寬筋藤乙酰膽堿酯酶抑制活性提取物及其組合物的醫(yī)藥用途和制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種寬筋藤乙酰膽堿酯酶抑制活性提取物及其 組合物的制備方法以及它在治療阿爾茨海默?。ˋD)等方面的醫(yī)藥用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 寬筋藤為防已科植物中華青牛膽的干燥莖藤。 原植物中華青牛膽為落葉草質(zhì)高大藤木，長(zhǎng)達(dá)10余米或更長(zhǎng)；莖、枝肥厚，嫩枝綠色，有條 紋，被柔毛，老枝草黃色，覆膜質(zhì)的表皮，有顯著凸出的皮孔。性涼，味苦。歸肝、脾經(jīng)。具有 祛風(fēng)除濕，舒筋活絡(luò)的功效。用于風(fēng)濕骨痛，筋絡(luò)拘攣，骨折，跌打損傷。
[0003] 本發(fā)明通過(guò)大規(guī)模、系統(tǒng)地活性篩選，意外地發(fā)現(xiàn)維吾爾藥寬筋藤提取物及其部 分化學(xué)組分，具有顯著地乙酰膽堿酯酶抑制活性，該活性提取物及其組合物有望應(yīng)用于治 療阿爾茨海默?。ˋD)等方面的醫(yī)藥用途。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種寬筋藤提取物。
[0005] 本發(fā)明還提供了以寬筋藤提取物為主要活性成分的組合物。
[0006] 本發(fā)明同時(shí)提供了寬筋藤提取物及其組合物的制備和在制備乙酰膽堿酯酶抑制 活性藥物中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的： 維吾爾藥寬筋藤經(jīng)甲醇超聲提取，提取液濃縮后，用硅膠（SiO2)柱分離，上樣后的硅膠 柱，用氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫(氯仿-甲醇，比例見(jiàn)表1 )，各氯仿-甲醇比例混合溶劑 洗脫液，濃縮，干燥后，利用體外篩選體系測(cè)試其乙酰膽堿酯酶抑制活性，意外地發(fā)現(xiàn)先用 氯仿-甲醇混合溶劑(氯仿_甲醇，1〇〇: 1，體積比)洗脫，繼用氯仿-甲醇混合溶劑(氯仿-甲 醇，100:2，體積比）洗脫得到的氯仿-甲醇混合溶劑(氯仿-甲醇，100:2，體積比）洗脫液經(jīng) 回收有機(jī)溶劑，干燥，即為乙酰膽堿酯酶抑制活性提取物。而其他比例的洗脫部位，沒(méi)有乙 酰膽堿酯酶抑制活性的作用。特別地，優(yōu)選為先用氯仿-甲醇混合溶劑(氯仿-甲醇，100:1， 體積比）洗脫10倍柱體積，繼用氯仿-甲醇混合溶劑(氯仿-甲醇，100:2,體積比）洗脫30 倍柱體積，洗脫液即為本發(fā)明乙酰膽堿酯酶抑制活性的提取物，其可以通過(guò)以上方法得到 富集，從而與其他雜質(zhì)類成分分離開(kāi)。該寬筋藤乙酰膽堿酯酶抑制活性提取物從未見(jiàn)文獻(xiàn) 報(bào)道，其薄層譜色譜（TLC)分析表征如圖1，TLC分析條件：GF254硅膠板，展開(kāi)系統(tǒng)：氯仿： 乙酸乙酯：甲醇（3:1:1)顯色方法：香草醛-硫酸顯色。
[0008] 維吾爾藥寬筋藤經(jīng)甲醇超聲提取，提取液濃縮后，用硅膠（SiO2)柱分離，上樣后的 硅膠柱，用氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫(氯仿-甲醇，比例見(jiàn)表1 )，各氯仿-甲醇比例混合 溶劑洗脫液，濃縮，干燥后，利用體外篩選體系測(cè)試其乙酰膽堿酯酶抑制活性，意外地發(fā)現(xiàn) 先用氯仿-甲醇混合溶劑(氯仿-甲醇，100:8,體積比）洗脫，繼用氯仿-甲醇混合溶劑(氯 仿-甲醇，100:12,體積比)洗脫得到的氯仿-甲醇混合溶劑(氯仿-甲醇，100:12,體積比)洗 脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑，干燥，即為乙酰膽堿酯酶抑制活性提取物。而其他比例的洗脫部位， 沒(méi)有乙酰膽堿酯酶抑制活性的作用。特別地，優(yōu)選為先用氯仿-甲醇混合溶劑(氯仿-甲醇， 100:8,體積比）洗脫10倍柱體積，繼用氯仿-甲醇混合溶劑(氯仿-甲醇，100:12,體積比） 洗脫30倍柱體積，洗脫液干燥即為本發(fā)明乙酰膽堿酯酶抑制活性的提取物。乙酰膽堿酯酶 抑制活性的提取物可以通過(guò)以上方法得到富集，從而與其他雜質(zhì)類成分分離開(kāi)。該寬筋藤 乙酰膽堿酯酶抑制活性提取物從未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，其薄層譜色譜（TLC)分析表征如圖2,TLC 分析條件：GF254硅膠板，展開(kāi)系統(tǒng)：氯仿：乙酸乙酯：甲醇（3:1:1)顯色方法：香草醛-硫酸 顯色。
[0009] 具體，發(fā)現(xiàn)過(guò)程如下： 1、寬筋藤經(jīng)甲醇超聲提取物的制備 取維吾爾藥寬筋藤20g，經(jīng)100mL甲醇超聲提取15min，提取液濃縮后，得提取物SN0104,樣品1.4978g，留樣0.0760g，上樣量1.4218g，拌樣硅膠1.7g，空白硅膠10g， 氯仿-甲醇系統(tǒng)洗脫。
[0010] 2、氯仿-甲醇混合溶劑梯度洗脫方法和結(jié)果 取維吾爾藥寬筋藤20g，經(jīng)100mL甲醇超聲提取15min，提取液濃縮后，得提取物SN0104，1.4218g，上柱，甲醇溶解，共用甲醇15mL。上硅膠柱色譜，拌樣硅膠1.7g，空白 硅膠10g，玻璃柱內(nèi)徑2.0cm，氯仿-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫(條件見(jiàn)表1)，柱體積25mL，每個(gè) 梯度洗脫200mL，得到，各個(gè)濃度提取洗脫液的洗脫物，回收溶劑，即得，氯仿：甲醇梯度洗 脫提取物，TLC分析結(jié)果見(jiàn)圖2,圖3,TLC分析條件：GF254硅膠板，展開(kāi)系統(tǒng)：氯仿：乙酸乙 酯：甲醇（3:1:1)顯色方法：香草醛-硫酸顯色。
[0011] 表 1

3、抑制乙酰膽堿酯酶活性篩選方法和結(jié)果 1) 實(shí)驗(yàn)條件 a、 材料：DMSO(二甲基亞砜）（科密歐公司）；KH2P04、K2HP04WH2CK廣東汕頭市西隴化 工廠）；AchE酶（美國(guó)Sigma公司）；PNPG(美國(guó)Sigma公司） b、 實(shí)驗(yàn)儀器：多功能酶標(biāo)儀Bio-RadModel680 型（Bio-RadLaboratoriesInc.) 2) 實(shí)驗(yàn)方法和過(guò)程 樣品處理：將Img待測(cè)樣品溶于20 二甲基亞砜（DMSO)作為母液，取I母液 加入249 蒸餾水配成200 .mr1的溶液。
[0012] 乙酰膽堿酯酶抑制活性測(cè)定方法： 在96孔酶標(biāo)板上測(cè)定樣品的AchE抑制活性。具體操作如下：在96孔酶標(biāo)板中依次加 入 20yLPB(100mM，pH8. 0)，25yLAChE(0? 033U/mL，pH8. 0PB溶解稀釋），25yL 樣品溶液（40yg.mL_ 〇。冰浴 5min后，加 15yLATCI(0. 6mM)及 15yLDTNB(I. 5mM)。 37°C孵育60min后，用酶標(biāo)儀在412nm下測(cè)定其吸光度值。根據(jù)下式計(jì)算抑制率： 酶活性抑制率％=[A空白_(A樣品-A背景）]/A空白X100 式中Aee :不加樣品反應(yīng)后的吸收值； :加入樣品反應(yīng)后的吸收值； Awft :只加樣品的吸收值。
[0013] 3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 表2

結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 本發(fā)明的最優(yōu)方案為：維吾爾藥寬筋藤經(jīng)有機(jī)溶劑超聲提取，提取液濃縮后，用硅膠柱 分離，上樣后的硅膠柱，先用氯仿-甲醇混合溶劑(氯仿-甲醇，100:1，體積比）洗脫，繼用 氯仿-甲醇混合溶劑(氯仿-甲醇，100:2,體積比）洗脫，用氯仿-甲醇混合溶劑(氯仿-甲 醇，100:2,體積比）洗脫的洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑，干燥，即為該乙酰膽堿酯酶抑制活性提 取物。該乙酰膽堿酯酶抑制活性提取物從未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，其TLC分析表征如圖1。
[0014] 維吾爾藥寬筋藤經(jīng)有機(jī)溶劑超聲提取，提取液濃縮后，用硅膠柱分離，上樣后的硅 膠柱，先用氯仿-甲醇混合溶劑(氯仿-甲醇，100:8,體積比）洗脫，繼用氯仿-甲醇混合溶 劑(氯仿-甲醇，100:12,體積比）洗脫，用氯仿-甲醇混合溶劑(氯仿-甲醇，100:12,體積 比）洗脫的洗脫液經(jīng)回收有機(jī)溶劑，干燥，即為該乙酰膽堿酯酶抑制活性提取物。該乙酰膽 堿酯酶抑制活性提取物從未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，其TLC分析表征如圖2。
[0015] 4、乙酰膽堿酯酶抑制活性有效提取物的提取方法研宄 1)提取溶劑的種類研宄 分別用甲醇、丙酮、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶劑、乙醇水混合溶劑等有機(jī) 溶劑提取，并測(cè)試提取物的乙酰膽堿酯酶抑制活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 表3
研宄結(jié)果表明：提取用有機(jī)溶劑可以為甲醇、石油醚、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混 合溶劑、乙醇水混合溶劑。
[0016] 2)提取溶劑的用量研宄 分別用1、2、5、10、20、30、40、50倍(重量/體積比)有機(jī)溶劑提取，并測(cè)試提取物的乙酰 膽堿酯酶抑制活性，結(jié)果如下： 表4
活性提取物的提取所用有機(jī)溶劑用量為藥材重量的2-50倍(重量/體積比)。
[0017] 3)干燥方法的研宄 分別用真空干燥法、冷凍干燥法、鼓風(fēng)干燥、離心干燥、旋蒸干燥法等方法，對(duì)得到的抑 制乙酰膽堿酯酶活性提取物進(jìn)行干燥，以含水量、TLC、活性測(cè)試為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)真空干燥法、 冷凍干燥法、鼓風(fēng)干燥、離心干燥、旋蒸干燥法適用于對(duì)乙酰膽堿酯酶抑制活性提取物進(jìn)行 干燥，其中，最優(yōu)為真空干燥法、冷凍干燥法。
[0018]表 5
優(yōu)選地，寬筋藤乙酰膽堿