(shù)，如條形碼、電子標(biāo)簽等)、 化學(xué)方法(包括同位素溯源技術(shù)、礦物元素指紋溯源技術(shù)、有機(jī)物溯源技術(shù)等)和生物方法 (虹膜特征技術(shù)和DNA溯源技術(shù))。由于標(biāo)簽溯源技術(shù)存在標(biāo)簽丟失、記錄出差、標(biāo)記圖案 模糊不清以及標(biāo)簽容易人為改換等缺點(diǎn)，而指紋溯源技術(shù)、有機(jī)物溯源技術(shù)、虹膜特征溯源 技術(shù)分別因?yàn)闄z測(cè)時(shí)間長，檢測(cè)過程比較復(fù)雜，無法規(guī)?；灰淄茝V，而DNA溯源技術(shù)因 為其易分型、重復(fù)性好、檢測(cè)手段簡單快捷、成本低廉等成為目前國際上被公認(rèn)為最具發(fā)展 潛力和應(yīng)用價(jià)值的快速溯源技術(shù)。 DNA溯源技術(shù)的產(chǎn)生源于DNA的遺傳與變異。每個(gè)個(gè)體所擁有獨(dú)一無二的DNA序 列，通過分子生物學(xué)方法所顯示出來的DNA圖譜也就獨(dú)一無二，因此可以把DNA作為像指紋 那樣的獨(dú)特特征來識(shí)別不同的個(gè)體。DNA指紋鑒定早已作為一種法醫(yī)學(xué)物證分析方法運(yùn)用 到人類的刑事案件偵破以及親子鑒定中。同樣，DNA指紋鑒定也適用于肉制品的溯源乃至 所有食品的溯源。用于構(gòu)建個(gè)體DNA指紋圖譜的分子標(biāo)記，早期的有AFLP標(biāo)記(擴(kuò)增片段 長度多態(tài)性)、SSR標(biāo)記(微衛(wèi)星標(biāo)記)，以及新興的SNP標(biāo)記(單核苷酸多態(tài)性)。
AFLP具有的高度可靠性和操作簡便性，但是AFLP存在著對(duì)模板反應(yīng)表現(xiàn)遲鈍、譜 帶可能發(fā)生錯(cuò)配與缺失、成本相對(duì)比較高等缺點(diǎn)。相比SSR標(biāo)記和SNP標(biāo)記來講，AFLP標(biāo)記 更適于品種指紋的鑒定、品種質(zhì)量和純度的檢測(cè)。相比SNP標(biāo)記，微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因眾 多，多態(tài)豐富，研究表明，每個(gè)微型衛(wèi)星標(biāo)記的信息容量至少相當(dāng)于3個(gè)SNPs甚至更多SNPs 獲得的信息容量，但也正因如此，使得SSR標(biāo)記的帶型復(fù)雜，給DNA指紋識(shí)別自動(dòng)化和規(guī)模 化帶來困難。 SNP標(biāo)記是美國學(xué)者Lander E于1996年提出的DNA遺傳標(biāo)記，是指基因組同一 位點(diǎn)上單個(gè)核苷酸的變異，從理論上來說每一個(gè)SNP位點(diǎn)都可以有4種不同的變異形式，包 括置換、顛換、缺失和插入，但實(shí)際上發(fā)生的只有兩種，即轉(zhuǎn)換和顛換，二者之比為2 : l，并 且大部分表現(xiàn)為二等位基因，非此即彼。SNP標(biāo)記因分布廣泛，遺傳穩(wěn)定，并且適宜高通量
3自動(dòng)化分析，所以日益成為動(dòng)物身份識(shí)別最受關(guān)注的分子標(biāo)記，并將逐步取代AFLP標(biāo)記和 SSR標(biāo)記。 豬的育種工作者在長期的研究過程中，積累了大量的SNP標(biāo)記信息，但并非所有 的SNP標(biāo)記都可以用作溯源，可以用于溯源的SNP標(biāo)記具有以下特點(diǎn)(l)變異度高，等位 基因頻率接近；(2)品種間等位基因分布差異小；(3) SNP側(cè)翼序列不存在任何變異。
專利200410013385. 1公開了 PSMB6基因，并指出該基因主要參與泛素_蛋白酶體 途徑的蛋白水解，還參與其他的代謝途徑。雖然已有的技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了 RFLP分析，但RFLP 用于品種指紋的鑒定、品種質(zhì)量和純度的檢測(cè)，對(duì)上述的基因的SNP標(biāo)記研究和用于溯源 研究尚未有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于，在商品豬培育中使用廣泛的豬種和組合中篩選
PSMB6基因中以尋找可以用于豬肉產(chǎn)品DNA溯源的SNP分子標(biāo)記。 本發(fā)明還提供了一組用于鑒定豬PSMB6基因序列中SNP分子標(biāo)記的引物。 本發(fā)明還提供了用于鑒定豬PSMB6基因序列中SNP分子標(biāo)記方法。 為了解決上述問題本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣的 豬PSMB6基因中的SNP分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記是通過DNApool測(cè)序獲得，并根據(jù)該 SNP標(biāo)記在試驗(yàn)群體中等位基因的分布情況，可用于豬肉產(chǎn)品溯源。 所述的豬PSMB6基因的DNA序列，共587bp，其中包含完整內(nèi)含子l的序列，部分外 顯子1和部分的外顯子2的序列。 —種分離核酸，具有序列表SEQ ID NO. 1所示的堿基序列，在第428位有一個(gè)堿基 突變(C/G)的復(fù)等位基因的SNP標(biāo)記，在SEQ ID NO. 1序列中用n表示該位點(diǎn)，所述的SNP 導(dǎo)致Csp6I-RFLP (Restriction Fragment LengthPolymorphism)多態(tài)性。
—組鑒定豬PSMB6基因中的SNP分子標(biāo)記的引物，其特征在于，具有如序列表SEQ ID NO. 2和序列表SEQ ID NO. 3所示的堿基序列。 —種鑒定豬PSMB6基因中SNP分子標(biāo)記的方法，其特征在于，通過PCR-Csp6I-RFLP 的方法檢測(cè)豬PSMB6基因。豬PSMB6基因的mRNA序歹lj， GenBank號(hào)碼是NM_001144926。 PSMB6基因的SNP位點(diǎn)是通過DNApool測(cè)序比較獲得，通過在試驗(yàn)群體中檢測(cè)分析 SNP標(biāo)記的分布情況來篩選適于用于豬肉產(chǎn)品溯源的SNP標(biāo)記，包括步驟
(1)構(gòu)建豬的DNApool ; (2)設(shè)計(jì)引物分離PSMB6基因的DNA片段，測(cè)序并分析；
(3)采集9個(gè)品種和品系的耳組織樣，大約300個(gè)個(gè)體； (4)檢測(cè)SNP標(biāo)記在試驗(yàn)群體的分布，篩選適用于豬肉產(chǎn)品溯源的SNP標(biāo)記。
本發(fā)明通過鑒定豬PSMB6基因篩選獲得一個(gè)新的SNP分子標(biāo)記，并分析該SNP標(biāo) 記428位(C/G)在試驗(yàn)豬群中的分布，可以用于豬肉產(chǎn)品DNA溯源的SNP分子標(biāo)記。


圖1是PSMB6基因Csp6I-RFLP酶切圖。
具體實(shí)施例方式
為了使本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié) 合具體圖示，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。 如圖1所示的是PSMB6基因Csp6I-RFLP酶切圖。序列分析結(jié)果表明第428位堿 基處的堿基突變(428C-428G)，導(dǎo)致Csp6I-RFLP多態(tài)性。該基因座由兩個(gè)等位基因控制，C 等位基因只有5S7bp —個(gè)片段，G等位基因有428bp+159bp兩個(gè)片段。這兩個(gè)等位基因可 組成三種基因型CC， CG， GG(見圖1)。圖片泳道自左至右依次為DNA Marker, GG基因型個(gè) 體、CG基因型個(gè)體、CC基因型個(gè)體和CG基因型個(gè)體。
實(shí)施例1
1.分子標(biāo)記的查找
(l)DNApool的構(gòu)建 分別隨機(jī)采集大白豬、梅山豬、杜洛克個(gè)體各2頭(不分性別)的耳組織，提取DNA 后，等量吸取6個(gè)個(gè)體的DNA放入同一離心管中，混勻待用；
(2)引物設(shè)計(jì) 用人PSMB6基因cDNA(GenBank收錄號(hào)NM—002798)為信息探針，利用NCBI中的 BLAST工具在GenBank豬EST數(shù)據(jù)庫中做同源序列篩選，獲得一系列同源性為90%以上的 ESTs (片段長度大于100bp)，然后用DNAstar中的ASSEMBLY程序構(gòu)建豬EST-重疊群。根 據(jù)EST拼接序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物。 表1用于分子標(biāo)記查找的引物、退火溫度和預(yù)計(jì)長度
引物 引物序列 退火溫度片段大小
名稱 (5'_3， (°C) (bp) -'-
1PL GTAACGGAGGATGAAGATGG
58 587
1PR CAGTGGTTGTTCTGGAGTCG
2PLCGACTCCAGAACAACCACTG
58465
2PRCCAAGCTGATATGTGACTGC
3PLGCTGACTCCTATTCACGACC584
60
3PRTGTCTCACCATCATACCTCCPCR反應(yīng)總體積為20u l，其中豬基因組DNA約100ng，含1 Xbuffer (Promega)， 1. 5,1/L MgC12， dNTP終濃度為150 u mol/L，引物終濃度為0. 2 y mol/L， 2U Taq DNA聚合 酶(Promega)。 PCR擴(kuò)增程序是94。C 4min，然后循環(huán)35次94°C 30s，退火30s (溫度參見 表1) ，72°C 20s，最后72t:延伸5min。 PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。 [OO38] (3)測(cè)序分析將得到的PSMB6基因PCR產(chǎn)物按照常規(guī)方法進(jìn)行克隆，隨即
5挑取多個(gè)克隆子進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)引物1擴(kuò)增的DNA序列的428堿基處存在一個(gè) 堿基突變(428C-428G)，通過分子生物學(xué)軟件分析，發(fā)現(xiàn)428堿基處的堿基突變導(dǎo)致 Csp6I-RFLP (Restriction Fragment LengthPolymorphism)多態(tài)性 (4)RFLP檢測(cè)條件酶切反應(yīng)體積是10 ii l，其中IXbuffer 10ii 1， PCR產(chǎn)物3
5iU，限制性內(nèi)切酶Csp61為O. 5iil(5U)，用H20補(bǔ)足10ia，37t:水浴4h，用2%瓊脂糖凝
膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果。C等位基因只有587bp —個(gè)片段，G等位基因有428bp和159bp兩個(gè)
片段，這兩個(gè)等位基因可組成三種基因型CC， CG， GG。 實(shí)施例2 2.等位基因的分布情況 (1)試驗(yàn)群體的設(shè)計(jì) 試驗(yàn)組采集梅山豬(33頭)、通城豬(50頭)、清平豬(38頭)、藏豬(28頭)、民豬 (23頭)、二花臉豬(43頭)、大白豬(28頭)、長白豬(15頭)、皮特蘭(12頭)、杜洛克(14 頭)、申農(nóng)(31頭)、皮申(42頭)、大申(34頭)和杜申(23頭)個(gè)體的耳組織，提取DNA， 共計(jì)414個(gè)DNA樣本。試驗(yàn)群體目的在于檢測(cè)SNP標(biāo)記在不同品種中的分布情況。
(2)基因型檢測(cè)利用在上一步檢測(cè)有分子標(biāo)記的引物l，用相同的方法檢測(cè)試驗(yàn) 群體所有的個(gè)體基因型。 (3)統(tǒng)計(jì)分析記錄所有個(gè)體的基因型，并計(jì)算等位基因頻率。
表2PCR-RFLP-Csp61多態(tài)性在13個(gè)豬品種或品系中的分布
基因型基因頻率品種個(gè)體
CCCGGGCG
通城3316120.3939O掘l
梅山501027130.47000.5300
清平3862390.46050.5395
藏豬2878130.39290.6071
民豬231260.45650.5435
二花臉431119130.47670.5233
大白2891810.64290.3571
長白154920.56670.4333
皮特蘭124260.41670.5833
杜洛克14290.46430.5357
申農(nóng)31101920.62900.3710
皮申42112380.53570.4643
大中34614140.38240.6176
杜申2322010.52170.4783 分析該SNP位點(diǎn)等位基因的分布情況，發(fā)現(xiàn)第428位G/C分子標(biāo)記在不同的品種 和品系中的等位基因頻率接近，多態(tài)性豐富；品種或品系間，等位基因頻率C和G的分布差 異??；并且，序列分析結(jié)果顯示該標(biāo)記位點(diǎn)上下游lOObp序列以內(nèi)不存在變異，從而不影響 該標(biāo)記的檢測(cè)結(jié)果。 以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)
人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本
發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變
化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其
等同物界定。 序列表
7
〈110〉上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 〈120〉豬的SNP分子標(biāo)記及其引物 〈130>TXPI092153 〈160 〉3 〈210>1 〈211>587 〈212>DNA 〈213〉豬(Sus scrofa) 〈220〉 〈221>gene 〈222〉 (1) . (587) 〈223〉 〈220〉 〈221〉mutation 〈222〉 (428) 〈223>n = c或t 〈220〉 <221>exon 〈222〉 (1). (118) 〈223〉 〈220〉 <221>intron 〈222>(119). . . (520) 〈223〉 〈220> <221>exon 〈222〉 (521) . . (587) 〈223〉 〈400>1 <401> gteacggagg atgaag atg gcg gcc acc tte gte get get egg gga gcc 49 Met Ala Ala Thr Leu Val Ala Ala Arg Gly Ala 1 5 10 ggg ctg gca cca gcc tgg ggg cat gag gcc att acc ccc gac tgg gaa 97 Gly Leu Ala Pro Ala Trp Gly His Glu Ala lie Thr Pro Asp Trp Glu 15 20 25 aac egg gaa gtc tec acc ggg 118 Asn Arg Glu Val Ser Thr Gly 30
gtgagcaagg acgcggggttcaggagatgc tcac朋ggcttga朋tggtg g朋ggate朋1783CCtggCtgg gttggg卿3Ctgggtgg3g Cgg3g卿ggtg3tgtgCtt朋gc郷ggg238agaggtetct teaggatgctgg3gtg3tgt g3tggg郷tgg朋ggt朋g gctg朋gcgt298gteattctgg agtetgcagg3Cg朋3gCtt朋ggCC3gggtgggcctttg agaatttgag358gattggaaat ctggtettctgcggcccccg tgaggattteateatgagtt 3gtggcgcac418gacattctcn tectcttgagactg朋tete C3gatcattgaggtttgcga atgctgtega478atetggaggg gctccgattcacccctttct cctttttcccag acc act ate atg532Thr Thr lie Met35gcc gtg caa ttc gat ggg ggc gtg gtt cte ggagCC g3C tCC 3g3580Ala Val Gin Phe Asp Gly Gly Val Val Leu Gly Ala Asp Ser Arg Thr404550acc act g587Thr Thr55〈210>2〈211>20〈212>DNA〈213〉豬(Sus scrofa)〈220〉 [o川]〈221>primer_bind 〈222〉 (1) . (20)〈223〉〈400>2gt雄gg3gg 3tg3卿tgg20〈210>3〈211>20〈212>DNA〈213〉豬(Sus scrofa)〈220〉〈221>primer_bind〈222〉 (1) . (20)〈223〉〈400>3cagtggttgt tctggagtcg20
權(quán)利要求
一種分離核酸，具有序列表SEQ ID NO.1所示的堿基序列，在第428位有一個(gè)堿基突變(C/G)的復(fù)等位基因的SNP標(biāo)記，在SEQ ID NO.1序列中用n表示該位點(diǎn)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分離核酸，其特征在于，所述的SNP導(dǎo)致Csp6I-RFLP多態(tài)性。
3. —組鑒定豬PSMB6基因中的SNP分子標(biāo)記的引物，其特征在于，具有如序列表SEQ IDNO. 2和序列表SEQ ID NO. 3所示的堿基序列。
4. 一種鑒定豬PSMB6基因中SNP分子標(biāo)記的方法，其特征在于，通過PCR-Csp6I-RFLP的方法檢測(cè)豬PSMB6基因。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的鑒定豬PSMB6基因中SNP分子標(biāo)記的方法，其特征在于，PSMB6基因的SNP位點(diǎn)是通過DNApool測(cè)序比較獲得，包括步驟(1) 構(gòu)建豬的DNApool ;(2) 設(shè)計(jì)引物分離PSMB6基因的DNA片段，測(cè)序并分析；(3) 采集至少9個(gè)品種和品系的耳組織樣，至少300個(gè)個(gè)體；(4) 檢測(cè)SNP標(biāo)記在試驗(yàn)群體的分布，篩選適用于豬肉產(chǎn)品溯源的SNP標(biāo)記。
6. —種豬的SNP分子標(biāo)記用于豬肉產(chǎn)品的溯源。
全文摘要
本發(fā)明通過在商品豬培育中使用廣泛的豬種和組合中篩選PSMB6基因，尋找到可以用于豬肉產(chǎn)品DNA溯源的SNP分子標(biāo)記，在該基因第428位有一(C/G)復(fù)等位基因SNP的分子標(biāo)記。本發(fā)明還提供了一組用于鑒定豬PSMB6基因序列中SNP分子標(biāo)記的引物及其方法。分析該SNP位點(diǎn)等位基因的分布情況，可以用于豬肉產(chǎn)品DNA的溯源。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101705232SQ200910199140
公開日2010年5月12日 申請(qǐng)日期2009年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月20日
發(fā)明者吳瀟, 唐雪明 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院