專利名稱：一種乙酰膽堿酯酶熒光生物傳感器的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乙酰膽堿酯酶熒光生物傳感器的制備方法。
背景技術(shù)：
我國是一個農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)藥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中十分重要的生產(chǎn)資料。由于有機 磷類農(nóng)藥具有藥效高、品種多、防治對象多、在環(huán)境中易降解等優(yōu)點，在我國
農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上得到大量使用。有機磷農(nóng)藥及殘留物致使人、畜中毒的情況時常發(fā) 生。解決農(nóng)產(chǎn)品的關(guān)鍵問題是檢測技術(shù)建立一種準(zhǔn)確快速、簡單廉價的農(nóng)藥殘 留檢測技術(shù)是食品安全和環(huán)境保護的當(dāng)務(wù)之急。
有機磷生物傳感器快速檢測方法的研制國內(nèi)外均有報道，電化學(xué)酶電極生
物傳感器的研制較多，但存在受環(huán)境影響造成酶活性喪失，造成假陽性；酶的 價格昂貴，不可逆反應(yīng)造成生物傳感器無法多次使用，儀器成本過高；選擇性 不高。與電化學(xué)酶傳感器相比，熒光型酶傳感器具有不需連接外部電源不用參 考電極、體積小、質(zhì)量輕、易于小型化、信息容量大、響應(yīng)速度快等優(yōu)點。
本發(fā)明制備的乙酰膽堿酯酶熒光生物傳感器，具有貯存穩(wěn)定性高、分離回 收容易、可多次重復(fù)使用、操作連續(xù)及可控、工藝簡便、成本低廉等一系列優(yōu) 點?？蓱?yīng)用于食品中有機磷農(nóng)藥的快速檢測。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有酶生物傳感器受環(huán)境影響造成酶活性喪失、造成假陽性；酶 的價格昂貴、不可逆反應(yīng)造成生物傳感器無法多次使用、儀器成本過高等問題， 本發(fā)明提供了一種乙酰膽堿酯酶熒光生物傳感器的制備方法，能有效提高食品 中有機磷農(nóng)藥殘留測定的速度和精度。本發(fā)明中一種乙酰膽堿酯酶熒光生物傳 感器的制備方法，其特征在于乙酰膽堿酯酶熒光生物傳感器的制備方法的步驟 如下 一、乙酰膽堿酯酶的提取1、將購買的活鯽魚頭于自制冰盒保存，剪 開頭骨，再用鑷子將整個腦組織取出，以濾紙吸去血絲，并除去非腦組織，放 入表面皿中稱重。2、 Tris-HCl浸提法含0.1%TritonX-100和0.05mol/LNaCl 的Tris-HCl冰浴條件下勻漿(每15s,間歇5s)。勻漿液在0 4。C離心(10000 r/min)10min。 二、純化1、脫鹽將硫酸銨分級鹽析后，Tris-Hcl (0.07mol/l，pH=8)溶解的酶液裝入透析袋中，對蒸餾水透析48h，并用BaCl2溶液檢測透 析袋外溶液，直至透析袋外溶液與BaCl2溶液無沉淀生成。2、使用 SephadexG-200凝膠層析柱(2.5cmx60cm)，洗脫液為緩沖液，以一定的流速 每管3ml進行收集，測定每管酶液比活力，檢測時做三個平行樣。三、乙酰膽 堿酯酶固定化殼聚糖膜吸附-交聯(lián)法固定化乙酰膽堿酯酶取0,2g殼聚糖粉 末，加入1%醋酸lOmL,室溫下磁力攪拌5-10min，至形成黃色溶膠。4°C, lOOOOrymin離心3min，除去不溶顆粒。將纖維素膜(lcmxlcmx0.04cm)置于該 溶膠中浸泡12h，取出在自制晾干床上晾干后再置于0.1mol/L、 pH值為8.0的 PBS浸泡12h，取出，晾干備用。將5(^1酶液用移液器噴涂在已制備的殼聚 糖膜兩面，置于4"C吸附，用戊二醛于4t:進行交聯(lián)，取出旗，用PBS將多余 的戊二醛洗凈，吸干，即制得殼聚糖酶膜。晾干最后得到乙酰膽堿酯酶熒光生 物傳感器。
本發(fā)明中，在乙酰膽堿酯酶固定化方法中，采用殼聚糖吸附-交聯(lián)法固定 化乙酰膽堿酯酶，克服了游離乙酰膽堿酯酶穩(wěn)定性差,易失活、乙酰膽堿酯酶 催化反應(yīng)后與反應(yīng)體系混在一起,無法回收和重復(fù)利用、生產(chǎn)成本偏高等缺點。 與游離酶相比,固定化酶在保持其高效、專一及溫和的酶催化反應(yīng)特性的同時, 還呈現(xiàn)貯存穩(wěn)定性高、分離回收容易、可多次重復(fù)使用。所制備的乙酰膽堿酯 酶熒光生物傳感器，具有貯存穩(wěn)定性高、分離回收容易、可多次重復(fù)使用、操 作連續(xù)及可控、工藝簡便、成本低廉等一系列優(yōu)點。可應(yīng)用于食品中有機磷農(nóng) 藥的快速檢測。
具體實施例方式
具體實施方式
一本具體實施方式
中，1、 一種乙酰膽堿酯酶熒光生物傳 感器的制備方法，其特征在于乙酰膽堿酯酶熒光生物傳感器的制備方法的步驟 如下 一、乙酰膽堿酯酶的提取1、將購買的活鯽魚頭于自制冰盒保存，剪 開頭骨，再用鑷子將整個腦組織取出，以濾紙吸去血絲，并除去非腦組織，放
入表面皿中稱重。2、 Tris-HCl浸提法含0.1 % Triton X-100和0.05mol/LNaCl 的Tris-HCl冰浴條件下勻漿(每15s，間歇5s)。勻漿液在0~4°(3離心(10000 r/min)10min。 二、純化1、脫鹽將硫酸銨分級鹽析后，Tris-Hcl C0.07mo1/1， pH=8)溶解的酶液裝入透析袋中，對蒸餾水透析48h，并用BaCl2溶液檢測透析袋外溶液，直至透析袋外溶液與BaCl2溶液無沉淀生成。2、使用 SephadexG-200凝膠層析柱(2.5cmx60cm)，洗脫液為緩沖液，以一定的流速 每管3ml進行收集，測定每管酶液比活力，檢測時做三個平行樣。三、乙酰膽 堿酯酶固定化殼聚糖膜吸附-交聯(lián)法固定化乙酰膽堿酯酶取0.2§殼聚糖粉 末，加入1%醋酸10mL，室溫下磁力攪拌5 10min,至形成黃色溶膠。4'C， 10000r/min離心3min，除去不溶顆粒。將纖維素膜(lcmxlcmx0.04cm)置于該 溶膠中浸泡12h，取出在自制晾干床上晾干后再置于0.1mol/L、 pH值為8.0的 PBS浸泡12h，取出，晾干備用。將50pl酶液用移液器噴涂在已制備的殼聚 糖膜兩面，置于4r吸附，用戊二醛于4"C進行交聯(lián)，取出膜，用PBS將多余 的戊二醛洗凈，吸干，即制得殼聚糖酶膜。晾干最后得到乙酰膽堿酯酶熒光生 物傳感器。
具體實施方式
二本具體實施方式
與具體實施方式
一不同的是其特征在 于步驟一中，乙酰膽堿酯酶的提取，采用pH=8.0~10.0Tris-HCl溶液，冰浴條 件下勻漿4 10min(每15s，間歇5s)，勻漿比(質(zhì)量體積)為1:5。其它與具體實 施方式一相同。
具體實施方式
三本具體實施方式
與具體實施方式
一不同的是其特征在 于步驟二中使用SephadexG-200凝膠層析柱純化，洗脫液為0.1~0.2mol/L的磷 酸鹽緩沖液，流速0.15mL/min。其它與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
四本具體實施方式
與具體實施方式
一不同的是其特征在 于步驟三中50jil酶液置于4。C吸附12h，用0.1~0.4%戊二醛于4"C進行交聯(lián) 1.0~3.0h。其它與具體實施方式
一相同。
權(quán)利要求
1、一種乙酰膽堿酯酶熒光生物傳感器的制備方法，其特征在于乙酰膽堿酯酶熒光生物傳感器的制備方法的步驟如下一、乙酰膽堿酯酶的提取1、將購買的活鯽魚頭于自制冰盒保存，剪開頭骨，再用鑷子將整個腦組織取出，以濾紙吸去血絲，并除去非腦組織，放入表面皿中稱重。2、Tris-HCl浸提法含0.1％Triton X-100和0.05mol/LNaCl的Tris-HCl冰浴條件下勻漿(每15s，間歇5s)。勻漿液在0～4℃離心(10000r/min)10min。二、純化1、脫鹽將硫酸銨分級鹽析后，Tris-Hcl(0.07mol/l，pH＝8)溶解的酶液裝入透析袋中，對蒸餾水透析48h，并用BaCl2溶液檢測透析袋外溶液，直至透析袋外溶液與BaCl2溶液無沉淀生成。2、使用SephadexG-200凝膠層析柱(2.5cm×60cm)，洗脫液為緩沖液，以一定的流速每管3ml進行收集，測定每管酶液比活力，檢測時做三個平行樣。三、乙酰膽堿酯酶固定化殼聚糖膜吸附-交聯(lián)法固定化乙酰膽堿酯酶取0.2g殼聚糖粉末，加入1％醋酸10mL，室溫下磁力攪拌5～10min，至形成黃色溶膠。4℃，10000r/min離心3min，除去不溶顆粒。將纖維素膜(1cm×1cm×0.04cm)置于該溶膠中浸泡12h，取出在自制晾干床上晾干后再置于0.1mol/L、pH值為8.0的PBS浸泡12h，取出，晾干備用。將50μl酶液用移液器噴涂在已制備的殼聚糖膜兩面，置于4℃吸附，用戊二醛于4℃進行交聯(lián)，取出膜，用PBS將多余的戊二醛洗凈，吸干，即制得殼聚糖酶膜。晾干最后得到乙酰膽堿酯酶熒光生物傳感器。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乙酰膽堿酯酶熒光生物傳感器的制備方法， 其特征在于步驟一中，乙酰膽堿酯酶的提取，采用pH=8.0~10.0Tris-HCl溶液， 冰浴條件下勻漿4 10min(每15s，間歇5s)，勻漿比(質(zhì)量體積)為1:4 1:10。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乙酰膽堿酯酶熒光生物傳感器的制備方法， 其特征在于步驟二中使用SephadexG-200凝膠層析柱純化，洗脫液為 0.1~0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液，流速0.1 0.5mL/min。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乙酰膽堿酯酶熒光生物傳感器的制備方法， 其特征在于步驟三中50^1酶液置于4。C吸附0~12h，用0.1~0.4%戊二醛于4°C 進行交聯(lián)1.0 3.0h。
全文摘要
一種乙酰膽堿酯酶熒光生物傳感器的制備方法，涉及一種乙酰膽堿酯酶熒光生物傳感器的制備方法。本發(fā)明解決了現(xiàn)有酶生物傳感器受環(huán)境影響造成酶活性喪失，造成假陽性；酶的價格昂貴，不可逆反應(yīng)造成生物傳感器無法多次使用，儀器成本過高；選擇性不高等問題。一種乙酰膽堿酯酶熒光生物傳感器的制備方法的步驟為首先對鯽魚腦乙酰膽堿酯酶進行提取分離、純化，然后采用殼聚糖將鯽魚腦乙酰膽堿酯酶進行固定化，制備出固定化乙酰膽堿酯酶膜，即得酰膽堿酯酶熒光生物傳感器。本發(fā)明制備的乙酰膽堿酯酶熒光生物傳感器，具有不需連接外部電源、不用參考電極、體積小、質(zhì)量輕、響應(yīng)速度快、抗電磁干擾、防腐蝕、靈敏度很高、測量帶寬很寬、操作簡便、成本低廉等優(yōu)點。可應(yīng)用于食品中有機磷農(nóng)藥的快速檢測。
文檔編號G01N21/64GK101581670SQ200910072240
公開日2009年11月18日 申請日期2009年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月11日
發(fā)明者巖 焦, 王振宇 申請人:王振宇