專利名稱：一種通過ercc2基因檢測(cè)肺癌易感性的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疾病易感性檢測(cè)用的試劑盒，尤其是一種檢瀾肺痛易感性的試劑盒，通過檢鑭切除修 寞爽合物2 ( Excision Rq ir Crpss-conpl咖enting Rodent Repair Deficiency,. Comptementttion Group 2, ERCC2)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)來預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)肺痛的易感性。背聚技術(shù)屎發(fā)性支氣管肺痛，簡(jiǎn)稱肺痛，為當(dāng)前世界各地《常見的惡性腫瘤之一，是一種嚴(yán)霣 人民 和 生余的疾病。腫癍細(xì)胞源于支氣管粘鵬Sl^體，常有區(qū)域性淋巴結(jié)和血行轉(zhuǎn)移，早期常有刺激性咳敏、瘐 中裙血等呼吸道癥狀，病情進(jìn)展速度與細(xì)胞的生物特性有關(guān)。半個(gè)世紀(jì)以來，世界各國(guó)肺痛的發(fā)病率和病死率都有明顯増布趨勢(shì),世界衛(wèi)生組織(WHO)2000年報(bào)吿: l訴7年全世界死于惡性腫癯的共706.5萬人，占死亡人數(shù)的12.6%,其中肺癌占惡性腫痛死亡的19%,居 SMt腫痛死因的第一位。我國(guó)1990 1992年的抽樣調(diào)査顯示，在城市入口的腫癯死亡中，肺痛由原來的 第4位上升為第1位，農(nóng)村上升條快的也是肺痛。云南錘礦的肺痛發(fā)病率在1954 1959年間為28.02/10 萬，1960~1969年間為197.87/10萬，1970~1979年間上升到219.10/10萬，這在全世界也是罕見的.英國(guó) 著名腫痛學(xué)家R.Peto預(yù)言如果我國(guó)不及時(shí)控制吸煙和空氣污染，到2025年我國(guó)每年肺痛將超過1加萬, 成為世界第一肺癌大國(guó)。病因和發(fā)病機(jī)制迄今尚未明確。 一致認(rèn)為肺癌的發(fā)病與下列因素有關(guān)①吸煙(包括主動(dòng)吸煙和被動(dòng) 吸煙)；②職業(yè)致痛因子，已被確認(rèn)的致人類肺痛的職業(yè)因素包括石棉、無機(jī)砷化合物、二豕甲睫、鉻及 其化合物、錁、氡、芥子氣、氣乙烯、煤煙、焦油和石油中的多環(huán)芳烴、煙草的加熱產(chǎn)物等③空氣污染 (包括室內(nèi)小環(huán)境和室外大環(huán)境污染)；④電離輻射⑤飲食與營(yíng)養(yǎng)，美國(guó)紐約和芝加哥開展的前瞻性人群農(nóng)察的結(jié)果說明，食物中天然維生素A類、e胡蘿卜素的攝入量與十幾年后痛癥的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，其中最k出的是肺癌；⑥其他，美國(guó)痛癥學(xué)會(huì)將結(jié)核列為肺痛的發(fā)病因素之一。有結(jié)核病者患肺痛的危險(xiǎn)性是 正常人群的10倍。其主要組織學(xué)類型是腺癌，此外，病毒感染、真菌毒素(黃曲S)、機(jī)體免疫功能低下、 內(nèi)分泌失調(diào)以及家族遺傳等因素，對(duì)肺痛的發(fā)生可能也起一定的綜合作用。近年研究表明，肺痛的發(fā)生與某些痛基因的活化及抑痛基因的失活密切相關(guān)。己經(jīng)證明的幾個(gè)痛基因 家族包括引起突變的ras族、放大基因的myc族、OerB2、機(jī)制不明的bcl-2、 Kit及由野生型變異的抗痛 基因p53、 P16和RB等。大量研究表明C-myc、 L-myc、 N-myc和RAF在小細(xì)胞肺痛中均有過度表達(dá)。 非小細(xì)胞肺痛中則?？梢娦褡寤虻倪^度表達(dá)。這些深入的研究將為基因預(yù)防和治療肺癌提供理論基礎(chǔ)。ERCC2,位于第13號(hào)染色體19ql3.3位置，共有23個(gè)外顯子，基因全長(zhǎng)19.0kb, mRNA全長(zhǎng)2355bp, 編碼含761個(gè)貧基酸的蛋白。由ERCC2編碼的蛋白參與轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的核苷酸切除修復(fù)，它可識(shí)別與修復(fù)結(jié) 構(gòu)無關(guān)的大范圍的損傷，如大的加合物和腳腺嘧啶二聚體，并且是基本轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物BTF2/TFHH的一 個(gè)組成成分，該蛋白具有ATP依賴性的DNA解旋活性，并且屬于RAD3/XPD解旋酶亞家族。ERCC2的 功能缺失導(dǎo)致基本轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物不能正確識(shí)別DNA損傷位點(diǎn)，從而使械基切除修復(fù)無法正確進(jìn)行，導(dǎo) 致DNA上的致痛損傷積累。ERCC2基因的突變或者失活可能導(dǎo)致的疾病包括癌癥、著色性千皮病、毛 發(fā)瑰營(yíng)養(yǎng)不良、柯凱因氏綜合癥。SNP(single nucleotide polyaorphism),即單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記，是一類基于單堿基變異引起的DNA 多審性，被遺傳學(xué)界稱為第三代遺傳標(biāo)記。主要是指由基因組核苷黢水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性， 包搪單堿基轉(zhuǎn)換、顛換，以及單堿基的插入/缺失等。它是基因組中最為廣泛存在的一類多態(tài)性標(biāo)記，占 大約90%,這些基因組序列變異可以導(dǎo)致個(gè)體間表型的差異以及不同個(gè)體對(duì)疾病，特別是寞雜疾病的易感 性、和對(duì)環(huán)埭因素、藥物反應(yīng)的差異，rel3181是位于第19號(hào)染色體ERCC2基因第23號(hào)外顯子段Lys751Gln的TVG多態(tài)，世界人群中的頻 率約為T:G《7訴:0.202，雜合度0.322,中國(guó)人群中的頻率約為T:G =0.91:0.訴。目前的多項(xiàng)研究表明， Lys751Gln的氛基酸替代位于ERCC2蛋白C-末端部，這個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性與肺痛、膀胱痛、乳腺痛、皮膚
痛等疾病有關(guān)。ERCC2 Lys751Gln位點(diǎn)的多態(tài)現(xiàn)象與肺痛特別是肺DI0的發(fā)生存在顯著關(guān)聯(lián)，rsl3181位 點(diǎn)攜帶G型即為肺痛易感型。

發(fā)明內(nèi)容
基于ERCC2基因上的rel3181號(hào)SNP位點(diǎn)可用來評(píng)估個(gè)體對(duì)肺痛的易移性的Sffll上，本發(fā)明提供一 種檢攤肺痛易感性的試劑盒。
該試劑盒包括檢測(cè)ERCC2基因SEQ ID NO: 1中第156位SNP的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針、 T叫,、dNTP混合液、MgCl:港液、熒光定豕PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水。
本試劑盒中所述的特異性引物對(duì)是指針對(duì)SEQ ID NO: 1中第156位SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能特異性擴(kuò)增 tft SEQ ID NO: 1中包含第156位SNP位點(diǎn)的DNA片段的引物對(duì)。設(shè)計(jì)這類別物對(duì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠 輕易完成的，優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO: 2和3所示序列的引物對(duì)。特異性引物對(duì)可用常規(guī) 的合成技術(shù)進(jìn)行合成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的引物不限于這兩對(duì)引物.
本試劑盒中所述的特異性熒光探針是指針對(duì)SEQ ID NO: 1中第156位SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能通過熒光 定置PCR技術(shù)特異性檢測(cè)出這個(gè)SNP位點(diǎn)肺癌易感基因型的探針。設(shè)計(jì)這類探針是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕 蠢完成的.優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQ IDNO: 4所示序列的T叫man探針。特異性熒光探針可用常規(guī) 的合成技術(shù)進(jìn)行合成*本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的特異性熒光探針不限于這條探針，所有可用 于熒光定量PCR檢測(cè)SEQ ID NO: 1中第156位SNP位點(diǎn)的探針均在本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括 lul 10 X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液， 0. lpl 25mM dNTP混合液， 0.6pl 25mMHgCl,溶液， 0.025ul (5units/pl) Taq DNA聚合酶， 加l0uM特異性引物對(duì)(兩條)各0.225ul， 10jdl特異性熒光探針0.25ul, 去離子水5.575u1本試劑盒供一人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20.C。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步解述本發(fā)明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī) ，或按照廠商所建議的條件，實(shí)例l.檢測(cè)試劑盒的使用 步驟l: DNA模板的抽取 用硅膠吸附法抽提口腔上皮細(xì)胞的基因組DNA。 步驟2:熒光定量PCR反應(yīng)使用可檢測(cè)肺痛易感性的熒光定蕭PCR檢測(cè)試劑盒，其中，含有下列引物對(duì)和熒光探針有義引物5' - ACTCAGGAGTCACCAGGAA -3，(SEQ ID NO: 2) Tm值為581C 反義引物5' - TCTGTTCTCTGCAGGAGGA -3' (SEQ ID NO: 3) Tm值為明TC熒光探針5' - AATCTGCTCTATCCTCTGCAGC -3' (SEQ ID NO: 4〉 Tm值為66TC熒光定量PCR反應(yīng)體系為總體積10fU,包含濃度為20ng/u1的DNA模板2}il、 lpl 10 X熒先定量PGR 反應(yīng)緩沖液、0. lfil 25mM dNTP混合液、0.6ul( 25mM MgCl，溶液、0.025ul (5units/pl〉 Taq DNA聚合,、 幼liM的有義引物和反義引物各0.225nl、 10nM的熒光探針0.25^1,去離子水5. 575fil,在旭I9700型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為501C、 2分鐘，95X:、 IO分鐘，進(jìn)行60個(gè)循環(huán)的951C、 30秒，601C、 l分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在旭I7恥0型熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。 步驟3: SNP基因型分析將熒光定置PCR儀上顯示的ft終樣品熒光量和正常對(duì)照相對(duì)比，熒光探針最終的熒光信號(hào)明顯離于正 常對(duì)照，說明被檢測(cè)DNA的ERCC2基因上rel3181號(hào)SNP位點(diǎn)基因型攜帶有G型，為肺痛易感型。實(shí)施例2.指導(dǎo)人們主動(dòng)預(yù)防肺痛的艇務(wù)目前在上海主健生物工程有限公司已經(jīng)開展了這項(xiàng)股務(wù). 步驟l:咖A提取對(duì)被檢擁者進(jìn)行股務(wù)前咨詢，由被檢測(cè)者簽署知情同意書，填寫生活飲食習(xí)慣問巻調(diào)査表，依照取樣 盒中的指示使用口腔采樣拭進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞取樣，采用桂膠吸附法進(jìn)行口扭上皮細(xì)胞的DNA抽提， 步驟2:基因分型檢測(cè)使用本發(fā)明提供的試劑盒,對(duì)被檢測(cè)者DNA的ERCC2基因上的isl3181號(hào)SNP位點(diǎn)進(jìn)行熒光定量PGR 推擁，確定該SNP位點(diǎn)的基因型。步雜3:指導(dǎo)人們主動(dòng)預(yù)防肺痛通過對(duì)被檢擁者SNP基因型的分析，出具基因分型檢翻報(bào)吿和被檢擁者個(gè)體化健摩街導(dǎo)報(bào)吿，基因推 糖報(bào)吿詳鄰說明了被檢擁者肺癯易感程度的離低以及患病的概率大小.個(gè)體ft健ift指導(dǎo)報(bào)吿以ll檢翻者的 籌因分型檢測(cè)結(jié)果為基礎(chǔ)，結(jié)合其生活飲食習(xí)憤問巻調(diào)査結(jié)果，評(píng)估被檢擁者肺痛逮傳縣感的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)， 一財(cái)制定出針對(duì)于被檢測(cè)者的個(gè)性化健康行動(dòng)方案，方案包括在飲食習(xí)慣、生活方式上的改進(jìn)建議等，并 為被檢測(cè)者普及預(yù)防肺癌的健康知識(shí)。
序列表<110>上海主健生物工程有限公司<1加> —種通過ERCC2基因檢測(cè)肺痛易感性的試劑盒<咖> 4<210> <211> <212> <213>1300 DNA 人屬'幸> 1gg^cgt辟cagg9acc鄉(xiāng)gcactcagagcctcc鄉(xiāng)ctg鄉(xiāng)ggggcac人種(Ho加sapiens, human)gtgagaaatg tcacct辟ct tcataagacc ttctagcacc accgccgctg 60cc鄉(xiāng)c幼ga ctcaggagtc accaggaacc gtttatggcc ccacccgccc 120tgctgagcaa tctgctctat cctcttcagc gtctcctctg attctagctg 180agc鄉(xiāng)辟ca ggcccagctg atcctcctgc agagaac卿ggaaagggag 240tgttgggcag gggccc鄉(xiāng)c agctgctgca cttccccaac cacccccccg 300<210> 2 <211> 19 <212> DNA <213>人工序列<幼0><223>引物 2actc鄉(xiāng)agt caccaggaa 19<210> <211> <212> <213>319鵬A人工序列<220><223>引物 <柳> 3tctgttctct gcaggag辟 19<210> 4 <211> 22 <212>咖A <213>人:l:序列<2加> <223>探針<柳> 4幼tctgctct atcctctgca gc 2權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)肺癌易感性的試劑盒，其特征在于包括檢測(cè)ERCC2基因SEQ ID NO1中第156位SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性引物對(duì)是指針對(duì)SEQIDNOt 1中第156 位SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能特異性擴(kuò)堆出包含SEQ ID NO: 1中第156位SNP位點(diǎn)的DNA片段的引物對(duì)，
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性熒光探針是指針對(duì)SEQ IDNO: l中第 156位SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，Hgil過熒光定童PCR技術(shù)特異性檢劂出該SNP位點(diǎn)肺痛易感基因型的探針.
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性弓I物對(duì)選自具有SEQ IDNO: 2和3所 示序列的引物對(duì)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性熒光探針選自具有SEQ IDNO: 4所示序列的Taqman探針。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含貴包括IOX熒光定量PCR反 應(yīng)敏沖液，0.1^1 25nM dNTP混合液，0.6|xl 25nM MgCl2溶液，O.Q25(il (5witsAi1) Taq DNA衆(zhòng)合酶， 加MM特異性引物對(duì)(兩條)各0.225pl， lOnM特異性熒光探針0.25^1，去離子水5.575pl。本試劑盒供 —人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-201C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于檢測(cè)肺癌易感性的試劑盒。該試劑盒包括檢測(cè)ERCC2基因SEQ ID NO1中第156位SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針、用于熒光定量PCR檢測(cè)的常規(guī)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過檢測(cè)分析個(gè)體的ERCC2基因上SNP位點(diǎn)基因攜帶型來預(yù)測(cè)個(gè)體對(duì)肺癌的易感性。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101130812SQ20061003038
公開日2008年2月27日 申請(qǐng)日期2006年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月25日
發(fā)明者馮哲民, 鄒祖燁 申請(qǐng)人:上海主健生物工程有限公司