專利名稱：一種菊屬及其近緣種屬通用的ssr標(biāo)記pcr反應(yīng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種菊屬及其近緣種屬通用的SSR標(biāo)記PCR反應(yīng)方法。
背景技術(shù)：
聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一 DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍，使肉眼能直接觀察和判斷。PCR五因素引物、TaqDNA聚合酶、dNTP、DNA模板和Mg2+。
PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成①模板DNA的變性模板DNA經(jīng)加熱至93°C左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55°C左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；③引物的延伸DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2 4分鐘，2 3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。SSR標(biāo)記是一類重要的分子標(biāo)記，應(yīng)用于植物的育種、品種鑒定等領(lǐng)域，SSR標(biāo)記的開發(fā)與利用需要一個(gè)靈敏度高，準(zhǔn)確性好的PCR反應(yīng)方法。而目前在菊屬及其近緣種屬(菊屬、亞菊屬、太行菊屬、芙蓉菊屬)尚未研究出高效、通用性強(qiáng)的SSR標(biāo)記的PCR反應(yīng)方法。

發(fā)明內(nèi)容
為填補(bǔ)在菊屬、亞菊屬，太行菊屬、芙蓉菊屬的野生種和品種之間沒有通用的SSR標(biāo)記PCR反應(yīng)方法的空白，本發(fā)明的目的是提供一種菊屬及其近緣種屬通用的SSR標(biāo)記PCR反應(yīng)方法。本發(fā)明提供的菊屬及其近緣種屬通用的SSR標(biāo)記PCR反應(yīng)方法，其PCR反應(yīng)體系
如下引物濃度0.32 μ M/μ I Taq 晦濃度0.211/μΙ dNTP 濃度0.4 μ M/ μ I Mg2+的濃度0.65 μ M/μ I DNA樣品的濃度2~4ng/ μ I 反應(yīng)體系總體積為25 μ I,其中，所述引物可選自以下2對(duì)引物中的任意一對(duì)SSR標(biāo)記LHJ-I弓丨物序列上游引物5’-ATGGTGGTGGTAGCTGGGT-3’(如 SEQ ID NO. I 所示)下游引物5’-GAGATCGGAGGGTGCGTG-3’(如 SEQ ID NO. 2 所示)SSR標(biāo)記ΥΗ-2弓丨物序列上游引物5’-TTCGACGGGTGGTGGTGTT-3’(如 SEQ ID NO. 3 所示)下游引物5’-GACACCACAACGCTACCGC-3’(如 SEQ ID NO. 4 所示)其中，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min ;94°C變性 O. 5min，50_62°C復(fù)性 O. 5min，72°C延伸lmin, 30個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min 。本發(fā)明還提供所述菊屬及其近緣種屬通用的SSR標(biāo)記PCR反應(yīng)方法在菊屬、亞菊屬、太行菊屬、芙蓉菊屬的野生種和品種中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的菊屬及其近緣種屬通用的SSR標(biāo)記PCR反應(yīng)方法具有如下優(yōu)點(diǎn)I、本發(fā)明填補(bǔ)了在菊屬，亞菊屬，太行菊屬，芙蓉菊屬的野生種和品種之間缺少通用的SSR標(biāo)記PCR反應(yīng)方法的空白。2、本發(fā)明的SSR標(biāo)記PCR反應(yīng)方法靈敏度高，重復(fù)性好，易于操作，而且通用性好。3、有利于菊屬，亞菊屬，太行菊屬，芙蓉菊屬SSR標(biāo)記的開發(fā)和利用，推動(dòng)菊屬及近緣種屬的新品種培育和商品花卉生產(chǎn)。


圖I為本發(fā)明方法所做菊屬品種和野生種的SSR標(biāo)記PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖。圖2為本發(fā)明方法所做亞菊屬、太行菊屬、芙蓉菊屬及菊屬野生種的SSR標(biāo)記PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖。其中，圖I中PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳條帶序號(hào)代表的種類依次是1野菊、2甘菊、3甘野菊、4毛華菊、5小紅菊、6菊花腦、7紫花野菊、8神農(nóng)香菊、9陽光小菊、10繁白露、11四季黃、12香玉、13上海小菊、14夏菊、15國慶紅、16玉人面、17神馬、18帥旗、19粉玉卷簾、20金葵臺(tái)、21精興將軍。圖2中PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳條帶序號(hào)代表的種類依次是I亞菊、2磯菊、3灌木亞菊、4細(xì)裂亞菊、5異色亞菊、6柳葉亞菊、7太行菊、8長裂太行菊、9芙蓉菊、10甘野菊、11毛華菊。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中，菊屬及近緣種屬植物材料均取自北京林業(yè)大學(xué)種質(zhì)資源圃，DNA樣品的提取采用天根生化科技(北京)有限公司DNA提取試劑盒完成，所用的Tag酶、dNTP和MgCl2是由Promega公司生產(chǎn)的，SSR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。實(shí)施例I本發(fā)明菊屬及其近緣種屬通用的SSR標(biāo)記PCR反應(yīng)方法的建立(I)提取了菊屬、亞菊屬、太行菊屬、芙蓉菊屬內(nèi)常用的野生種及其栽培品種的DNA樣品。菊屬野生種類有野菊，甘菊，甘野菊，毛華菊，小紅菊，菊花腦，紫花野菊，神農(nóng)香菊。菊屬栽培種類中小菊品種有陽光小菊(盆栽小菊)，繁白露(北方地被小菊)，四季黃(北方地被小菊)，香玉(切花小菊)，上海小菊(南方地被小菊)，夏菊(夏季開花種類)，國慶紅(南方地被小菊)，玉人面(茶用菊品種);菊屬栽培種類中大菊有神馬(重要切花菊品種)，帥旗(中國傳統(tǒng)大菊品種)，粉玉卷簾(中國傳統(tǒng)大菊品種)，金葵臺(tái)(中國傳統(tǒng)大菊品種)，精興將軍(日本大菊品種);亞菊屬種類亞菊，磯菊(原產(chǎn)日本)，灌木亞菊，細(xì)裂亞菊，異色亞菊，柳葉亞菊；太行菊屬太行菊，長裂太行菊(此屬為中國特有，僅此兩種);芙蓉菊屬芙蓉菊(僅此一種，特產(chǎn)我國)。(2)經(jīng)過大量的預(yù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)了 25 μ I體系PCR五因素4水平正交試驗(yàn)Taq 酶(5υ/μ I) :0. 25 μ 1,0. 5μ 1,0. 75 μ I, I. 0μ I ；dNTP (20 μ M/μ I) 0. 25 μ 1,0. 5μ 1,0. 75 μ I, I. 0μ I ；Mg2+ (6. 5 μ M/μ I ) I. 5 μ 1, 2. O μ 1, 2. 5 μ 1, 3. O μ I ；引物(ΙΟμΜ/L):0· 2μ 1，0· 4μ 1，0· 6μ 1，0· 8μ I ;DNA 樣品(50ng/y I) :0. 5 μ 1，I. O μ 1，I. 5 μ 1，2· O μ I根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理得到16個(gè)不同的反應(yīng)體系，見表I。表IPCR反應(yīng)體系1-1權(quán)利要求
1.一種菊屬及其近緣種屬通用的SSR標(biāo)記PCR反應(yīng)方法，其特征在于，PCR反應(yīng)體系如下引物濃度0.32 μ M/μ I Taq 酶濃度0.2υ/μ1dNTP 濃度0.4 μ M/μ IMg2+的濃度0.65 μ M/μ I DNA樣品的濃度2 4ng/ μ I 反應(yīng)體系總體積為25 μ I.
2.如權(quán)利要求I所述的菊屬及其近緣種屬通用的SSR標(biāo)記PCR反應(yīng)方法，其特征在于，弓丨物為SSR標(biāo)記LHJ-I引物序列 上游引物5’ -ATGGTGGTGGTAGCTGGGT-3’ 下游引物5’ -GAGATCGGAGGGTGCGTG-3'。
3.如權(quán)利要求I所述的菊屬及其近緣種屬通用的SSR標(biāo)記PCR反應(yīng)方法，其特征在于，弓丨物為SSR標(biāo)記ΥΗ-2引物序列 上游引物5’ -TTCGACGGGTGGTGGTGTT-3’ 下游引物5’ -GACACCACAACGCTACCGC-3’。
4.如權(quán)利要求I所述的菊屬及其近緣種屬通用的SSR標(biāo)記PCR反應(yīng)方法，其特征在于，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 O. 5min，50-62°C 復(fù)性 O. 5min，72°C 延伸 lmin,30個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的菊屬及其近緣種屬通用的SSR標(biāo)記PCR反應(yīng)方法在菊屬、亞菊屬、太行菊屬、芙蓉菊屬的野生種和品種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種菊屬及其近緣種屬通用的SSR標(biāo)記PCR反應(yīng)方法，其PCR反應(yīng)體系中，引物濃度為0.32μM/μl，Taq酶濃度為0.2U/μl，dNTP濃度為0.4μM/μl，Mg2+的濃度為0.65μM/μl，DNA的濃度為2~4ng/μl。應(yīng)用本發(fā)明所用的方法進(jìn)行SSR分子標(biāo)記PCR反應(yīng)，所得到的條帶清晰、多態(tài)性好、重復(fù)性高，而且操作簡單，在菊屬、亞菊屬、太行菊屬、芙蓉菊屬的野生種和品種間通用，應(yīng)用前景十分廣闊。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102876790SQ20121034831
公開日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月18日
發(fā)明者張啟翔, 劉華, 孫明, 程堂仁, 王佳, 潘會(huì)堂 申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué)