專利名稱：用人間充質(zhì)干細(xì)胞為滋養(yǎng)層培養(yǎng)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種以人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為滋養(yǎng)層培養(yǎng)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
誘導(dǎo)多能干細(xì)胞anduced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)是近年來干細(xì)胞研究領(lǐng)域中具有里程碑意義的突破。其是通過異位表達(dá)幾個(gè)與維持胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)多潛能性相關(guān)的關(guān)鍵性核轉(zhuǎn)錄因子，使體細(xì)胞發(fā)生重編程，得到的一種類似ESCs的多潛能細(xì)胞，可以在體內(nèi)外分化為三胚層的所有組織細(xì)胞。由體細(xì)胞重編程而來的iPSCs為獲得與患者自身遺傳背景一致的多能干細(xì)胞增加了一個(gè)新途徑，且不再使用人類早期胚胎和卵母細(xì)胞，故倫理學(xué)的爭論將隨之平息，核移植技術(shù)缺乏卵母細(xì)胞和技術(shù)繁雜的窘境也得到了合理的解決。是組織工程和再生醫(yī)學(xué)、疾病模型、藥物篩選的理想種子細(xì)胞，因此具有廣闊的臨床應(yīng)用背景。目前，研究者已在體外將人iPSCs向各種組織細(xì)胞誘導(dǎo)分化，如造血干/祖細(xì)胞、紅細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、心肌細(xì)胞、胰島β細(xì)胞、肝臟細(xì)胞等； 建立了多種遺傳性疾病人iPSCs疾病模型，用于發(fā)病機(jī)制的研究，并在動(dòng)物模型上嘗試通過對有遺傳缺陷的iPSCs進(jìn)行基因改造，治療遺傳性疾??；建立多種腫瘤iPSCs疾病模型， 用于發(fā)病機(jī)制的研究和藥物篩選。人iPSCs的體外培養(yǎng)需要細(xì)胞與細(xì)胞的相互作用、各種細(xì)胞因子、基質(zhì)等來維持其自我更新和多潛能性。其經(jīng)典培養(yǎng)模式是以小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(Mouse Embryonic fibroblasts, MEF)為滋養(yǎng)層，用含bFGF、血清替代物(serum replacement, SR)的培養(yǎng)液培養(yǎng)。但是，人iPSCs進(jìn)入臨床應(yīng)用前，去除培養(yǎng)體系中異源蛋白、細(xì)胞污染是必須解決的一個(gè)問題。因此，自人iPSCs出現(xiàn)以后，研究者就開始嘗試改善其培養(yǎng)體系，在維持其自我更新和多潛能性的同時(shí)，減少異源蛋白、細(xì)胞的污染。如2010年，Christian等用永生化的人皮膚成纖維細(xì)胞作為滋養(yǎng)層，培養(yǎng)人iPSCs，發(fā)現(xiàn)這種人源化的滋養(yǎng)層可產(chǎn)生和維持人 iPSCs的培養(yǎng)，但其培養(yǎng)時(shí)間較短(報(bào)道的培養(yǎng)代數(shù)為7代)；同年，Kristiina等用一種成分明確的無異源蛋白的RegES培養(yǎng)液培養(yǎng)人iPSCs，發(fā)現(xiàn)其能長期(> 80代)維持iPSCs的自我更新和多潛能性，但是并沒有證明在重編程過程中，該培養(yǎng)液可使人體細(xì)胞重編程為 iPSCs。Ruth等用另一種成分明確的mTeSRTM培養(yǎng)液懸浮培養(yǎng)人iPSCs，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)17代后， 仍可維持其自我更新和多潛能性，但是該培養(yǎng)體系價(jià)格昂貴，且同樣沒有證明在重編程過程中，該培養(yǎng)液可使人體細(xì)胞重編程為iPSCs。因此，進(jìn)一步開發(fā)研究人iPSCs人源化的培養(yǎng)體系，包括重編程過程和維持培養(yǎng)，以及對iPSCs生物學(xué)特性的影響，是人iPSCs走向臨床應(yīng)用的重要前提。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)作為滋養(yǎng)層培養(yǎng)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)的方法，通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)(1)滋養(yǎng)層細(xì)胞的準(zhǔn)備用傳代培養(yǎng)、低溫凍存復(fù)蘇后培養(yǎng)的第三 第五代的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為滋養(yǎng)層細(xì)胞。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞采用目前常用的Ficoll-paque密度梯度離心結(jié)合貼壁篩選分離培養(yǎng)獲得。作為滋養(yǎng)層時(shí)，細(xì)胞接種到用0. l%gelatin處理后的六孔板上，細(xì)胞融合度達(dá)80%-90% (約2X 104/cm2)，并用10ug/ml的絲裂霉素C處理2小時(shí)滅活，滅活后的細(xì)胞M小時(shí)內(nèi)使用；
(2)人iPSCs的獲得取2-3歲兒童包皮成纖維細(xì)胞，用攜帶有Klf4、Sox2、0ct4和 c-Myc轉(zhuǎn)錄因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染兩次。第二天在培養(yǎng)體系中加維生素C 25ug/ml，第五天加入VPA2 μ M (共使用5天)，第六天將轉(zhuǎn)染后的成纖維細(xì)胞接種到滋養(yǎng)層細(xì)胞上，第七天， 換用含bFGF、替代血清的人ESCs培養(yǎng)液。隨后每天換液，直到出現(xiàn)類ESCs的克隆，挑選、擴(kuò)增培養(yǎng)；
(3)人iPSCs的擴(kuò)增培養(yǎng)顯微鏡下挑選類ESCs的克隆，用IV型膠原酶消化5-10分鐘后，輕輕吹散成小團(tuán)塊，接種到準(zhǔn)備好的滋養(yǎng)層細(xì)胞上。每天換液。每7-8天傳代一次。 擴(kuò)增后的細(xì)胞用機(jī)械法傳代，即用5ml的玻璃滴管將細(xì)胞從滋養(yǎng)層上輕輕刮下，隨后輕輕吹散成小團(tuán)塊，接種到準(zhǔn)備好的滋養(yǎng)層細(xì)胞上；
(4)人iPSCs的生物學(xué)特性和多潛能性的維持在以人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為滋養(yǎng)層上擴(kuò)增培養(yǎng)14代以后，用RT-PCR法鑒定擴(kuò)增培養(yǎng)后人iPSCs的ESCs特異基因表達(dá)情況；同時(shí)用EB形成法和免疫缺陷小鼠畸胎瘤形成法檢測其在體內(nèi)外是否可向三胚層分化。本發(fā)明提供了一種用人源化細(xì)胞即人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為滋養(yǎng)層獲得培養(yǎng)人 iPSCs的方法，這種人源化的滋養(yǎng)層細(xì)胞可長期維持人iPSCs的生物學(xué)特征和多潛能性；由此獲得的人iPSCs沒有異源細(xì)胞的污染，為其臨床應(yīng)用提供了可能性。本發(fā)明使用人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞代替?zhèn)鹘y(tǒng)方法中用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞作為滋養(yǎng)層細(xì)胞，培養(yǎng)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，減少了培養(yǎng)體系中異源細(xì)胞的污染，并證明了該培養(yǎng)體系可使人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在體外擴(kuò)增(見實(shí)施例4)，且維持了其生物學(xué)特性和多潛能性(見實(shí)施例5)，為人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞進(jìn)入臨床應(yīng)用提供了可能。


圖1為技術(shù)路線圖。圖2為第4代人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。A為滅活前；B為絲裂霉素C滅活后。圖3為用人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為滋養(yǎng)層獲得的人iPSCs。A為成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染 21-25天后，出現(xiàn)的肉芽腫樣克隆(標(biāo)尺為100 μ m)，B為擴(kuò)增培養(yǎng)后形成的iPSCs克隆(標(biāo)尺為100 μ m)，C為克隆局部細(xì)胞形態(tài)(標(biāo)尺為20 μ m)。圖4為第8-11代人iPSCs在以第4代人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中的生長曲線。圖5為第9、10代人iPSCs在不同供者來源第4代人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中的擴(kuò)增倍數(shù)(hMSCl和hMSC2為女性供者來源，hMSC3為男性供者來源)。圖6為RT-PCR檢測人iPS/MSC7在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中擴(kuò)增培養(yǎng)14代以后人ESCs特異基因的表達(dá)情況。圖7為人iPS/MSC7在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中擴(kuò)增培養(yǎng)14代以后在體外形成EB向三胚層分化情況。A為EB培養(yǎng)8天后形成的懸浮EB(標(biāo)尺為50 μ m);B-D為培養(yǎng)14天后EB貼壁分化成的各種類型細(xì)胞(標(biāo)尺為100 μ m) ;E為PT-PCT檢測EB 分化后多潛能基因(S0X2和0CT4)和三胚層的標(biāo)記基因(F0XA2和AFP為內(nèi)胚層標(biāo)記基因； MSXl和BRACHYURY為中胚層標(biāo)記基因；MAP2和PA)(6為外胚層標(biāo)記基因)表達(dá)情況(U表示未分化，D表示分化后)。圖8為人iPS/MSC7在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中擴(kuò)增培養(yǎng)14代以后在NOD-SCID小鼠體內(nèi)形成畸胎瘤情況。A為長出畸胎瘤的小鼠；B為畸胎瘤內(nèi)形成的腺樣組織(HE染色，標(biāo)尺為20 μ m);C為畸胎瘤內(nèi)形成的肌肉樣組織(HE染色，標(biāo)尺為20 μ m)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例1 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)、凍存復(fù)蘇 (1)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)
無菌條件下采集3份健康供者的骨髓，肝素抗凝，用Ficoll-paque (比重1. 077)密度梯度離心收集單個(gè)核細(xì)胞，以5X IO5個(gè)細(xì)胞/cm2密度接種，培養(yǎng)液為含10% (V/V)胎牛血清和1%谷氨酰胺的低糖DMEM (LG-DMEM)培養(yǎng)液，置于37%、5%0)2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。M小時(shí)后更換培養(yǎng)液，棄去非貼壁細(xì)胞，可見有梭形貼壁細(xì)胞。之后每3天換液1次，14天左右原代細(xì)胞貼壁融合達(dá)90%-95%，排列有明顯方向性，成漩渦狀、網(wǎng)狀、輻射狀(見圖2A)。用0. 25% 胰蛋白酶-1 mmol EDTA消化，按1 :3比例分瓶傳代培養(yǎng)，并標(biāo)記為Pl細(xì)胞。傳代培養(yǎng)過程中每3天換液一次，細(xì)胞達(dá)90%融合后消化傳代，并標(biāo)記為P2，以此類推。(2)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇
凍存時(shí)，將處于對數(shù)生長期的間充質(zhì)干細(xì)胞消化后，用凍存保護(hù)液(60% LG-DMEM、30% 胎牛血清、10% DMSO)重懸細(xì)胞，細(xì)胞終濃度為5 X 106/ml，分轉(zhuǎn)入凍存管內(nèi)，標(biāo)記上細(xì)胞名稱、代數(shù)、凍存時(shí)間和凍存者。立即將凍存管放入異丙醇凍存盒后，放入_80°C，過夜后移入-196 液氮罐保存。細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)，從液氮中取出細(xì)胞放入37 恒溫水浴箱快速解凍，待凍存液解凍至小冰晶后，移入超凈臺(tái)。無菌條件下，將細(xì)胞懸液移入15ml離心管，逐滴加入預(yù)冷的培養(yǎng)液10ml，200g離心5min后，棄去上清。將細(xì)胞團(tuán)塊用適量預(yù)熱培養(yǎng)液重懸培養(yǎng)。 復(fù)蘇存活細(xì)胞接種他后完全貼壁，細(xì)胞形態(tài)逐漸變成梭形。細(xì)胞經(jīng)過1-2天休眠期后開始迅速增殖。復(fù)蘇后的細(xì)胞形態(tài)與凍存前基本一致。實(shí)施例2 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為滋養(yǎng)層細(xì)胞的準(zhǔn)備
取第3-5代人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為滋養(yǎng)層的細(xì)胞。將6孔板預(yù)先用0. l%gelatin在 37°C孵育Ih到過夜。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以2X IOVcm2密度接種到gelatin處理后的六孔板上，使第二天細(xì)胞融合度達(dá)80%-90%。用10ug/ml的絲裂霉素C處理2小時(shí)滅活，滅活后的細(xì)胞形態(tài)與滅活前基本一致(見圖2)。滅活后的細(xì)胞M小時(shí)內(nèi)使用。實(shí)施例3 以人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為滋養(yǎng)層的人iPSCs的誘導(dǎo)
取第三代兒童(2-3歲)包皮成纖維細(xì)胞，用攜帶有Klf4、Sox2、0ct4和c-Myc轉(zhuǎn)錄因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染兩次。轉(zhuǎn)染結(jié)束后在培養(yǎng)體系中加維生素C 25ug/ml直到挑選克隆， 第五天加入VPA2 μΜ(共使用5天)，第六天將轉(zhuǎn)染后的成纖維細(xì)胞接種到以人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞上，第七天換用含8ng/ml的bFGF、1%谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、100 μ M 和20%替代血清的人ESCs培養(yǎng)液。隨后每天換液，直到出現(xiàn)類ESCs的克隆(見圖3Α)，邊界清楚、細(xì)胞致密。顯微鏡下逐個(gè)挑選、擴(kuò)增培養(yǎng)。技術(shù)路線見圖1
實(shí)施例4 以人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為滋養(yǎng)層的人iPSCs的擴(kuò)增培養(yǎng) (1)人iPSCs在以人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中擴(kuò)增培養(yǎng)后的細(xì)胞形態(tài)顯微鏡下挑選類ESCs的克隆，用lmg/ml的IV型膠原酶消化5_10分鐘后，輕輕吹散成小團(tuán)塊，接種到準(zhǔn)備好的滋養(yǎng)層細(xì)胞上，用人ESCs培養(yǎng)液，在37乂、5%0)2中培養(yǎng)。每天換液。iPSCs每7-8天傳代一次。擴(kuò)增后的細(xì)胞用機(jī)械法傳代，即用5ml的玻璃滴管將細(xì)胞從滋養(yǎng)層上輕輕刮下，隨后輕輕吹散成小團(tuán)塊，以1 :2-1 :3接種到準(zhǔn)備好的滋養(yǎng)層細(xì)胞上。人 iPSCs在以人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中擴(kuò)增后形成典型的人ESCs樣克隆 邊界清楚，細(xì)胞致密，大部分細(xì)胞為圓形，核仁明顯，邊界為類成纖維樣細(xì)胞(見圖3B、C)。(2)人iPSCs在以人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中的生長動(dòng)力學(xué)將第 8 代的三株人 iPSCs (iPS/MSCl、iPS/MSC7 和 iPS/MSC10)以 5X IO4 細(xì)胞 / 孔接
種(以小團(tuán)塊接種)到鋪有人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為滋養(yǎng)層的12孔板中，設(shè)三個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng) 7天后，將人iPSCs從滋養(yǎng)層上刮下，取部分計(jì)數(shù)，計(jì)算擴(kuò)增倍數(shù)；同時(shí)取其中部分接種到新的鋪有人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為滋養(yǎng)層的12孔板中，設(shè)三個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)7天，計(jì)數(shù)并計(jì)算擴(kuò)增倍數(shù)。以此類推，共培養(yǎng)三代，計(jì)算擴(kuò)增倍數(shù)。人iPSCs在以人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中可持續(xù)擴(kuò)增，平均每代擴(kuò)增2. 32士0. 05倍(見圖4)。(3)人iPSCs在不同供者來源的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中的生長情況
將第 9、10 代的三株人 iPSCs (iPS/MSCl、iPS/MSC7 禾口 iPS/MSC10)以 5 X IO4 細(xì)胞 / 孔接種(以小團(tuán)塊接種)到鋪有不同供者來源的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCl、hMSC2、hMSC3，其中hMSCl和hMSC2為女性供者，hMSC3為男性供者)為滋養(yǎng)層的12孔板中，設(shè)三個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)7天后，將人iPSCs從滋養(yǎng)層上刮下，取部分計(jì)數(shù)，計(jì)算擴(kuò)增倍數(shù)。不同供者來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)體系對人iPSCs細(xì)胞的擴(kuò)增沒有顯著差異(見圖5)。實(shí)施例5 人iPSCs在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中擴(kuò)增培養(yǎng)14代以后生物學(xué)特性和多潛能性的維持情況
(1)人iPSCs表達(dá)人ESCs特異基因情況
收集在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中擴(kuò)增培養(yǎng)14代以后的人iPSC/ MSC7細(xì)胞團(tuán)塊，用TRIZOL提取總RNA，隨后進(jìn)行RT-PCR，檢測人ESCs特異基因的表達(dá)情況包括內(nèi)源性 KLF4、S0X2、c-Myc、0CT4 以及 NANOG、DNMT3B、DPPA4、hTERT、NODAL、REX13、 TDGFl等。同時(shí)以Hl人ESCs和兒童包皮成纖維細(xì)胞為對照。檢測結(jié)果顯示這些基因在人 iPSCs中的表達(dá)水平類似于Hl人ESCs。(2)人iPSCs在體外形成EB向三胚層分化情況
在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中擴(kuò)增培養(yǎng)14代以后的人iPSC/MSC7從滋養(yǎng)層上刮下，以細(xì)胞團(tuán)塊接種在超低黏附性6孔板中，培養(yǎng)液為不含bFGF的人ESCs培養(yǎng)液，在37%、5%0)2中培養(yǎng)，隔天換液；培養(yǎng)8天后，接種到0. l%gelatin處理后的6孔板中， 繼續(xù)用不含bFGF的人ESCs培養(yǎng)液，在37%、5%0)2中貼壁培養(yǎng)8天。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示擴(kuò)增后的人iPSCs可在體外形成EB (見圖7A)，這些EB貼壁培養(yǎng)后，可分化成各種類型的細(xì)胞(見圖7B-D)。收集這些分化的細(xì)胞，用RT-PCR檢測三胚層標(biāo)記性基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示分化后的細(xì)胞三胚層標(biāo)記基因(F0XA2和AFP為內(nèi)胚層標(biāo)記基因；MSXl和BRACHYURY為中胚層標(biāo)記基因；MAP2和PAX6為外胚層標(biāo)記基因)表達(dá)明顯增加。表明在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中擴(kuò)增培養(yǎng)14代以后的人iPSCs仍維持了其多向分化潛能。
(3)人iPSCs在體內(nèi)形成畸胎瘤向三胚層分化情況
將在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中擴(kuò)增培養(yǎng)14代以后的人iPSC/MSC7 從滋養(yǎng)層上刮下，用不含鈣鎂離子的PBS緩沖液清洗兩遍，用PBS將人iPSCs重懸，取200ul 注射到NOD-SCID小鼠的后腿根部肌肉中，每個(gè)注射點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)量為2-3X106。注射后觀察成瘤情況。待畸胎瘤形成后，取出畸胎瘤行石蠟切片和HE染色，觀察其向三胚層分化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示擴(kuò)增后的人iPSCs可在免疫缺陷小鼠體內(nèi)形成畸胎瘤(見圖8A)，HE染色后見瘤內(nèi)有肌肉樣、腺樣組織形成(見圖8B、C)。表示在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為滋養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中擴(kuò)增培養(yǎng)14代以后的人iPSCs仍維持了其多向分化潛能。
權(quán)利要求
1.一種用人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為滋養(yǎng)層培養(yǎng)人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的方法，通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)(1)滋養(yǎng)層細(xì)胞的準(zhǔn)備用傳代培養(yǎng)、低溫凍存復(fù)蘇后培養(yǎng)的第三 第五代的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為滋養(yǎng)層細(xì)胞，細(xì)胞接種到用0. l%gelatin處理后的六孔板上，細(xì)胞融合度 80%-90%，并用10ug/ml的絲裂霉素C處理2小時(shí)滅活，滅活后的細(xì)胞M小時(shí)內(nèi)使用；(2)人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的獲得取2-3歲兒童包皮成纖維細(xì)胞，用攜帶有Klf4、Sox2、 0ct4和c-Myc轉(zhuǎn)錄因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染兩次，第二天在培養(yǎng)體系中加維生素C 25ug/ml, 第五天加入VPA2 μ Μ,第六天將轉(zhuǎn)染后的成纖維細(xì)胞接種到滋養(yǎng)層細(xì)胞上，第七天，換用含bFGF、替代血清的人ESCs培養(yǎng)液，隨后每天換液，直到出現(xiàn)類ESCs的克隆，挑選、擴(kuò)增培養(yǎng)；(3)人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)顯微鏡下挑選類ESCs的克隆，用IV型膠原酶消化5-10分鐘后，輕輕吹散成小團(tuán)塊，接種到準(zhǔn)備好的滋養(yǎng)層細(xì)胞上，每天換液，每7-8天傳代一次，擴(kuò)增后的細(xì)胞用機(jī)械法傳代；(4)人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的生物學(xué)特性和多潛能性的維持在以人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為滋養(yǎng)層上擴(kuò)增培養(yǎng)14代以后，用RT-PCR法鑒定擴(kuò)增培養(yǎng)后人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的ESCs 特異基因表達(dá)情況，同時(shí)用EB形成法和免疫缺陷小鼠畸胎瘤形成法檢測其在體內(nèi)外是否可向三胚層分化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為滋養(yǎng)層培養(yǎng)人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的方法，其特征在于，步驟(3)所述擴(kuò)增培養(yǎng)是用5ml的玻璃滴管將細(xì)胞從滋養(yǎng)層上輕輕刮下，隨后輕輕吹散成小團(tuán)塊，接種到準(zhǔn)備好的滋養(yǎng)層細(xì)胞上。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為滋養(yǎng)層培養(yǎng)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，用傳代培養(yǎng)、低溫凍存復(fù)蘇后培養(yǎng)的第三~第五代的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為滋養(yǎng)層細(xì)胞，從兒童包皮成纖維細(xì)胞獲得人iPSCs，經(jīng)擴(kuò)增培養(yǎng)，接種到滋養(yǎng)層細(xì)胞，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。本發(fā)明使用人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞代替?zhèn)鹘y(tǒng)方法中用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞作為滋養(yǎng)層細(xì)胞，培養(yǎng)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，減少了培養(yǎng)體系中異源細(xì)胞的污染，并證明了該培養(yǎng)體系可使人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在體外擴(kuò)增，且長期維持了人iPSCs的生物學(xué)特性和多潛能性，為人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞進(jìn)入臨床應(yīng)用提供了可能。
文檔編號(hào)C12N5/0775GK102161980SQ201110036898
公開日2011年8月24日 申請日期2011年2月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月12日
發(fā)明者張麗飛, 鄭偉燕, 黃河 申請人:浙江大學(xué)