專利名稱：檢測(cè)男性腫瘤疾病遺傳易感性的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)男性腫瘤疾病遺傳易感性的試 劑盒，通過(guò)對(duì)男性腫瘤疾病遺傳風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的基因進(jìn)行檢測(cè)分析來(lái)評(píng)估個(gè)體男性腫瘤疾病遺傳易感性。
背景技術(shù)：
基因檢測(cè)分析技術(shù)己迅速成為預(yù)測(cè)人類疾病健康的重要工具?；蚣夹g(shù)能將人類的健康狀態(tài)和生理病 癥、遺傳突變的因素、疾病的傾向和狀態(tài)等關(guān)聯(lián)起來(lái)。DNA序列由于堿基插入、缺失、錯(cuò)配引發(fā)的遺傳因 子突變，以及個(gè)體DNA表達(dá)式的上下調(diào)節(jié)等都是和健康狀態(tài)及疾病的機(jī)理有關(guān)的生物信息。
例如，"老年性癡呆"是一種出現(xiàn)于老年期的持續(xù)性智能損害。遺傳基因是老年性癡呆的重要風(fēng)險(xiǎn)因 素，其中AP0E基因e4亞型與老年性癡呆患病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。如果攜帶2個(gè)拷貝AP0E e4等位基因(e4/e4)， 便屬于高風(fēng)險(xiǎn)人群。在沒(méi)有采取預(yù)防措施的情況下，65歲以下患老年性癡呆的可能性是60%到75%。而相 比之下，在AP0E基因e4等位基因檢測(cè)結(jié)果呈陰性的人群中，老年性癡呆的發(fā)病危險(xiǎn)不足10%。被測(cè)試者 可以根據(jù)基因檢測(cè)結(jié)果，采取積極預(yù)防措施，使發(fā)病年齡至少可以推遲10年。
又如，研究顯示P0N1基因的Glnl92Arg多態(tài)性與冠心病嚴(yán)重性、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展程度、血脂 水平和降血脂藥物治療效果都有相關(guān)。通過(guò)檢測(cè)中國(guó)北方地區(qū)49例老年冠心病患者和38例健康老年對(duì)照 者的P0N1的Gln/ Argl92基因多態(tài)性，研究發(fā)現(xiàn)冠心病組與健康組比較各基因型分布差異具有顯著性意 義。B等位基因在冠心病組比例為0. 56，在健康組為0. 37,冠心病組的B等位基因比例明顯高于健康組。 B等位基因是中國(guó)北方地區(qū)冠心病發(fā)病的危險(xiǎn)因素。說(shuō)明P0N1基因Gln/Arg192遺傳多態(tài)性與中國(guó)北方地 區(qū)冠心病發(fā)病明顯相關(guān)。通過(guò)檢測(cè)P0N1基因的Gln/ Argl92遺傳多態(tài)性能夠得到被檢測(cè)者的冠心病易感 性，可以根據(jù)檢測(cè)結(jié)果盡早采取預(yù)防措施，減小發(fā)病的可能性。
再如，p53突變和DNA甲基化在一定程度上預(yù)示了直腸癌的病理存在，進(jìn)行基因檢測(cè)可以在被測(cè)者身 體尚未顯現(xiàn)任何癥狀的情況下發(fā)現(xiàn)早期直腸癌，及早采取措施進(jìn)行治療，延長(zhǎng)生命。ALDH2基因的rs671 多態(tài)性改變(G/A)缺陷導(dǎo)致機(jī)體對(duì)乙醛的代謝能力下降，引起飲酒的不適感，臉紅綜合癥等，容易導(dǎo)致 酒精中毒。通過(guò)基因檢測(cè)分析可以預(yù)知個(gè)人是否會(huì)發(fā)生酒精中毒情況，可以進(jìn)行提前預(yù)防。相對(duì)于已經(jīng)發(fā) 生酒精中毒再進(jìn)行補(bǔ)救，基因檢測(cè)可以更好地保障生命健康。同樣對(duì)于一些藥物的使用，基因檢測(cè)可以得 知個(gè)體對(duì)藥物藥效與毒副作用的敏感性，基因檢測(cè)的結(jié)果可以作為醫(yī)師用藥的參考。

發(fā)明內(nèi)容
基于基因檢測(cè)分析技術(shù)可用來(lái)評(píng)估個(gè)體男性腫瘤疾病遺傳易感性的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種檢測(cè)男性 腫瘤疾病遺傳易感性的試劑盒。
本發(fā)明所述的試劑盒主要用于檢測(cè)與男性腫瘤疾病遺傳易感性相關(guān)的基因位點(diǎn)。通過(guò)檢測(cè)這些基因位 點(diǎn)，可得到被檢人男性腫瘤疾病遺傳易感性的情況，并向被檢人提供個(gè)體化健康指導(dǎo)報(bào)告。
該試劑盒包括
檢測(cè)CCND1、 CYP2A13、 CYP1A1、 CYP2E1、 ERCC2、 GSTM1、 GSTP1、 GSTT1、 MTHFR、 NQOl、 PARP1、 XRCC1
和ERCC1基因上16個(gè)SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)；
熒光定量PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCh溶液、反應(yīng)緩沖液、去離子水等)。 本試劑盒中所述的特異性引物對(duì)是指針對(duì)CCND1、 CYP2A13、 CYP1A1、 CYP2E1、 ERCC2、 GSTM1、 GSTP1、
GSTT1、 MTHFR、 NQOl、 PARP1、 XRCC1和ERCC1基因上16個(gè)SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能特異性擴(kuò)增出包含這些SNPs
位點(diǎn)的DNA片段的引物對(duì)。設(shè)計(jì)這類引物對(duì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成的。特異性引物對(duì)可用常規(guī)的
合成技術(shù)進(jìn)行合成。
本試劑盒中所述的特異性熒光探針對(duì)是指針CCND1、 CYP2A13、 CYP1A1、 CYP2E1、 ERCC2、 GSTM1、 GSTP1、 GSTT1、 MTHFR、 NQOl、 PARP1、 XRCC1和ERCC1基因上16個(gè)SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)特 異性檢測(cè)出這些SNPs位點(diǎn)基因型的Ta(pan探針對(duì)。設(shè)計(jì)這類探針是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成的。特 異性熒光探針對(duì)可用常規(guī)的探針合成技術(shù)進(jìn)行合成。所有可用于熒光定量PCR法檢測(cè)本發(fā)明中所述的16
個(gè)SNPs位點(diǎn)的探針均在本發(fā)明范圍內(nèi)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī) 條件，或按照廠商所建議的條件。
實(shí)施例l.檢測(cè)試劑盒的使用 步驟l: DNA模板的抽取
用硅膠吸附法抽提口腔上皮細(xì)胞的基因組DNA。 步驟2:熒光定量PCR反應(yīng)
使用檢測(cè)試劑盒，每個(gè)SNP位點(diǎn)分別進(jìn)行一次獨(dú)立的熒光定量PCR反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)的體系為總體積 lOpl，包含濃度為20ng/Vl的DNA模板2pl、 1^1 10 X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、0. 1^1 25mM dNTP混合 液、0.6jil 25mM MgCl2溶液、0. 025[d (5units/nl) Taq DNA聚合酶、20^M的引物每一條各0.225^1、 10nM的熒光探針每一條各0. 25nl,去離子水5. 325nl。
在ABI9700型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為50。C、 2分鐘，95°C、 IO分鐘，進(jìn)行60個(gè)循環(huán)的 95°C、 30秒，60°C、 l分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在ABI7900型熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。
步驟3: SNP基因型分析
熟悉熒光定量PCR技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過(guò)辨識(shí)熒光定量PCR儀上顯示的最終樣品熒光量，根 據(jù)不同序列探針的不同熒光信號(hào)的強(qiáng)弱即可確定所檢測(cè)的SNP位點(diǎn)的基因型。
實(shí)施例2.進(jìn)行男性腫瘤疾病遺傳易感性檢測(cè)的服務(wù) 步驟l: DNA提取
由醫(yī)院檢驗(yàn)科醫(yī)師指導(dǎo)被檢者使用口腔采樣拭進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞取樣，采用硅膠吸附法進(jìn)行口腔上皮 細(xì)胞的DNA抽提。
步驟2:基因分型檢測(cè)
使用本發(fā)明提供的試劑盒，對(duì)被檢測(cè)者基因組DNA的CCND1、 CYP2A13、 CYP1A1、 CYP2E1、 ERCC2、 GSTM1、 GSTP1、 GSTT1、 MTHFR、 NQOl、 PARP1、 XRCC1和ERCC1基因上16個(gè)SNP位點(diǎn)分別進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)， 確定這些SNP位點(diǎn)的基因型。
步驟3:男性腫瘤疾病遺傳易感性的分析
通過(guò)對(duì)被檢測(cè)者SNPs基因型的分析，出具男性腫瘤疾病遺傳易感性的分析報(bào)告單，并由醫(yī)師向被檢 者詳細(xì)說(shuō)明和解讀男性腫瘤疾病遺傳易感性分析報(bào)告單。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)男性腫瘤疾病遺傳易感性的試劑盒，其特征在于包括同時(shí)檢測(cè)CCND1、CYP2A13、CYP1A1、CYP2E1、ERCC2、GSTM1、GSTP1、GSTT1、MTHFR、NQO1、PARP1、XRCC1和ERCC1基因上16個(gè)SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于:所述的特異性引物對(duì)是指針對(duì)CCND1、CYP2A13、CYP1A1、 CYP2E1、 ERCC2、 GSTM1、 GSTP1、 GSTT1、 MTHFR、 NQOl、 PARP1、 XRCC1和ERCC1基因上16個(gè)SNP位點(diǎn)而設(shè) 計(jì)，能特異性擴(kuò)增出包含這16個(gè)SNPs位點(diǎn)的DNA片段的引物對(duì)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性熒光探針對(duì)是指針對(duì)CCND1、 CYP2A13、 CYP1A1、 CYP2E1、 ERCC2、 GSTM1、 GSTP1、 GSTT1、 MTHFR、 NQOl、 PARP1、 XRCC1和ERCC1基因上16個(gè)SNP 個(gè)SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)特異性檢測(cè)出這16個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型的Taqman探針對(duì)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)男性腫瘤疾病遺傳易感性的試劑盒。該試劑盒包括同時(shí)檢測(cè)CCND1、CYP2A13、CYP1A1、CYP2E1、ERCC2、GSTM1、GSTP1、GSTT1、MTHFR、NQO1、PARP1、XRCC1和ERCC1基因上16個(gè)SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)、用于熒光定量PCR檢測(cè)的常規(guī)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過(guò)同時(shí)檢測(cè)與男性腫瘤疾病遺傳易感性密切相關(guān)的16個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型來(lái)評(píng)估男性腫瘤疾病遺傳易感性。
文檔編號(hào)G01N21/00GK101354339SQ20071004428
公開(kāi)日2009年1月28日 申請(qǐng)日期2007年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月27日
發(fā)明者馮哲民, 鄒祖燁 申請(qǐng)人:上海主健生物工程有限公司