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快速檢測和鑒定生物物體的方法

文檔序號:413429閱讀:392來源:國知局
專利名稱:快速檢測和鑒定生物物體的方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及快速檢測和鑒定環(huán)境、臨床或其它樣品中的生物體的方法。該方法提供了檢測和特征分析任何生物體,包括細(xì)菌和病毒的獨(dú)特堿基組合簽名(BCS)。這種獨(dú)特的BCS可用于快速鑒定該生物體。
背景技術(shù)
快速和明確的微生物鑒定對各種工業(yè)、醫(yī)學(xué)、環(huán)境、質(zhì)量和研究原因是需要的。傳統(tǒng)上,微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的功能是通過直接檢查和培養(yǎng)樣品來鑒定傳染性疾病的病原體。自從1980年代中期以來研究者們反復(fù)證明了分子生物學(xué)技術(shù)在實(shí)踐上的用途,許多這些技術(shù)形成了臨床診斷試驗(yàn)的基礎(chǔ)。這些技術(shù)中的一些包括核酸雜交分析、限制性酶分析、遺傳序列分析和核酸的分離及純化(參見,如J. Sambrook, E. F. Fritsch和T. Maniatis,分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊,第二版,冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社,冷泉港,紐約,1989)。這些方法一般費(fèi)時(shí)且冗長。另一選擇是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR),或其它擴(kuò)增方法,根據(jù)所用側(cè)翼引物擴(kuò)增特異性靶DNA序列。最后,檢測和數(shù)據(jù)分析可將雜交轉(zhuǎn)換成分析結(jié)果。其它檢測生物體的技術(shù)包括高分辨率質(zhì)譜(MS)、低分辨率MS、熒光、放射性碘化、DNA芯片和抗體技術(shù)。這些技術(shù)中沒有一個(gè)是完全令人滿意的。質(zhì)譜提供了被分析分子的詳細(xì)信息,包括很高的質(zhì)量準(zhǔn)確性。它也是一種可容易地自動化的方法。然而,高分辨率MS單獨(dú)不能用來對未知的或生物工程改造的生物體進(jìn)行分析,或運(yùn)用于存在高背景水平生物體(“混亂的”背景)的環(huán)境中。低分辨率MS不能檢測某些已知的生物體,如果它們的光譜線足夠弱或足夠接近樣品中其它活生物體的光譜線。具有特異性探針的DNA芯片只能夠測定具體的預(yù)計(jì)的生物體的存在與否。因?yàn)橛袔资f種良性細(xì)菌,一些細(xì)菌在序列上十分類似于有威肋的細(xì)菌,即使有10,000個(gè)探針的芯片陳列仍缺乏檢測具體生物體所需的寬度??贵w面對的多樣性限制比陳列更嚴(yán)峻。如果抗體設(shè)計(jì)是針對高度保守的靶子以提高多樣性,假報(bào)警問題就會是主要問題,還是因?yàn)槲kU(xiǎn)生物體十分類似于良性生物體??贵w只能檢測相對不混亂環(huán)境中的已知生物體。一些研究中組報(bào)道了用高分辨率電噴射離子化-傅立葉變換-離子回旋共振質(zhì)譜法(ESI-FT-ICR MS)檢測PCR產(chǎn)物。準(zhǔn)確測定確切的質(zhì)量與至少一種核苷的數(shù)量的知識相結(jié)合,可計(jì)算出大約100個(gè)堿基對的PCR雙鏈體產(chǎn)物的總堿基組成。(Aaserud等.,J. Am. Soc. Mass Spec. 7 :1266-1269,1966 ;Muddiman 等·,Anal. Chem. 69 :1543-1549,1997 ;Wunschel 等.,Anal. Chem. 70 :1203-1207,1998 ;Muddiman 等.,Rev.Anal. Chem. 17 :1-68,1998)。電噴射離子化-傅立葉變換-離子回旋共振(ESI-FT-ICr)MS可通過平均分子質(zhì)量來確定500喊基對雙鏈體,PCR產(chǎn)物的質(zhì)量(Hurst等.,Rapid Commun. Mass. Spec. 10 377-382,1996)。已報(bào)道了采用基質(zhì)-輔助的激光解吸離子化飛行時(shí)間(MALDI-T0F)質(zhì)譜來特征鑒定 PCR 產(chǎn)物。(Muddiman 等.,Rapid Commun. Mass. Spec. 13 :1201-1204,1999)。然而,用MALDI只能觀察75個(gè)核苷以上的DNA的降解限制了此方法的應(yīng)用。
美國專利5,849,492描述了挽回系統(tǒng)發(fā)育信息DNA序列的方法,包括搜索兩個(gè)高度保守片斷包圍的基因組DNA的高度趨異區(qū)段,設(shè)計(jì)了用PCR擴(kuò)增此高度趨異區(qū)域的通用引物,用此通用引物經(jīng)PCR技術(shù)擴(kuò)增該基因組DNA,然后測是比基因序列以確定該生物體的身份。美國專利5,965,363公開了用質(zhì)譜技術(shù)分析擴(kuò)增的靶核酸來篩檢核酸多態(tài)性的方法,和提高這些方法的質(zhì)量分辨率及質(zhì)量準(zhǔn)確性的方法。WO 99/14375描述了通過質(zhì)譜分析預(yù)選的DNA串聯(lián)核苷酸重復(fù)等位基因所用的方法、PCR引物和試劑盒。WO 98/12355公開了通過質(zhì)譜分析測定靶核酸的質(zhì)量的方法,通過切割靶核酸以減少其長度,產(chǎn)生靶單鏈并用MS測定單鏈變短的靶子的質(zhì)量。還公開了制備用于MS分析的雙鏈靶核酸的方法,包括擴(kuò)增靶核酸,使一條鏈結(jié)合于固相載體,釋放第二條鏈,并隨后釋放第一條鏈,接著用MS分析。也提供了制備靶核酸的試劑盒。PCT WO 97/33000公開了檢測靶核酸中突變的方法,通過使靶子非隨機(jī)斷裂成一組單鏈非隨機(jī)長度的片斷,并用MS測定它們的質(zhì)量。美國專利5,605,798報(bào)道了快速和高度準(zhǔn)確的以質(zhì)譜儀為基礎(chǔ)的方法,檢測生物樣品中特定核酸的存在用于診斷目的。WO 98/21066描述了通過質(zhì)譜測定特定靶核酸序列的方法。公開了用PCR擴(kuò)增和質(zhì)譜檢測來檢測生物樣品中靶核酸存在的方法,也報(bào)道了通過用含有限制性酶切位點(diǎn)和標(biāo)記的引物擴(kuò)增樣品中的靶子,延伸和切割擴(kuò)增的核酸,并檢測延伸產(chǎn)物的存在來檢測靶核酸的方法,其中存在不同于野生型質(zhì)量的DNA片斷表明有突變。通過質(zhì)譜方法測定核酸序列的方法也有報(bào)道。WO 97/3704UW0 99/31278和美國專利5,547,835描述了用質(zhì)譜測定核酸序列的方法。美國專利5,622,824,5, 872,003和5,691,141描述了用于外切核酸酶_介導(dǎo)的質(zhì)譜測序的方法、系統(tǒng)和試劑盒。因此,需要一種特異和快速的生物體檢測和鑒定的方法,其中不需要給核酸測序。本發(fā)明符合此需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是一種鑒定未知生物體的方法,該方法包括(a)使該生物體的核酸接觸至少一對寡核苷酸引物,此引物能與該核酸序列雜交并側(cè)接有一可變的核酸序列;(b)擴(kuò)增此可變的核酸序列產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物;(c)測定此擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量;(d)將此分子量與在多種已知生物體上進(jìn)行步驟(a)-(c)所獲得的一種或多種擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量相比較,其中一種匹配可鑒定該未知的生物體。在此優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面,能與至少一對寡核苷酸引物雜交的序列高度保守。優(yōu)選擴(kuò)增步驟包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)?;蛘?,擴(kuò)增步驟包括連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或鏈置換擴(kuò)增。在此優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面,生物體是細(xì)菌、病毒、細(xì)胞或孢子。有利的是此核酸是核糖體RNA。在另一方面,此核酸編碼RNA酶P或RNA-依賴的RNA聚合酶。優(yōu)選擴(kuò)增產(chǎn)物在分子量測定前離子化。該方法還可包括在使該核酸接觸至少一對寡核苷酸引物前,從生物體中分離得到核酸的步驟。該方法還可包括使用一對不同的寡核苷酸引物進(jìn)行步驟(a)-(d)的步驟,并將結(jié)果與在步驟d)的不同的多種已知生物體上進(jìn)行步驟(a)-(c)獲得的一種或多種擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量相比較。優(yōu)選一種或多種分子量包含在分子量數(shù)據(jù)庫中。在此優(yōu)選實(shí)施方案的另一個(gè)方面,擴(kuò)增產(chǎn)物通過電噴射離子化、基質(zhì)-輔助的激光解吸或快速原子轟擊而離子化。有利的是,分子量通過質(zhì)譜測定。優(yōu)選質(zhì)譜是傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜法(FT-ICR-MS)、離子陷阱、四極、磁扇面、飛行時(shí)間(TOF)、Q-T0F或三重四極。該方法還可包括在存在具有與腺苷、胸苷、鳥苷或胞苷不同的分子量的腺嘌呤、胸苷、鳥苷或胞苷類似物時(shí)進(jìn)行步驟(b)。在一方面,互寡核苷酸引物在引物中各個(gè)三聯(lián)體位置I和2上含有堿基類似物或替換堿基,其中此堿基類似物或替換堿基能以比天然堿基更高的親和力與其互補(bǔ)物相結(jié)合。優(yōu)選該引物在引物中各個(gè)三聯(lián)體位置3上含有通用堿基。此堿基類似物或替換堿基可以是2,6_ 二氨基嘌呤、丙炔T、丙炔G、吩嗪或G-夾子。優(yōu)選此通用堿基是肌苷、胍、尿苷、5-硝基吲哚、3-硝基吡咯、dP或dK或1-(2-脫·氧-β -D-呋喃核糖)-咪唑-4-酰胺。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案是一種鑒定未知生物體的方法,該方法包括(a)使該生物體的核酸接觸至少一對寡核苷酸引物,此引物能與該核酸序列雜交并側(cè)接有一可變的核酸序列;(b)擴(kuò)增此可變的核酸序列產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物;(c)測定擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基組成;(d)將此堿基組成與在多種已知生物體上進(jìn)行步驟(a)-(c)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的一種或種種堿基組成相比較,其中一種匹配可鑒定該未知生物體。在此優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面,能與至少一對寡核苷酸引物雜交的序列高度保守。優(yōu)選擴(kuò)增步驟包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。或者,擴(kuò)增步驟包括連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或鏈置換擴(kuò)增。在此優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面,生物體是細(xì)菌、病毒、細(xì)胞或孢子。有利的是,此核酸是核糖體RNA。在另一方面,此核酸編碼RNA酶P或RNA-依賴的RNA聚合酶。優(yōu)選擴(kuò)增產(chǎn)物在分子量測定前離子化。該方法還可包括在使該核酸接觸至少一對寡核苷酸引物前,從生物體中分離得到核酸的步驟。該方法還可包括使用一對不同的寡核苷酸引物進(jìn)行步驟(a)-(d)的步驟,并將結(jié)果與在步驟d)的不同的多種已知生物體上進(jìn)行步驟(a)-(c)獲得的一種或多種擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基組成相比較。優(yōu)選一種或多種堿基組成包含在堿基組成數(shù)據(jù)庫中。在此優(yōu)選實(shí)施方案的另一個(gè)方面,擴(kuò)增產(chǎn)物通過電噴射離子化、基質(zhì)一輔助的激光解吸或快速原子轟擊而離子化。有利的是,分子量通過質(zhì)譜測定。優(yōu)選質(zhì)譜是傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜法(FT-ICR-MS)、離子陷阱、四極、磁扇面、飛行時(shí)間(TOF)、Q-T0F或三重四極。該方法可進(jìn)一步包括在存在具有與腺苷、胸苷、鳥苷或胞苷不同的分子量的腺嘌呤、胸苷、鳥苷或胞苷類似物時(shí)進(jìn)行步驟(b)。在一方面此寡核苷酸引物在引物中各個(gè)三聯(lián)體位置I和2上含有堿基類似物或替換堿基,其中此堿基類似物或替換堿基能以比天然堿基更高親和力與和其互補(bǔ)物相結(jié)合。優(yōu)選該引物在引物中各個(gè)三聯(lián)體位置3上含有通用堿基。此堿基類似物或替換堿基可以是2,6_ 二氨基嘌呤、丙炔T、丙炔G、吩嗪或G-夾子。優(yōu)選此通用堿基是肌苷、胍、尿苷、5-硝基吲哚、3-硝基吡咯、dP或dK獲I-(2-脫氧-β -D-呋喃核糖)-咪唑-4-酰胺。本發(fā)明也提供檢測個(gè)體中單個(gè)核苷多態(tài)性的方法,該方法包括以下步驟(a)分離個(gè)體的核酸;(b)使該核酸與寡核苷酸引物接觸,此引物能與側(cè)接有一含有潛在多態(tài)性的區(qū)域的該核酸雜交;(C)擴(kuò)增此區(qū)域產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物;(d)測定擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量;(e)將該分子量與個(gè)體中已知具有多態(tài)性的區(qū)域的分子量相比較,其中如果兩分子量相同,則該個(gè)體具有此多態(tài)性。在此優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面,使引物與高度保守的序列雜交。優(yōu)選多態(tài)性與其疾病相關(guān)連。或者,多態(tài)性是一種血型抗原。在此優(yōu)選實(shí)施方案的一個(gè)方面,擴(kuò)增步驟是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)?;蛘?,擴(kuò)增步驟是連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或鏈置換擴(kuò)增。優(yōu)選擴(kuò)增產(chǎn)物在質(zhì)量測定前離子化。一方面,擴(kuò)增產(chǎn)物通過電噴射離子化、基質(zhì)-輔助的激光解吸或快速原子轟擊而離子化。有利的是,分子量通過質(zhì)譜測定。優(yōu)選質(zhì)譜法是傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜法(FT-ICR-MS)、離子陷阱、四極、磁扇面、飛行時(shí)間(TOF)、Q-TOF或三重四極。


圖1A-1I顯示保守區(qū)域例子的共有序列圖,此保守區(qū)域來自16S rRNA(圖1A-1B)(SEQ ID N0:3)、23S rRNA (3,-半,圖 1C-1D ;5’-半,圖 1E-F) (SEQ ID N0:4)、23S rRNA 結(jié)構(gòu)域1(圖1G)、23S rRNA結(jié)構(gòu)域IV (圖1H)和16S rRNA結(jié)構(gòu)域III (圖II),它們適合用于本發(fā)明。帶箭頭的線是設(shè)計(jì)用于PCR引物對所針對的區(qū)域的例子。各引物對的標(biāo)記代表該共有序列圖上被擴(kuò)增區(qū)域的起始和終止堿基的編號。大寫字母的堿基95%以上保守;小寫字母的堿基90-95%保守;實(shí)心圓80-90%保守;空心圓低于80%保守。各引物對的標(biāo)記代表該共有序列圖上被擴(kuò)增區(qū)域的起始和終止堿基的編號。圖2顯示圖IC中所示的16S rRNA結(jié)構(gòu)域III的典型的引物擴(kuò)增區(qū)域。圖3顯示RNA酶P中保守區(qū)域的示意圖。大寫字母的堿基90%以上保守;小寫字母的堿基80-90%保守;實(shí)心圓代表的堿基70-80%保守;空心圓代表的堿基低于70%保守。圖4是堿基組成簽名測定的示意圖,用核苷類似物“標(biāo)志”來確定堿基組成簽名。圖5顯示炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)具有或沒有質(zhì)量標(biāo)志硫代磷酸A(A*)區(qū)域的去卷積質(zhì)譜。這兩個(gè)質(zhì)譜的區(qū)別在于含該質(zhì)量標(biāo)記的序列測定的分子量大于未修飾的序列。圖6顯示金黃色葡萄球菌(S. aureus 16S_1337F)和炭疽桿菌(B. anthr. 16S_1337F)的PCR產(chǎn)物的堿基組成簽名(BCS)質(zhì)譜,,擴(kuò)增采用了相同的引物。兩條鏈的差別僅為兩個(gè)(AT — CG)替換并且根據(jù)它們的BCS可清楚地鑒別。圖7顯示兩種序列(炭疽芽胞桿菌的A14對蠟樣芽胞桿菌的A15)之間的一個(gè)差別可容易地用ESI-TOF質(zhì)譜檢測。圖8是炭疽桿菌芽孢桿菌包膜蛋白sspE 56聚體加校準(zhǔn)的ESI-T0F。此信號明確地鑒定了其它芽胞桿菌和炭疽桿菌。圖9是炭疽桿菌合成的16S_1228雙鏈體(反向和正向鏈)的ESI-T0F。此技術(shù)可容易的鑒別正向和反向鏈。圖10是合成的炭疽桿菌16S_133746堿基對雙鏈體的ESI-FTICR-MS。
圖11是炭疽桿菌saspB基因的56聚體寡核苷酸(3次掃描)的ES I-TOF-MS,采用內(nèi)部質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。此內(nèi)部質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)用星號表示。圖12是用5mM TBA-TFA緩沖液配的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品的ESI-T0F-MS,顯示含三丁銨三氟醋酸鹽的帶電條帶降低了最大豐度的帶電狀態(tài),從[M-8H+]8_降到[M-3H+]3_。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了非PCR生物量檢測模式,優(yōu)選高分辨率MS,與采用“智能引物”的以PCR為基礎(chǔ)的BCS技術(shù)相結(jié)合,此智能引物能與衍生自某生物體的核酸的保守序列區(qū)域雜交并包含能獨(dú)特地鑒定該生物體的可變序列區(qū)域。高分辨率MS技術(shù)用于測定被擴(kuò)增序列區(qū)域的分子量和堿基組成簽名(BCS)。然后將此獨(dú)特的“堿基組成簽名”(BCS)輸入最大可能性檢測算法中,用于匹配同一被擴(kuò)增區(qū)域中堿基組成簽名的數(shù)據(jù)庫。本方法結(jié)合了以PCR 為基礎(chǔ)的擴(kuò)增技術(shù)(提供特異性)和分子量檢測模式(提供速度且不需要測定被擴(kuò)增的靶序列的核酸序列),用于生物體檢測和鑒定。本方法與現(xiàn)有方法相比能非常迅速和精確地檢測和鑒定生物體。此外,即使當(dāng)樣品物質(zhì)不純時(shí),此快速檢測和鑒定也是可行的。因此,此方法在各種領(lǐng)域中是有用的,包括但不限于,環(huán)境測試(如檢測和區(qū)別水或其它樣品中的病原和非病原菌)、細(xì)菌戰(zhàn)爭(可立即鑒定生物體和適當(dāng)治療)、藥物遺傳分析和醫(yī)學(xué)診斷(包括根據(jù)突變和多態(tài)性作出癌癥診斷;藥物抗性和易感性試驗(yàn);篩檢和/或診斷遺傳疾病和狀況;診斷傳染病和狀況)。此方法影響了正在進(jìn)行的關(guān)于毒性、病原性、藥物抗性和基因組測序的生物醫(yī)學(xué)研究,提供了與現(xiàn)有方法相比大為改進(jìn)的靈敏性、特異性和可靠性,假陽性率更低的方法。本方法可用于檢測和分類任何生物體,包括細(xì)菌、病毒、真菌和毒素。作為一個(gè)例子,當(dāng)該生物體是一種生物威脅,所得的信息可用于確定對策所需的實(shí)踐信息,包括毒素基因,病原分離和抗生素抗性基因。此外,此方法可用于鑒定天然事物或仔細(xì)考慮的基因工程事物,包括染色體片斷交換、分子繁殖(基因改組)和冒出的傳染病。細(xì)菌具有一套共同的絕對需要的基因。約250個(gè)基因存在于所有種類的細(xì)菌中(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93 :10268,1996 !Science 270 :397,1995),包括小基因組,如支原體(Mycoplasma)、脲原體(Ureaplasma)和立克次體(Rickettsia)。這些基因編碼的蛋白,參與翻譯、復(fù)制、重組和修復(fù)、轉(zhuǎn)錄、核苷酸代謝、氨基酸代謝、脂類代謝、能量產(chǎn)生、吸收、分泌等。這些蛋白質(zhì)的例子是DNA聚合酶ΙΙΙβ、延伸因子TU、熱激蛋白groEL、RNA聚合酶B、磷酸甘油酸激酶、NADH脫氫酶、DNA連接酶、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶和延伸因子G。操縱子也可用本方法靶向。操縱子的一個(gè)例子是腸道致病性大腸桿菌的bfp操縱子。多種核心染色體基因可用于在屬或種水平上分類細(xì)菌來確定某生物體是否具有潛在威脅。此方法也可用于檢測病原性標(biāo)記(質(zhì)?;蛉旧w)和抗生素抗性基因來證實(shí)某生物體的潛在威脅和指導(dǎo)對策。理論上理想的生物體檢測器應(yīng)能鑒定、定量測定和報(bào)告到達(dá)傳感器的各生物體的全核酸序列。病原體核酸組分的全序列應(yīng)提供關(guān)于威脅的所有相關(guān)信息,包括它的身份和藥物抗性或病原性標(biāo)記的存在。這個(gè)理想還未達(dá)到。然而,本發(fā)明提供了采用堿基組成簽名(BCS)獲得具有用相同實(shí)際值信息的簡單策略。雖然基因片斷的堿基組成不如序列本身那樣富含信息,但如果適當(dāng)選擇短的分析物序列片斷,就不需要分析該基因的全序列??芍苽鋮⒖夹蛄袛?shù)據(jù)庫,其中將各序列指數(shù)化成獨(dú)特的堿基組成簽名,從而某序列的存在可精確地從其簽名的存在來推知。堿基組成簽名的優(yōu)點(diǎn)是它們可以整塊平行方式,采用多重PCR(在PCR中兩對或多種引物對同時(shí)擴(kuò)增靶序列)和質(zhì)譜定量測定。這些多對引物擴(kuò)增的區(qū)域能獨(dú)特地鑒定最有感脅的和普遍的背景細(xì)菌和病毒。此外,簇-特異引物對能分辨重要的本地簇(如炭疽群)。在本發(fā)明的上下文中,“生物體”是任何生物體,活的或死的,或衍生自這種生物體的核酸。生物體的例子包括但不限于細(xì)胞(包括但不限于人臨床樣品、細(xì)菌細(xì)胞和其它病原體)、病毒、毒素基因和生物調(diào)節(jié)化合物)。樣品可以是活的或死的或處在生長狀態(tài)(例如,生長繁殖細(xì)菌或孢子)且可以是被包裹的或經(jīng)生物工程改造的。如本文所用,“堿基組成簽名”(BCS)是能獨(dú)特地鑒定靶基因和來源生物體的核酸序列所選片斷的精確堿基組成。BCS可認(rèn)為是特定基因的獨(dú)特指數(shù)。如本文所用,“智能引物”是能與側(cè)接有一價(jià)入可變區(qū)的序列區(qū)域相結(jié)合的引物。在一個(gè)較佳實(shí)施方案中,這些側(cè)接有可變區(qū)的序列區(qū)域在不同種類的生物體中高度保守。 例如,此序列區(qū)域可在所有種類芽孢桿菌中高度保守。術(shù)語“高度保守”,意味著這些序列區(qū)域顯示約80-100%的相同性,更優(yōu)選約90-100%、最優(yōu)選約95-100%相同性能擴(kuò)增16S和23S rRNA區(qū)域的智能引物的例子見圖2。箭頭代表能與側(cè)接有16S rRNA結(jié)構(gòu)域III可變區(qū)的高度保守區(qū)域相結(jié)合的引物。被擴(kuò)增的區(qū)域是“ 1100-1188 ”下的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。如本文所用,“匹配”指任何統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性的概率確定或結(jié)果。本法明檢測方法的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是不需要具體細(xì)菌種類或者菌屬的特異性引物,如芽胞桿菌(Bacillus)或鏈霉菌(Streptomyces)。此引物能識別橫跨數(shù)百個(gè)細(xì)菌種類的高度保守區(qū)域,包括但不限于,本文所述的種類。因此,同一引物對可用于鑒定任何期望的細(xì)菌,因?yàn)樗鼤c側(cè)接有一可變區(qū),此可變區(qū)對一個(gè)菌種是特異的或?qū)θ舾删N是共同的保守區(qū)域結(jié)合,從而能使該介入序列的核酸擴(kuò)增和測定它的分子量及堿基組成。例如,16S_971-1062、16S_1228-1310 和 16S_1100_1188 區(qū)域在約 900 種細(xì)菌中 98-99%保守(16S=16S rRNA,數(shù)字表示核苷酸位置)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,本方法所用的引物能結(jié)合一個(gè)或多個(gè)這些區(qū)域或其部分。本發(fā)明提供了非PCR生物量檢測模式,優(yōu)選高分辨率MS,與采用“智能引物”的以核酸擴(kuò)增為基礎(chǔ)的BCS技術(shù)相組合,該智能引物能與保守區(qū)域雜交并含有能獨(dú)特鑒定該生物體的可變區(qū)域。雖然采用PCR是優(yōu)選的但其它核酸擴(kuò)增技術(shù)也可使用,包括連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)和鏈置換擴(kuò)增(SDA)。高分辨率MS技術(shù)可在高度混雜的環(huán)境中從背景譜線中分離出生物體的線。然后將被分辨的譜線翻譯成BCS,輸入到最大可能性檢測算法中,與一種或多種已知的BCS譜線作匹配。較佳的是,生物體BCS譜與許許多多生物體的BCS的數(shù)據(jù)庫的一種或多種相匹配。優(yōu)選采用最大可能性檢測算法進(jìn)行此種匹配。在一個(gè)較佳實(shí)施方案中,堿基組成簽名以整塊平行方式定量測定,采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR),優(yōu)選多重PGR和質(zhì)譜(MS)方法。必須存在足夠量的核酸用于MS檢測生物體。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知多種制備大量純化核酸或其片斷的技術(shù)。PCR要求能與側(cè)接有待擴(kuò)增靶序列的區(qū)域相結(jié)合的一對或多對寡核苷酸引物。這些引物引導(dǎo)了 DNA不同鏈的合成,合成發(fā)生時(shí)一個(gè)弓I物朝向另一個(gè)弓丨物的方向。將引物、待擴(kuò)增的DNA、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(如Taq聚合酶)、四種脫氧核苷三磷酸和緩沖液相混合起動DNA合成。加熱變性此溶液,然后冷卻使新加入的引物退火,接著進(jìn)行又一輪的DNA合成。此過程通常重復(fù)約30個(gè)循環(huán),導(dǎo)致靶序列的擴(kuò)增。“智能引物”明確了待擴(kuò)增和分析的靶序列。在一個(gè)實(shí)施方案中,靶序列是核糖體RNA (rRNA)基因序列。現(xiàn)在可得到許多最小的微生物基因組的全序列,故有可能鑒定一套定義為“最小生命”的基因和鑒定能獨(dú)特分辨各基因和生物體的組成簽名。編碼核心生命功能,如DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、核糖體結(jié)構(gòu)、翻譯和轉(zhuǎn)運(yùn)的基因廣泛分布于細(xì)菌基因組中且是BCS分析的優(yōu)選區(qū)域。核糖體RNA (rRNA)基因包含有提供有用堿基組成簽名的區(qū)域。像許多參與核心生命功能的基因,rRNA基因包含橫跨細(xì)菌結(jié)構(gòu)域的非常保守的序列,散布著對各菌種更特異的高度不同的區(qū)域??衫眠@些不同區(qū)域來構(gòu)建堿基組成簽名的數(shù)據(jù)庫。策略包括建立rRNA基因小亞基(16S)和大亞基(23S)序列的以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的排列對比。例如,目前核糖體RNA數(shù)據(jù)庫中已有超過13,000種序列由Robin Gutell, University of Texas atAustin創(chuàng)建和維持,并且公眾可在 the Institute for Cellular and Molecular Biology網(wǎng)頁(www.rna.icmb.utexas.edu/)中得到。公眾也可得到由 University of Antwerp,比利時(shí)網(wǎng)頁(www. rrna. uia. ac. be)創(chuàng)建和維持的rRNA數(shù)據(jù)庫。 已分析了這些數(shù)據(jù)確定了用作為堿基組成簽名的區(qū)域。這些區(qū)域的特征是a)在感興趣的具體生物種類中,作為序列擴(kuò)增弓I物位置的上游和下游核苷酸序列的相同性在80-100%之間,優(yōu)選> 95% ;b)介入的可變我顯示在諸種類中相同性不大于約5% ;c)保守區(qū)域之間,分隔約30至1000個(gè)核苷酸,優(yōu)選不超過50-250個(gè)核苷酸更優(yōu)選不超過約60-100個(gè)核苷。由于它們總體上保守,側(cè)翼的rRNA引物序列可作為優(yōu)良的“通用”引物結(jié)合位點(diǎn)來擴(kuò)增大多數(shù)(如果不是所有)菌種感興趣的區(qū)域。幾套引物之間的該介入?yún)^(qū)域在長度和/或組成上不同,因此提供了獨(dú)特的堿基組成簽名。設(shè)計(jì)的此“智能引物”的優(yōu)點(diǎn)是通用性,可能最大程度減少需合成的引物數(shù)量,可用一對引物檢測許多生物種類。這些引物對可用于擴(kuò)增這些物種中的不同區(qū)域。因?yàn)槲锓N中這些保守區(qū)域中的任何變化(由于密碼子第三個(gè)位置的不穩(wěn)定)可能發(fā)生在DNA三聯(lián)體的第三個(gè)位置,可設(shè)計(jì)寡核苷酸引物使對應(yīng)這個(gè)位置的核苷酸是可結(jié)合一種以上核苷酸的堿基,本文稱為“通用堿基”。例如,在這種“不穩(wěn)定的”配對中,肌苷⑴能結(jié)合U、C或A;鳥嘌呤(G)能結(jié)合U或C,尿苷(U)能結(jié)合U或C。其它通用堿基的例子包括硝基吲哚如5-硝基卩引哚或 3_ 硝基卩比咯(Loakes 等,Nucleosides and Nucleotides 14:1001-1003,1995)、簡并核苷dP或dK (Hill等)、含5-硝基吲唑的無環(huán)核苷類似物(Van Aerschot等.,Nucleosidesand Nucleotides 14:1053-1056,1995)或嘌呤類似物 I-(2_ 脫氧-β _D_ 呋喃核糖)-咪唑-4-酰胺(Sala 等·,Nucl. Acids. Res. 24 :3302-3306,1996)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中,為補(bǔ)償“不穩(wěn)定”堿基的較弱結(jié)合,設(shè)計(jì)了寡核苷酸引物使各個(gè)三聯(lián)體的第一和第二個(gè)位置為比未修飾的核苷酸親和力更高的核苷酸類似物所占據(jù)。這些類似物的例子是能結(jié)合胸腺嘧啶的2,6_ 二氨基嘌呤、能結(jié)合腺嘌呤的丙炔T和丙炔C和吩嗪,包括能結(jié)合G的G-夾子。丙炔描述見美國專利5645958、5830653和5494908其整個(gè)內(nèi)容納入本文參考文獻(xiàn)。吩噴嗪的描述見專利5,502,177,5, 763,588和6,005, 096,它們的完整內(nèi)容納入本文參考義·。G-夾子描述見美國專利號6,00, 992和6,028,183,它們的完整內(nèi)容納入本文參考文獻(xiàn)。
能被現(xiàn)有方法檢測的細(xì)菌生物戰(zhàn)物質(zhì)包括炭疽芽孢桿菌(炭疽熱)、耶爾森鼠疫桿菌(鼠疫性肺炎)、土拉熱弗朗西斯菌(土拉熱)、豬布魯菌、流產(chǎn)布魯菌、馬耳他布魯菌(波狀熱)、鼻疽伯克霍爾德氏菌(鼻疽)、類鼻疽伯克霍爾德氏菌(類鼻疽)、傷寒沙門菌(傷寒癥)、斑疹傷寒立克次體(流行性斑疹傷寒癥)、普氏立克次體(地方性斑疹傷寒)和伯納特立克次體(Q熱)、莢膜紅細(xì)菌、肺炎衣原體、大腸桿菌、志賀痢疾菌、弗氏志賀菌、蠟樣芽胞桿菌、肉毒梭菌、伯納特立克次體、綠膿假單胞菌、嗜肺軍團(tuán)菌和霍亂弧菌。除了 16S和23S rRNA,其它適合用于本發(fā)明檢測的細(xì)菌靶區(qū)域包括5S rRNA和RNA酶P(圖3)。生物戰(zhàn)真菌生物戰(zhàn)物質(zhì)包括immitis球孢子菌球孢子菌病。能通過本發(fā)明的方法檢測的生物戰(zhàn)毒素基因包括肉表毒素、T-2霉菌素素、篦麻毒素、葡萄球菌腸毒素B、志賀菌毒素、相思豆毒素、黃曲霉毒素、產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素、芋螺毒素、蛇形菌素、河豚毒素和蛤蛘毒素?!?br> 生物戰(zhàn)病毒威脅物質(zhì)主要是RNA病毒(正鏈和負(fù)鏈),除天花外。每種RNA病毒是一個(gè)相關(guān)病毒的家族(準(zhǔn)種)。這些病毒變異迅速且作為工程發(fā)行改造株的潛力(天然或仔細(xì)考慮的)很高。RNA病毒聚簇形成諸家族,它們在病毒基因組上具有保定的RNA結(jié)構(gòu)域(如病毒粒子組分,輔助蛋白)和編碼核心病毒蛋白的保守管家基因,包括單鏈正鏈RNA病毒、RNA依賴的RNA聚合酶、雙連RNA解旋酶、胰凝乳蛋白酶樣和木瓜蛋白酶樣蛋白酶及轉(zhuǎn)甲基酶。(-)_鏈RNA病毒的例子包括沙粒病毒(如sabia病毒、拉沙熱、Machupo、阿根廷出血熱、flexal病毒)、木雅病毒(如漢坦病毒屬、納伊羅病毒、白蛉病毒、漢坦病毒、剛果-克里米亞半島出血熱、里夫特裂谷熱)和單負(fù)病毒(mononegavirales)(如纖絲病毒、副粘病毒、埃博拉病毒、馬爾堡病毒、馬麻疫病毒)。(+)_鏈RNA病毒的例子包括小核糖核酸病毒(如柯薩奇病毒、艾柯病毒、人柯薩奇病毒A、人艾柯病毒、人腸道病毒、人脊髓灰質(zhì)炎病毒、甲肝病毒、人parechovirus、人鼻病毒)、星狀病毒(如人星狀病毒)、隹丐病毒(calcivimses)(如千葉病毒(chiba)、chitta病毒、人韓病毒、諾沃克病毒)、nidovirales (如人冠狀病毒、人torovirus)、黃病毒(如登革熱病毒1-4、日本腦炎病毒、森林出血熱病毒、Murray河谷腦炎病毒、Rocio病毒、圣路易斯腦炎病毒、西尼羅河病毒、黃熱病病毒、丙肝病毒)和披膜病毒(如屈曲病毒、東部馬腦炎病毒、Mayaro病毒、O’ nyong-nyong病毒、羅斯河冰毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒、風(fēng)疫病毒、戍型肝炎病毒)。丙型肝炎病毒有340個(gè)核苷酸的5’ -非翻譯區(qū)域,編碼9種蛋白質(zhì)的開放讀框有3010個(gè)氨基酸和240個(gè)核苷的3’ -非翻譯區(qū)域。5’ -UTR和3’ -UTR在丙型肝炎病毒中99%保守。在一個(gè)實(shí)施方案中,靶基因是RNA依賴的RNA聚合酶或由(+) _鏈RNA病毒編碼的解旋酶,或(_)-鏈RNA病毒的RNA聚合酶。(+)-鏈RNA病毒是雙鏈RNA且能通過采用RNA依賴的RNA聚合酶和正鏈作為模板的RNA-指導(dǎo)的RNA合成來復(fù)制。解旋酶解旋RNA雙鏈?zhǔn)沟脝捂淩NA復(fù)制。這些病毒包括來自小核糖核酸病毒家族的病毒(如脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒、艾柯病毒)、披膜病毒(如甲病毒、黃病毒、風(fēng)疹病毒)、沙粒病毒(如淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、拉沙熱病毒)、cononaviridae (如人呼吸病毒)和甲肝病毒。編碼這些蛋白的基因包含可變區(qū)和側(cè)接該可變區(qū)的高度保守區(qū)域。
在一個(gè)較佳實(shí)施方案中,對生物體產(chǎn)生PCR產(chǎn)物的檢測方案有三個(gè)特征。首先,該技術(shù)可同時(shí)檢測和區(qū)分多種(一般約6-10種)PCR產(chǎn)物。第二,該技術(shù)提供了從可能的引物位置獨(dú)特鑒定生物體的BCS。最后,該檢測技術(shù)快速,使多個(gè)PCR反應(yīng)平行進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中,此方法可用于檢測細(xì)菌種類中抗生素抗性和/或毒素基因的存在。例如,含有四環(huán)素抗性質(zhì)粒和編碼一種或兩種炭疽毒素(pxOl和/或px02)的質(zhì)粒的炭疽芽胞桿菌可用抗生物抗性引物對和毒素基因引物對檢測。如果炭疽桿菌四環(huán)素抗性是陽性,可用一種不同的抗生素,如quinalone。以質(zhì)譜(MS)為基礎(chǔ)的PCR產(chǎn)物檢測提供了所有這些特點(diǎn)和另外的優(yōu)點(diǎn)。MS本身是一種平行的檢測方案,無需放射性或熒光標(biāo)記,因?yàn)榫哂歇?dú)特堿基組成的各擴(kuò)增產(chǎn)物可 通過其分子量鑒定。本領(lǐng)域在質(zhì)譜上的當(dāng)前狀況是可以容易地分析小于毫微微摩爾量的物質(zhì)以提供關(guān)于樣品分子成分的信息。物質(zhì)分子量的精確測定可迅速獲得,無論樣品分子量是幾百還是超過十萬原子質(zhì)量單位(amu)或道爾頓。完整的分子型離子可用使樣品轉(zhuǎn)變成氣相的多種電離技術(shù)之一從擴(kuò)增產(chǎn)物中產(chǎn)生。這些電離技術(shù)包括但不限于,電噴射離子化(ES)、基質(zhì)-輔助的激光解吸離子化(MALDI)和快速原子轟擊(FAB)。例如,核酸的MALDI,和用于核酸MALDI的矩陣的例子一起,描述見WO 98/54751 (Genetrace, Inc·)。在離子化上,由于形成了帶不同電荷的離子,可從一個(gè)樣品中觀察到幾個(gè)峰。平均單個(gè)質(zhì)譜中獲得的多個(gè)分子量讀數(shù)提供了對該生物體子量的估計(jì)。電噴射離子化質(zhì)譜(ESI-MS)對分子量非常高的多聚體,如蛋白質(zhì)和分子量超過IOkDa的核酸特別有用,因?yàn)樗a(chǎn)生了該樣品的多種電荷分子的分布,而不引起顯著量的斷裂。本發(fā)明方法中所用的質(zhì)量檢測器包括但不限于,傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜法(FT-ICR-MS)、離子陷阱、四極、磁扇面、飛行時(shí)間(TOF)、Q-TOF或三重四極。通??捎糜诒景l(fā)明的質(zhì)譜技術(shù)包括但不限于,串聯(lián)質(zhì)譜、紅外多光子解離和熱解氣相色譜質(zhì)譜(PGC-MS)。在本發(fā)明的實(shí)施方案中,生物體檢測系統(tǒng)采用沒有PCR的熱解GC-MS以生物體檢測模式連續(xù)操作,快速檢測生物量的增加(例如,飲用水或細(xì)菌戰(zhàn)爭介質(zhì)糞便污染的上升)。為使等待最短,使樣品流連續(xù)直接流入PGC-MS的燃燒室。當(dāng)檢測到生物量的增加,PCR過程自動啟動。生物體的存在引起100-7,OOODa大分子片斷的水平上升,這些片斷在PGC-MS質(zhì)譜中可觀察到。將所見質(zhì)譜與閾值水平相比,當(dāng)測定的生物量水平超過預(yù)定的閾值時(shí),啟動本文上述的生物體分類過程(結(jié)合PCR和MS,優(yōu)選FT-ICR-MS)。任選地此種檢測到的生物量水平也可啟動報(bào)警和其它過程(停止通風(fēng)氣流、物理分離)。大DNAs分子量的精確測定受到每條鏈PCR反應(yīng)的陽離子加合、自然界豐富的13C和15N同位素的同位素峰的分辨和離子帶電狀態(tài)排布的限制。陽離子可用流經(jīng)芯片的在線透析去除,在電場梯度與液流正交的情況下,使含PCR產(chǎn)物的溶液接觸含醋酸銨的溶液。后兩個(gè)問題通過以分辨能力> 10,000操作和加入同位素衰竭的核苷三磷酸到DNA中可解決。儀器的分辨能力也是考慮因素。分辨能力為10,000時(shí),84聚體PCR產(chǎn)物的[M-14H+]14—帶電狀態(tài)的模式信號特征表現(xiàn)弱且此帶電狀態(tài)的排布或確切質(zhì)量測定是不可能的。分辨能力為33,000時(shí),可看見各同位素組分的峰。分辨能力為100,000時(shí),可分辨相對于基線的同位素峰且離子帶電狀態(tài)的排布是簡單易懂的。為獲得[13C,15N]-衰竭的三磷酸,例如,可通過在耗盡的培養(yǎng)基上生培養(yǎng)收集核苷的(Batey等·,Nucl. Acids. Res. 20 :4515_4523,1992)。雖然完整核酸區(qū)域的質(zhì)量測定被認(rèn)為足以確定大多數(shù)生物體串,但聯(lián)質(zhì)譜(MSn)技術(shù)可提供關(guān)于分子相同性或序列的更明確的信息。串聯(lián)MS包括聯(lián)合使用質(zhì)量分析的兩個(gè)或更多階段,當(dāng)分離和檢測步驟都以質(zhì)譜為基礎(chǔ)時(shí)。第一個(gè)階段用于選擇樣品的離子或組分,從中進(jìn)一步獲得結(jié)構(gòu)信息。用如黑體輻射、紅外多光子解離或碰撞活化然后使所選的離子斷裂,。例如,電噴射離子化(ESI)產(chǎn)生的離子可用IR多光子解離斷裂?;罨瘜?dǎo)致糖苷鍵與磷酸骨架分離,產(chǎn)生兩種系列的碎片離子,稱為ω-系列(內(nèi)部切割后含有完整的3’末端和5’磷酸)和α -堿基系列(含有完整的5’末端和3’呋喃)。然后將質(zhì)量分析的第二個(gè)階段用于檢測和測定這些產(chǎn)物離子所得片斷的質(zhì)量。這種片段化后的離子選擇可以進(jìn)行多次以基本上完全剖析樣品分子序列。如果有兩個(gè)或多個(gè)堿基組成或質(zhì)量類似的靶子或如果一次擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生的產(chǎn)物質(zhì)是與兩種或多種生物體參考標(biāo)準(zhǔn)品相同,它們可采用質(zhì)量修飾的“標(biāo)志”來區(qū)分。在本發(fā)明的實(shí)施方案中,可在擴(kuò)增時(shí)加入與未修飾的堿基具有不同分子量的核苷酸類似物或“標(biāo)志”(如5_(三氟甲基)脫氧胸苷三磷酸)而提高質(zhì)量的區(qū)分。這些標(biāo)志的描述見PCT W097/33000。這更限制了與任何質(zhì)量相符合可能的堿基組成的數(shù)量。例如,5-(三氟甲基)脫氧胸苷三磷酸可用于在分離的核酸擴(kuò)增反應(yīng)中代替dTTP。測定常規(guī)擴(kuò)增產(chǎn)物和標(biāo)記產(chǎn)物之間的質(zhì)量轉(zhuǎn)變可用于定量測定每條單鏈中胸苷核苷酸的數(shù)量。因?yàn)槎準(zhǔn)腔パa(bǔ)的,也可測定每條鏈中腺苷核苷酸的數(shù)量。在另一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中,測定每條鏈中G和C殘基的數(shù)量,可采用例如胞苷類似物5-甲基胞嘧啶(5-meC)或丙炔C。聯(lián)合A/T反應(yīng)和G/C反應(yīng),然后測定分子量,這提供了獨(dú)特的堿基組成。此方法總結(jié)于圖4和表I。表I
權(quán)利要求
1.一種鑒定未知生物體的方法,其特征在于,所述方法包括 a)使所述生物體的核酸接觸至少一對寡核苷酸引物,此引物能與所述核酸的序列雜交,其中所述序列側(cè)接有該生物體的可變核酸序列; b)擴(kuò)增所述可變核酸序列產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物; c)測定所述擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量; d)將所述分子量與在多種已知生物體上進(jìn)行步驟a)-c)獲得的一種或多種擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量相比較,其中一種匹配可鑒定所述的未知生物體。
2.如權(quán)利要求I所述的方法,其特征在于,與所述至少一對寡核苷酸引物雜交的所述序列是聞度保守的。
3.如權(quán)利要求I所述的方法,其特征在于,所述擴(kuò)增步驟包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
4.如權(quán)利要求I所述的方法,其特征在于,所述擴(kuò)增步驟包括連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或鏈置換擴(kuò)增。
5.如權(quán)利要求I所述的方法,其特征在于,所述生物體是細(xì)菌、病毒、細(xì)胞或孢子。
6.如權(quán)利要求I所述的方法,其特征在于,所述核酸是核糖體RNA。
7.如權(quán)利要求I所述的方法,其特征在于,所述核酸編碼RNA酶P或RNA依賴的RNA聚合酶。
8.如權(quán)利要求I所述的方法,其特征在于,所述擴(kuò)增產(chǎn)物在分子質(zhì)量測定前離子化。
9.如權(quán)利要求I所述的方法,其特征在于,該方法還包括在使所述核酸與所述至少一對寡核苷酸引物接觸之前,從所述生物體中分離核酸的步驟,。
10.如權(quán)利要求I所述的方法,其特征在于,該方法還包括用不同寡核苷酸引物對進(jìn)行步驟a)-d)的步驟,并將結(jié)果與在步驟d)的不同的多種已知生物體上進(jìn)行步驟a)-C)獲得的一種或多種擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量相比較。
11.如權(quán)利要求I所述的方法,其特征在于,所述一種或多種分子量包含在分子量數(shù)據(jù)庫中。
12.如權(quán)利要求I所述的方法,其特征在于,所述擴(kuò)增產(chǎn)物通過電噴射離子化、基質(zhì)輔助的激光解吸或快速原子轟擊來離子化。
13.如權(quán)利要求I所述的方法,其特征在于,所述分子量用質(zhì)譜測定。
14.如權(quán)利要求11所述的方法,其特征在于,所述質(zhì)譜選自傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜法(FT-ICR-MS)、離子陷阱、四極、磁扇面、飛行時(shí)間(TOF)、Q-TOF或三重四級。
15.如權(quán)利要求I所述的方法,其特征在于,該方法還包括在存在與腺苷、胸苷、鳥苷或胞苷有不同的分子量的腺嘌呤、胸苷、鳥苷或胞苷類似物時(shí)進(jìn)行步驟b)。
16.如權(quán)利要求I所述的方法,其特征在于,所述寡核苷酸引物在所述引物中各個(gè)三聯(lián)體位置I和2上含有堿基類似物,其中所述堿基類似物能以比天然堿基更高的親和力結(jié)合其互補(bǔ)物。
17.如權(quán)利要求16所述的方法,其特征在于,所述引物在所述引物中各個(gè)三聯(lián)體位置3上含有通用喊基。
18.如權(quán)利要求16所述的方法,其特征在于,所述堿基類似物選自2,6_二氨基嘌呤、丙炔T、丙炔G、吩嗪和G-夾子。
19.如權(quán)利要求16所述的方法,其特征在于,所述通用堿基選自肌苷、胍尿苷、5-硝基吲哚、3-硝基吡咯、dP、dK和I-(2-脫氧-β -D-呋喃核糖)-咪唑-4-酰胺。
20.一種鑒定未知生物體的方法,其特征在于,所述方法包括 a)使所述生物體的核酸接觸至少一對寡核苷酸引物,此引物能與所述核酸的序列雜交,其中所述序列側(cè)接有一可變核酸序列; b)擴(kuò)增所述可變核酸序列產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物; c)測定所述擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基組成; d)將所述堿基組成與在多種已知生物體上進(jìn)行步驟a)-c)獲得的一種或多種擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基組成相比較,其中一種匹配可鑒定所述的未知生物體。
21.如權(quán)利要求20所述的方法,其特征在于,與所述至少一對寡核苷酸引物雜交的所述序列是聞度保守的。
22.如權(quán)利要求20所述的方法,其特征在于,所述擴(kuò)增步驟包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
23.如權(quán)利要求20所述的方法,其特征在于,所述擴(kuò)增步驟包括連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或鏈置換擴(kuò)增。
24.如權(quán)利要求20所述的方法,其特征在于,所述生物體是細(xì)菌、病毒、細(xì)胞或孢子。
25.如權(quán)利要求20所述的方法,其特征在于,所述核酸是核糖體RNA。
26.如權(quán)利要求20所述的方法,其特征在于,所述核酸編碼RNA酶P或RNA依賴的RNA聚合酶。
27.如權(quán)利要求20所述的方法,其特征在于,所述擴(kuò)增產(chǎn)物在堿基組成測定前離子化。
28.如權(quán)利要求20所述的方法,其特征在于,該方法還包括在使所述核酸與所述至少一對寡核苷酸引物接觸之前,從所述生物體中分離核酸的步驟。
29.如權(quán)利要求20所述的方法,其特征在于,該方法還包括采用不同寡核苷酸引物對進(jìn)行步驟a)_d)的步驟,并將結(jié)果與在步驟d)的不同的多種已知生物體上進(jìn)行步驟a)_c)獲得的一種或多種擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基組成相比較,。
30.如權(quán)利要求20所述的方法,其特征在于,所述一種或多種堿基組成簽名包含在堿基組成簽名數(shù)據(jù)庫中。
31.如權(quán)利要求20所述的方法,其特征在于,所述擴(kuò)增產(chǎn)物通過電噴射離子化、基質(zhì)輔助的解吸或快速原子轟擊來離子化。
32.如權(quán)利要求20所述的方法,其特征在于,所述堿基組成簽名用質(zhì)譜測定。
33.如權(quán)利要求32所述的方法,其特征在于,所述質(zhì)譜選自傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜法(FT-ICR-MS)、離子陷阱、四極、磁扇面、飛行時(shí)間(TOF)、Q-TOF或三重四極。
34.如權(quán)利要求20所述的方法,其特征在于,該方法還包括在存在與腺苷、胸苷、鳥苷或胞苷有不同的分子量的腺嘌呤、胸苷、鳥苷或胞苷類似物時(shí)進(jìn)行步驟b)。
35.如權(quán)利要求20所述的方法,其特征在于,所述寡核苷酸引物在所述引物中各個(gè)三聯(lián)體位置I和2上含有堿基類似物,其中所述堿基類似物能以比天然堿基更高的親和力結(jié)合其互補(bǔ)物。
36.如權(quán)利要求35所述的方法,其特征在于,所述引物在所述引物中各個(gè)三聯(lián)體位置3上含有通用喊基。
37.如權(quán)利要求35所述的方法,其特征在于,所述堿基類似物選自2,6_二氨基嘌呤、丙炔T、丙炔G、吩嗪和G-夾子。
38.如權(quán)利要求36所述的方法,其特征在于,所述通用堿基選自肌苷、胍尿苷、5-硝基吲哚、3-硝基吡咯、dP、dK和1-(2-脫氧-β -D-呋喃核糖)-咪唑-4-酰胺。
39.一種檢測個(gè)體中單個(gè)核苷多態(tài)性的方法,其特征在于,所述方法包括以下步驟 a)分離所述個(gè)體的核酸; b)使所述核酸與寡核苷酸引物接觸,此引物能與側(cè)接了一含有所述潛在多態(tài)性的區(qū)域的所述核酸區(qū)域雜交; c)擴(kuò)增所述區(qū)域產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物; d)測定所述擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量; e)將所述分子量與已知具所述多態(tài)性的個(gè)體的所述區(qū)域的分子量相比較,其中如果分子量相同,所述個(gè)體具有所述多態(tài)性。
40.如權(quán)利要求39所述的方法,其特征在于,所述多態(tài)性與某疾病相關(guān)。
41.如權(quán)利要求39所述的方法,其特征在于,所述多態(tài)性是血型抗原。
42.如權(quán)利要求39所述的方法,其特征在于,所述擴(kuò)增步驟是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
43.如權(quán)利要求39所述的方法,其特征在于,所述擴(kuò)增步驟是連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或鏈置換擴(kuò)增。
44.如權(quán)利要求39所述的方法,其特征在于,所述擴(kuò)增產(chǎn)物在質(zhì)量測定前離子化。
45.如權(quán)利要求39所述的方法,其特征在于,所述擴(kuò)增產(chǎn)物通過電噴射離子化、基質(zhì)-輔助的激光解吸或快速原子轟擊來離子化。
46.如權(quán)利要求39所述的方法,其特征在于,所述引物能與保守序列雜交。
47.如權(quán)利要求39所述的方法,其特征在于,所述分子量用質(zhì)譜測定。
48.如權(quán)利要求47所述的方法,其特征在于,所述質(zhì)譜選自傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜法(FT-ICR-MS)、離子陷阱、四極、磁扇面、飛行時(shí)間(TOF)、Q-TOF或三重四極。
全文摘要
檢測和鑒定未知生物體,包括細(xì)菌、病毒等的方法,采用了能與生物體的核酸的保守序列區(qū)域雜交的并含有能獨(dú)特分辨法生物體的可變序列區(qū)域的引物。結(jié)果是一種“堿基組成簽名”(BCS),然后與堿基組成簽名數(shù)據(jù)庫匹配,由此鑒定該生物體。
文檔編號C12N15/09GK102912036SQ201210348178
公開日2013年2月6日 申請日期2002年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月2日
發(fā)明者D·J·埃克, R·H·格里菲, R·桑帕斯, S·霍夫施塔勒, J·邁克尼爾 申請人:Ibis生物科學(xué)股份有限公司
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