專利名稱：檢測肺癌腫瘤細胞rna變化的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及小RNA檢測試劑盒的制備及使用方法，具體而言，本發(fā)明涉及以新發(fā)現(xiàn)小RNA前體的核苷酸序列為基礎(chǔ)，設(shè)計特異的寡聚核苷酸引物和熒光標記探針，采用實時熒光定量PCR技術(shù)組裝肺癌骨轉(zhuǎn)移的檢測試劑盒，本發(fā)明也涉及其檢測方法。
背景技術(shù)：
肺癌是當今世界上腫瘤患者死亡的首位病種，且其發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢，嚴重威脅著人類健康和生命。2000年全世界肺癌新發(fā)病例120萬，死亡110萬。造成肺癌高病死率的主要原因是早期肺癌因無癥狀而發(fā)現(xiàn)困難，當出現(xiàn)癥狀就診時，大多已經(jīng)比較嚴重或已肺外轉(zhuǎn)移，到了臨床不可治愈的階段。肺癌易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，有研究表明肺癌骨轉(zhuǎn)移發(fā)生率為 22%-81. 8%。(Lack E, Dickgreber N, Muller T, et a I. Randomized PhaseIII study of Gemcitabine and Vinorelbine versus Gemcitabine， Vinorelbine， and Cisplatin in the treatment of Advanced Non-Small-Cell lung cancer From theGerman and Swiss Lung Cancer Smdy Group[J]. Journal of clinical Oncology，2004，22(12) :2348-2356)骨轉(zhuǎn)移的常見臨床癥狀包括程度不等的疼痛、病理性骨折、脊髓受壓以及危及生命的高I丐血癥等，統(tǒng)稱骨相關(guān)事件(Skeletal related events, SREs)。骨轉(zhuǎn)移瘤所引起的疼痛等癥狀往往成為肺癌患者的最大痛苦，對患者造成嚴重的心理影響，是臨床上降低肺癌患者生活質(zhì)量和影響患者生存的重要因素。腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移是決定腫瘤患者預(yù)后的一個關(guān)鍵因素。大部分患者并不是死于原發(fā)部位的腫瘤，而是死于腫瘤其它部位的擴散轉(zhuǎn)移。所謂腫瘤的轉(zhuǎn)移，是指腫瘤細胞從原發(fā)腫瘤部位脫離，遷徙到其他位點，不斷生長，最終發(fā)展為轉(zhuǎn)移性腫瘤。人們很早就發(fā)現(xiàn)，腫瘤的轉(zhuǎn)移不是隨機性的，而是有選擇性，具有嗜器官性的。腫瘤骨轉(zhuǎn)移，是腫瘤轉(zhuǎn)移研究中最早觀察到的現(xiàn)象之一。骨骼的主要組成是礦物質(zhì)成分，其微環(huán)境對腫瘤細胞而言可謂嚴酷，但乳腺癌、前列腺癌、肺癌卻極易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，這暗示能夠轉(zhuǎn)移至骨的腫瘤細胞具有改造局部微環(huán)境的特性。腫瘤骨轉(zhuǎn)移過程涉及一系列復(fù)雜的分子事件，是多步驟、多因素、多基因共同參與的復(fù)雜過程，腫瘤細胞首先從原發(fā)灶中分離，通過侵襲透過腫瘤新生血管進入全身循環(huán)系統(tǒng)，在其中絕大多數(shù)癌細胞由于宿主免疫反應(yīng)和血流物理壓力而滅亡，只有極少量癌細胞可以存活，進入骨髓腔的竇狀小管，而后穿過竇狀小管的壁，侵襲骨髓基質(zhì)，癌細胞與局部骨組織微環(huán)境發(fā)生一系列復(fù)雜的相互作用，導(dǎo)致癌細胞增殖分化，局部骨質(zhì)破壞，形成骨轉(zhuǎn)移灶。肺癌骨轉(zhuǎn)移絕大多數(shù)為溶骨性轉(zhuǎn)移，最初人們認為腫瘤骨轉(zhuǎn)移引起溶骨性骨質(zhì)破壞是腫瘤細胞直接作用引起的，然而研究證實到達局部骨組織的腫瘤細胞，并不能直接破壞骨組織，而是通過分泌多種細胞因子，包括甲狀旁腺激素(PTH)、甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(PTHrP)、IL-U IL-6、前列腺素E2等，直接或間接的作用于骨組織中破骨細胞，激活破骨細胞引起局部骨吸收作用異常活躍，使局部出現(xiàn)溶骨性的骨質(zhì)破壞，為腫瘤細胞的“定居”和擴展提供了空間。同時骨基質(zhì)中富含有多種生長因子，包括轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)、纖維母細胞生長因子(FGF)、胰島素生長因子(IGF)、血小板源性生長因子(TOGF)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)等。溶骨性骨破壞的過程中，大量生長因子獲得釋放并被激活，刺激腫瘤細胞分裂增殖，同時增多的腫瘤細胞進一步刺激破骨細胞分化，骨質(zhì)破壞進一步加重，這樣就形成了一個惡性循環(huán)，從而導(dǎo)致溶骨性轉(zhuǎn)移灶的形成。microRNA(miRNA)是天然存在、長約22個核苷酸的非編碼RNA，它們介導(dǎo)了轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)控。miRNAs在許多生物過程中扮演了重要角色，包括分化和發(fā)育、細胞信號通路以及對感染的反應(yīng)。miRNAs表現(xiàn)出一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達的全新機制，它通過結(jié)合靶基因的mRNA的3’ UTR抑制基因的表達。miRNAs已經(jīng)被證實在發(fā)育、感染、免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)和腫瘤的發(fā)生等多種生理與病理過程中發(fā)揮作用。從最初發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在，已經(jīng)在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了 700多個miRNAs，其中絕大部分miRNAs的生物學功能是未知的。已有報道，miRNAs參與免疫應(yīng)答中多方面的調(diào)控作用。研究還發(fā)現(xiàn)血清和血漿中可以檢測到循環(huán)miRNAs，且它們的表達因疾病而異，這一發(fā)現(xiàn)說明循環(huán)miRNAs的表達特征可作為疾病診斷和預(yù)防的 生物標志物，具有巨大潛力。而缺乏特異的、高敏感度的分子標志物是目前制約肺癌骨轉(zhuǎn)移早期診斷以及有效治療的關(guān)鍵問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測小RNA表達水平的熒光定量PCR試劑盒及使用方法，該PCR試劑盒適合于目前存在市場上的所有類型熒光定量基因擴增儀，靈敏度高，定量快速準確、穩(wěn)定性好，具有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明的另一目的是在于提供一種熒光定量PCR試劑盒對肺癌是否發(fā)生骨轉(zhuǎn)移進行快速的檢測。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先分別提取了肺癌發(fā)生骨轉(zhuǎn)移患者腫瘤細胞和肺癌未發(fā)生骨轉(zhuǎn)移患者腫瘤細胞的總RNA,并從中純化miRNA,利用Single-end library建庫方法，共得到兩個肺癌骨轉(zhuǎn)移前后腫瘤細胞miRNA轉(zhuǎn)錄組文庫。對所得的miRNA轉(zhuǎn)錄組文庫進行高通量測序，對高通量測序序列過濾，去除低質(zhì)量序列，使用S0AP2方法跟人類基因組進行比對。并對測序結(jié)果進行分析，其中通過fold-change方法，對不同樣本的表達差異基因進行了比較，得到了表達差異顯著的miRNA_novel_mir_30，其序列見序列表SEQ NO. 5。本發(fā)明根據(jù)nOVel_mir_30的序列信息，設(shè)計了四條引物，第一條為莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物RT30，其序列見序列表SEQ NO. I ;第二條是上游的特異引物F30，其序列見序列表SEQ NO. 2 ;第三條為下游的通用引物R30，其序列見序列表SEQ NO. 3 ;第四條是在熒光定量PCR中需要的熒光探針引物Flu30，其序列見序列表SEQ NO. 4，在熒光探針Flu30的5’端標有熒光基因FAM，在熒光探針Flu30的3’端標有熒光淬滅基團TAMRA。本發(fā)明還制備了含有noVel_mir_30序列的標準DNA模板。制備步驟方法如下提取肺癌未發(fā)生骨轉(zhuǎn)腫瘤細胞的總RNA，從中純化出miRNA，接著進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反轉(zhuǎn)錄體系為:莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物RT30，SEQ ID NO. I (2 μ mol/L) I μ 1，miRNA4 μ 1，dNTP混合物(每種 2.5mmol/L)4y 1,0. lmol/LDTT2 μ I, SuperScript RNase H 逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/μ1)2μ1。反應(yīng)條件為37°C水浴60分鐘，95°C水浴3分鐘。將逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到的cDNA進行常規(guī)PCR擴增，PCR產(chǎn)物檢測后切膠回收并純化，將純化產(chǎn)物連接到PGM-T克隆載體上，隨后轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)細胞中。通過序列為SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3的特異性引物篩選陽性克隆。陽性克隆擴增后提取質(zhì)粒DNA，質(zhì)粒DNA采用NanoDropND-IOOO核酸定量儀定量(NanoDrop Technologies,Wilmington,Delaware)并做10倍系列稀釋作為標準品用于標準曲線的制備。本發(fā)明還制備了一種檢測novel_mir_30表達水平的突光定量PCR試劑盒,組分如下特異性引物、特異性探針、標準DNA模板、熒光定量PCR反應(yīng)液。其中所述的特異性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列為SEQ IDN0.2，下游引物序列為SEQ ID NO. 3，特異性探針的核苷酸序列見序列表SEQN0. 4，在熒光探針的5’端標有熒光基因FAM，在熒光探針的3’端標有熒光淬滅基團TAMRA。本發(fā)明還公開了一種檢測肺癌是否發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的熒光定量PCR試劑盒的使用方法，熒光定量 PCR體系Hot-start Taq DNA聚合酶(2. 5U/μ I) I μ l，Hot_start Taq DNA聚合酶的IOXbuffer 5 μ I, dNTP混合物(每種IOmmoI/L) I μ 1，上游引物(10 μ mol/L)，下游引物(10 μ mol/L) ,TaqMan 探針(5 μ mol/L)各 I μ 1，樣品 cDNA5 μ I 或標準質(zhì)粒 DNA2 μ 1，加·離子水至50 μ I。熒光定量PCR程序5°C IOmin預(yù)變性，接45個循環(huán)95°C 40s，60°C lmin。本發(fā)明還檢測了本試劑盒靈敏性，結(jié)果顯示本試劑盒檢測范圍為107_102copies/μ I，最小檢出濃度為IOOcopies/ μ I。通過對陽性樣品的檢測，發(fā)現(xiàn)本試劑盒檢測準確率達96%。連續(xù)3次重復(fù)實驗，實驗結(jié)果穩(wěn)定。


圖I小RNA長度在樣本A和B的分布。樣本A為肺癌未轉(zhuǎn)移病人的腫瘤細胞miRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，樣本B為肺癌骨轉(zhuǎn)移病人的腫瘤細胞的miRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。圖2各濃度下標準DNA模板的PCR擴增曲線。曲線從左到右依次為濃度為108、107U06U05U04U03U02個拷貝/ μ I的標準DNA模板的PCR擴增曲線。圖3標準DNA模板熒光定量PCR的標準曲線。圖4novel_mir_30在肺癌骨轉(zhuǎn)移病人和正常人中的表達量，其中在正常人中的表達量均值為2112個，在肺癌骨轉(zhuǎn)移病人中不表達。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照廠商所建議的條件。實施例I肺癌骨轉(zhuǎn)移前后腫瘤細胞microRNA表達的變化一材料和方法I、材料腫瘤細胞均來自于云南腫瘤醫(yī)院2004年-2010年因肺癌住院病例，分別取30例肺癌骨轉(zhuǎn)移病人的腫瘤細胞和30例肺癌未轉(zhuǎn)移病人的腫瘤細胞。2、方法2. I肺癌骨轉(zhuǎn)移前后腫瘤細胞總RNA的提取
按Trizol試劑盒說明書提取肺癌骨轉(zhuǎn)移病人和肺癌未轉(zhuǎn)移病人腫瘤細胞的RNA，通過凝膠電泳證明RNA的完整性，用核酸蛋白儀測定RNA的濃度和純度。采用上海華舜生物工程有限公司總RNA抽提試劑盒子提取。主要操作步驟如下(I)用胞裂解液BL裂解組織細胞，離心取上層細胞。在上層細胞中加入I ml的Trizol，用帶針頭的一次性注射器抽打裂解物10次。(2)靜置5分鐘后，加入200 μ I的氯仿，用力顛倒離心管混勻后，室溫靜置使之分層，12000g離心5分鐘，小心移取水相至I. 5ml的離心管中。(3)加入等體積的異丙醇，徹底混勻后，取出750 μ I移入吸附柱，離心30秒，倒掉收集管中的液體，將吸附柱移入同一收集管中，將剩余的全部將入吸附柱中，離心30秒。倒掉收集管中的液體，將吸附柱移入同一個收集管中。(4)加入500 μ L RP液，離心30秒。倒掉收集管中的液體，將吸附柱移入同一收集·管中。(5)將500 μ I的W3液，靜置I分鐘，離心15秒。(6)將吸附柱移入一個干凈的收集管中，加入500 μ I W3液，離心15秒。(7)倒掉收集管中的液體，再將吸附柱移入同一收集管中，離心I分鐘。(8)將吸附柱放入另一個干凈的I. 5ml的離心管中，在吸附膜中央加入50 μ I純水，室溫靜置I分鐘后，離心I分鐘。將RNA貯存于-70°c。(9)總RNA完整性鑒定取2 μ I RNA樣品在I. 5%瓊脂糖凝膠電泳(80v，15min)，分出區(qū)帶后，EB染色，紫外燈下觀察電泳區(qū)帶。(10)用核酸蛋白儀測定RNA的濃度和純度2. 2、肺癌骨轉(zhuǎn)移前后腫瘤細胞miRNA轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建及測序利用QIAGEN公司的RNeasy MinElute Cleanup Kit從上述得到的總RNA純化miRNA,具體步驟見說明書。利用Single-end library建庫方法,共得到兩個肺癌骨轉(zhuǎn)移前后腫瘤細胞miRNA轉(zhuǎn)錄組文庫。將上述miRNA轉(zhuǎn)錄組文庫進行高通量測序，對高通量測序序列過濾,去除低質(zhì)量序列，使用S0AP2方法跟人類基因組進行比對。2. 3、生物信息學分析生物信息學分析流程Illumina測序所得50nt序列，通過去接頭、去低質(zhì)量、去污染等過程完成數(shù)據(jù)處理得到干凈序列，對其進行序列長度分布的統(tǒng)計及樣品間公共序列統(tǒng)計。將清理后的干凈序列分類注釋，可以獲得樣品中包含的各組分及表達量信息。將所有小RNA片段注釋后，用預(yù)測軟件Mireap對未得到注釋片段進行新的miRNA預(yù)測。具體生物信息學內(nèi)容如下數(shù)據(jù)處理對原始數(shù)據(jù)進行去除接頭、污染序列及低質(zhì)量reads的處理，并統(tǒng)計sRNA的長度分布，標準信息分析(I)分析樣品間的公共序列及特有序列；(2)探索sRNA在選定的參考基因組上的分布；(3)通過與Rfam(9. I)數(shù)據(jù)庫以及Genbank的比對,鑒定rRNA、tRNA、snRNA等非編碼RNA ；(4)通過與miRNA數(shù)據(jù)庫(miRBasel6. O)中指定范圍的miRNA進行比對,鑒定樣品中的已知miRNA ；(5)分析已知miRNA的表達模式；(6)通過與重復(fù)序列的比對，鑒定與重復(fù)序列相關(guān)的sRNA ；(7)通過與外顯子、內(nèi)含子的比對鑒定mRNA降解片段；(8)按照優(yōu)先級對sRNA進行分類注釋；(9)利用Mireap對沒有注釋的sRNA進行預(yù)測預(yù)測新的miRNA,繪制新的miRNA的二級結(jié)構(gòu)圖；
(10)參照Audic S.等人發(fā)表在Genome Research上的基于測序的差異基因檢測方法，分析了肺癌骨轉(zhuǎn)移前后病人的腫瘤細胞miRNA的差異表達。二結(jié)果通過使用Illumina Solexa Hiseq2000,利用 Single-end library 建庫方法,共得到兩個miRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分別為A和B，A為肺癌未轉(zhuǎn)移病人的腫瘤細胞miRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，B為肺癌骨轉(zhuǎn)移病人的腫瘤細胞的miRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。I. small RNA測序結(jié)果概述對這些初步的35nt左右的原始reads做去接頭,去低質(zhì)量reads,去污染等處理，得到高質(zhì)量的測序reads，其中A有25 100 000個reads，B有24 600 000個reads，后續(xù)分析均以此為基礎(chǔ)。首先對小RNA做長度分布統(tǒng)計，一般來說，miRNA集中在21或22nt，siRNA集中在24nt，piRNA集中在30nt。2個樣本的small RNA均在22nt位置呈現(xiàn)出明顯的單峰結(jié)構(gòu)(如圖I)，說明其大多數(shù)為miRNA。A組中20— 24nt的sRNAs占細胞總sRNA的51. 61 %，B組中20—24nt的sRNAs占細胞總sRNA的52. 28%。樣品中reads做分類注釋，得到2個樣本中各種小RNA的比例(如圖2)?？梢钥吹絤iRNA的含量最高，其次是未注釋的RNA(unarm)，其可能為siRNA和未發(fā)現(xiàn)的miRNA。2.新miRNA候選基因的預(yù)測將clean reads序列做分類注釋，我們獲得樣品中各類小RNA的表達信息，其包括miRNAs, rRNA, tRNA, scRNA, snRNA, snoRNA,重復(fù)序列相關(guān)小 RNA，mRNA 相關(guān) RNA 和未注釋的小RNA。除表達量最高的miRNAs之外，其次就是未注釋的小RNA。對新miRNA的生物信息學預(yù)測，是基于已知的miRNA加工成熟中的特點來實現(xiàn)的，長度為18-25nt，其對應(yīng)前體的位置能夠形成發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)，我們是利用miRNA預(yù)測軟件Mireap (https: //sourceforge. net/pro jects/mireap/)進行的，預(yù)測 miRNA 主要是根據(jù)miRNA的特殊結(jié)構(gòu)1、候選發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)的上游高度保守的模序的存在；2、sRNA必須在遠離發(fā)夾結(jié)構(gòu)環(huán)，位于發(fā)夾結(jié)構(gòu)兩臂上；3、酶切位點的保守性，一般的miRNA酶切位點不會偏移超過3個堿基；4、發(fā)夾前體要有較低的折疊自由能能量。分析發(fā)現(xiàn)了一些新的miRNA候選基因，共107條，其中在骨轉(zhuǎn)移前88條，骨轉(zhuǎn)移后76條。3.肺癌骨轉(zhuǎn)移前后病人的腫瘤細胞miRNA的差異表達分析為了分析肺癌骨轉(zhuǎn)移前后病人miRNA的差異表達，先將A、B兩個miRNA轉(zhuǎn)錄組的各個miRNAs標準化，某miRNA標準化表達=某miRNA實際數(shù)量X 1000000/轉(zhuǎn)錄組中reads的總數(shù)。如果某個miRNA在兩個轉(zhuǎn)錄組中的標準化reads之和小于1，則被剔除不再分析，如果某個miRNA在其中一個轉(zhuǎn)錄組中的表達值為O則其標準表達值為O. 01。倍數(shù)變化(fold-change)計算為Log2 (實驗組/對照組)。用下面方法計算P值
權(quán)利要求
1.一種miRNA novel_mir_30的特異性引物及特異性探針,其特征在于,所述的特異性引物包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列分別為SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3，特異性探針的核苷酸序列為SEQ ID NO. 4。
2.一種檢測肺癌骨轉(zhuǎn)移的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含有權(quán)利要求I所述的特異性引物和特異性探針。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種檢測肺癌骨轉(zhuǎn)移的熒光定量PCR試劑盒，還包括標準DNA 模板、Hot-start Taq DNA 聚合酶,其濃度為 2. 5U/μ I, Hot-start TaqDNA 聚合酶的IOXbuffer, dNTP 混合物，每種 NTP 濃度為 10mmol/L。
4.權(quán)利要求I的引物和探針在制備檢測肺癌骨轉(zhuǎn)移試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了檢測肺癌腫瘤細胞RNA變化的試劑盒。該試劑盒包括以下成分特異性引物、特異性探針、標準DNA模板、熒光定量PCR反應(yīng)液。本發(fā)明還公開了一種檢測肺癌骨轉(zhuǎn)移熒光定量PCR試劑盒的使用方法。利用該試劑盒可以快速定量檢測novel_mir_89的表達量，從而檢測肺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生情況。本發(fā)明操作簡便、快速、結(jié)果穩(wěn)定、靈敏度高且特異性強。
文檔編號C12N15/11GK102899405SQ20121034724
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月19日
發(fā)明者楊祚璋, 謝琳, 徐磊, 李國奇 申請人:楊祚璋