專利名稱：：新的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：應(yīng)的用途，特別是用于預(yù)防和治療病原體所致的感染。具體地，本發(fā)明涉及能夠在受試者中誘導(dǎo)CD4+和CD8+T細胞反應(yīng)以及抗體反應(yīng)而不依賴于復(fù)雜的初免-力口強(prime-boost)方案的組合物。
背景技術(shù)：
：十九世紀晚期開始，滅活的整個有機體就已成功地用于疫苗接種。近來，采用了涉及給予提取物、亞基、類毒素和莢膜多糖的疫苗。自從可以使用基因工程技術(shù)以來，重組蛋白的使用成為了受歡迎的策略，它消除了與使用來自天然來源的純化蛋白相關(guān)的一些風(fēng)險。早期的疫苗方法基于在體內(nèi)刺激免疫反應(yīng)的某些方面的蛋白的給藥。隨后理解到還可以通過給予可以被宿主轉(zhuǎn)錄和翻譯成免疫原性蛋白的DNA來增加免疫反應(yīng)。哺乳動物免疫反應(yīng)具有兩個重要的組分體液反應(yīng)和細胞介導(dǎo)的反應(yīng)。體液反應(yīng)包括循環(huán)抗體的產(chǎn)生，該循環(huán)抗體結(jié)合其所特異性的抗原，從而中和抗原并有助于其隨后的清除，這種清除是通過涉及其他細胞毒性或吞噬性細胞的過程達成的。B細胞負責(zé)產(chǎn)生抗體(漿B細胞)，并保持免疫性體液記憶(記憶B細胞)，即，在第一次接觸抗原(例如，通過疫苗接種)后若干年識別該抗原的能力。細胞介導(dǎo)的反應(yīng)涉及許多不同類型的細胞的相互影響，尤其是T細胞。T細胞分為一些不同的亞型，主要是CD4+和CD8+細胞。諸如巨噬細胞和樹突細胞等抗原呈遞細胞(APC)充當免疫系統(tǒng)的守衛(wèi)，屏蔽機體與外來抗原。當APC檢測到胞外的外來抗原時，將這些抗原吞噬(吞入)到APC內(nèi)，這些抗原在此被加工成較小的肽。隨后，這些肽被呈遞到APC表面的II類主要組織相容性復(fù)合體(MHCn)上，它們在此可以6被表達CD4表面分子的抗原特異性T淋巴細胞(CD4+T細胞)識別。當CD4+T細胞在存在其他足夠的共刺激信號的條件下，識別它們在MHCII分子上的特異性抗原時，它們被激活，并分泌一批細胞因子，這些細胞因子隨后激活其他組的免疫系統(tǒng)。一般地，CD4+T細胞根據(jù)抗原識別后它們所產(chǎn)生的反應(yīng)類型被分為1類輔助性T細胞(Thl)或2類輔助性T細胞(Th2)亞型。在識別肽-MHCII復(fù)合體后，ThlCD4+T細胞分泌白細胞介素和細胞因子(如干擾素Y)，從而激活巨噬細胞釋放有毒化學(xué)物質(zhì)，如一氧化氮和活性氧/氮。IL-2和TNF-a也一般被分為Thl細胞因子。相比之下，Th2CD4+細胞一4殳分泌如IL-4、IL-5或IL-13等白細胞介素。輔助性CD4+T細胞的其他功能包括為激活B細胞產(chǎn)生和釋放抗體提供幫助。它們還可以參與抗原特異性008+T細胞的激活，CD8+T細胞是除CD4+T細胞之外的另一主要的T細胞亞型。當在存在適當?shù)墓泊碳ば盘柕臈l件下，CD8+T細胞特異性的肽由I類主要組織相容性(MHCI)分子呈遞到宿主細胞表面時，CD8+T細胞識別它們。為了呈遞到MHCI分子上，外來抗原需要直接進入細胞內(nèi)(胞質(zhì)溶膠或核)，如在病毒或胞內(nèi)細菌直接穿過宿主細胞或在DNA疫苗接種后的情況下。在細胞內(nèi)，抗原被加工成小肽，這些小肽將被加載到MHCI分子上，重新定位到細胞表面。在激活后，CD8+T細胞分泌一批細胞因子，如干擾素Y，它們激活巨噬細胞和其他細胞。具體地，CD8+T細胞的一個亞組在激活后分泌溶解性和細胞毒性分子(如，粒酶(granzyme)、穿孔素)。這種CD8+T細胞被稱為細胞毒性T細胞。最近，描述了抗原呈遞的另一途徑，該途徑涉及將胞外抗原或其片段加載到MHCI復(fù)合體上，它被稱為"交叉呈遞"。T細胞反應(yīng)的性質(zhì)還受疫苗中所使用的佐劑的組成的影響。例如，已經(jīng)顯示含有MPL&QS21的佐劑能激活ThlCD4+T細胞分泌IFN-y(Stewart等人Vaccine.2006，24(42-43):6483-92)。盡管已熟知佐劑在增強對蛋白抗原的免疫反應(yīng)中有作用，但它們一般不與DNA或DNA基載體疫苗接種結(jié)合使用。有一些關(guān)于佐劑為何不與DNA載體基疫苗結(jié)合使用的假說。確實，佐劑和載體之間的干涉可能對它們的穩(wěn)定性有影響。此外，人們可能預(yù)測到在減毒載體中添加佐劑能增加此產(chǎn)品誘導(dǎo)的反應(yīng)原性。最后，增加DNA載體基疫苗的免疫原性可以導(dǎo)致抗載體本身的中和免疫反應(yīng)增強，從而排除了相同載體基疫苗隨后注射的任何加強效應(yīng)。事實上，在涉及防止惡性瘧原蟲(p.falciparum)感染中，Jones等人(2001,JinfectDiseases183,303-312)已報道了在DNA的初次免疫后組合DNA、重組蛋白和佐劑作為加強組合物的不利后果。確實，在加強組合物只含有蛋白和佐劑的群組中寄生蟲血癥的水平顯著較低。推斷在此方法中使用DNA、重組蛋白和佐劑的組合不利地影響了寄生蟲血癥和抗體反應(yīng)的后果。另一方面，有加佐劑的DNA基載體疫苗效力增強的報道(Ganne等人Vaccine(1994)12(1301190-1196)。具體地，通過添加油佐劑的復(fù)制缺陷型腺病毒載體疫苗效力的增強與較高的抗體水平相關(guān)，但是未報道對CD4和CD8T細"包反應(yīng)的影響。WO2007/016715公開了非致病性病毒作為佐劑的用途。它未提出所述病毒可以含有任何異源多核苦酸。通常認為CD4+和CD8+細胞兩者的刺激都是最佳保護性免疫所需的，尤其是在某些疾病中，如HIV感染/AIDS。為預(yù)防性或治療性地誘導(dǎo)最佳的免疫反應(yīng)，需要刺激CD4+和CD8+細胞兩者。這是"初免-加強"疫苗接種策略的主要目的之一，其中蛋白基疫苗(主要誘導(dǎo)CD4+T細胞)與DNA載體基疫苗(即，棵DNA、病毒載體或胞內(nèi)細菌載體，如李斯特菌(listeria))(主要誘導(dǎo)CD8+T細胞)的交替給藥或相反情況很可能激活CD4+和CD8+T細胞反應(yīng)。然而，盡管"初免-加強"疫苗策略一般可能產(chǎn)生更強或更平衡的反應(yīng)，不止一次，且當然是超過兩次接種的需要可能是繁瑣的或甚至不可能的，尤其是在發(fā)展中國家的大量免疫程序中。此外，如上面已經(jīng)提到的，通常不可能加強病毒載體組分，因為可能產(chǎn)生抗載體本身的免疫。因此，本發(fā)明的目的包括下列的一個或多個(a)提供完整的疫苗接種方法和疫苗組合物，該疫苗組合物刺激CD4+和/或CD8+細胞和/或抗體產(chǎn)生，尤其是能消除或減輕重復(fù)免疫接種的需要；(b)提供疫苗接種方法和疫苗組合物，該疫苗組合物與僅含有免疫原性多肽或僅含有多核苷酸的疫苗組合物相比，或與包括單獨給予免疫原性多肽和多核苷酸的傳統(tǒng)初免-加強方法相比，更好地刺激CD4+細胞和/或CD8+細胞和/或抗體產(chǎn)生；(c)提供刺激或更好地刺激Thl反應(yīng)的疫苗組合物；(d)提供疫苗組合物和疫苗接種方法，其中組分的所需劑量，尤其是病毒載體的所需劑量是最小的；和(e)更一般地提供可用于治療或防止病原體引起的疾病的疫苗組合物和疫苗4妄種方法。所謂"更好地刺激"是指反應(yīng)的強度和/或持久性增強。
發(fā)明內(nèi)容因此，根據(jù)本發(fā)明，提供一種引起抗病原體的免疫反應(yīng)的方法，包括給予(i)源自所述病原體的一種或多種第一免疫原性多肽；(ii)包含一種或多種異源多核苷酸的一種或多種腺病毒載體，所述一種或多種異源多核苷酸編碼源自所述病原體的一種或多種第二免疫原性多肽；和(iii)佐劑；其中所述一種或多種第一免疫原性多肽、所述一種或多種腺病毒載體和所述佐劑并行給予。根據(jù)本發(fā)明的具體方面，提供一種疫苗組合物，包含(i)源自病原體的一種或多種第一免疫原性多肽；(ii)包含一種或多種異源多核苦酸的一種或多種腺病毒載體，所述一種或多種異源多核苦酸編碼源自所述病原體的一種或多種第二免疫原性多肽；和(iii)佐劑。還提供一種免疫原性組合物，包含(i)源自病原體的一種或多種第一免疫原性多肽；(ii)包含一種或多種異源多核苦酸的一種或多種腺病毒載體，所述一種或多種異源多核苦酸編碼源自所述病原體的一種或多種第二免疫原性多肽；和(iii)佐劑。所述疫苗和免疫原性組合物適當?shù)卮碳げ≡w特異性CD4+T細胞和/或CD8+T細胞和/或抗體的產(chǎn)生。所謂"病原體特異性CD4+T細胞和/或CD8+T細胞和/或抗體"是指特異性識別整個病原體或其部分(如，免疫原性亞基)的CD4+T細l包和/或CD8+T細胞和/或抗體。所謂"特異性識別，，是指CD4+T細胞和/或CD8+T其部分)。還提供一種刺激哺乳動物中免疫反應(yīng)的方法，該方法包括給予受試者免疫有效量的此種組合物。途。還提供此種組合物用于刺激哺乳動物中的免疫反應(yīng)。還提供刺激哺乳動物中病原體特異性CD4+T細胞和/或CD8+T細胞和/或抗體產(chǎn)生的方法，包括給予所述哺乳動物(i)源自病原體的一種或多種第一免疫原性多肽；(ii)包含一種或多種異源多核苷酸的一種或多種腺病毒載體，所述一種或多種異源多核苷酸編碼源自所述病原體的一種或多種第二免疫原性多肽；和(iii)佐劑；其中所述一種或多種第一免疫原性多肽、所述一種或多種腺病毒載體和所述佐劑并行給予，例如通過給予免疫有效量的上述組合物。還提供了上述組合物在制備藥物中的用途，所述藥物用于刺激哺乳動物中病原體特異性的CD4+和/或CD8+細胞和/或抗體的產(chǎn)生。例如，刺激CD4+T細胞或CD8+T細胞或抗體產(chǎn)生。合適的是刺激CD4+T細胞和/或CD8+T細胞和/或抗體中的2種、尤其是3種的產(chǎn)生。合適的是刺激CD8十T細胞的產(chǎn)生。合適的是刺激CD4+和CD8+T細胞的產(chǎn)生。合適的是刺激CD4+和CD8+T細胞和抗體的產(chǎn)生。另外合適的是刺激CD4十T細胞的產(chǎn)生。合適的是刺激CD4+和抗體的產(chǎn)生。另外合適的是刺激抗體的產(chǎn)生。本發(fā)明的方法旨在適合地提供用于引起免疫反應(yīng)的完整方法的足夠步驟—盡管需要時可以重復(fù)該方法)。-因此合適的是該-方法不包括使用初免劑量的任何免疫原性多肽或編碼任何免疫原性多肽的多核苷酸(例如，載體形式，如腺病毒載體)。例如，提供了引起抗病原體的免疫反應(yīng)的方法，該方法由下列組成(a)給予(i)源自所述病原體的一種或多種第一免疫原性多肽；(ii)包含一種或多種異源多核苷酸的一種或多種腺病毒載體，所述一種或多種異源多核苷酸編碼源自所述病原體的一種或多種第二免疫原性多肽；和(iii)佐劑；其中所述一種或多種免疫原性多肽、所述一種或多種腺病毒載體和所述佐劑并行給予；和(b)任選地重復(fù)步驟(a)。如果重復(fù)能產(chǎn)生改善的免疫反應(yīng)則可以重復(fù)該方法的步驟?？梢圆恍枰魏沃貜?fù)而獲得足夠的反應(yīng)，至少是就T細胞反應(yīng)來說。還提供了引起抗病原體的免疫反應(yīng)的方法，該方法包括(a)給予(i)源自所述病原體的一種或多種第一免疫原性多肽；(ii)包含一種或多種異源多核苦酸的一種或多種腺病毒載體，所述一種或多種異源多核苷酸編碼源自所述病原體的一種或多種第二免疫原性多肽；和(iii)佐劑；其中所述一種或多種第一免疫原性多肽、所述一種或多種腺病毒載體和所述佐劑并行給予；所述方法不包括給予任何初免劑量的免疫原性多肽或編碼免疫原性多肽的多核普酸。還提供了一種試劑盒，所述試劑盒包含(i)源自病原體的一種或多種第一免疫原性多肽；(ii)包含一種或多種異源多核苦酸的一種或多種腺病毒載體，所述一種或多種異源多核苦酸編碼源自所述病原體的一種或多種第二免疫原性多肽；和(iii)佐劑；具體地，包含(i)源自病原體的一種或多種第一免疫原性多肽和佐劑；和(ii)包含一種或多種異源多核苷酸的一種或多種第二腺病毒載體，所述一種或多種異源多核香酸編碼源自所述病原體的一種或多種免疫原性多肽；所述試劑盒用于根據(jù)本發(fā)明的方法。由病原體所致的感染，或預(yù)防之前病原體感染過的受試者再次感染，或治療:故病原體感染的受試者。附圖簡述圖1顯示質(zhì)粒p73i-Tgrn的構(gòu)建的代表圖；圖2-8顯示實施例1中所討論的實-驗的結(jié)果，具體地圖2a、2b、3a、3b:在各種免疫方法之后在不同的時間點，響應(yīng)于源自p24、RT、Nef和p17的肽庫的再次刺激的CD4+和CD8+T細J包反應(yīng)；ii圖4:抗F4的抗體反應(yīng)；圖5-8:分別抗F4組分p24、RT、p17和Nef的抗體反應(yīng)；圖9顯示實施例2中所討論的實驗結(jié)果，具體地在各種免疫方法后,響應(yīng)于源自p24和RT的肽庫的再次刺激的CD4+T細刀包反應(yīng)。圖10-12顯示實施例3所討論的實驗的結(jié)果，具體地圖10顯示兔PBMC抗含有F4序列的肽庫的淋巴增殖性反應(yīng)；圖11顯示抗F4的抗體反應(yīng)的時程；圖12a和12b分別顯示抗F4組分p24和RT的抗體反應(yīng)(第77天)；圖13顯示HIV-1特異性CD4T細胞的定量；圖14顯示在兩次免疫后7天F4特異性CD4T細胞的頻率分布；圖15顯示兩次免疫后7天F4特異性CD4T細胞的細胞因子產(chǎn)生；圖16顯示HIV-1特異性CD8T細胞的定量；圖17顯示在兩次免疫后7天F4特異性CD8T細胞的細胞因子產(chǎn)生；圖18顯示CSP特異性CD4T細胞的定量；圖19顯示CSP特異性CD8T細胞的定量；圖20顯示CSP(N末端)特異性CD4T細胞的定量；圖21顯示CSP(C末端)特異性CD4T細胞的定量；圖22顯示CSP(N末端)特異性CD8T細胞的定量；圖23顯示CSP(C末端)特異性CD8T細胞的定量；圖24顯示CSP特異性抗體效價的定量。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>HIVgpl40(進化枝A)(cDNA)5HlVgpl40(進化枝A)(氨基酸)6HIVgpl20(進化枝B)(cDNA)7HIVgpl20(進化枝B)(氨基酸)8TB抗原融合蛋白M72(cDNA)9TB抗原融合蛋白M72(氨基酸)10惡性癡原蟲CS蛋白源抗原(cDNA)11惡性疾原蟲CS蛋白源抗原(氨基酸)12惡性癡原蟲CS蛋白源融合蛋白"RTS"(cDNA)13惡性癡原蟲CS蛋白源融合蛋白"RTS"(氨基酸)14HIVp24-RT-Nef-pl7(cDNA)15HIVp24-RT-Nef-p17(氨基酸)16的多核苷酸使用。所述多肽可以由上述序列組成或包含上述序列。任選初始Met殘基。任選N末端His殘基(包括緊隨初始Met之后的His殘基，如SEQIDNo9)或者可以采用不同長度的N末端His標簽(如，通常可以采用最多6個His殘基以有助于蛋白分離)。可以采用與參考序列的全長具有顯著序列同一性的類似蛋白，如大于80%，如大于90%，如大于95%，如大于99%的序列同一性，尤其是在類似蛋白具有類似的功能時，具體是在類似蛋白具有類似的免疫原性時。例如可以接受最多20個，如最多10個，如l-5個取代(如，保守取代)?？梢圆捎门c上述那些不同但是編碼相同蛋白或上述類似蛋白的核酸?？梢酝ㄟ^常規(guī)方法測定序列同一性，如使用BLAST。在可能提到的一個SEQIDNo16的特定變體中，殘基398是Ser而不是Cys。發(fā)明詳述如本文所用，術(shù)語"并行(concomitantly)"意指所述一種或多種免疫原性多肽、一種或多種腺病毒載體和佐劑在不超過12小時的期間內(nèi)給予，如在不超過l小時的期間內(nèi)，通常是在一次的情況下，例如，在對健康專家的13同一次探訪過程中，例如所述一種或多種免疫原性多肽、一種或多種腺病毒載體和佐劑順序給予或同時給予。如本文所用，術(shù)語"表位"是指免疫原性氨基酸序列。表位通常是指通常6-8個氨基酸的最小氨基酸序列，該最小序列在從其天然環(huán)境移出時是免疫原性的，如移植到異源多肽中時。表位還可指蛋白的免疫原性部分，其中含有表位的多肽被稱為抗原(或者有時稱為"多肽抗原，，)。多肽或抗原可以含有一個或多個(如2個或3個或更多個)不同的表位。術(shù)語"表位"包括B細胞和T細胞表位。術(shù)語"T細胞表位"包括CD4+T細胞表位和CD8+T細胞表位(有時也稱為CTL表位)。術(shù)語"免疫原性多肽"是指免疫原性的多肽，也就是說能夠在哺乳動物中引起免疫反應(yīng)，因此含有一個或多個表位(如，T細胞和/或B細月包表位)。免疫原性多肽可以含有一個或多個多肽抗原(如非天然排列的，如在融合蛋白中)。免疫原性多肽通常為重組蛋白，通過(例如)在諸如細菌宿主、酵母或培養(yǎng)的哺乳動物細胞等異源宿主中表達來制備。術(shù)語"源自病原體的多肽"是指部分或完整地含有在病原體中天然出現(xiàn)的序列(即，抗原)或與其具有高度序列同一性(如，在一段至少10個，例如至少20個氨基酸的長度上大于95%的同一性)的多肽。免疫原性多肽可以含有一個或多個(例如，1、2、3或4個)多肽抗原。除非另外指明，否則"免疫反應(yīng)"可以是細胞反應(yīng)和/或體液反應(yīng)。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述一種或多種第一免疫原性多肽的一種或多種基本上與所述一種或多種第二免疫原性多肽的一種或多種相同。例如，至少一種第一免疫原性多肽之一和至少一種第二免疫原性多肽之一的整體序列同一性沿一個或另一個免疫原性多肽的長度可以為90%或更高，如95%或更高，如98%或99%或更高。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述一種或多種第一免疫原性多肽的一種或多種含有至少一個與所述第二免疫原性多肽的一種或多種中所含的抗原基本上相同的抗原。例如，至少一種第一免疫原性多肽之一和至少一種第二免疫原性多肽之一的整體序列同一性在一段20個氨基酸或更多，如40個氨基酸或更多，如60個氨基酸或更多的長度上可以為90%或更高，如95%或更高，如98%或99%或更高。合適地，一種或多種第一免疫原性多肽含有至少一個T細胞表位。合適地，一種或多種第二免疫原性多肽含有至少一個T細胞表位。合適地，一種或多種第一免疫原性多肽含有至少一個B細胞表位。合適地，一種或多種第二免疫原性多肽含有至少一個B細胞表位。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述一種或多種第一免疫原性多肽的一種或多種和所述第二免疫原性多肽的一種或多種共有一個或多個相同的B細胞和/或T細胞表位。合適地，它們共有一個或多.個相同的氨基酸序列，所述氨基酸序列長度為10個氨基酸或更多，如15個氨基酸或更多，如25個氨基酸或更多。在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述一種或多種第一免疫原性多肽的一種或多種沒有一種與所述一種或多種第二免疫原性多肽的一種或多種相同或與其含有任何共同抗原，例如它們在一段20個氨基酸或更多，如40個氨基酸或更多，如60個氨基酸或更多的長度上的整體序列同一性小于90%。因此，它們可能不共有任何B細胞或T細胞表位。例如它們可以不共有任何長度為10個氨基酸或更多，如15個氨基酸或更多，如25個氨基酸或更多的相同氨基酸序列。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，第一免疫原性多肽和第二免疫原性多肽含有相同排列或不同排列(如，不同排列)的相同抗原。所謂"不同排列"意指它們可以不同的順序排列和/或它們可以分開。在本發(fā)明的另一具體實施方式中，第一免疫原性多肽和第二免疫原性多肽是相同的。才艮據(jù)本發(fā)明的組合物可以含有一種第一免疫原性多肽作為組合物中僅有的免疫原性多肽?；蛘?，根據(jù)本發(fā)明的組合物可以含有不止一種第一免疫原性多肽，如2或3或4或更多種免疫原性多肽。根據(jù)本發(fā)明的組合物可以含有一種腺病毒載體?；蛘咚鼈兛梢院胁恢挂环N腺病毒載體，如2種腺病毒載體。在根據(jù)本發(fā)明的組合物中，腺病毒載體可以含有異源多核苷酸，該異源多核苷酸編碼一種第二免疫原性多肽，或者它可以含有不止一種異源多核苷酸，所述異源多核苷酸在多于1個的啟動子的控制下編碼多于1種的第二免疫原性多肽。至于預(yù)防性疫苗接種，本發(fā)明的組合物還可以用于已經(jīng)被病原體感染的個體中，結(jié)果是改善對已形成的感染的免疫控制。這在病原體為HIV時尤其受關(guān)注。在HIV的情況下，這種控制被認為是通過特異性識別HIV感染的細il包的CD8陽性T細胞達成的。這種CD8陽性T細胞反應(yīng)通過HIV特異性CD4陽性的輔助性T細胞的存在來維持，因此，兩種類型的免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)都特別有用，可以通過組合不同的疫苗組合物來達成。特別關(guān)注的是加佐劑的蛋白與重組腺病毒的組合。在接種時為HIV感染的初級(primary)感染、潛伏期或末期的HIV感染患者都將從上述疫苗接種中獲益?；颊咴谝呙缃臃N時可以經(jīng)受或不經(jīng)受其他抗病原體的治療干涉(在HIV的情況下-例如，高活性的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療)。抗原根據(jù)本發(fā)明使用的抗原源自病原體。病原體包括病毒、細菌、原生動物和其他對哺乳動物(包括人)有害的寄生有機體。作為多肽或編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽的多核苷酸給予的合適多肽抗原包括源自下列的抗原HIV(如HIV-l)、人皰滲病毒(如gH、gL、gM、gB、gC、gK、gE或gD或其書f生物、或立即早期蛋白(ImmediateEarlyprotein)，如來自HSV1或HSV2的ICP27、ICP47、ICP4、ICP36)、巨細胞病毒(尤其人的，如gB或其衍生物)、EB(EpsteinBarr)病毒(如gp350或其衍生物)、水痘帶狀皰滲病毒(如gpl、II、m和IE63);或來自肝炎病毒，如乙肝病毒(例如，乙肝表面抗原、PreSl、PreS2和表面env蛋白、乙肝核心抗原或pol)、丙肝病毒(如核心、El、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和B)和戊型肝炎病毒抗原；或來自其他病毒病原體，如副粘病毒(paramyxovirus):呼吸道合胞病毒(如F和G蛋白或其衍生物)；或來自下列的抗原副流感病毒、麻瘆病毒、腮腺炎病毒、人乳頭瘤病毒(例如，HPV6、11、16、18，如L1、L2、El、E2、E3、E4、E5、E6、E7)、黃病毒(如，黃熱病病毒、登革熱(Dengue)病毒、埤傳腦炎病毒(Tick-borneencephalitisvirus)、日本月齒炎病毒)或;危感病毒(^口，血凝素(haemaggluttin)、核蛋白、NA或M蛋白、或它們的組合)；或源自細菌病原體的抗原，如奈瑟菌屬(A^wen'a印;？)，包括淋病奈瑟菌(iV.go加rrAea)和腦膜炎奈瑟菌(附e"/"g"zVfe)，如轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合蛋白、乳鐵蛋白結(jié)合蛋白、PiIC、粘附素)；化膿性鏈球菌(&;^oge"^)(例如，M蛋白或其片段、C5A蛋白酶、無乳鏈球菌(6".aga/ac"ae)、變形鏈球菌(5".mwto/w);杜克雷嗜血桿菌(i/.dwc^yz');莫拉克氏菌屬(Moraxe〃aw;),包括粘膜炎莫4立菌(M.Ca^z/rAa/z;)，也牙爾為舉占膜炎布蘭漢氏菌(萬rawAawe〃aC"to/r/^//j)(例J(口，高分子量和低分子量粘附素和侵襲素)；博德特氏菌(SoW^e//fl),包括百日咳斥干菌(及；w^s^y)(例如，百日咳菌粘附素(pertactin)、百日咳毒素或其書f生物、絲狀血凝素、腺苷酸環(huán)化酶、菌毛(fimbriae))、副百曰咳桿菌(5./arape^^^)和支氣管敗血性博德特氏菌(及6rowc/^印"cfl);分支桿菌屬(M少co6a"eWwws;/7)，包括結(jié)核分支4干菌(A/./w6e/xt//as7\s)、牛分支桿菌(M.Zov&)、麻風(fēng)分支桿菌(M./印rae)、鳥分支桿菌(M.aWwm)、副結(jié)核分支桿菌(71/.para^^ercw/as/s)、恥祐分支才干菌(Af.s附egwato);軍團詳干菌屬(Z^g/owe〃a印;？)，包4舌嗜肺性軍團斥干菌(丄.pwewmo;/n7(3);埃希氏菌屬(五"/^nW^5/p),包括腸毒性大腸桿菌(五.co/z')(例如，移生因子(colonizationfactor)、不耐熱腸毒素或其衍生物、熱穩(wěn)定性毒素或其衍生物)、腸出血性大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌(例如，志賀毒素(shigatoxin)樣毒素或其衍生物)；弧菌屬(FAn'o^;),包括霍亂弧菌(Kc/zo/era)(例如，霍亂毒素或其衍生物)；志賀菌屬(幼z'geZ/fl^;),包括宋內(nèi)志賀菌(S.sowweZ)、痢疾志賀菌(5".c/j^ewfen'ae)、一畐氏志賀菌(51./exwen7);耶爾森菌屬(7erw'm'as;/)，包括小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Ke"eraco//"ca)(例如，Yop蛋白)、鼠疫耶爾森菌(K;^to)、假結(jié)核耶爾森菌(K尸i^wdo/w6ercw/0^);彎曲軒菌屬(C/_y/oZ<2"er),包括空腸彎曲桿菌(C.m')(例如，毒素，粘附素和侵襲素)和結(jié)腸彎曲桿菌(C.co/z');沙門氏菌屬(5Wmo^〃flwp),包括傷寒沙門氏菌(S.typhi)、副傷寒沙門氏菌(&;ara0^/^)、豬霍亂沙門氏菌(S.cAo/eraew^)、腸炎沙門氏菌e"&n力W^);李斯特菌屬(),包括單核細胞增多性李斯特17菌(丄.mowoc少togewas);螺J走4干菌屬(//e//co6<3cters//)，包4舌幽門蟲累方走桿菌;^fen')(例如脲酶、過氧化氫酶、空泡毒素)；假單胞菌屬(尸jet^omowoyj/7/7)，包括綠膿假單胞菌(尸.;葡萄5求菌屬(5Vop/^/ococctw5/p),包括金黃色葡萄球菌(尸.)、表皮葡萄球菌(尸.ejozWermzWz^);腸J求菌屬(5Vz/encocct^5/p)，包4舌糞腸王求菌(五.聲eca/^)、屎腸球菌(五./fle"'wm);梭菌屬(C/oWW&wwwp),包括破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌(C.Wam')(例如，破傷風(fēng)毒素及其衍生物)、肉毒梭狀芽孢桿菌(C.Zjo似/z'"ww)(例如，肉毒桿菌毒素及其衍生物)、艱難梭狀芽孢桿菌(C.Aj^cz7e)(例如梭菌毒素A或B及其衍生物)；桿菌屬(5ac〃/iw)，包括炭疽桿菌(及fl",Arac^)(例如，肉毒桿菌毒素及其衍生物)；棒狀桿菌屬(Co/7we6acfen'wms;;)，包4舌白"娛^干菌(C.dz》/^Aen'ae)(侈寸^(口，白喉毒素及其衍生物)；疏螺旋體屬(Sore/z'a^;7),包括博氏疏螺旋體(5.Zt^gdor/en')(Y列長口,OspA、OspC、DbpA、DbpB)、5.(i"列長口,OspA、OspC、DbpA、DbpB)、及a/ze/"(例如，OspA、OspC、DbpA、DbpB)、5.例3口，OspA、OspC、DbpA、DbpB)、赫氏發(fā)u蟲累》走體(及A^tmw7);埃利希氏體屬(￡7^//c/'a印p)，包括馬埃里希體(五.e^!')和人粒細胞性》矣利希體(Humangranulocyticehrlichiosis)的制劑；立克,欠氏體屬(Az'cA:eto7'a卿)，包括立克氏立克次氏體(兄rz.cA:eto");衣原體屬(C7to—.a卿)，包括沙眼衣原體(CJrac/oma";y)、肺炎衣原體(C.jwewmo"&e)、鷚鵡熱衣原體(C.;w/"acz');鉤端螺旋體屬(Z印tos^ra^;)，包括問號鉤端螺旋體(L.z7^erragaw);密螺4t體屬(7Vepowemas/p)，包4舌才每毒密螺》炎體(71./m〃Www)(例如，微量外膜蛋白)、齒垢密螺旋體(r.^""co/fl)、舌骨痢疾密螺-走體(T-/^o辦化w&n'ae);或源自寄生蟲，如疾原蟲屬(/VosmoA'wms//),包括惡性癡原蟲和間日疾原蟲(P.vivax);弓形體屬(7b:co;/^ma)，包括鼠弓形體(r.gow&7)(例如，SAG2、SAG3、Tg34);內(nèi)阿米巴屬(五"&moe6a)，包括溶組織內(nèi)阿米巴(f./^Wo/;;/z'c");巴貝西蟲屬(Sa&w'a5/p)，包4舌果氏巴貝蟲(及m/cra");錐蟲屬(7b^朋oso附a)，包括克氏錐蟲(r.cn/zz');賈第蟲屬(G7an/z'a^j!)，包括蘭伯賈第蟲(G./am6/z'a);利什曼原蟲屬(丄e^/wmm'a)，包括碩大利什曼原蟲(丄.m^'or);肺嚢蟲屬(尸wewmoc;^to)，包括卡氏肺嚢蟲(尸.can'm'z');毛滴蟲屬(7WcA(mcw^s/p),包4舌陰道毛滴蟲(Zvagz'"a/^);血吸蟲屬(Sc/H'5osfoma，包括曼氏血吸蟲(5".ma"^m');或源自酵母，如念珠菌屬(C""&Wa,包4舌白色念珠菌(C,a/Z^caw);隱J求菌屬(Q7//0cos;;),包括新型隱5求菌(C.weo/orm朋s)。其他的細菌抗原包括源自下列的抗原鏈^求菌屬(5Vreptococct^)，包括月申炎鏈球菌(<S./"e謂o"zVe)(PsaA、PspA、鏈球菌溶血素、膽堿結(jié)合蛋白)和蛋白抗原肺炎球菌溶血素(BiochemBiophysActa,1989，67，1007;Rubins等人，MicrobialPathogenesis,25,337-342)、及其突變蛋白去毒衍生物(WO90/06951;WO99/03884)。其他細菌抗原包括源自下列的抗原嗜血4干菌屬(//aemop/n7ws)，包括B型流感嗜血桿菌(//z'"y7wewzaetypeB)(例如PRP及其結(jié)合物)、非典型性流感嗜血桿菌，例如OMP26、高分子量粘附素、P5、P6、蛋白D和脂蛋白D、和絲束蛋白和絲束蛋白來源的肽(US5,843,464)或其多拷貝變體或融合蛋白。具體地，本發(fā)明的方法或組合物可以用于預(yù)防或治療病毒性疾病，如由乙肝病毒、丙肝病毒、人乳頭瘤病毒、人免疫缺陷性病毒(HIV)、或單純胞滲病毒引起的疾??；細菌性疾病，如由結(jié)核分支桿菌(AfycoZ)(3cten'w77/t/6ercw/ow'5，TB)或衣原體屬引起的那些疾?。缓图纳x感染，如疾疾。應(yīng)認識到這些具體的疾病狀況、病原體和抗原僅為示例性參考，而不旨在限制本發(fā)明的范圍。TB抗原病原體可以為(例如)結(jié)核分支桿菌。源自結(jié)核分枝桿菌的示例性抗原為例如，a-晶體蛋白(HspX)、HBHA、Rvl753、Rv2386、Rv2707、Rv2557、Rv2558、RPFs:Rv0837c、Rvl884c、Rv2389c、Rv2450、Rvl009、aceA(Rv0467)、ESAT6、Tb38-1、Ag85A、Ag85B或Ag85C、MPT44、MPT59、MPT45、HSP10、HSP65、HSP70、HSP75、HSP90、PPD19kDa[Rv3763]、PPD38kDa[Rv0934]、PstSl(Rv0932)、SodA(Rv3846)、Rv2031c,16kDa、Ral2、TbH9、Ra35、19Tb38-1、Erdl4、DPV、MTI、MSL、DPPD、mTCCl、mTCC2、hTCCl(WO99/51748)和hTCC2，尤其是Mtb32a、Ra35、Ral2、DPV、MSL、MTI、Tb38-1、mTCCl、TbH9(Mtb39a)、hTCCl、mTCC2和DPPD。源自結(jié)核分枝桿菌的抗原還包括融合蛋白及其變體，其中至少兩個或(例如，3個)結(jié)核分枝桿菌的多肽融合成較大的蛋白。這種融合體可以包括Ral2-TbH9-Ra35、Erdl4-DPV-MTI、DPV-MTI-MSL、Erdl4-DPV-MTI匿MSL-mTCC2、Erdl4-DPV-MTI-MSL、DPV-MTI-MSL-mTCC2、TbH9-DPV-MTI(WO99/51748)、Ral2-Tbh9-Ra35-Ag85B和Ral2-Tbh9-Ra35-mTCC2?？梢蕴岬降木唧w的Ral2-Tbh9-Ra35序列定義為WO2006/117240SEQIDNo6與其中該序列的Ser70突變?yōu)榉墙z氨酸(例如Ala)的變體以及它們整合了適當長度的N末端His標簽的衍生物(如，WO2006/117240的SEQIDNo2或4)。還參見SEQIDNo10，它是含有任選的初始M和任選的N末端His-His標簽(位置2和3)并且其中在位置706的Ala突變?yōu)橐吧蚐er的序列。衣原體抗原病原體可以為(例如)衣原體屬，如沙眼衣原體。源自如沙眼衣原體等衣原體屬的示例性抗原選自CT858、CT089、CT875、MOMP、CT622、PmpD、PmpG及其片段、SWIB和它們?nèi)魏我环N的免疫原性片段(如PmpDpd和PmpGpd)和它們的組合。優(yōu)選的抗原組合包括CT858、CT089和CT875。可以采用的具體序列和組合描述于WO2006/104890。癡原蟲抗原病原體可以為(例如)引起疾疾的寄生蟲，如癥原蟲屬，如惡性癥原蟲(尸^/c^arwm)或間日癡原蟲(尸vz'va義)。例如，源自惡性癥原蟲的抗原包括環(huán)子孢子(circumsporozoite)蛋白(CS蛋白)、PfEMP-l、Pfsl6抗原、MSP-1、MSP-3、LSA-1、LSA-3、AMA-1子孢子(cs)蛋白的基本上所有的c末端部分的雜合蛋白，該c末端部分通過乙肝表面抗原的PreS2部分的4個氨基酸連沖妄到乙肝病毒表面(S)抗原。當在酵母中表達時，產(chǎn)生的RTS為脂蛋白粒子，當其與來自HBV的S抗原共表達時，產(chǎn)生稱為RTS,S的混合粒子。RTS和RTS，S的結(jié)構(gòu)爿〉開于WO93/10152。TRAP抗原描述于WO90/01496中。其他的瘧原蟲抗原包括惡性疾原蟲EBA、GLURP、RAP1、RAP2、鉗合蛋白、Pf332、STARP、SALSA、PfEXPl、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfs48/45、Pfs230以及它們在其他癡原蟲中的類似物。本發(fā)明的一個實施方式是包含下列的組合物RTS，S或CS蛋白或其片段，如RTS,S的CS部分與一種或多種另外的瘧疾抗原的組合，該另外的瘧疾抗原可以選自例如MSP-1、MSP-3、AMA-1、Pfs16、LSA-1或LSA-3。來自間日癡原蟲的可能抗原包括環(huán)子孢子蛋白(CS蛋白)和Duffy抗原結(jié)合蛋白及其免疫原性片段，如RvRII(參見，例如W002/12292)。因此，在本發(fā)明的一個合適的實施方式中，第一和第二免疫原性多肽選自源自惡性疸原蟲和/或間日疸原蟲的抗原。例如，第一和/或第二免疫原性多肽選自源自惡性癥原蟲和/或間曰癡原蟲的抗原，該抗原選自RTS(如，RTS,S)、環(huán)子孢子(CS)蛋白、MSP-1、MSP-3、AMA-1、LSA-1或LSA-3以及它們的免疫原性衍生物或它們的免疫原性片段。可以提及的一個具體的衍生物為稱為RTS的雜合蛋白，尤其在其以稱為RTS,S的混合粒子形式存在時。示例性惡性癡原蟲CS蛋白源抗原示于SEQIDNo12中。該具體序列對應(yīng)于惡性瘧原蟲(3D7抹系)的CSP序列，該序列還含有來自7G84朱系的19aa的插入序列(81-100)。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，第一免疫原性多肽為RTS,S，第二免疫原性多肽為來自惡性瘧原蟲的CS蛋白或其免疫原性片段。HPV抗原病原體可以為(例如)人乳頭瘤病毒。因此本發(fā)明中所用的抗原可以源自例如認為能產(chǎn)生生殖器疣的人乳頭21瘤病毒(HPV)(HPV6或HPV11和其他)、和/或產(chǎn)生子宮頸癌的HPV病毒(HPV16、HPV18、HPV33、HPV51、HPV56、HPV31、HPV45、HPV58、HPV52和其他)。在一個實施方式中，生殖器疣預(yù)防或治療組合物的形式包括L1粒子或殼粒、和融合蛋白，該融合蛋白包含一種或多種選自HPV蛋白El、E2、E5、E6、E7、L1和L2的抗原。在一個實施方式中，融合蛋白的形式為L2E7,如W096/26277中所公開；和PCT/EP98/05285中所公開的蛋白D(1/3)陽E7。優(yōu)選的HPV子宮頸感染或癌癥預(yù)防或治療組合物可以包含HPV16或18抗原。例如，L1或L2抗原單體、或一起作為病毒樣粒子(VLP)存在的Ll或L2抗原或在VLP或殼粒結(jié)構(gòu)中單獨存在的Ll蛋白。這類抗原、病毒樣粒子和殼粒本身是已知的。參見，例如WO94/00152、WO94/20137、WO94/05792、和WO93/02184?？梢詥为毣蛞匀诤系鞍仔问桨ㄆ渌脑缙诘鞍祝鏓7、E2或優(yōu)選E5;它的具體的優(yōu)選實施方式包括含有L1E7融合蛋白的VLP(WO96/11272)。在一個實施方式中，HPV16抗原包括早期蛋白E6或E7與蛋白D載體融合形成來自HPV的蛋白D-E6或E7融合體、或它們的組合；或E6或E7與L2的組合(WO96/26277)?；蛘逪PV16或18早期蛋白E6和E7可以單個分子存在，優(yōu)選為蛋白D-E6/E7融合體。這種組合物可以任選提供來自HPV18的E6和E7蛋白的任一種或兩種，優(yōu)選為蛋白D-E6或蛋白D-E7融合蛋白或蛋白D-E6/E7融合蛋白的形式?？梢圆捎脕碜云渌鸋PV菌抹的其他抗原，優(yōu)選來自HPV31或33菌抹。HIV抗原病原體可以(例如)為HIV，如HIV曙1。因此，抗原可以選自HIV源抗原，具體為HIV-1源抗原。HIVTat和Nef蛋白為早期蛋白，即，它們在感染早期表達，不存在結(jié)構(gòu)蛋白。Nef基因編碼早期HIV輔助蛋白，該蛋白已顯示具有一些活性。例如，已知Nef蛋白引起CD4(HIV受體)從細胞表面移除，盡管此功能的生物學(xué)重要性還有爭議。此外，Nef與T細胞信號通路相互作用，誘導(dǎo)活性狀態(tài)，繼而可以促進更有效的基因表達。一些HIV分離物在此區(qū)域具有突變或缺失，這使它們不編碼功能蛋白并嚴重降低它們在體內(nèi)的復(fù)制和致病性。Gag基因由全長RNA翻譯產(chǎn)生前體多聚蛋白，該前體多聚蛋白隨后被裂解為3-5個外殼蛋白；基質(zhì)蛋白p17、外殼蛋白p24和核酸結(jié)合蛋白(FundamentalVirology,FieldsBN,KnipeDMandHowleyM19962.FieldsVirology第2巻1996)。Gag基因產(chǎn)生55千道爾頓(kd)的Gag前體蛋白，也稱為p55，其由未剪接的病毒mRNA表達。在翻譯期間，p55的N末端被十四烷基化，從而觸發(fā)其與細胞膜胞質(zhì)方面的結(jié)合。膜結(jié)合的Gag多聚蛋白募集兩個拷貝的病毒基因組RNA與觸發(fā)病毒粒子從感染的細胞表面出芽的其他病毒和細胞蛋白。在出芽后，在病毒成熟過程中，p55被病毒編碼的蛋白酶(Pol基因的產(chǎn)物)裂解成4個較小的蛋白，稱為MA(基質(zhì)[pl7])、CA(外殼[p24])、NC(核殼[p9])、和p6.(4)。除了3個主要的Gag蛋白(pl7、p24和p9)外，所有的Gag前體都含有幾個其他的區(qū)域，它們被裂解并以各種大小的肽保留在病毒粒子中。這些蛋白具有不同的作用，例如，p2蛋白在調(diào)控蛋白酶的活性中有作用并且有助于校正蛋白水解進程的時限。MA多肽源自p55的十四烷基化N末端。大部分MA分子仍然連接在病毒粒子脂質(zhì)雙層的內(nèi)表面，穩(wěn)定粒子。MA的一個亞群在病毒粒子更深層內(nèi)募集，它們在此處成為復(fù)合體的一部分保護病毒DNA到核。這些MA分子促進病毒基因組的核轉(zhuǎn)運，因為MA上的親核信號能夠被細胞核輸入機制識別。這種現(xiàn)象使得HIV能夠感染未分裂的細胞，這是反轉(zhuǎn)錄病毒不常見的特性。p24(CA)蛋白形成病毒粒子的錐形核。已證明親環(huán)蛋白(Cyclophilin)A與p55的p24區(qū)域相互作用導(dǎo)致其整合到HIV粒子中。Gag與親環(huán)蛋白A之間的相互作用很重要，因為環(huán)孢霉素對這種相互作用干擾能抑制病毒復(fù)制。Gag的NC區(qū)域負責(zé)特異性識別HIV的所謂包裝信號。包裝信號由位于病毒RNA5'端附近的4個莖環(huán)結(jié)構(gòu)構(gòu)成，其足以介導(dǎo)異源RNA整合到HIV-1病毒中。NC通過由兩個鋅指基序介導(dǎo)的相互作用結(jié)合至包裝信號。NC還能促進反轉(zhuǎn)錄。p6多肽區(qū)域介導(dǎo)p55Gag與輔助蛋白Vpr的相互作用，導(dǎo)致Vpr整合到組裝的病毒粒子中。p6區(qū)域還含有晚期結(jié)構(gòu)域，該晚期結(jié)構(gòu)域是從感染的細胞有效釋放出芽病毒粒子所需要的。Pol基因編碼三種蛋白，這三種蛋白具有病毒在早期感染中所需要的活性反轉(zhuǎn)錄酶RT、蛋白酶和將病毒DNA整合到細胞DNA中所需的整合酶蛋白。Pol的初級產(chǎn)物被病毒粒子蛋白酶裂解產(chǎn)生含有DNA合成所需活性(RNA和DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶、核糖核酸酶H)的氨基末端RT肽和羧基末端整合酶蛋白。HIVRT是的全長RT(p66)和缺乏羧基末端RNaseH結(jié)構(gòu)域的裂解產(chǎn)物(p51)的異二聚體。RT是反轉(zhuǎn)錄病毒基因組編碼的保守性最高的蛋白之一。RT的兩種主要活性是DNAPol和核糖核酸酶H。RT的DNAPol活性可互換地使用RNA和DNA為模板，像所有已知的NDA聚合物一樣能夠從頭開始DNA合成，但是需要預(yù)先存在的分子作為引物(RNA)。所有RT蛋白中所固有的RNaseH活性在復(fù)制早期起重要作用，它隨DNA合成的進行移除RNA基因組。它從所有的RNA-DNA雜合分子中選擇性地降解RNA。聚合酶和和riboH在結(jié)構(gòu)上在Pol內(nèi)占有獨立的、不重疊的結(jié)構(gòu)域，覆蓋了Pol三分之二的氨基。p66催化亞基折疊成5個不同的亞結(jié)構(gòu)域。它們的氨基末端具有有RT活性的部分。它們的羧基末端為RNaseH結(jié)構(gòu)域。在感染宿主細胞后，反轉(zhuǎn)錄病毒RNA基因組通過在感染粒子中存在的反轉(zhuǎn)錄酶復(fù)制成線性雙鏈DNA。整合酶(在SkalkaAM，99AdvinVirusRes52271-173中的綜述)識別病毒DNA末端，修整它們，將病毒DNA附接到宿主染色體位點以催化整合。宿主DNA的許多位點可以是整合的靶標。盡管整合酶足以催化體外的整合，但它并不是與體內(nèi)病毒DNA有關(guān)的唯一蛋白-從感染的細胞分離的大的蛋白-病毒DNA復(fù)合體代表了前整合復(fù)合體。這有助于子代病毒基因組獲得宿主細胞基因。整合酶由3個不同的結(jié)構(gòu)域組成，N末端結(jié)域、催化核心和C末端結(jié)構(gòu)域。催化核心結(jié)構(gòu)域含有所有多核苷酸轉(zhuǎn)移的化學(xué)需要。因此，用于本發(fā)明的HIV-1源抗原可以(例如)選自Gag(例如，全長Gag)、pl7(Gag的一部分)、p24(Gag的另一部分)、p41、p40、Pol(例如，全長pol)、RT(Pol的一部分)、p51(RT的一部分)、整合酶(Pol的一部分)、蛋白酶(Pol的一部分)、Env、gpl20、gpl40或gp160、gp41、Nef、Vif、Vpr、Vpu、Rev、Tat和它們的免疫原性書f生物和它們的免疫原性片#史，尤其是Env、Gag、Nef和Pol以及它們的免疫原性衍生物和它們的免疫原性片段，包括pl7、p24、RT和整合酶。HIV疫苗可以包含對應(yīng)于多種不同的HIV抗原的多肽和/或編碼多肽的核香酸，例如，2或3或4或更多種可選自上述列表的HIV抗原。在單個融合蛋白中可以包含(例如)幾個不同的抗原。可以采用各自為HIV抗原或不止一個抗原的融合體的不止一種第一免疫原性多肽和/或不止一種第二免疫原性多肽。例如，抗原可以包含Gag或其免疫原性衍生物或免疫原性片段，其融合至RT或其免疫原性衍生物或免疫原性片段，融合至Nef或其免疫原性衍生物或免疫原性片段，其中融合蛋白的Gag部分存在于多肽5，末端。才艮據(jù)本發(fā)明所用的Gag序列可以不包括Gagp6多肽編碼序列。用于本發(fā)明的Gag序列的一個具體實例包含p17和/或p24編碼序列。RT序列可以含有基本上滅活任何反轉(zhuǎn)錄酶活性的突變(參見WO03/025003)。RT基因是HIV基因組中較大的Pol基因的組分。應(yīng)了解根據(jù)本發(fā)明所采用的RT序列可以存在于Pol的上下文中，或者至少對應(yīng)于RT的Pol片段。這種Pol的片段保留著Pol的主要CTL表位。在一個具體的實施例中，所包括的RT僅為RT的p51或p66片段。沖艮據(jù)本發(fā)明的融合蛋白或組合物的RT組分任選包含如下的突變該突變移除作為原核表達系統(tǒng)內(nèi)的起始位點的位點。任選地，用于本發(fā)明的Nef序列被平截以移除編碼N末端區(qū)域的序列，即，移除30至85個氨基酸，例如65至85個氨基酸，尤其是N末端的65個氨基酸(后一種平截在本文中稱為trNef)?；蛘呋蛄硗獾?，可以修飾Nef以移除十四烷基化位點。例如，Gly2十四烷基化位點可以通過剔除或取代來移除?；蛘呋蛄硗獾?，可以修飾Nef以改變Leu174和Leul75的雙亮氨酸基序，這通過剔除或取代一個或兩個亮氨酸來達成。在CD4下調(diào)中亮氨酸基序的重要性描述于例如BresnahanP.A.等人(1998)CurrentBiology,8(22):1235-8。Env抗原可以全長(如gpl69)或平截的(如gpl40)或更短的形式存在(任選具有適當?shù)耐蛔?，該突變破壞gpl20與gp41之間的裂解位點基序)。Env抗原還可以其天然出現(xiàn)的加工形式(如gpl20和gp41)存在。這兩種gpl60的衍生物可以單獨或一起組合使用。上述Env抗原還可以表現(xiàn)有缺失(尤其是可變環(huán)的缺失)和平截。也可以使用Env的片段。示例性gpl20序列示于SEQIDNo8中。示例性gpl40序列示于SEQIDNo6中。根據(jù)本發(fā)明的免疫原性多肽可以包含Gag、Pol、Env和Nef,其中存在至少75%、或至少90%、或至少95%,例如96%的這些天然抗原的CTL表位。在才艮據(jù)本發(fā)明的包含pl7/p24Gag、p66RT和上文所定義的平截Nef的免疫原性多肽中，適合存在天然Gag、Pol和Nef抗原的96%的CTL表位。本發(fā)明的一個實施方式提供含有p17、p24Gag、p66RT、平截Nef(缺乏編碼末端氨基酸1-85的核苷酸-"trNef，)的免疫原性多肽，順序為Gag、RT、Nef。在編碼本發(fā)明的免疫原性多肽的多核苷酸中，合適的是將p24Gag和P66RT進行密碼子優(yōu)化。根據(jù)本發(fā)明的具體多核苷酸構(gòu)建體和對應(yīng)的多肽抗原包括1、p17、p24(密碼子優(yōu)化的)Gag-p66RT(密碼子優(yōu)化的)-平截Nef;2、平截Nef-p66RT(密碼子優(yōu)化的)-pl7、p24(密碼子優(yōu)化的)Gag;3、平截Nef-pl7、p24(密碼子優(yōu)化的)Gag-p66RT(密碼子優(yōu)化的)；4、p66RT(密碼子優(yōu)化的)-p17、p24(密碼子優(yōu)化的)Gag-平截Nef;5、p66RT(密碼子優(yōu)化的)-平截Nef-p17、p24(密碼子優(yōu)化的)Gag;6、p17、p24(密碼子優(yōu)化的)Gag-平截Nef-p66RT(密碼子優(yōu)化的)；示例性的融合體為Gag、RT和Nef的融合體，尤其是以Rag-RT-Nef的順序(參見，例如SEQIDNo2)。另一示例性融合體是p27、p24、RT26和Nef的融合體，尤其是以p24-RT-Nef-p17的順序(參見，例如SEQIDNo16,在本文其他地方稱為"F4")。在另一實施例中，免疫原性多肽含有Gag、RT、整合酶和Nef，尤其是以Gag-RT-整合酶-Nef的順序(參見，例如SEQIDNo4)。在另一實施例中，HIV抗原可以為融合多肽，該融合多肽包含Nef或其免疫原性衍生物或其免疫原性片段、和pl7Gag和/或p24Gag或其免疫原性衍生物或其免疫原性片段，其中當pl7和p24Gag都存在時，在它們之間至少有一個HIV抗原或其免疫原性片段。例如，Nef適宜為全長Nef。例如，p17Gag和p24Gag分別適宜為全長p17和p24。在一個實施方式中，免疫原性多肽包含p17和p24Gag或它們的免疫原性多肽。在此構(gòu)建體中，p24Gag組分和p17Gag組分被至少一個另外的HIV抗原或免疫原性片隔開，如Nef和/或RT或其免疫原性^f汙生物或其免疫原性片段。其他細節(jié)參見WO2006/013106。在包含p24和RT的融合蛋白中，可能優(yōu)選的是在構(gòu)建體中p24在RT之前，因為當抗原單獨在大腸桿菌中表達時，觀察到p24比RT表達更好。根據(jù)本發(fā)明的一些構(gòu)建體包括下列1、p24隱RT-Nef-p172、p24-RT*-Nef-pl73、p24-p51RT-Nef-pl74、p24-p51RT*-Nef-pl75、p24-p51RT-Nef6、p24-p51RT*-Nef7、Nef-pl78、具有連接子的Nef-pl79、pl7-Nef10、具有連接子的pl7-Nef承表示RT曱硫氨酸592突變?yōu)橘嚢彼?。在另一方面，本發(fā)明提供HIV抗原的融合蛋白，該融合蛋白包含至少427個HIV抗原或免疫原性片段，其中四個抗原或片段是或衍生自Nef、Pol和Gag。優(yōu)選地，Gag以#1至少一個其他抗原隔開的兩個單獨組分存在于融合體中。優(yōu)選地，Nef為全長Nef。優(yōu)選地，Pol為p66或p51RT。優(yōu)選地，Gag為pl7和p24Gag。本發(fā)明這個方面中融合體的抗原組分的其他優(yōu)選特征和性質(zhì)如本文所描述。本發(fā)明此方面的優(yōu)選實施方案為如上面已列出的四組分融合體1、p24-RT-Nef陽p172、p24-RT*-Nef-P173、p24-p51RT畫Nef畫p174、p24-p51RT*-Nef-pl7本發(fā)明的免疫原性多肽在對應(yīng)于如Gag、RT和Nef等特定抗原的序列之間可以存在連接子序列。此類連接子序列可以為(例如)長度上最多20個氨基酸。在一個具體實例中，它們可以為1至10個氨基酸、或1至6個氨基酸，例如4至6個氨基酸。此類適合的HIV抗原的進一步說明可以參見WO03/025003。本發(fā)明的HIV抗原可以衍生自任何HIV進化枝，例如進化枝A、進化枝B或進化枝C。例如HIV抗原可以衍生自進化枝A或B,尤其是B。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，第一免疫原性多肽為包含Gag和/或Pol和/或Nef或它們中任何一種的片段或衍生物的多肽(如，p24-RT-Nef-p17)。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，第二免疫原性多肽為包含Gag和/或Pol和/或Nef或它們中任何一種的片段或衍生物的多肽(如，Gag-RT-Nef或Gag-RT-整合酶-Nef)。因此在一個具體實施方式中，包含Gag和/或Pol和/或Nef或它們中任何一種的片段或^f汙生物的多肽(如，p24-RT-Nef-p17)為第一免疫原性多肽，包含Gag和/或Pol和/或Nef或它們中任何一種的片段或衍生物的多肽(如，Gag-RT-Nef或Gag-RT-整合酶-Nef)為第二免疫原性多肽。在本發(fā)明的另一具體實施方式中，第一免疫原性多肽為Env或其片段或衍生物，如gpl20、gpl40或gpl60(尤其是gpl20)。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，第二免疫原性多肽為包含Gag和/或Pol和/或Nef或它們中任何一種的片#更或衍生物的多肽(如，p24-RT-Nef-p17)。因此，在一個具體實施方式中，Env或其片段或衍生物(如gpl20、gpl40或gpl60(尤其gpl20))為第一免疫原性多肽，包含Gag和/或Pol和/或Nef或它們中任何一種的片段或衍生物的多肽(如，p24-RT-Nef-p17)為第二免疫原性多肽。在本發(fā)明的另一具體實施方式中，第一免疫原性多肽為包含Gag和/或Pol和/或Nef或它們中任何一種的片段或衍生物的多肽(如，p24-RT-Nef-p17)。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，第二免疫原性多肽為Env或其片段或衍生物，如gpl20、gpl40或gp160(尤其gpl20)。因此，在一個具體實施方式中，包含Gag和/或Pol和/或Nef或它們中任何一種的片段或書f生物的多肽(如，p24-RT-Nef-p17)為第一免疫原性多肽，Env或其片段或衍生物(如gpl20、gpl40或gp160(尤其gpl20))為第二免疫原性多肽。抗原的免疫原性衍生物和免疫原性片段上述抗原可以其免疫原性衍生物或免疫原性片段而非整個抗原的形式采用。如本文所用，術(shù)語"免疫原性衍生物"在涉及天然來源的抗原時是指抗原相對于其天然對應(yīng)物進行了有限修飾。例如，它可以包括點突變，該點突變可以(例如)通過改善在原核系統(tǒng)中的表達或通過移除不希望的活性(如酶活性)改變蛋白的性質(zhì)。然而，免疫原性衍生物應(yīng)與天然抗原足夠類似，以便保持它們的抗原性質(zhì)并仍然能夠引起抗天然抗原的免疫反應(yīng)。給定的衍生物是否能引起這種免疫反應(yīng)可以通過適宜的免疫分析測量，如ELISA(用于抗體反應(yīng))或使用適宜的細胞標記物染色的流式細胞術(shù)(用于細胞反應(yīng))。免疫原性片段是編碼至少一個表位(例如，CTL表位)的片段，通常為至少8個氨基酸的肽。認為長度為至少8個，例如8-10個氨基酸或最多20、50、60、70、100、150或200個氨基酸的片段在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要多肽表現(xiàn)出抗原性即可，也就是說多肽保留著主要的表位(如，CTL表位)。29腺病毒本發(fā)明的腺病毒載體包含一種或多種編碼一種或多種免疫原性多肽的異源多核苷酸(DNA)。用于本發(fā)明的腺病毒載體可以源自許多哺乳動物宿主。腺病毒(本文稱為"Ad"或"Adv")具有二十面體衣殼的特征性形態(tài)，該二十面體衣殼由三種主要蛋白六位體(11)、五位體基質(zhì)(III)和多節(jié)纖維(knobbedfibre,IV)以及一些其他的次要蛋白VI、VIII、IX、Ilia和IVa2構(gòu)成(RussellW.C.2000,GenViriol,81:2573-2604)。病毒基因組為線性雙鏈DNA，其中末端蛋白共價連接到具有反向末端重復(fù)(ITR)的5'末端。病毒DNA與高堿性蛋白VII和稱為mu的小肽緊密結(jié)合。另一蛋白V與DNA-蛋白復(fù)合體一起包裝，經(jīng)由蛋白VI提供與衣殼的結(jié)構(gòu)連接。病毒還含有病毒編碼的蛋白酶，該蛋白酶是加工一些結(jié)構(gòu)蛋白產(chǎn)生成熟的感染性病毒所需要的。分離出了感染多種哺乳動物的100余種不同血清型的腺病毒，其中的51種是人源的。因此一種或多種腺病毒載體可以源自人腺病毒。這種人源腺病毒的實例為Adl、Ad2、Ad4、Ad5、Ad6、Adll、Ad24、Ad34、Ad35，尤其為Ad5、Adll和Ad35。人血清型根據(jù)一些生物、化學(xué)、免疫和結(jié)構(gòu)上的標準分為6個亞屬(A-F)。盡管Ad5基載體已廣泛用于許多基因治療試驗中，但是Ad55和其他C類腺病毒載體的使用可能有限制，因為在一般人群中由于天然感染會預(yù)先存在免疫性。Ad5和其他C類成員是血清普遍性最高的血清型。在治療期間向載體的暴露可能會產(chǎn)生對已有載體的免疫。這些預(yù)先存在的或產(chǎn)生的對血清普遍性載體的免疫可能限制基因治療或疫苗接種的效力。因此其他的腺病毒血清型在能夠侵襲宿主免疫反應(yīng)的基因遞送系統(tǒng)的開發(fā)中構(gòu)成了極為重要的耙標。一種這種方面的其他血清型是源自非人的靈長類的那些，尤其是黑猩猩腺病毒。參見美國專利6,083,716,其描述了兩種黑猩猩腺病毒的基因組。已經(jīng)顯示黑猩猩("Pan"或"C")腺病毒載體與人腺病毒載體一樣有效地針對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品誘導(dǎo)強免疫反應(yīng)(Fitzgerald等人J.Immunol.170:1416)。非人靈長類腺病毒可以從黑猩猩的腸系膜淋巴結(jié)分離。黑猩猩腺病毒與C亞型人腺病毒類似足以使E1缺失的病毒在HEK293細胞中復(fù)制。然而，黑猩猩腺病毒在種系發(fā)生上與更常見的人血清型(Ad2和Ad5)不同。Pan6與Pan5、7和9相關(guān)性略低并且在血清學(xué)上與它們不同。因此一種或多種腺病毒載體可源自非人的靈長類腺病毒，如黑猩猩腺病毒，如選自血清型Pan5、Pan6、Pan7和Pan9中的一種。腺病毒載體可以源自不止一種腺病毒血清型，并且每種血清型可以來自相同或不同的來源。例如，它們可以源自不止一種人血清型和/或不止一種非人靈長類血清型。構(gòu)建嵌合腺病毒載體的方法z厶開于WO2005/001103。將異源DNA插入腺病毒可能伴有某些大小上的限制。人腺病毒具有包裝最多野生型基因組長度的105%的能力(Bett等人1993,JVirol67(10),5911-21)。已顯示人腺病毒的包裝下限為野生型基因組長度的75%(Parks等人1995,JVirol71(4),3293-8)。用于本發(fā)明的腺病毒的一個實例是與人群中天然產(chǎn)生的普遍的血清型(如Ad2和Ad5)不同的腺病毒。這避免了誘導(dǎo)抗載體的強效免疫反應(yīng)，抗載體的強效免疫反應(yīng)能通過經(jīng)由中和抗體并影響毒性而阻斷載體吸收，從而限制隨后給予相同血清型的效力。因此腺病毒可以不是天然產(chǎn)生的普遍的人病毒血清型的腺病毒。自動物分離的腺病毒具有免疫原性不同的衣殼、六位體、五位體和纖維組分，但是在種系發(fā)生上很相近。具體地，病毒可為非人腺病毒，如猿腺病毒，尤其是黑猩猩腺病毒，如Pan5、6、7或9。這些菌抹的實例描述于WO03/000283,可以得自美國標準培養(yǎng)物保藏中心(10801UniversityBoulevard,Manassas,Virginia20110-2209)和其他來源。希望的黑猩猩腺病毒菌抹為Pan5[ATCCVR-591]、Pan6[ATCCVR-592]、和Pan7[ATCCVR-593]。據(jù)認為使用黑猩猩腺病毒比使用人腺病毒血清型有利，因為缺乏預(yù)先存在的對靶群體中腺病毒的免疫性，尤其是缺乏抗靶群體中腺病毒的交叉中和抗體。黑猩猩腺病毒與預(yù)先存在的中和抗體反應(yīng)的交叉反應(yīng)僅存在于2%的靶群體中，相比之下在某些候選的人腺病毒載體的情況下為35%。黑猩猩腺病毒與更常見的人亞型Ad2和Ad5不同，但是更接近人E亞組的Ad4，該亞型不是普遍的亞型。Pan6與Pan5、7和9相關(guān)性稍差。本發(fā)明的腺病毒可以是復(fù)制缺陷型的。這是指與野生型病毒相比其具有較低的在非補足(non-complementing)細胞中復(fù)制的能力。這可以通過突變病毒而產(chǎn)生，例如通過剔除參與復(fù)制的基因，例如剔除Ela、Elb、E3或E4基因。根據(jù)本發(fā)明的腺病毒載體可以源自包含功能性El缺失的復(fù)制缺陷型腺病毒。因此，根據(jù)本發(fā)明的腺病毒載體可以是復(fù)制缺陷型的，因為不存在表達腺病毒Ela和Elb的能力，即，在Ela和Elb中功能性缺失。重組腺病毒還可以具有其他基因的功能缺失[參見WO03/000283],例如，E3或E4基因中的缺失?？梢詮男纬芍亟M病毒的一部分的腺病毒序列中移除腺病毒延遲早期基因E3。E3的功能不是產(chǎn)生重組腺病毒粒子所必須的。因此，不需要為了包裝可用于本發(fā)明的重組腺病毒而補償(replace)該基因產(chǎn)物的功能。在一個具體實施方式中，重組腺病毒具有功能上缺失的El和E3基因。此類載體的構(gòu)建描述于Roy等人，HumanGeneTherapy15:519-530，2004。重組腺病毒還可以被構(gòu)建成具有功能缺失的E4基因，盡管可能需要保留E4ORF6功能。根據(jù)本發(fā)明的腺病毒載體還可以含有延遲早期基因E2a中的缺失。缺失還可以在腺病毒基因組的晚期基因Ll至L5中的任何一個中進行。類似地，也可以使用中間基因IX和IVa的缺失?？梢栽谄渌慕Y(jié)構(gòu)性或非結(jié)構(gòu)性腺病毒基因中進行其他缺失。上述缺失可以單獨使用，即，用于本發(fā)明的腺病毒序列可以僅含有El缺失?；蛘?，可以任何組合使用能有效破壞其生物活性的整個基因或其部分的缺失。例如，在一個示例性載體中，腺病毒序列可以具有El基因和E4基因缺失；或El、E2a和E3基因缺失；或El和E3基因缺失(如Ela和Elb的功能缺失、和至少部分E3的缺失)；或具有或不具有E3缺失的El、E2a和E4基因缺失等。這些缺失可以是這些基因的部分或全部缺失，并且可以與其他突變(如溫度敏感性突變)組合以達成所需的結(jié)果。腺病毒載體可以在病毒能夠在其中復(fù)制的任何適宜的細胞系中制備。具體地，可以使用補足(complementing)細胞系，該補足細胞系能提供病毒載體所丟失的削弱其復(fù)制特征的因子(如El和/或E4)。不受限制，此細胞系可以為HeLa[ATCC登錄號CCL2]、A549[ATCC登錄號CCL185]、HEK293、KB[CCL17〗、Detroit[例如，Detroit510、CCL72]和WI-38[CCL75]細月包等。這些細l包系均得自美國標準培養(yǎng)物4呆藏中心(10801UniversityBoulevard,Manassas,Virginia20110-2209)。其他合適的親本細胞系可以從其他來源獲得，例如？￡11丄60細胞，如在微生物應(yīng)用與研究中心(CentreforAppliedMicrobiologyandResearch,CAMR，UK)的歐洲動物細月包孑咅養(yǎng)物j呆藏中心(EuropeanCollectionofAnimalCellCultures,ECACC)以ECACCno.96022940保藏的細胞；或Her96細胞(Crucell)。編碼免疫原性多肽的多核苷酸序列可以針對哺乳動物進行密碼子優(yōu)化。這種密碼子優(yōu)化詳細描述于WO05/025614中。某些HIV序列的密碼子優(yōu)化進一步描述于WO03/025003中。在本發(fā)明的一個實施方式中，多核苷酸構(gòu)建體包含N末端前導(dǎo)序列。信號序列、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域各自都任選地存在或缺失。在本發(fā)明的一個實施方式中，存在所有這些區(qū)域，但是它們被修飾。用于根據(jù)本發(fā)明的腺病毒載體的啟動子可以為來自HCMVIE基因的啟動子，例如其中包括含外顯子1的HCMVIE基因的5'非翻譯區(qū)域，并且完全或部分地排除了內(nèi)含子A,如WO02/36792所述。當幾個抗原融合成融合蛋白時，該蛋白將在單個啟動子控制下由多核苷酸編碼。在本發(fā)明的另一實施方式中。幾個抗原可以通過單獨的啟動子獨立表達，每個所述啟動子可以相同或不同。在本發(fā)明的又一實施方式中，一些抗原可以形成連接到第一啟動子的融合體，其他抗原可以連接到第二啟動子，第二啟動子可以與第一啟動子相同或不同。因此，腺病毒載體可以包含一個或多個表達框，每個表達框在一個啟動子的控制下編碼一種抗原。或者或另外，它可以含有一個或多個表達框，每個表達框在一個啟動子的控制下編碼不止一種抗原，這些抗原因因而表達成融合體。各表達框可以存在于腺病毒載體中的不止一個位置上。編碼待表達的免疫原性多肽的一種或多種多核苦酸可以插入任何腺病毒缺失區(qū)域，例如插入El缺失區(qū)域。盡管編碼免疫原性多肽的兩個或多個多核苷酸可以連接成融合體，但所33得蛋白可以表達成融合蛋白，或它可以表達成單獨的蛋白產(chǎn)物，或它可以表達為融合蛋白然后降解成較小的亞基。佐劑佐劑大至丈4苗述于VaccineDesign—theSubunitandAdjuvantApproach(例如，Powell和Newman,PlenumPress,NewYork,1995)。合適的佐劑包括鋁鹽，如氬氧化鋁或磷酸鋁，但也可以為鈣、鐵或鋅鹽，或者可以是酰化酪氨酸、或?；?、陽離子或陰離子衍生的多糖或聚磷腈的不溶性懸浮液。在本發(fā)明的制劑中，優(yōu)選的是佐劑組合物優(yōu)先誘導(dǎo)Thl反應(yīng)。然而，應(yīng)當理解不排除其他反應(yīng)，包括其他體液反應(yīng)。已知某些病毒佐劑特別適于刺激Thl或Th2型細胞因子反應(yīng)。傳統(tǒng)上在疫苗接種或感染后免疫反應(yīng)的Thl:Th2平衡的最佳指示包括在體外用抗原再刺激后直接測量T淋巴細胞產(chǎn)生的Thl或Th2細胞因子；和/或測量抗原特異性抗體反應(yīng)的IgGl:IgG2a比率。因此，Thl型佐劑能夠刺激分離的T細胞群體在體內(nèi)(如在血清中測量)或離體(在體外用抗原再刺激細胞時測量的細胞因子)條件下產(chǎn)生高含量的Th1型細胞因子，并誘導(dǎo)與Th1型血清型相關(guān)的抗原特異性免疫球蛋白反應(yīng)?？梢耘渲埔援a(chǎn)生適用于本發(fā)明的佐劑的優(yōu)選Thl型免疫刺激劑包括但不限制為下列Toll樣受體(TLR)4配體，尤其是激動劑，如脂質(zhì)A衍生物，具體是單磷酰(monophosphoryl)脂質(zhì)A或更具體為3脫酰單磷酰脂質(zhì)A(3D-MPL)。3D-MPL由GlaxoSmithKline以商標MPLSa出售，它主要促進CD4+T細胞反應(yīng)，CD4+T細胞的特征在于產(chǎn)生IFN-g(Thl細胞，即，具有1型表型的輔助性CD4T細胞)。它可以根據(jù)GB2220211A中所公開的方法制備。從化學(xué)上講，它是3脫酰單磷酰脂質(zhì)A與3、4、5或6個?；湹幕旌衔?。優(yōu)選地，在本發(fā)明的組合物中使用小顆粒3D-MPL。小顆粒3D-MPL具有使其可以通過0.22pm濾器無菌過濾的粒徑。這類制劑描述于國際專利申請No.W094/21292中。已知的認為是TLR4拮抗劑的脂質(zhì)A的合成衍生物包括，但不限于OM174(2-脫氧-6-0-[2-脫氧-2-[(11)-3-十二烷酰氧基四-癸?；被鵠-4-0-膦?；?P-D-吡喃葡糖基]-2-[(R)-3-羥基四癸?；被鵠-a-D-吡喃葡糖基二氫磷酸酯)，(W095/14026)OM294DP(3S,9R)-3—[(R)-十二烷酰氧基四癸?；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9(R)-[(R)-3-羥基四癸?；被鵠癸-UO-二醇，UO-雙(二氫磷酸酯)(W099/64301和WO00/0462)OM197MP-AcDP(3S-,9R)-3-[(R)-十二》克酰氧基四癸?；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基四癸酰基氨基]癸-l，10-二醇,1-二氫磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)(W001/46127)可以使用的其他TLR4配體為烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)，如WO9850399或US6303347中所公開的(還公開了制備AGP的方法)或AGP藥學(xué)上可接受的鹽(如US6764840中所公開)。一些AGP為TLR4激動劑，一些為TLR4拮抗劑。認為兩種都可用作佐劑。皂香也是根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選Thl免疫刺激劑。皂苷是熟知的佐劑，在Lacaille-Dubois，M和WagnerH.(1996.Areviewofthebiologicalandpharmacologicalactivitiesofsaponins.Phytomedicine第2巻第363-386頁)中提出。例如，QuilA(源自一種南美洲的樹智利皂莢樹(Quillajasaponariamolina)的樹皮)及其級分，描述于US5，057，540和"Saponinsasvaccineadjuvants",Kensil，C.R.,CritRevTherDrugCarrierSyst,1996，12(1-2):1-55;和EP0362279Bl。已經(jīng)描述了溶血性皂苷QS21和QS17(QuilA的HPLC純化級分)為有效的全身性佐劑，它們的制備方法公開于美國專利No.5057,540和EP0362279Bl。這些參考文獻中還描述了QS7(Quil-A的非溶血性級分)的用途，QS7用作全身性疫苗的有效佐劑。QS21的用途另外描述于Kensil等人(1991.J.Immunology第146巻，431-437)。還已知了QS21和聚山梨醇酯或環(huán)糊精的組合(WO99/10008)。包含QuilA的級分(如QS21和QS7)的孩i粒佐劑系統(tǒng)描述于WO96/33739和WO96/11711。一種此類系統(tǒng)稱為Iscom,可能含有一種或多種皂苷。本發(fā)明的佐劑尤其可以包含Toll樣受體(TLR)4配體(尤其是3D-MPL)與皂苷的組合。其他合適的佐劑包括TLR9配體(激動劑)。因此，另一優(yōu)選的免疫刺激劑為含有未曱基化的CpG二核苷酸("CpG")的免疫刺激性寡核苷酸。CpG是DNA中存在的胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸基序的縮寫。業(yè)內(nèi)已知CpG在通過全身性和粘膜途徑給予時作為佐劑(WO96/02555;EP468520;Davis等人，J.Immunol,1998，160(2):870-876;McCluskie和Davis，J.Immunol"1998，161(9):4463-6)。從歷史上看，據(jù)觀察BCG的DNA級分可以施加抗腫瘤作用。在進一步的研究中，據(jù)顯示源自BCG基因序列的合成寡核苷酸能夠誘導(dǎo)免疫刺激性效應(yīng)(體外和體內(nèi))。這些研究的作者推斷某些回文序列(包括中心的CG基序)具有此活性。之后CG基序在免疫刺激中的主要作用在Kreg發(fā)表的文章(Nature374，第546頁，1995)中闡明。詳細的分析顯示CG基序需要在某些序列環(huán)境內(nèi)，并且這些序列在細菌DNA中常見但在脊推動物DNA中很罕見。免疫刺激性序列通常為噪呤、嘌呤、C、G、嘧啶、嘧啶；其中CG基序未被甲基化，但是其他已知為免疫刺激性的未曱基化CpG序列可用于本發(fā)明。在六個核苷酸的某些組合中，存在回文序列。這些基序中的幾個可以作為一個基序的重復(fù)或不同基序的組合存在于相同的寡核苷酸中。一種或多種含有這些免疫刺激性序列的寡核苷酸的存在可以激活多種免疫亞群，包括自然殺傷細胞(其產(chǎn)生干擾素y,具有細胞毒活性)和巨噬細胞(Wooldrige等人，第89巻(第8期)，1977)。其他含有未曱基化CpG而不具有這種共有序列的序列也顯示為免疫調(diào)節(jié)性的。當CpG配制成疫苗時，它通常以游離溶液與游離的抗原一起給予(WO96/02555;McCluskie和Davis，如上)或者共價結(jié)合至抗原(WO98/16247);或者與載體(如氫氧化鋁)一起配制(肝炎表面抗原)Davis等人，如上；Brazolot-Millan等人，Proc.Natl,Acad.Sci.,USA,1998,95(26)，15553-8)?？赡荜P(guān)注到的其他TLR9激動劑包括含有免疫刺激性CpR基序的寡核苷酸和含YpG基序的寡核苷酸(Idera)。上面所述的這些免疫刺激劑可以與載體一起配制，如脂質(zhì)體、水包油乳液、和/或金屬鹽，包括鋁鹽(如氫氧化鋁)。例如，3D-MPL可以與氬氧化36鋁(EP0689454)或水包油乳液(WO95/17210)—起配制；Q21可以有利地與含膽固醇的脂質(zhì)體(WO96/33739)、水包油乳液(WO95/17210)或明礬(WO98/15287)—起配制；CpG可以與明鞏(Davis等人，如上；Brazolot-Millan,如上)或與其他陽離子載體一起配制。免疫刺激劑的組合也是優(yōu)選的，具體是單磷酰脂質(zhì)A和皂苷衍生物的組合(WO94/00153;WO95/17210;WO96/33739;WO98/56414;WO99、12565;WO99/11241),更具體為QS21與3D-MPL的組合，如WO94/00153中所公開?；蛘?，CpG加上皂普(如QS21)的組合也形成用于本發(fā)明的有效佐劑?；蛘?，皂苦可以在脂質(zhì)體中或在Iscorn中與免疫刺激性寡核苷酸一起配制。因此，適宜的佐劑系統(tǒng)包括(例如)單磷酰脂質(zhì)A(優(yōu)選3D-MPL)與鋁鹽一起的組合(如WO00/23105中所述)。增強系統(tǒng)包括單磷酰脂質(zhì)A與皂苷衍生物的組合，具體為QS21與3D-MPL的組合，如WO94/00153中所公開；或為反應(yīng)原性較弱的組合物，其中QS21在含有膽固醇的脂質(zhì)體(DQ)中弱化，如WO96/33739中所公開。這種組合還可以包含免疫刺激性寡核苦酸。因此，一種實例性的佐劑包含QS21和/或MPL和/或CpG。一種具體的有效佐劑制劑包含在水包油乳液中的QS21、3D-MPL和生育酚，它描述于WO95/17210中，是用于本發(fā)明的另一優(yōu)選制劑。另一優(yōu)選的制劑僅包含CpG寡核苷酸或其與鋁鹽一起。在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備本文所述疫苗制劑的方法，其中該方法包括將根據(jù)本發(fā)明的一種或多種第一免疫原性多肽與合適的佐劑混合。用于根據(jù)本發(fā)明的制劑的具體的優(yōu)選佐劑如下i)3D-MPL+在脂質(zhì)體中的QS21(參見，例如下面的佐劑B)ii)明礬+3D-MPLiii)明鞏+在脂質(zhì)體中的QS21+3D-MPLiv)明礬+CpGv)3D-MPL+QS21+水包油乳液vi)CpGvii)3D-MPL+QS21(例如，在脂質(zhì)體中)+CpGviii)QS21+CpG優(yōu)選地，佐劑以脂質(zhì)體、ISCOM或水包油乳液形式存在。在本發(fā)明的一個實例性實施方式中，佐劑包含水包油乳液。在本發(fā)明的另一個實例性實施方式中，佐劑包含脂質(zhì)體。適宜的佐劑組分不含有任何病毒。因此，合適的是，根據(jù)本發(fā)明使用的組合物除了包含編碼源自病原體的一種或多種第二免疫原性多肽的一種或多種異源多核苷酸的一種或多種腺病毒之外不含有任何病毒。組合物、劑量和給藥在本發(fā)明的方法中，免疫原性多肽、腺病毒載體和佐劑并行給予。通常佐劑與免疫原性多肽共同配制。合適地，佐劑還與要給予的任何其他免疫原性多肽共同配制。因此，在本發(fā)明的一個實施方式中，提供一種引起免疫反應(yīng)的方法，包括給予(i)一種或多種與佐劑共同配制的第一免疫原性多肽；和(ii)包含一種或多種異源多核苷酸的一種或多種腺病毒載體，所述一種或多種異源多核苷酸編碼一種或多種第二免疫原性多肽；其中一種或多種第一免疫原性多肽和佐劑、以及一種或多種腺病毒載體并行給予。所謂"共同配制的，，意指第一免疫原性多肽和佐劑包含在相同的組合物例如藥物組合物中。通常，腺病毒載體包含在組合物例如藥物組合物中?；蛘撸环N或多種第一免疫原性多肽、一種或多種腺病毒載體和佐劑共同配制。因此，根據(jù)本發(fā)明提供了組合物，其包含一種或多種免疫原性多肽、一種或多種腺病毒載體、和佐劑根據(jù)本發(fā)明的組合物和方法可以包括使用不止一種免疫原性多肽和/或不止一種腺病毒載體。多種抗原的使用在引起對某些病原體(如HIV、結(jié)核分支桿菌、癡原蟲屬)的保護性免疫反應(yīng)中是尤其有利的。根據(jù)本發(fā)明的組合物可以包含不止一種佐劑。根據(jù)本發(fā)明所采用的組合物和方法通常可以包含載體，例如水性緩沖的載體?？梢园Ｗo性組分，如糖。組合物給予的量應(yīng)足以轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細胞；并且提供足夠水平的基因轉(zhuǎn)移和表達；并且允許產(chǎn)生病原體特異性的免疫反應(yīng)，從而提供預(yù)防或治療有益效果，而沒有不適當?shù)牟焕Ч蚓哂嗅t(yī)學(xué)上可接受的生理效果，該量可以由醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)的那些技術(shù)人員確定。常規(guī)的和藥學(xué)上可接受的給藥途徑包括但不限于直接遞送給視網(wǎng)膜和其他眼內(nèi)遞送方法、直接遞送給肝、吸入、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、氣管內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、表皮、直腸、經(jīng)口和其他胃腸外給藥途徑。如果需要，給藥途徑可以組合，或者根據(jù)基因產(chǎn)物或病況進行調(diào)整。給藥途徑主要取決于所治療的病況的性質(zhì)。最適宜的途徑是肌內(nèi)、皮內(nèi)或表皮。優(yōu)選的扭向組織為肌肉、皮膚和粘膜。皮膚和粘膜是通常遇到大部分感染性抗原的生理部位。當?shù)谝幻庖咴远嚯摹⒆魟┖拖俨《据d體不是共同配制時，不同的制劑(例如多肽/佐劑和腺病毒載體制劑)可以通過相同給藥途徑或不同給藥途徑給藥。本方法中組合物的劑量主要取決于諸如所治療的病況、受試者的年齡、體重和健康狀況等因素，因此在受試者之間可以不同。例如，治療有效的成人或脊推動物劑量通常在下列范圍內(nèi)約100pL至約lOOmL載體含有濃度約lxl()S至約lxlO"的病毒粒子、約lxlO"至lxlO"的病毒粒子、或約lxio9至lxlO^的病毒粒子與約l-1000嗎、或約2-100嗎(例如約4-40(xg)的免疫原性多肽。劑量可以依據(jù)動物的大小和給藥途徑而變化。例如，對于肌內(nèi)注射的適宜的人或脊推動物劑量(對于約80kg動物)對于單個部位介于每ml約lxl(^至約5xl0"病毒粒子和4-40嗎蛋白的范圍內(nèi)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)給藥途徑、和采用該組合物的治療或疫苗應(yīng)用來調(diào)整這些劑量。佐劑的量取決于佐劑和免疫原性多肽的性質(zhì)、所治療的病況和受試者的年齡、體重和健康狀況。通常對于人類給藥，每劑l-100|ig，例如10-50嗎的佐劑量可能是合適的。合適的是，通過以本發(fā)明的方法單次并行給予本發(fā)明的(一種或多種)39組合物來達成足夠的免疫反應(yīng)。然而，如果通過在第二次或后續(xù)情況(例如在一個月或兩個月之后)給予另外劑量的第一免疫原性多肽、佐劑和腺病毒載體來進一步增強免疫反應(yīng)，則這種提議也包含在本發(fā)明中。物之后通?？梢砸鹩欣牟≡w特異性CD4+和/或CD8+T細胞反應(yīng)。然而我們發(fā)現(xiàn)有利的病原體特異性抗體反應(yīng)可能需要本發(fā)明的(一種或多種)組合物的第二次或另外的并行給藥。本發(fā)明的組分可以與諸如水、緩沖劑等任〗可適宜的藥物賦形劑組合或一起配制。實施例佐劑制備1)根據(jù)WO95/17210中所列的方法制備水包油乳液乳液含有42.72mg/ml堇烯、47.44mg/ml生育酚、19.4mg/ml吐溫80。所得油滴大小約180nm。將吐溫80溶解于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中得到在PBS中的2%溶液。為提供100ml的兩倍濃縮液，將5gDLa生育酚和5ml角鯊烯的乳液旋渦直至徹底混合。添加90mlPBS/吐溫溶液并充分混合。然后將所得乳液通過注射器，最終通過使用M110S微流機進行微流化。所得油滴的大小為約180nm。2)用QS21和MPL制備水包油乳液將無菌本體乳液添加至PBS中達到終濃度為500pl乳液/ml(v/v)。然后添力口3D-MPL。然后在各組分添加之間添加QS21，將中間產(chǎn)物攪拌5分鐘。15分鐘后，檢查pH，如果需要用NaOH或HCl將其調(diào)整到6.8+/-0.1。3D-MPL和QS21的終濃度各自為100嗎/ml。3)制備脂質(zhì)體MPL將脂質(zhì)(如來自卵黃的或合成的磷脂酰膽堿)和膽固醇和3D-MPL在有機溶劑中的混合物在真空下(或者在惰性氣體流下)干燥。然后添加水溶液(如磷酸緩沖鹽水)，攪動容器直到所用脂質(zhì)懸浮。然后將此懸浮液微流化直至脂質(zhì)體大小降低至約100nm,然后通過0.2nm的濾器無菌過濾。擠出或超聲波可以代替此步驟。通常，膽固醇磷脂酰膽石威的比率為l:4(w/w)，添加水溶液4吏得膽固醇終濃度為10mg/ml。MPL的終濃度為2mg/ml。脂質(zhì)體的大小為約100nm,被稱為SUV(小單層嚢泡(smallunilamelarvesicles)。脂質(zhì)體本身隨時間是穩(wěn)定的，并且不具有促融合(fusogenic)能力。4)制備佐劑B("adjB")將無菌的SUV本體添加到PBS中。PBS組成為Na2HP04:9mM;KH2P04:48mM;NaCl:100nM，pH6.1。將QS21水溶液添加到SUV中。3D-MPL和QS21的終濃度各自為100嗎/ml。該混合物稱為佐劑B。在各個組分添加之間，將中間產(chǎn)物攪拌5分鐘。檢查pH,如果需要，用NaOH或HC1將其調(diào)整到6.1+/-0.1。制備p24-RT國Nef-P17蛋白("F4")按照WO2006/013106實施例1，密碼子優(yōu)化方法制備F4。制備含有Gag-RT-Nef轉(zhuǎn)基因的黑猩猩腺病毒Pan7("Pan7GRN")構(gòu)建Gag、RT、Nef質(zhì)粒質(zhì)粒p73i-TgrnTgrn質(zhì)粒插入片段的全長序列在SEQIDNo1中給出，質(zhì)粒構(gòu)建在圖1中示意性示出。它含有pl7、p24(密碼子優(yōu)化)Gag、p66RT(密碼子優(yōu)化和滅活的)和平截的Nef。按照WO03/025003實施例1-13中所述制備質(zhì)粒P73i-Tgrn。構(gòu)建El/E3缺失的Pan7腺病毒按照WO2006/120034實施例1中所述制備El/E3缺失的Pan7腺病毒。載體的其他血清型可以類似的方法構(gòu)建。在這個或其他的Pan腺病毒血清型中的El、E3和E4缺失的構(gòu)建的完整說明在WO03/0046124中給出。其他J言息也可見于HumanGeneTherapy15:519-530。Gag、RT、Nef序列插入到腺病毒中。按照WO2006/120034實施例3中所述使用質(zhì)粒P73i-Tgra將GRN表達框插入El/E3缺失的Pan7腺病毒中制備C7-GRNc。C7-GRNc是本文所列的實施例中所用的Pan7GRN腺病毒組分。實施例1用腺病毒組分(Pan7GRN)和蛋白組分(F4/佐劑B)單獨免疫或用腺病毒和蛋白組分一起共同配制的制劑免疫的小鼠中的免疫原性研究所用的小鼠林系為CB6F1,每個時間點用3只小鼠。對于用F4/佐劑B(P)進行的免疫，注射1/10的人劑量，即，9嗎F4蛋白/50iil佐劑B。對于用Pan7GRN(A)進行的免疫使用的是10x108病毒粒子/50pl鹽水(對于注射液為0.9%NaCl水)。Pan7GRN黑猩猩腺病毒攜帶編碼Gag(G)、RT(R)和Nef(N)的基因。疫苗接種方案如下:組別第0天第21天第42天第63天1-一F4/adjBF4/adjB2-一Pan7GRNPan7GRNF4/adjBF4/adjBPan7GRNPan7GRN4Pan7GRNPan7GRNF4/adjBF4/adjB5-一-F4/adjB/Pan7GRN6--F4/adjB/F4/adjB/42<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>因此，可以看出在組1和組2中，小鼠分別用蛋白(pp)或腺病毒(AA)注射2次免疫。來自組3和4的小鼠接受傳統(tǒng)的初免-加強方案蛋白然后腺病毒(PPAA)或者另一種反向方式(AAPP)，而組5和6中，小鼠接受一次或兩次根據(jù)本發(fā)明的蛋白和腺病毒組合在一起(combo)的注射。來自組7的小鼠僅接受佐劑對照，而來自組6的小鼠未接受注射(naive)。進fl"下列讀出抗體反應(yīng)(對來自各組的各個動物的血清進行ELISA):-抗F4的抗體反應(yīng)(圖4)-抗F4組分p24、RT、Nef和pl7的抗體反應(yīng)(圖5-8)細胞反應(yīng)(圖2-3)-通過如下方法測量用p24、RT、Nef或p17的庫(pool)再次刺激脾細胞過夜，然后進行表面和細胞內(nèi)細胞因子染色，之后進行流式細胞術(shù)分析。每個時間點每組收集3只小鼠的脾細胞用于分析。對于組1和2，在相應(yīng)的最后免疫之后21天取樣測量。對于剩余的組，在相應(yīng)的最后免疫之后21天、56天和112天進4亍測量。結(jié)果結(jié)果示于圖2-8中。X軸標記如下對應(yīng)PP-在第二次免疫后的組1動物AA-在第二次免疫后的組2動物PPAA-在第四次免疫后的組3動物AAPP-在第四次免疫后的組4動物Combo-免疫后的《且5動物Combox2-第二次免疫后的組6動物測量時間點(最后免疫之后21、56或112天)示于括號中。細胞反應(yīng)(圖2-3):在所分析的時間點，數(shù)據(jù)顯示主要觀察到抗p24、RT和Nef的CD4+T細胞反應(yīng)。如圖2a和2b(左側(cè)欄)所示，最后免疫之后21天，觀察到兩次腺病毒免疫之后進行兩次蛋白/佐劑免疫(組4動物)具有最高的CD4+T細胞反應(yīng)。用p24、RT或Nef肽再次刺激之后，(發(fā)現(xiàn))注射一次腺病毒/蛋白/佐劑的組合比注射兩次蛋白/佐劑誘導(dǎo)更高的CD4+T細胞水平。對于RT和Nef再次刺激，用腺病毒/蛋白/佐劑的組合免疫兩次誘導(dǎo)的CD4+T細胞反應(yīng)比用該組合免疫一次誘導(dǎo)的略高，而對于p24，用一次或兩次免疫的反應(yīng)相同。在所分析的時間點，主要觀察到抗p24和RT肽的CD8+T細胞反應(yīng)，沒有4全測到顯著數(shù)量的對Nef或p17特異性的CD8+T細胞。如圖2a和2b(右側(cè)欄)中所示，在最后免疫后21天，用腺病毒/蛋白/佐劑的組合免疫一次或兩次后CD8+T細胞反應(yīng)類似。在(i)用腺病毒免疫兩次或(ii)用腺病毒免疫兩次然后用蛋白免疫兩次或(iii)用腺病毒/蛋白/佐劑免疫的組合免疫一次或兩次的組中，觀察到抗p24的CD8反應(yīng)各自相當并且比來自用蛋白免疫兩次然后用腺病毒免疫兩次的組中的反應(yīng)略低。觀察到在用腺病毒/蛋白/佐劑的組合免疫一次或兩次的組中，抗RT的CD8反應(yīng)相當并且比以下組的反應(yīng)略低(i)用腺病毒免疫兩次或(ii)用腺病毒免疫兩次然后用蛋白免疫兩次或(iii)用蛋白免疫兩次然后用腺病毒免疫兩次。還在較晚的時間點(最后免疫之后56和112天)分析了CD4和CD8T細胞反應(yīng)，這些時間點可以測定反應(yīng)的持久性(圖3a和3b)。主要觀察到抗p24、RT和Nef的CD4反應(yīng)(圖3a和3b，左側(cè)欄)。在這些時間點，在用腺病毒免疫兩次然后用蛋白免疫兩次的動物中觀察到了最高的CD4反應(yīng)。觀察到在用腺病毒/蛋白/佐劑免疫一次或兩次的小鼠中，CD4反應(yīng)彼此相當，并且一般高于用蛋白免疫兩次然后用腺病毒免疫兩次的組中所觀察到的反應(yīng)。在較晚的時間點，抗p24的CD8反應(yīng)在用腺病毒/蛋白/佐劑的組合免疫一次的組中最高(圖3b，右側(cè)欄)。其與用蛋白免疫兩次然后用腺病毒免疫兩次的動物中的反應(yīng)相當，并且略高于(i)用腺病毒/蛋白/佐劑的組合免疫兩次或(ii)用腺病毒免疫兩次然后用蛋白免疫兩次的動物的反應(yīng)。后兩者彼此相當。下組中抗RT的CD8反應(yīng)最高并且類似(i)用腺病毒/蛋白/佐劑的組合免疫兩次或(ii)用腺病毒免疫兩次然后用蛋白免疫兩次。(i)用腺病毒/蛋白/佐劑的組合免疫兩次或(ii)用蛋白免疫兩次然后用腺病毒免疫兩次的組中的抗RT的CD8反應(yīng)略低，Y旦是它們;波此相當(圖3)。如圖3a(右側(cè)欄)中所示，沒有檢測到顯著數(shù)量的Nef或p17特異性的CD8+T細胞。抗體反應(yīng)如圖4至8所示，檢測到的抗體反應(yīng)主要是抗p24(圖5)、RT(圖6)和Nef(圖8)的?？笷4(圖4)反應(yīng)大致類似于所觀察到的抗p24、RT或Nef組分各自的反應(yīng)，特點如下-在(i)用腺病毒免疫兩次或(ii)用腺病毒/蛋白/佐劑的組合免疫一次的組中檢測到低乃至無抗體反應(yīng)；-免疫后21天在用蛋白免疫兩次的組中通常檢測到最高的抗體反應(yīng)。然而，在該組中還^f企測到個體間最高的變異性。此外，對于抗Nef血清學(xué)，用腺病毒免疫兩次然后用蛋白免疫兩次的組與其他組相比似乎顯示最高的反應(yīng)；-在(i)用腺病毒/蛋白/佐劑的組合免疫兩次或(ii)用蛋白免疫兩次然后用腺病毒免疫兩次或(iii)用腺病毒免疫兩次然后用蛋白免疫兩次的組中所觀察到的反應(yīng)相當，峰值在免疫后21天，然后隨時間稍微降低。在所有組中抗pl7的抗體反應(yīng)(圖7)都極低乃至不可檢測。結(jié)論總體上，在四次免疫后的AAPP處理組觀察到最高的抗原特異性的細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。然而，當比l^兩次免疫后的組(即，AA、PP和2xcombo組)時，僅在用蛋白/腺病毒/佐劑的組合免疫兩次的組中觀察到了抗原特異性CD4和CD8T細胞反應(yīng)兩者的誘導(dǎo)。此外，在單次注射蛋白/腺病毒/佐劑45組合之后可以達成相似水平的CD4和CD8T細月包反應(yīng)。此外，在持久性方面，在用蛋白/腺病毒/佐劑組合第2次免疫之后112天所觀察到的抗原特異性T細胞反應(yīng)與在AAPP處理組中4次免疫之后112天所觀察到的抗原特異性T細胞反應(yīng)相當。最后，似乎需要用蛋白/腺病毒/佐劑組合免疫2次以獲得與用加佐劑的蛋白免疫兩次的組(一般提供最高的抗體反應(yīng)的組)所獲得的抗體反應(yīng)相當?shù)目贵w反應(yīng)。實施例2在用Pan7GRN腺病毒和F4蛋白/佐劑B—起共同配制的制劑免疫的小鼠中的免疫原性研究所用的小鼠林系為CB6F1，每組9只小鼠。用F4蛋白(注射1/10人劑量，即，9|ig)與在50pL佐劑B或其稀釋液(1/2、1/4或1/10)中的10x108個Pan7GRN病毒粒子一起的共制劑免疫小鼠一次。在免疫后21天測定抗Nef、p17、p24或RT肽庫的CD4和CD8細胞反應(yīng)(每組3個脾的3個庫)。進行下列讀出細胞反應(yīng)(圖9):-通過如下方法測量用p24、RT、Nef或p17肽庫再次刺激脾細力包過夜，然后進行表面和細胞內(nèi)細胞因子染色，之后進行流式細胞術(shù)分析。收集脾細胞用于分析(每組3個脾的3個庫)。結(jié)果圖9中所示的結(jié)果表示用p24或RT肽庫再次刺激后所觀察到的細胞反應(yīng)。X軸才示記對應(yīng)如下AdjB—用9(igF4/l()8vpPan7GRN/未稀釋的佐劑B免疫的小鼠1/2AdjB—用9pgF4/108vpPan7GRN/l/2稀釋的佐劑B免疫的小鼠1/4AdjB—用9嗎F4/108vpPan7GRN/l/4稀釋的佐劑B免疫的小鼠1/lOAdjB—用9|igF4/108vpPan7GRN/l/10稀釋的佐劑B免疫的小鼠空白-空白小鼠(未免疫)結(jié)果表明主要觀察到抗p24和RT的CD4(圖9,左側(cè)欄)和CD8(圖9,右側(cè)欄)反應(yīng)，RT特異性的CD8T細胞反應(yīng)低于p24特異性的CD8T細胞反應(yīng)。此外，結(jié)果表明在用未稀釋的佐劑B或其1/2稀釋液免疫的組在免疫后21天抗p24和RT的CD4反應(yīng)類似。當佐劑1/4稀釋時，這些CD4反應(yīng)趨于降低。當佐劑B以1/10稀釋時，所觀察到的CD4反應(yīng)與用佐劑B的1/4稀釋液免疫的組中的CD4反應(yīng)類似。佐劑1/2稀釋或不稀釋時，抗p24的抗CD8反應(yīng)相當。然而，當佐劑B1/4稀釋時，反應(yīng)降低，如果1/10稀釋，甚至降低更多。相比之下，這些趨勢沒有在抗RTCD8反應(yīng)中看到，其中沒有所用佐劑劑量的真正劑量范圍效應(yīng)。結(jié)論通過單次給予含有免疫原性多肽、含有編碼免疫原性多肽的異源多核苷酸的腺病毒載體和佐劑的組合物，誘導(dǎo)了抗F4組分的CD4+細胞和CD8+細胞，即使在佐劑被稀釋時也如此。佐劑稀釋的影響依據(jù)所關(guān)注的抗原特異性CD4或CD8反應(yīng)而不同。具體地，觀察到的最高的反應(yīng)是抗p24的，抗p24CD4和CD8T細胞反應(yīng)顯示出與組合疫苗中所用的佐劑劑量相關(guān)的劑量范圍效應(yīng)。盡管對于抗RTCD4T細胞反應(yīng)可以觀察到相同的效應(yīng)，但combo中所用的佐劑劑量的劑量范圍效應(yīng)不如抗RTCD8T細胞反應(yīng)明確。最后，如果我們考慮總體的抗原特異性CD4和CD8T細胞反應(yīng)并將抗4種抗原的反應(yīng)加起來，則可以觀察到劑量范圍。實施例3在用Pan7GRN免疫或用F4/佐劑B順序免疫或用腺病毒和蛋白組分一起共同配制的制劑免疫的新西蘭白兔中的免疫原性研究對于用F4/佐劑B進行的免疫，注射人劑量，即，90(igF4蛋白/500佐劑B。對于用Pan7GRN進行的免疫，使用10x101()或10x1012病毒粒子/500pL鹽水。對于用腺病毒和蛋白組分一起共同配制的制劑進行的免疫，47使用每500|iL佐劑B90嗎F4蛋白、10x1011Pan7GRN病毒粒子。疫苗接種方案如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>除組1僅包括2只兔子外，每組3只兔子。進行下列讀出抗體反應(yīng)(對來自各組的各個動物的血清進行ELISA):-抗F4的抗體反應(yīng)-抗F4組分p24、RT、Nef和pl7的抗體反應(yīng)淋巴增殖性反應(yīng)通過外周血單核細胞(在密度梯度后從全血分離)對氚標記的胸腺嘧啶的吸收來測定淋巴增殖，該外周血單核細胞在體外經(jīng)Nef、p17、p24和/或RT肽庫再刺激88小時，孵育的最后16小時存在氮標記的胸腺嘧啶。結(jié)果淋巴增殖性反應(yīng)如圖10中所示，在用蛋白免疫兩次的組中觀察到了最高的淋巴增殖性反應(yīng)。在用腺病毒/蛋白/佐劑的組合免疫兩次的動物中的淋巴增殖性反應(yīng)在該組的所有兔子中都觀察到了。事實上它在一次注射后達到峰值并且在第三次注射腺病毒/蛋白/佐劑的組合后進一步恢復(fù)(與第一次注射后水平相似)，這表明前兩次注射沒有誘導(dǎo)中和反應(yīng)，該中和反應(yīng)將抑制對任何再進行類似注射的反應(yīng)。在其強度方面，在用腺病毒/蛋白/佐劑的組合免疫的兔子中所觀察到的增殖性反應(yīng)與用1012腺病毒的病毒粒子免疫一次或兩次的動物中觀察到的增殖性反應(yīng)相當，并且高于用10"腺病毒的病毒粒子免疫一次或兩次的動物中的增殖性反應(yīng)?？傊@表明使用腺病毒/蛋白/佐劑的組合可以降低使用的腺病毒劑量。最后，在第三次注射腺病毒/蛋白/佐劑的組合后，在組4中觀察到的反應(yīng)與用蛋白免疫3次的動物(組l)的反應(yīng)類似。jfii清學(xué)如圖11所示，在用腺病毒/蛋白/佐劑的組合免疫兩次的動物中所觀察到的抗F4抗體反應(yīng)的動力學(xué)與用蛋白免疫兩次的動物的動力學(xué)類似其在第二次注射后7天檢測到，然后隨時間降低。然而，在強度方面，用腺病毒/蛋白/佐劑的組合免疫兩次的動物的抗F4反應(yīng)與用蛋白免疫兩次的動物的抗F4反應(yīng)相比在后期時間點(第二次免疫后21和63天)仍然較高。在用101Q腺病毒的病毒粒子免疫一次的兔子中沒有觀察到抗F4抗體反應(yīng)。在用1012腺病毒的病毒粒子免疫一次的兔子中，僅在免疫后21和63天檢測到抗F4反應(yīng)。在那個組中，在免疫時間點后63天(d77)觀察到了反應(yīng)的高度變異性，這是由于(3只動物中的)一只動物展示出抗不同F(xiàn)4組分的較高效價，尤其是抗p24和RT，如分別在圖12a和12b中所示。抗F4抗體反應(yīng)主要由耙向p24和RT的抗體以及明顯較小程度的Nef和p17抗體構(gòu)成。結(jié)論在兩次注射含有免疫原性多肽、含有編碼免疫原性多肽的異源多核普酸的腺病毒載體和佐劑的組合物后，可以在兔子中誘導(dǎo)淋巴增殖性反應(yīng)和抗體反應(yīng)。此外，我們證明淋巴增殖性反應(yīng)可以在第三次注射此組合物之后恢復(fù)。最后，觀察到的最佳的抗體反應(yīng)(強度和持久性方面)是用腺病毒/蛋白/佐劑的組合引起的抗體反應(yīng)。實施例4在CB6F1小鼠中F4(密碼子優(yōu)化的)/佐劑B和C7-GRN組合給予時的免疫原性實驗設(shè)計49用下列不同的組合免疫CB6F1小鼠兩次(第0天和21天)。以50|il佐劑B中9|igF4co/動物(1/10人劑量)使用F4co/佐劑B。實施例4中的F4co如WO2006/013106實施例1的密碼子優(yōu)化方法中所述制備的F4。組合C7-GRNC7-GRN/佐劑BC7-G雨F4coC7-GRN/F4co/佐劑BF4coF4co/佐劑B佐劑BC7空白C7空白/佐劑BC7空白/F4coC7空白/F4co/佐劑B免疫方案和免疫反應(yīng)分析在第0天和第21天進行免疫。在第21天、28天(第2次免疫后7天)、42天(第2次免疫后21天)、和77天(第2次免疫后56天)進行胞內(nèi)細胞因子染色(ICS)。結(jié)果HIV特異性CD4T細胞反應(yīng)結(jié)果顯示在下列圖中圖13.HIV-1特異性CD4T鈿胞的定量。示出了在4個時間點，對于各個免疫方法，分泌IFN-y和/或IL-2的CD3CD4T細胞的百分比。在離體條件下，用含有F4序列的肽庫刺激外周血淋巴細胞(PBL)(2小時后添加布雷菲德菌素(Brefeldin),然后過夜)，通過ICS測量細胞因子的產(chǎn)生。每個值是3只小鼠的5個庫的幾何平均值。圖14.在兩次免疫后7天F4特異性CD4T細胞的頻率分布。示出了對于各個方法，在兩次免疫后7天F4特異性循環(huán)CD4T細胞的頻率。每個點表示3只小鼠的一個庫所獲得的值。圖15.在兩次免疫后7天F4特異性CD4T細胞的細胞因子的產(chǎn)生。示出了對于3只小鼠的5個庫，分泌IFN-Y和/或IL-2的F3特異性CD4T細胞的百分比。示出了用F4co/佐劑B(A)、F4co/佐劑B/C7空白(B)和F4co/佐劑/C7-GRN(C)免疫的結(jié)果。F4特異性循環(huán)CD4T細胞頻率在用F4co/佐劑B組合免疫兩次后21天達2.82%,在免疫后56天降至0.91%(圖13)。兩次劑量的單獨C7-GRN病毒在最后免疫后21天產(chǎn)生0.52%的F4特異性循環(huán)CD4T細胞，佐劑B的存在不會改變此反應(yīng)。在F4co/佐劑B混合物之外，空載體C7或重組C7-GRN病毒的存在不增加或干擾F4特異性CD4T細胞反應(yīng)的頻率(最后免疫后21天分別為3.58%和2.82%)。即使不進行統(tǒng)計分析，群體分布也表明F4特異性CD4T細胞反應(yīng)的強度在F4co/佐劑B、F4co/佐劑B/C7空白和F4co/佐劑B/C7-GRN三種方法之間沒有不同(圖14)。如所預(yù)料的，給予沒有佐劑B的F4co不會誘導(dǎo)顯著的F4特異性CD4T細胞。細胞因子產(chǎn)生的曲線圖顯示，在用F4co/佐劑B免疫后，F(xiàn)4特異性CD4T細胞分泌IFN-Y和IL-2兩者。免疫方法中添加C7空白或C7-GRN不改變此曲線圖。因此，這些數(shù)據(jù)表明，在用F4co/佐劑B組合免疫后得到最高的F4特異性CD4T細胞反應(yīng)，C7-GRN病毒的存在不會改善或改變這種反應(yīng)。抗原特異性CD8T細胞反應(yīng)結(jié)果顯示在下列圖中圖16.HIV-1特異性CD8T細胞的定量。示出了在4個時間點,對于各個免疫方法，分泌IFN-Y和/或IL-2的CD3CD8T細胞的百分比。在離體條51件下，用含有F4序列的肽庫刺激外周血淋巴細胞(PBL)(2小時后添加布雷菲德菌素，然后過夜)，通過ICS測量細胞因子產(chǎn)物。每個值是3只小鼠的5個庫的幾何平均值。圖17.在兩次免疫后7天F4特異性CD8T細胞的細胞因子產(chǎn)生。示出了對于3只小鼠的5個庫，分泌IL-2和/或IFN-Y的F4特異性CD8T細胞的百分比。示出了用C7-GRN(A)、C7-GRN/佐劑B(B)和C7-GRN+F4co/佐劑B(C)免疫的結(jié)果。在一次注射后，重組載體C7-GRN誘導(dǎo)高頻率的F4特異性循環(huán)CD8T細胞(9.70%的總CD8T細胞，免疫后21天)(圖4)。第二次注射沒有加強F4特異性CD8T細胞反應(yīng)。F4co/佐劑B組合誘導(dǎo)^艮低乃至不可4企測的F4特異性CD8T細胞，添加這種組合到C7-GRN不會改善或削弱F4特異性CD8T細胞反應(yīng)。當將佐劑B添加到C7-GRN中時F4特異性CD8T細胞反應(yīng)被延遲，但是在第二次免疫后21天達到與C7-GRN單獨或C7-GRN/F4co/佐劑B組合相同的水平。C7-GRN載體單獨或與F4co/佐劑B組合注射時，F(xiàn)4特異性CD8T細胞都主要分泌IFN-y(圖17)。有趣的是，F(xiàn)4特異性CD8T細胞反應(yīng)持續(xù)到最后免疫后56天而沒有下降，這表明C7載體引起高且持久的CD8T細胞。結(jié)論F4co/佐劑B疫苗在CB6F1小鼠中誘導(dǎo)高頻率的多功能HIV特異性CD4T細胞但非HIV特異性CD8T細胞。在相同的動物模型中，表達Gag、RT和Nef的重組腺病毒C7(AdC7-GRN)誘導(dǎo)4艮高的抗原特異性CD8T細胞反應(yīng)以及^艮低乃至不可^:測的抗原特異性CD4T細胞反應(yīng)。F4/佐劑B和AdC7-GRN的組合同時引起抗原特異性的CD4和CD8T細胞兩者。F4co、佐劑B和C7-GRN三種組分的組合同時引起最高水平的抗原特異性CD4和CD8T細胞兩者。組合F4/佐劑B和AdC7-GRN對兩種細胞免疫反應(yīng)的強度具有疊加效應(yīng)。此模型中抗原特異性CD4T細胞反應(yīng)對抗原特異性CD8T細胞反應(yīng)的功能性的作用仍待測定。實施例5表達惡性癡原蟲CSP蛋白的CS2構(gòu)建體的黑猩猩腺病毒C7(C7-CS2)單獨給予時的免疫原性實驗設(shè)計用表達CSP癡疾抗原的C7黑猩猩腺病毒的劑量范圍(101Q、109&108病毒粒子)肌內(nèi)免疫CB6F1小鼠一次，在注射后21、28和35天通過ICS(胞內(nèi)細胞因子染色)測定CSP特異性(C-末端和N-末端)CD4和CD8T細胞反應(yīng)。CSP特異性CD4T細胞反應(yīng)結(jié)果顯示于下列圖中圖18.CSP特異性CD4T細胞的定量。示出了在三個時間點，對于各個方法，分泌IFN-Y和/或IL-2的CD4T細胞的百分比。在離體條件下，用含有CSPN-末端或CSPC-末端序列的肽庫刺激外周血淋巴細胞(PBL)(2小時后添加布雷菲德菌素，然后過夜)，通過ICS測量細胞因子產(chǎn)物。對C末端和N末端肽庫的反應(yīng)進行合計，每個值是4只小鼠的5個庫的幾何平均值。圖19.CSP特異性CD8T細胞的定量。示出了在三個時間點,對于各個免疫方法，分泌IFN-y和/或IL-2的CD8T細胞的百分比。在離體條件下，用含有CSPN-末端或CSPC-末端序列的肽庫刺激外周血淋巴細胞(PBL)(2小時后添加布雷菲德菌素，然后過夜)，通過ICS測量細胞因子產(chǎn)物。對C末端和N末端肽庫的反應(yīng)進行合計，每個值是4只小鼠的5個庫的幾何平均值。這些結(jié)果表明101()和109劑量的C7-CS2引起類似水平的CSP特異性CD4T細胞反應(yīng)(峰值為0.5%)和類似水平的CSP特異性CD8T細胞反應(yīng)(峰值為8%)。在隨后的實驗中選擇101Q的C7-CS2劑量，其中測試了C7-CS253與RTS,S組合的免疫原性(參見下文)。實施例6當C7-CS2與RTS，S組合給予時在CB6F1小鼠中的免疫原性實驗設(shè)計用在50pl佐劑B中的瘧疾疫苗候選物RTS,S(5昭)的組合(在下面的圖中稱為P-P-P)或在50^1佐劑B中的RTS,S(5嗎)與C7-CS2(101()病毒粒子)的組合(在下圖中稱為C-C-C)肌內(nèi)免疫CB6F1小鼠三次(第0、14、28天)。在下列時間點測定CSP特異性(C末端和N末端)CD4和CD8T細胞反應(yīng)-2次免疫后7天-3次免疫后7、21、35和49天通過ICS(胞內(nèi)細胞因子染色)測定CSP特異性T細胞反應(yīng)。還在第3次免疫后14和42天通過ELISA測定了來自免疫動物的血清中的CSP特異性抗體反應(yīng)。CSP特異性CD4T細胞反應(yīng)結(jié)果顯示在下列圖中圖20.CSP(N-末端)特異性CD4T細胞的定量。示出了在五個時間點，對于各個免疫方法，分泌IFN-y和/或IL-2的CD4T細胞的百分比。在離體條件下，用含有CSPN-末端序列的肽庫刺激外周血淋巴細胞(PBL)(2小時后添加布雷菲德菌素，然后過夜)，通過ICS測量細胞因子產(chǎn)物(IFNg和/或IL-2)。每個值是7只小鼠的4個庫的幾何平均值。圖21.CSP(C-末端)特異性CD4T細胞的定量。示出了在五個時間點，對于各個免疫方法，分泌IFN-Y和/或IL-2的CD4T細胞的百分比。在離體條件下，用含有CSPC-末端序列的肽庫刺激外周血淋巴細胞(PBL)(2小時后添加布雷菲德菌素，然后過夜)，通過ICS測量細胞因子產(chǎn)物(IFNg和/或IL-2)。每個值是7只小鼠的4個庫的幾何平均值。這些結(jié)果表明，用組合[RTS,S+C7-CS2101()+佐劑B]注射3次免疫的小鼠比用RTS,S+佐劑B注射3次免疫的小鼠展現(xiàn)出更高的抗原特異性CD4T細胞反應(yīng)(抗CSP的C-末端和N-末端部分)。CSP特異性CD8T細胞反應(yīng)結(jié)果顯示在下列圖中圖22.CSP(N-末端)特異性CD8T細胞的定量。示出了在五個時間點，對于各個免疫方法，分泌IFN-Y和/或IL-2的CD8T細胞的百分比。在離體條件下，用含有CSPN-末端序列的肽庫刺激外周血淋巴細胞(PBL)(2小時后添加布雷菲德菌素，然后過夜)，通過ICS測量細胞因子產(chǎn)物(IFNg和/或IL-2)。每個值是7只小鼠的4個庫的幾何平均值。圖23.CSP(C-末端)特異性CD8T細胞的定量。示出了在五個時間點，對于各個免疫方法，分泌IFN-Y和/或IL-2的CD8T細胞的百分比。在離體條件下，用含有CSPC-末端序列的肽庫刺激外周血淋巴細胞(PBL)(2小時后添加布雷菲德菌素，然后過夜)，通過ICS測量細胞因子產(chǎn)物(IFNg和/或IL-2)。每個值是7只小鼠的4個庫的幾何平均值。這些結(jié)果表明，用組合[RTS,S+C7-CS2101()+佐劑B]注射3次免疫的小鼠比用RTS,S+佐劑B注射3次免疫的小鼠展現(xiàn)出更高的抗原特異性CD8T細胞反應(yīng)(抗CSP的C-末端和N-末端部分)。CSP特異性抗體反應(yīng)結(jié)果顯示在下列圖中圖24.CSP特異性抗體效價的定量。在第3次免疫后14和42天收集來自小鼠的血清。通過ELISA測量這些個體中每個的抗CSP抗體效價。數(shù)據(jù)顯示為幾何平均值的抗體效價±95%置信區(qū)間。這些結(jié)果顯示，用組合[RTS,S+C7-CS2101()+佐劑B]注射3次免疫的小鼠展示出與用RTS,S+佐劑B注射3次免疫的小鼠類似的CSP特異性抗體效價。結(jié)論RTS,S/佐劑B疫苗誘導(dǎo)高頻率的CSPC-末端特異性CD4T細胞而非CSPN-末端特異性CD4T細胞。此外，RTS，S/佐劑B疫苗誘導(dǎo)很低乃至不可檢測的CSPC&N-末端特異性CD8T細胞。在相同的動物模型中，表達CSP的重組腺病毒C7誘導(dǎo)很高的CSP(C-末端和N-末端)特異性CD8T細胞反應(yīng)和較低的CSP(C-末端和N-末端)特異性CD4T細胞反應(yīng)。RTS，S/佐劑B與AdC7-CS2的組合同時引起高水平的CSP(C-末端和N-末端)特異性CD4和CD8T細胞兩者。組合RTS,S/佐劑B與AdC7-CS2對兩種T細胞反應(yīng)的強度具有疊加效應(yīng)。最后，RTS,S/佐劑B與AdC7-CS2的組合引起高水平的CSP特異性抗體反應(yīng)，與RTS，S/佐劑B誘導(dǎo)的CSP特異性抗體反應(yīng)相當。序列51015202530354045505560SEQIDNo1:ccctctactgggtt:這t:cc:cfce逸at逸c為逸tt欲t效欲g效ecc1S01效效o教seg在g改165ig撥cc:t^tacg1751改g逸欲gcatea2001scittggctgag2101cagtgg效c逸l;2151caagt孩cgoc2201ce袋改ggccgt2301g逸eog為at欲t2351c逸cct:cctct1o窮鄉(xiāng)抑冊oc2$0igc:tggg[Ca112701gtcccggccc27S1g逸狗cg9鄉(xiāng)01為ggt:atccttt1011512o:i2S13G13514014S1S"7s:isoi錢si観10011101i加1251細l1351WS124252〇(cfcgagggatgtcgcc改gatcggt:t:gt:cgaacggcac:c效c;ctetaeaetgectcctggt改c汰ggtccagetgggo翁tccccgg欲cttit紹at:ctccc:gcc逸tt:ttcc逸g逸gtgf逸ccg茲ggtgattcccctcTO逸，這ag效tctcctg改效gg為tcaagctgcc:tat:cc教g這agccggec:tgga99tg逸這e遂teat:tc:a99cccagcc^f3逸eciaaaaag99g33逸c七gg統(tǒng)s袋ggg絲at:逸c這的cttge逸taacggt瑰tc效c:統(tǒng)gctctccg為caccxcg汰etgcagagtgttga這ag汰tc在gc效t汰c汰汰cgtec弼gc汰gc逸fccgggcct:gaccttc遂逸9逸教octcgag汰aggagtc:c9敬gagccc:c:aggectgcaaggaggcc汰ggcccagc汰tttGtc;ctgac教t:gc;徵欲atgg孜gt:gcatccggtggatcattcc在tccttgcgaceggttt汰改效效ctggatt的gccccatttcagcgtcccccatotatcgt.這c汰仁g馬ctcactccggaca在絲c絲欲3ctgtcgtcsccccc:tcgcctggaca汰gctggfcgtc改c為cctctottagccac57532Wc:tgacttgatctgtgottgtt這catacttccctgac匕gacctttctgcatggga10SEGHDNo2:152025301mgarasvlsgSl1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heHisHisValAlaArg980985990GluLeuHisProGluTyrPheLysAsnCysArgProMetGlyAlaArg99510001005AlaSerValLeuSerGlyGlyGluLeuAspArgTrpGluLyslieArg101010151020LeuArgProGlyGlyLysLysLysTyrLysLeuLysHislieValTrp1025103010351040AlaSerArgGluLeuGluArgPheAlaValAsnProGlyLeuLeuGlu104510501055ThrSerGluGlyCysArgGinlieLeuGlyGinLeuGinProSerLeu訓(xùn)10651070GinThrGlySerGluGluLeuArgSerLeuTyrAsnThrValAlaThr107510801085LeuTyrCysValHisGinArglieGlulieLysAspThrLysGluAla109010951100LeuAspLySlieGluGluGluGinAsnLysSerLysLysLysAlaGin1105111011151120GinAlaAlaAlaAspThrGlyHisSerAsnGinValSerGinAsnTyr112511301135本申請中所引用的所有參考文獻，包括專利和專利申請，以全文可用的程度并入本文。整個說明書和下面的權(quán)利要求書中，除非內(nèi)容另外要求，否則詞語"包括"和變化形式如"包含"和"含有"，應(yīng)理解為包括所述的整數(shù)、步驟、整數(shù)組或步驟組，但是不排除任何其他的整數(shù)、步驟、整數(shù)組或步驟組。部分由此說明書和權(quán)利要求構(gòu)成的申請可以用作任何后續(xù)申請的優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)。該后續(xù)申請的權(quán)利要求可以涉及本文所述特征的任何特4i或組合。它們可以采取產(chǎn)品、組合物、方法或用途權(quán)利要求的形式，可以包括例如但不限于下列權(quán)利要求。權(quán)利要求1、一種引起抗病原體的免疫反應(yīng)的方法，包括給予(i)源自所述病原體的一種或多種第一免疫原性多肽；(ii)包含一種或多種異源多核苷酸的一種或多種腺病毒載體，所述一種或多種異源多核苷酸編碼源自所述病原體的一種或多種第二免疫原性多肽；和(iii)佐劑；其中所述一種或多種第一免疫原性多肽、所述一種或多種腺病毒載體和所述佐劑并行給予。2、一種引起抗病原體的免疫反應(yīng)的方法，包括給予(i)與佐劑共同配制的源自所述病原體的一種或多種第一免疫原性多肽；和(ii)包含一種或多種異源多核苷酸的一種或多種腺病毒載體，所述一種或多種異源多核苷酸編碼源自所述病原體的一種或多種第二免疫原性多肽；其中所述一種或多種免疫原性多肽和佐劑、以及一種或多種腺病毒載體并行給予。3、一種刺激哺乳動物中病原體特異性CD4+和/或CD8+T細胞和/或抗體產(chǎn)生的方法，包括給予所述哺乳動物(i)源自病原體的一種或多種第一免疫原性多肽；(ii)包含一種或多種異源多核苷酸的一種或多種腺病毒載體，所述一種或多種異源多核苦酸編碼源自所述病原體的一種或多種第二免疫原性多肽；和(iii)佐劑；其中所述一種或多種笫一免疫原性多肽、所述一種或多種腺病毒載體和所述佐劑并行給予，例如通過給藥免疫有效量的上述組合物給予。4、一種引起抗病原體的免疫反應(yīng)的方法，由下列組成(a)給予(i)源自所述病原體的一種或多種第一免疫原性多肽；(ii)包含一種或多種異源多核苷酸的一種或多種腺病毒載體，所述一種或多種異源多核苷酸編碼源自所述病原體的一種或多種第二免疫原性多肽；和(iii)佐劑；其中所述一種或多種免疫原性多肽、所述一種或多種腺病毒載體和所述佐劑并行給予；和(b)任選地重復(fù)步驟(a)。5、一種引起抗病原體的免疫反應(yīng)的方法，包括給予(i)源自所述病原體的一種或多種第一免疫原性多肽；(ii)包含一種或多種異源多核苦酸的一種或多種腺病毒載體，所述一種或多種異源多核苷酸編碼源自所述病原體的一種或多種第二免疫原性多肽；和(iii)佐劑；其中所述一種或多種第一免疫原性多肽、所述一種或多種腺病毒載體和所述佐劑并行給予；其中所述方法不包括給予任何初免劑量的免疫原性多肽或編碼免疫原性多肽的多核苷酸。6、根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其中一種或多種免疫原性多肽、一種或多種腺病毒載體和佐劑是共同配制的。7、根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的方法，其中刺激了病原體特異性的CD4+T細胞和CD8+T細胞以及抗體的產(chǎn)生。8、一種疫苗組合物，包含(i)源自病原體的一種或多種第一免疫原性多肽；(ii)包含一種或多種異源多核苦酸的一種或多種腺病毒載體，所述一種或多種異源多核苦酸編碼源自所述病原體的一種或多種第二免疫原性多肽；和(iii)佐劑。9、根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的方法或疫苗組合物，其中所述一種或多種第一免疫原性多肽的一種或多種與所述一種或多種第二免疫原性多肽的一種或多種基本上相同。10、根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的方法或疫苗組合物，其中所述一種或多種第一免疫原性多肽的一種或多種含有至少一種與所述一種或多種第二免疫原性多肽的一種或多種中所含有的抗原基本上相同的抗原。11、根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項所述的方法或疫苗組合物，其中所述一種或多種第一免疫原性多肽包含至少一個T細胞表位。12、根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項所述的方法或疫苗組合物，其中所述一種或多種第一免疫原性多肽包含至少一個B細胞表位。13、根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項所述的方法或疫苗組合物，其中所述一種或多種第一免疫原性多肽的一種或多種和所述一種或多種第二免疫原性多肽的一種或多種共有一個或多個相同的B細胞和/或T細胞表位。14、根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的方法或疫苗組合物，其中所述一種或多種第一免疫原性多肽的一種或多種中沒有一種與所述一種或多種第二免疫原性多肽的一種或多種基本上相同或與其含有任何共同抗原。15、根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項所述的方法或疫苗組合物，其中一種或多種所述腺病毒載體源自人腺病毒。16、根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法或疫苗組合物，其中所述人腺病毒血清型選自Adl、Ad2、Ad4、Ad5、Ad6、Adll、Ad24、Ad34和Ad35。17、根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項所述的方法或疫苗組合物，其中一種或多種所述腺病毒載體源自非人靈長類腺病毒。18、根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法或疫苗組合物，其中所述非人靈長類腺病毒血清型選自黑猩猩腺病毒血清型Pan5、Pan6、Pan7和Pan9。19、根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項所述的方法或疫苗組合物，其中所述病原體為HIV。20、根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法或疫苗組合物，其中所述免疫原性多肽含有HIV源抗原及其免疫原性衍生物和免疫原性片段，所述HIV源抗原選自Env、Nef、Gag和Pol。21、根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法或疫苗組合物，其中第一免疫原性多肽為p24-RT-Nef-p17。22、根據(jù)權(quán)利要求20或權(quán)利要求21所述的方法或疫苗組合物，其中第二免疫原性多肽為Gag-RT-Nef。23、根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項所述的方法或疫苗組合物，其中所述病原體為惡性癡原蟲和/或間日疾原蟲。24、根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法或疫苗組合物，其中所述免疫原性多肽含有源自惡性瘧原蟲和/或間日癡原蟲的抗原及其免疫原性衍生物或其免疫原性片段，所述抗原選自環(huán)子孢子(CS)蛋白、MSP-1、MSP-3、AMA-1、LSA畫1、LSA-3。25、根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法或疫苗組合物，其中免疫原性多肽/所述免疫原性多肽為雜合蛋白RTS。26、根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法或疫苗組合物，其中RTS以稱為RTS,S的混合粒子的形式存在。27、根據(jù)權(quán)利要求24至26中任一項所述的方法或疫苗組合物，其中由多核苷酸編碼的免疫原性多肽/所述免疫原性多肽為來自惡性癡原蟲的CS蛋白或其免疫原性片段。28、根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項所述的方法或疫苗組合物，其中所述病原體為分支結(jié)核桿菌。29、根據(jù)權(quán)利要求1至28中任一項所述的方法或疫苗組合物，其中所述佐劑包括Thl反應(yīng)的優(yōu)選刺激因子。30、根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法或疫苗組合物，其中所述佐劑包含QS21和/或3D-MPL和/或CpG。31、根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法或疫苗組合物，其中所述佐劑包含QS21和3D-MPL。32、根據(jù)權(quán)利要求1至31中任一項所述的方法或疫苗組合物，其中所述佐劑包含7jc包油乳液。33、才艮據(jù)權(quán)利要求1至31中任一項所述的方法或疫苗組合物，其中所述佐劑包含脂質(zhì)體。34、一種刺激哺乳動物中免疫反應(yīng)的方法，包括給予受試者免疫有效量的根據(jù)權(quán)利要求8至33中任一項所述的疫苗組合物。35、根據(jù)權(quán)利要求8至33中任一項所述的疫苗組合物在制備用于刺激哺乳動物免疫反應(yīng)的藥物中的用途。36、根據(jù)權(quán)利要求8至33中任一項的疫苗組合物用于刺激哺乳動物免疫反應(yīng)的用途。37、一種試劑盒，包含(i)源自病原體的一種或多種第一免疫原性多肽；(ii)包含一種或多種異源多核苷酸的一種或多種腺病毒載體，所述一種或多種異源多核苷酸編碼源自所述病原體的一種或多種第二免疫原性多肽；和(iii)佐劑。38、一種試劑盒，包含(i)源自病原體的一種或多種第一免疫原性多肽和佐劑；和(ii)包含一種或多種異源多核苦酸的一種或多種第二腺病毒載體，所述一種或多種異源多核苷酸編碼源自所述病原體的一種或多種免疫原性多肽。39、根據(jù)任何上述權(quán)利要求所述的方法、或疫苗、或試劑盒、或用途，其中所述第一免疫原性多肽包括p24-RT-Nef-pl7;所述佐劑包括脂質(zhì)體中的QS21和3D-MPL，如本文的佐劑B;所述腺病毒載體包括黑猩猩腺病毒血清型Pan7載體，所述載體包含編碼免疫原性多肽Gag-RT-Nef的多核苷酸，任選經(jīng)密碼子優(yōu)化。40、根據(jù)任何上述權(quán)利要求所述的方法、或疫苗、或試劑盒、或用途，其中所述多肽、腺病毒載體和佐劑組分中的一種、或兩種或所有與藥學(xué)上可接受的賦形劑組合。全文摘要本發(fā)明尤其涉及引起抗病原體的免疫反應(yīng)的方法，包括給予(i)源自所述病原體的一種或多種第一免疫原性多肽；(ii)包含一種或多種異源多核苷酸的一種或多種腺病毒載體，所述一種或多種異源多核苷酸編碼源自所述病原體的一種或多種第二免疫原性多肽；和(iii)佐劑；其中所述一種或多種第一免疫原性多肽、所述一種或多種腺病毒載體和所述佐劑并行給予。本發(fā)明還涉及采用所述多肽、腺病毒載體和佐劑的病毒、藥物組合物、試劑盒和用途。文檔編號C07K14/16GK101675068SQ200880014359公開日2010年3月17日申請日期2008年2月28日優(yōu)先權(quán)日2007年3月2日發(fā)明者G·H·沃斯申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司