專利名稱：定性檢測tpmt基因亞型的測序引物對及其試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及體外核酸檢測領域，尤其涉及一種在臨床樣本中區(qū)分TPMT基因中的*3A/3B/3C基因亞型的測序引物對及其試劑盒。
背景技術：
疏嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶TPMT (thiopurine S-methyltransferase, TPMT),是一種胞衆(zhòng)酶，廣泛分布于肝、腎、心、腦、肺、骨骼肌及血細胞組織中，主要催化芳香及雜環(huán)類巰基化合物的S-甲基化反應。巰嘌呤類藥物，如6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤和硫唑嘌呤，在臨床上作為抗腫瘤藥用于急性白血病的治療，或作為免疫抑制劑廣泛應用于器官移植、炎性腸病等的治療。TPMT在這類藥物的代謝過程中起著關鍵作用。巰嘌呤類藥物的療效和毒性均與患者體內(nèi)的TPMT的酶活性有關。TPMT酶活性高的患者長期服用這類藥會產(chǎn)生耐受性而且復發(fā)率很高，而TPMT酶活性低的患者服用常規(guī)劑量的巰嘌呤類藥物后會發(fā)生嚴重的造血系 統(tǒng)毒性。TPMT的酶活性與其基因多態(tài)性相關，突變導致基因編碼的蛋白水解增強、穩(wěn)定性，迄今已發(fā)現(xiàn)20余種導致酶活性降低的突變。TPMT基因突變類型在不同種族間存在顯著性差異。白種人最常見的突變類型是TPMT*3A，其次是TPMT*2和TPMT*3C，其中TPMT*2在其他人種中非常罕見。黑人中最常見的TPMT基因突變類型是TPMT*3C，其次是TPMT*3A。而亞洲人多為TPMT*3C，也檢測到TPMT*3A。據(jù)文獻顯示，在漢族人群中，TPMT*3C是目前唯一被發(fā)現(xiàn)的突變型等位基因，且均為雜合子，突變頻率約為I. 3%，這與日本人分布特征相似(亦僅發(fā)現(xiàn)TPMT*3C，等位基因頻率I. 60%)。通過對患者基因分型檢測，判定患者的TPMT酶活性，從而幫助醫(yī)生正確選擇藥物并合理調(diào)整藥物劑量，提高藥物使用有效性，并降低毒副作用。焦磷酸測序技術是近年來發(fā)展起來的新一代DNA序列分析技術，它通過核苷酸和模板結(jié)合后釋放的焦磷酸引發(fā)酶級聯(lián)反應，促使熒光素發(fā)光并進行檢測，既可進行DNA序列分析，又可進行基于序列分析的單核苷酸多態(tài)性檢測及等位基因頻率測定，突變檢測，缺失和插入分析，CpG島甲基化分析，細菌、病毒鑒定和分型，耐藥性分析等，是一個理想的遺傳分析技術平臺。焦磷酸測序技術是由4種酶催化的同一反應體系中的酶級聯(lián)化學發(fā)光反應。其技術原理是引物與模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATPsulfurytase).突光素酶(Iuciferase)和三磷酸腺苷雙磷酸酶(Apyrase) 4種酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個dNTP的聚合與一次熒光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測熒光的釋放和強度，達到實時測定DNA序列的目的。目前市場上還沒有利用焦磷酸技術進行TPMT基因分型的產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種特異性高、準確性好、能夠定性檢測TPMT*3A/3B/3C基因亞型的測序引物對及其試劑盒。為了達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案一種檢測TPMT基因亞型的測序引物對，所述引物對為如下引物TPMT 460 正向擴增引物5' -CAGCAGAGGGGACATGAAAT-3' (SEQ ID NO. I)；TPMT 460 反向擴增引物5' -CTTTGGAATGGCACAGGGTAC-3' (SEQ ID NO. 2)TPMT 460 測序引物5' -CTTCAAGGTGTAAAATGC-3' (SEQ ID NO. 3)TPMT 719 正向擴增引物5' -TGAAAGTGAACTCCCTGCTACC-3' (SEQ ID NO. 4)TPMT 719 反向擴增引物5' -TCCACTGGGATCAACAGTATCTT-3' (SEQ ID NO. 5) TPMT 719 測序引物5' -CGCCCTCTCCTACTTA-3' (SEQ IDN0. 6)其中，TPMT460 反向擴增引物(SEQ ID NO. 2)和 TPMT 719 (SEQ ID NO. 6)反向擴增引物的5'端分別進行生物素標記。一種定性檢測TPMT基因亞型的測序試劑盒，所述試劑盒包括含有SEQ ID NO. I所示正向擴增引物的PCR反應液1，含有SEQ IDN0. 4所示正向擴增引物的PCR反應液2，SEQID NO. 2和SEQ ID NO. 5所示的反向擴增引物，SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 6所示的測序引物；其中，SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 5所示引物的5’端進行生物素標記。進一步地，所述試劑盒中還包括質(zhì)控品TAYGGTTTGCA (SEQ ID NO. 7) (controloligo)和作為空白對照品的超純水；質(zhì)控序列是由QIAGEN設計合成的一段寡聚核苷酸鏈，用于檢測PyroMark Q24測序儀的各項性能指標。進一步地，所述試劑盒還包括TPMT 460陽性對照品1，TPMT 460陽性對照品2，TPMT 460陽性對照品3 ；TPMT 719陽性對照品I，TPMT 719陽性對照品2，TPMT 719陽性對照品3 ;所述TPMT 460陽性對照品I為插有SEQ ID NO. 8所示核苷酸序列的TPMT460野生純合子質(zhì)粒；所述TPMT 460陽性對照品2為插有SEQ ID NO. 9所示核苷酸序列的TPMT460突變純合子質(zhì)粒；TPMT 460陽性對照品3為由所述TPMT 460突變純合子質(zhì)粒和所述TPMT 460野生純合子質(zhì)粒組成的TPMT 460質(zhì)?；旌衔?；所述TPMT 719陽性對照品I為插有SEQ ID NO. 10所示核苷酸序列的TPMT719野生純合子質(zhì)粒；TPMT 719陽性對照品2為插有SEQ ID NO. 11所示核苷酸序列的TPMT 719突變純合子質(zhì)粒；TPMT 719陽性對照品3為由所述TPMT 719突變純合子質(zhì)粒和所述TPMT719野生純合子質(zhì)粒組成的TPMT 719質(zhì)?；旌衔?；其中，質(zhì)粒載體為pMD18-T質(zhì)粒；所述TPMT 460質(zhì)?；旌衔镏蠺PMT 460突變純合子質(zhì)粒和所述TPMT 460野生純合子質(zhì)粒的數(shù)量比為I: I ;所述TPMT719質(zhì)?；旌衔镏蠺PMT719突變純合子質(zhì)粒和所述TPMT 719野生純合子質(zhì)粒的數(shù)量比為1:1。所述的PCR反應液I和PCR反應液2中其他組分為常規(guī)的IOxPCR Buffer、dNTP和H2O,各組分按常規(guī)體積比配置(IOxPCR Buffer、dNTP、H2O和反應液中引物的體積比為5:3:37. 5:1)。試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測序的常規(guī)試劑，如由DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶組成的酶混合物，由5’-磷酰硫酸和熒光素組成的底物混合物，尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶等。本發(fā)明的優(yōu)點及有益效果
I)本發(fā)明提供的定量檢測TPMT基因亞型的焦磷酸測序試劑盒定性準確，具有靈敏性高、特異性強的優(yōu)點，樣品處理簡單，測序速度快，高通量，半個小時完成一次上機反應，直接給出檢測位點頻率分析，結(jié)果直觀。2)本發(fā)明提供的定量檢測TPMT基因亞型的焦磷酸測序試劑盒靈敏度和特異性聞;3)本發(fā)明提供的定量檢測TPMT基因亞型的焦磷酸測序試劑盒檢測速度快；4)本發(fā)明提供的定量檢測TPMT基因亞型的焦磷酸測序試劑盒步驟簡單；5)本發(fā)明提供的定量檢測TPMT基因亞型的焦磷酸測序試劑盒可同時進行高通量的樣本檢測。6)本發(fā)明的試劑盒中設置了空白對照和陽性對照，能更好的確保檢測結(jié)果的準確·性。由于設計了靈敏度高，特異性好的引物，并且選擇了合適的方法，本發(fā)明的試劑盒能夠?qū)PMT基因亞型進行快速檢測。本發(fā)明的試劑盒可實時監(jiān)測反應進程，反應時間短，PCR產(chǎn)物簡單處理即可上焦磷酸測序儀測序，操作簡便，反應時間短，高通量，比金標準——毛細管電泳測序靈敏度高，更適合用于突變分析。


圖I為臨床TPMT 460野生純合子的焦磷酸測序圖；圖2為臨床TPMT 719雜合子的焦磷酸測序圖；圖3為臨床質(zhì)控品control oligo的焦磷酸測序圖；圖4為臨床空白對照的焦磷酸測序圖。圖5多組設計引物的凝膠電泳圖；圖中①、②表明非特異性條帶，③表明特異性和片段大小均比較合適，④表明目的帶片段大小不對。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，下面結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步的詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實施例I :試劑盒的制備I.引物和探針的設計與合成使用PyroMark Assay Design2. O軟件，針對TPMT的7號外顯子和10號外顯子以及中間的內(nèi)含子區(qū)域，研究表明漢族人中目前針對TPMT基因分型主要集中在*3A/3B/3C中(William ZF et al. J Gastrointestin Liver Dis. 2011;20(3). 247-253. Shuta U etal. Pharmacogenetics and Genomics. 2008;18. 887-893. William EE et al. Journal ofClinical Oncology. 2001;19(8). 2293-2301. Oreste E et al. Pharmacogenetics and
Genomics. 2005; 15. 801-815.)，選擇特異的突變位點-TPMT G460A、A719G，其中擴增引
物和測序引物先經(jīng)過PAGE純化，再經(jīng)HPLC純化，其中擴增引物其中一條在5’端加上生物
^己O擴增序列如表I :
表I.特異性擴增引物與測序引物序列
權利要求
1.一種定性檢測TPMT基因分型的測序引物對，其特征在于，所述引物對為SEQ IDNO. I和SEQ ID NO. 4所示的正向擴增引物，SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 5所示的反向擴增引物，SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 6 所示的測序引物；其中，SEQ ID NO. I 和 SEQ ID NO. 5 PJf示引物的5’端進行生物素標記。
2.一種定性檢測TPMT基因分型的測序試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括含有SEQID NO. I所示正向擴增引物的PCR反應液1，含有SEQ ID NO. 4所示正向擴增引物的PCR反應液2，SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 5所示的反向擴增引物，SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 6所示的測序引物；其中，SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 5所示引物的5’端進行生物素標記。
3.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括SEQID NO. 7所示的質(zhì)控品和空白對照品。
4 權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述空白對照品為水。
5.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括TPMT460陽性對照品1，TPMT 460陽性對照品2，TPMT 460陽性對照品3 ；TPMT 719陽性對照品1，TPMT719陽性對照品2，TPMT 719陽性對照品3 ； 所述TPMT 460陽性對照品I為插有SEQ ID NO. 8所示核苷酸序列的TPMT 460野生純合子質(zhì)粒；所述TPMT 460陽性對照品2為插有SEQ ID NO. 9所示核苷酸序列的TPMT460突變純合子質(zhì)粒；TPMT 460陽性對照品3為由所述TPMT 460突變純合子質(zhì)粒和所述TPMT460野生純合子質(zhì)粒組成的TPMT 460質(zhì)粒混合物； 所述TPMT 719陽性對照品I為插有SEQ ID NO. 10所示核苷酸序列的TPMT 719野生純合子質(zhì)粒；TPMT 719陽性對照品2為插有SEQ ID NO. 11所示核苷酸序列的TPMT 719突變純合子質(zhì)粒；TPMT 719陽性對照品3為由所述TPMT 719突變純合子質(zhì)粒和所述TPMT 719野生純合子質(zhì)粒組成的TPMT 719質(zhì)粒混合物； 其中，質(zhì)粒載體為PMD18-T質(zhì)粒。
6.如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述TPMT460質(zhì)?；旌衔镏蠺PMT 460突變純合子質(zhì)粒和所述TPMT 460野生純合子質(zhì)粒的數(shù)量比為1:1。
7.如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述TPMT719質(zhì)?；旌衔镏蠺PMT 719突變純合子質(zhì)粒和所述TPMT 719野生純合子質(zhì)粒的數(shù)量比為1:1。
全文摘要
本發(fā)明提供一種定性檢測TPMT基因亞型的測序引物對及其試劑盒，屬于體外核酸檢測領域，所述試劑盒包括尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶、PCR反應液、PCR擴增引物、焦磷酸測序引物、以及對照品；本發(fā)明提供的試劑盒靈敏度高，特異性好，PCR產(chǎn)物簡單處理即可上焦磷酸測序儀測序，操作簡便，反應時間短，比金標準——毛細管電泳測序靈敏度高，更適合用于SNP分析。
文檔編號C12Q1/68GK102899407SQ20121034832
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月19日 優(yōu)先權日2012年9月19日
發(fā)明者陳艷 申請人:長沙三濟生物科技有限公司