專利名稱：突變的家蠅乙酰膽堿酯酶基因及其表達載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因生物工程領(lǐng)域，特別涉及家蠅乙酰膽堿酯酶基因序列的突變及其
表達載體和制備方法。
背景技術(shù)：
乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase, AChE)主要存在于多細(xì)胞動物的神經(jīng)元 間、神經(jīng)元與肌肉細(xì)胞間的化學(xué)突觸上，是生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的一種關(guān)鍵酶，是主要的信號傳 遞分子。乙酰膽堿酯酶AChE行使水解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿Ach的功能，從而終止Ach對膽堿 能受體的興奮作用，保持神經(jīng)沖動傳導(dǎo)的靈敏性。 研究表明，多種化合物可抑制AChE的活性，導(dǎo)致有機體類膽堿代謝途徑過度，膽 堿酯不能被有效水解，大量積累于神經(jīng)末梢，有機體表現(xiàn)出肌肉抽搐，中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能紊 亂等癥狀，嚴(yán)重者甚至死亡。在眾多抑制劑中，有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥被認(rèn)為是AChE 的專性抑制劑，他們可使昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)中的AChE的絲氨酸羥基基團發(fā)生磷酸化或甲氨酰 化，使AChE失去活性，不能迅速水解乙酰膽堿，致使昆蟲死亡。 我國是蔬菜生產(chǎn)大國，目前我國蔬菜農(nóng)業(yè)上濫用高毒、高殘留農(nóng)藥的現(xiàn)象屢禁不 止。有的不按規(guī)范要求使用農(nóng)藥，有的甚至嚴(yán)重違反農(nóng)藥安全使用標(biāo)準(zhǔn)使用高毒農(nóng)藥；致使 相當(dāng)部分農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留明顯超標(biāo)，食用后在人體內(nèi)積累，引發(fā)疾病，有時甚至發(fā)生急性中 毒，嚴(yán)重危及人民健康和生命安全。與此同時，農(nóng)藥殘留問題也給農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)和正常貿(mào)易帶 來了許多負(fù)面影響。近年來，我國農(nóng)產(chǎn)品因農(nóng)藥殘留超標(biāo)而被進口國拒絕、扣留、退貨、索賠 和中止合同的事件時有發(fā)生。如2002年上海出口到韓國的紫菘因農(nóng)藥殘留超標(biāo)問題而遭 到退貨，造成直接經(jīng)濟損失達500多萬元。 一些國家更是利用國際貿(mào)易技術(shù)壁壘，人為地對 我國農(nóng)產(chǎn)品出口設(shè)置障礙，使我國蔬菜出口屢屢受阻。如何快速、靈敏、準(zhǔn)確地檢測出農(nóng)產(chǎn) 品及其加工產(chǎn)品中的殘留農(nóng)藥，是解決上述問題的關(guān)鍵。 目前農(nóng)藥殘留檢測主要有兩大類方法色譜檢測法和快速檢測法。色譜檢測法因 為其監(jiān)測數(shù)據(jù)的精確性和準(zhǔn)確性可為農(nóng)藥殘留執(zhí)法提供有力的參考依據(jù)。但其操作程序 復(fù)雜、需要高技術(shù)專業(yè)檢測人員，檢測儀器和費用都相當(dāng)昂貴，不利于大眾化?？焖贆z測法 操作簡便、不需要昂貴儀器，適合于現(xiàn)場檢測及大批樣品的篩選檢測，主要用來防止有機磷 和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留嚴(yán)重超標(biāo)的蔬菜和水果流入市場。快速檢測法中應(yīng)用最為廣泛的 是酶抑制法酶抑制法檢測農(nóng)產(chǎn)品中有機磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留是根據(jù)有機磷農(nóng)藥的 毒理特性對酶分解底物的抑制作用而建立起來的；其中使用較多的是乙酰膽堿酯酶(簡稱 AChE)。 近年來，我國在利用乙酰膽堿酯酶進行農(nóng)藥殘留檢測方面的研究取得了一定的成 果，并研發(fā)出了相應(yīng)的試劑盒、速測卡和速測儀。無論采用何種方法，酶是決定檢測方法靈 敏度和可靠性的最關(guān)鍵因子。目前采用的酶原料主要有兩類一是從國外進口乙酰膽堿酯 酶純酶制劑，如電鰻和牛血清來源的酶，但價格較高，而且對有機磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥缺 乏敏感性；二是直接從昆蟲體內(nèi)提取粗酶液，但該類酶產(chǎn)品的純度及穩(wěn)定性較差，影響了檢測結(jié)果的重復(fù)性。國際上先進的農(nóng)藥殘留速測技術(shù)是利用基因工程技術(shù)獲得高熱穩(wěn)定性膽 堿酯酶，并制備速測試紙條，克服了膽堿酯酶易失活、不穩(wěn)定等缺點，使檢測效率大幅度提 高。 自上世紀(jì)90年代起，多種來源(包括線蟲、果蠅、電鰻、鼠類、人等)的乙酰膽堿酯 酶基因在昆蟲細(xì)胞、爪蟾卵母細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞甚至植物株系中成功獲得了表達(Morel and Massouli6，1997 ;Simon and Massouli6，1997 ;Mendelson et al，1998 ;Hussein et al，1999,2000 ;Mor et al，2001 ;Uccelletti et al，2002 ;0vadia Lazari et al，2003)。 研究者利用這些重組蛋白注射老鼠、豚鼠和靈長類，在有機磷中毒試驗中取得了良好的預(yù) 防與治療效果。不同生物來源的AChE對抑制劑的敏感程度不同。蠅類的AChE發(fā)生磷酸化 與甲氨?；乃俣雀哂谄渌锏拿?，也就是說，蠅類的AChE對有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng) 藥是最為敏感的，是農(nóng)藥殘留檢測的較好生物學(xué)材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)難題在于通過分子生物學(xué)手段克隆到家蠅AChE基因后， 對其進行定點突變以顯著地提高酶的活性和穩(wěn)定性，以克服農(nóng)殘檢測中現(xiàn)有技術(shù)的不足， 使改造后的AChE對有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥更加敏感。 本發(fā)明所要解決的又一技術(shù)難題在于將上述定點突變后的AChE基因，在表達系 統(tǒng)中快速高效地獲得表達。用此種方法獲得的活性蛋白經(jīng)過純化之后便可以獲得純的 AChE，最終達到工業(yè)化生產(chǎn)的要求，為開發(fā)農(nóng)藥生物學(xué)檢測產(chǎn)品及農(nóng)藥設(shè)計和篩選提供有 用的蛋白材料。 為解決上述技術(shù)問題，采用的技術(shù)方案為 乙酰膽堿酯酶基因表達的成熟蛋白由612個氨基酸組成，具有SEQ IDNO. 1的氨基 酸序列，對應(yīng)SEQ ID NO. 2的核苷酸序列。 —種突變的家蠅乙酰膽堿酯酶基因，其表達的蛋白與現(xiàn)有的SEQ ID NO. l的氨基 酸序列相比，發(fā)生第262、327和374三個位點的氨基酸取代。 —種突變的家蠅乙酰膽堿酯酶基因，氨基酸取代如下在第262位用甘氨酸(G)取 代丙氨酸(A)，在第327位用苯丙氨酸(F)取代酪氨酸(Y)，在第374位用天冬氨酸(D)取 代異亮氨酸(I);該突變的家蠅乙酰膽堿酯酶具有SEQ ID NO. 3的氨基酸序列，與SEQ ID NO. 5的核苷酸序列相對應(yīng)。 —種突變的家蠅乙酰膽堿酯酶基因，氨基酸取代如下在第262位用甘氨酸(G)取 代丙氨酸(A)，在第327位用天冬氨酸(D)取代酪氨酸(Y)，在第374位用天冬氨酸(D)取 代異亮氨酸(I);所述突變的家蠅乙酰膽堿酯酶具有SEQ ID N0.4的氨基酸序列，與SEQ ID NO. 6的核苷酸序列相對應(yīng)。本發(fā)明還提供了一種載體，含有如前所述的SEQ ID NO. 5或SEQ ID NO. 6核苷酸序列。 所述的載體，包括pPIC9K或本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。
本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，其含有如前所述的SEQ ID NO. 5或SEQ IDNO. 6核 苷酸序列分子，或者含有如前所述具有SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 4的氨基酸序列的載體。
所述的宿主細(xì)胞，包括原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，其中，常用的原核宿主細(xì)胞如大腸桿菌，枯草桿菌等。優(yōu)選為真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；以及昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞等。 本發(fā)明的突變的家蠅乙酰膽堿酶基因，可應(yīng)用于對有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測。 —種突變的家蠅乙酰膽堿酯酶基因的表達蛋白的制備方法，包括以下步驟
1)、利用反向PCR法依次對第262位、327位和374位3個位點進行突變，得到突變 后的AChE基因序列并測序驗證； 2)、將編碼具有突變乙酰膽堿酯酶基因的核苷酸序列連接于表達載體pPIC9K中， 形成家蠅乙酰膽堿酯酶表達載體； 3)、將上述表達載體轉(zhuǎn)入酵母宿主細(xì)胞中，形成家蠅乙酰膽堿酯酶的重組細(xì)胞；
4)、在適合乙酰膽堿酯酶表達的條件下，培養(yǎng)上述的重組細(xì)胞；
5)、分離出具有家蠅乙酰膽堿酯酶蛋白活性的多肽。 本發(fā)明所述的DNA分子以合適的取向和正確的閱讀框插入到所述的載體中，再轉(zhuǎn) 入到所述的宿主細(xì)胞中，所述的DNA分子可以在宿主細(xì)胞中進行表達。 在眾多表達系統(tǒng)中，酵母表達系統(tǒng)具有繁殖迅速、營養(yǎng)要求簡單和便于工業(yè)化大 規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)的優(yōu)點。此外，酵母表達系統(tǒng)克服了大腸桿菌表達系統(tǒng)的缺點，不產(chǎn)生毒素， 安全可靠；具有分泌功能，使蛋白分泌到胞外，利于純化；可對蛋白進行多種翻譯后的修 飾，利于保持生物產(chǎn)品的活性和穩(wěn)定性。 本發(fā)明通過人工分子進化獲得新型基因資源，并利用基因工程手段在酵母細(xì)胞中 高效表達突變基因，獲得大量有活性的乙酰膽堿酯酶。通過該方法獲得的乙酰膽堿酯酶比 直接從昆蟲體內(nèi)提取的粗酶液純度更高，對低濃度的有機磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥具有更顯 著的敏感性，可用于農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的檢測，為發(fā)展新型酶法檢測農(nóng)藥殘留技術(shù)以及農(nóng) 藥的設(shè)計和篩選提供了高效的酶源，具有很大的應(yīng)用價值。


圖1本發(fā)明的技術(shù)流程圖。 圖2重組表達質(zhì)粒的酶切鑒定圖，其中 Ml為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL15000 ; M2為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 ; 1為載體pPIC9K ; 2為pPIC9K-EcoRI/Notl ; 3為pPIC9K-AChE-EcoRI/Notl ; 4為pPIC9K-GFD-EcoRI/Notl ; 5為pPIC9K-GDD-EcoRI/Notl ; 6為AChE的PCR產(chǎn)物。 圖3AChE在畢赤酵母中的SDS-PAGE檢測 M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)； l為陰性對照； 2為轉(zhuǎn)入pPIC9K-AChE的酵母重組子； 3為轉(zhuǎn)入pPIC9K-GFD的酵母重組子；
4為轉(zhuǎn)入pPIC9K-GDD的酵母重組子。 圖4工程菌株中表達的AChE粗酶液活性檢測結(jié)果，為反應(yīng)后3分鐘的吸光值變 化。
具體實施例方式
下面實施例進一步描述本發(fā)明，但所述實施例僅用于說明本發(fā)明而不是限制本發(fā) 明。 實施例1家蠅AChE基因序列的獲得 提取家蠅總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄獲得家蠅總cDNA的第一條鏈。然后采用正 向弓l物Ace-F :5' -AAAGGATCC(BamHI)ATGGCTAGATCCGTCAG-3， 和反向弓|物Ace-R : 5' -AAAGAGCTC(SacI) TTACTGGAAGATAGAG-3'進行PCR擴增，獲得家蠅AChE基因的cDNA擴 增產(chǎn)物，并進行電泳回收。用限制性內(nèi)切酶BamHI和Sacl分別雙酶切回收的PCR產(chǎn)物和 pBbluScipt SK+載體，連接兩者酶切后的片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a ，獲得含AChE cDNA基 因序列的大腸桿菌克隆，將大腸桿菌中含AChE cDNA序列的質(zhì)粒命名為PBSK-AChE.
實施例2AChE基因的突變 根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，我們對AChE蛋白的結(jié)構(gòu)進行了模擬分析，最終確定
對以下位點的氨基酸進行定點突變改造 對于第262位氨基酸突變，設(shè)計如下引物A262G-up :5' GCACAATGAATGCTCCCTGGAGC3' 突變位點A262G-dn :5' CCGACTGCATCATACCCCATTTGAC3'
對于第327位氨基酸突變，分別設(shè)計如下2對引物
Y327F-up :5' CCTCCCTCGGCTCCAACCATCGATG3'
突變位點Y327F-dn :5' ACTTAAAATTCCAGAATACGAGTTC3'
以及Y327D-up :5' GATCCCTCGGCTCCAACCATCGAT3'
突變位點Y327D-dn :5' ACTTAAAATTCCAGAATACGAGTTC3'
對于第374位氨基酸突變，設(shè)計如下引物
I374D-up :5' GATGATTATTTCGATAAGGATGATG3，
突變位點 I374D-dn :5' AAAGTCGTAGAGCAGAAAATATGTGC3' 利用反向PCR法依次對上述位點進行突變，具體操作步聚按T0Y0B0定點突變試劑 盒說明書進行(購自T0Y0B0公司)，并進行測序驗證，最終獲得含有預(yù)期突變位點的AChE 基因序列。 實施例3AChE基因表達載體的構(gòu)建 根據(jù)酶母表達載體pPIC9K(購自Invitrogen公司)的多克隆位點，設(shè) 計并合成 一 對引物Pl :5' AAAAGAATTC(EcoRI)ATGACAGATCATCTAACGGTTC3'禾P P2 :5' AAAAGCGGCCGC (Notl) TTACTGGAAGATAGAGTTGAC3'，在5'端分別引入酶切位點EcoRI和 Notl。以含有AChE基因的質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，擴增的產(chǎn)物采用EcoRI和Notl進行 雙酶切，酶切產(chǎn)物與同樣進行雙酶切后的載體pPIC9K連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑 取陽性克隆進行酶切鑒定并測序，圖2是重組表達質(zhì)粒的酶切鑒定圖。構(gòu)建得到的載體分 別命名為pPIC9K-AChE、pPIC9K-GFD(突變位點為A262G， Y327F和I374D) 、 pPIC9K-GDD (突 變位點為A262G， Y327D和I374D)。
實施例4線性化質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化畢赤酵母 在50ml三角瓶中加入5mlYPD，將SMD1168酵母單菌落接種其中，振蕩培養(yǎng)過夜 (3(TC，200rpm)。取0. 1_0. 5ml菌液，接種在100ml新鮮培養(yǎng)液中，再次劇烈振蕩培養(yǎng)過夜， 至0D600 = 1. 3-1. 5。離心(4。C，5000rpm，5min)，用100ml預(yù)冷的無菌水重懸細(xì)胞沉淀。離 心(4°C ， 5000rpm， 5min)，用50ml預(yù)冷的無菌水重懸細(xì)胞沉淀。離心(4°C ， 5000rpm， 5min)， 用4ml預(yù)冷的1M山梨醇重懸細(xì)胞沉淀。離心(4。C，5000rpm，5min)，用200ul預(yù)冷的1M山 梨醇重懸細(xì)胞沉淀。 取80ul經(jīng)上述處理的酵母細(xì)胞懸液，與線性化質(zhì)粒(5-20ug)混合。將混合物轉(zhuǎn) 移至預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中。冰上放置5min。用電轉(zhuǎn)化儀(購自E卯endorf公司)進行電轉(zhuǎn) 化(參數(shù)2KV， 200 Q ， 25uF)。在電轉(zhuǎn)化杯中迅速加入lml預(yù)冷的1M山梨醇，顛倒數(shù)次，以 混合細(xì)胞，冰浴數(shù)分鐘，取250 ii 1等份，涂布于MD平板，溫育(30°C ， 3-4d)至菌落出現(xiàn)。
實施例5誘導(dǎo)甲醇酵母細(xì)胞表達AChE蛋白 即使在同一個轉(zhuǎn)化事件中，外源基因也可能以多種形式發(fā)生重組，不同的重組子 表達外源蛋白的效率不同。實驗中，挑選1000個酵母重組子，誘導(dǎo)其表達AChE，篩選表達水 平高的重組子。為保證表達活力，從平板上挑選新鮮的單菌落，或從-7(TC凍存的菌種中挑 取一部分培養(yǎng)，誘導(dǎo)外源蛋白表達過程如下 從MD平板上挑取單菌落，接種于25ml的BMGY中，振蕩培養(yǎng)(28 °C ， 250rpm)，至 0D600 = 2 (約18h)，細(xì)胞處于對數(shù)增長期。離心(室溫，5000rpm， 5min)，收集細(xì)胞。用50ml B匪Y重懸細(xì)胞沉淀，至0D600 = 1。將菌液轉(zhuǎn)移至另一個三角瓶，用兩層紗布蓋住瓶口，繼續(xù) 振蕩培養(yǎng)。為持續(xù)誘導(dǎo)表達，每2處補充甲醇，終濃度為0.5%。為確定最佳誘導(dǎo)時間，分別 在誘導(dǎo)后第48、72、96、120、144小時，收集500ul培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)入1. 5ml離心管，離心(室溫， 13000rpm，2min)，將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管，取出一部分用于SDS-PAGE電泳分析蛋白表達 情況，結(jié)果表明，含有AChE或突變AChE基因的重組酵母在67kD左右出現(xiàn)特異性表達條帶， 與預(yù)期蛋白大小相符(圖3)。
實施例6AChE酶活的測定 吸取20iil酵母培養(yǎng)液，加入96孔酶標(biāo)板的對應(yīng)微孔中，25。C，放置5min。在孔 中加入180 ii 1 Ellman試劑(2， 2雙(4硝基2羧基)二硫化物，DTNB) (20mM ATChI， 20mM DTNB， 0. 1M磷酸鈉緩沖液)，混勻，立即將96孔板置于酶標(biāo)儀中，測定405nm波長下3min的 吸光值。每個時間點的收集樣品平行測定3次。測定的結(jié)果見圖4，柱形圖為反應(yīng)后3分 鐘的不同酶的吸光值變化。a為正常AChE的OD吸收值0. 005， b為突變的AChE即GFD的 OD吸收值0. 076， c為突變的AChE即GDD的OD吸收值0. 012。經(jīng)過計算，突變后的AchE吸 收值比正常對照有顯著差異性p < 0. 01，即本發(fā)明的突變的乙酰膽堿酯酶都具有很高的活 性。
從上可以看出，突變后的乙酰膽堿酯酶活性都有顯著提高，可以用來對蔬菜、瓜果 中的有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留進行檢測。 以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù) 人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本 發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變 化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權(quán)利要求書及其
等同物界定。序列表〈110〉上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院〈120〉突變的家蠅乙酰膽堿酯酶基因及其表達載體〈130〉TXPI092250〈160>6〈170>PatentIn version 3.3〈210>1〈211>612〈212>PRT〈213>家蟲雖(Musca domestica)〈220〉〈221〉CHAIN〈22:(612)〈400>1MetThr AspHisLeuThrValGinThrThrSerGlyProValArgGly151015ArgSer ValThrValGinGlyArgAspValHisValPheThrGlylie202530ProTyr AlaLysProProValAspAspLeuArgPheArgLysProVal354045ProAla GluProTrpHisGlyValLeuAspAlaThrArgLeuProAla505560ThrCys ValGinGluArgTyrGluTyrPheProGlyPheSerGlyGlu65707580GluMet TrpAsnProAsnThrAsnValSerGluAspCysLeuPheMet859095Asnlie TrpAlaProAlaLysAlaArgLeuArgHisGlyArgGlyThr100105110AsnGly GlyGluHisSerSerLysThrAspGinAspHisLeulieHis115120125 [o川]SerAla Thr 130ProGinAsnThr 135ThrAsnGlyLeuPro 140lieLeulieTrp
lieTyrGlyGlyGlyPheMetThrGlySerAlaThrLeuAsplieTyr145150155160AsnAlaGlulieMetSerAlaValGlyAsnVallieValAlaSerPhe165170175GinTyrArgProGlyAlaPheGlyPheLeuHisLeuSerProValMet180185190ProGlyPheGluGluGluAlaProGlyAsnValGlyLeuTrpAspGin195200205AlaLeuAlaLeuArgTrpLeuLysGluAsnAlaArgAlaPheGlyGly210215220AsnProGluTrpMetThrLeuPheGlyGluSerAlaGlySerSerSer225230235240ValAsnAlaGinLeuMetSerProValThrArgGlyLeuValLysTrp245250255GlyMetMetGinSerAlaThrMetAsnAlaProTrpSerHisMetThr260265270SerGluLysAlaValGlulieGlyLysAlaLeuValAsnAspCysAsn275280285CysAsnAlaSerLeuLeuProGluAsnProGinAlaValMetAlaCys290295300MetArgGinValAspAlaLysThrlieSerValGinGinTrpAsnSer305310315320TyrSerGlylieLeuSerTyrProSerAlaProThrlieAspGlyAla325330335PheLeuProAlaAspProMetThrLeuLeuLysThrAlaAspLeuSer340345350GlyTyrAsplieLeulieGlyAsnValLysAspGluGlyThrTyrPhe355360365LeuLeuTyrAspPhelieAspTyrPheAspLysAspAspAlaThrSer370375380LeuProArgAspLysTyrLeuGlulieMetAsnAsnliePheGinLys385390395400AlaSerGinAlaGluArgGluAlalieliePheGinTyrThrSerTrp405410415GluGlyAsnProGlyTyrGinAsnGinGinGinlieGlyArgAlaVal420425430GlyAspHisPhePheThrCysProThrAsnGluTyrAlaGinAlaLeu435440445AlaGluArgGlyAlaSerValHisTyrTyrTyrPheThrHisArgThr
450455460SerThrSer LeuTrpGly GluTrpMetGlyValLeuHisGlyAspGlu465470475■lieGluTyr PhePheGly GinProLeuAsnAsnSerLeuGinTyrArg485490495ProValGlu ArgGluLeu GlyLysTrpMetLeuAsnSerVallieGlu500505510PheAlaLys SerGlyAsn ProAlaValAspGlyGluGluTrpProAsn515520525PheSerLys GluAspPro ValTyrTyrValPheSerThrAspGluLys530535540lieGluLys LeuGinArg GlyProLeuAlaLysTrpCysSerPheTrp545550555560AsnAspTyr LeuProLys ValArgSerTrplieGlySerGluCysGlu565570575AsnLysSer SerThrSer AlaSerAlaAlalieTyrGluMetLysMet580585590GinGinLeu ThrLeuLeu AlaValAlalielieLeuThrMetValAsn595600605SerliePhe Gin610〈210>2〈211>1839〈212>DNA〈213>Muscadomestica〈220〉〈221>gene〈22:(1839)〈400>2atgacagatcatcteacggttc朋3cgacc agcggtccag teagagg朋g atcggttecc60gttcagggtegagatgtacacgtcttteccggcattccgt atgccaagcctcctgttgat120gatttgagattcag朋朋cctgtecctgctgaaccttggc atggtgtcct agatgcaact1803g3CtgCC3gcaacatgcgt3C3gg3gag3 tetgagtect tccctggcttttccggtgaa240g卿tgtgg3atccteacacaaatgtatctgaagattgtt tgtttetgaa tetctgggct300cctgcteaggc朋gattgag3catggteg3 gg朋cc朋tg gtggtgagca ttcatcte朋3603CCg3tC3ggaccattteatccategcgca actccacaga acaccaccaacggtttgcct420atctteatctggatttetggcggtggcttt atgactggct cagccacattggacatttec■朋CgC3g3g3ttetgtcggccgtgggc朋tgtgatcgttg cctcgttcca gtecagaccc540ggtgctttcggtttcctgcatctttcacctgttetgccag gttttg朋ga ag朋gctccc6000190]ggc雄gtgggcctttgggatcaggccttg
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0223]〈220〉
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權(quán)利要求
一種突變的家蠅乙酰膽堿酯酶基因，其特征在于，其表達的蛋白與現(xiàn)有的SEQ ID NO.1氨基酸序列相比，發(fā)生第262、327和374三個位點的氨基酸取代。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種突變的家蠅乙酰膽堿酯酶基因，其特征在于，所述的氨 基酸取代如下在第262位用甘氨酸(G)取代丙氨酸(A)，在第327位用苯丙氨酸(F)取代 酪氨酸(Y)，在第374位用天冬氨酸(D)取代異亮氨酸(I);所述突變的家蠅乙酰膽堿酯酶 具有SEQ ID NO. 3的氨基酸序列，與SEQ ID NO. 5的核苷酸序列相對應(yīng)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種突變的家蠅乙酰膽堿酯酶基因，其特征在于，所述的氨 基酸取代如下在第262位用甘氨酸(G)取代丙氨酸(A)，在第327位用天冬氨酸(D)取代 酪氨酸(Y)，在第374位用天冬氨酸(D)取代異亮氨酸(I);所述突變的家蠅乙酰膽堿酯酶 具有SEQ ID NO. 4的氨基酸序列，與SEQ ID NO. 6的核苷酸序列相對應(yīng)。
4. 一種載體，其特征在于，含有如前所述的SEQ ID NO. 5或SEQID N0.6核苷酸序列。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種載體，其特征在于，所述的載體為pPIC9K。
6. —種宿主細(xì)胞，其特征在于，其含有如前所述的SEQ ID NO. 5或SEQ IDNO. 6核苷酸 序列分子，或者含有如前所述具有SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 4的氨基酸序列的載體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種宿主細(xì)胞，其特征在于，包括真核細(xì)胞或原核細(xì)胞。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的真核細(xì)胞為酵母細(xì)胞、昆 蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的原核細(xì)胞為大腸桿菌，枯 草桿菌。
10. —種突變的家蠅乙酰膽堿酶基因在有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥檢測中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了通過基因工程改造得到突變的家蠅乙酰膽堿酯酶基因及其表達載體。本發(fā)明所述的突變的家蠅乙酰膽堿酯酶表達的蛋白與現(xiàn)有的SEQ IDNO.1氨基酸序列相比，發(fā)生第262、327和374三個位點的氨基酸取代。本發(fā)明得到的突變后的乙酰膽堿酯酶對低濃度的有機磷及氨基甲酸酯農(nóng)藥具有顯著的敏感性，可以用于農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的檢測，為研制農(nóng)藥生物學(xué)檢測產(chǎn)品提供更為靈敏的蛋白酶材料，具有很大的應(yīng)用價值。
文檔編號C12N9/16GK101709304SQ20091019914
公開日2010年5月19日 申請日期2009年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月20日
發(fā)明者唐雪明, 朱宏, 段可, 王利剛, 王金斌, 譚芙蓉, 趙凱 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院