專利名稱：一種檢測(cè)與SARS－CoV感染相關(guān)的易感基因MBL基因型的方法及MBL易感基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)人群預(yù)防中的個(gè)體易感性及其遺傳學(xué)檢測(cè)方法。具體地，本發(fā)明涉及與SARS冠狀病毒(SARSCoronavirus，SARS-CoV)感染相關(guān)的易感基因甘露糖結(jié)合凝集素(mannose-binding lectin，MBL)基因的基因型檢測(cè)方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及上述易感基因基因型的檢測(cè)試劑盒，以及該試劑盒的應(yīng)用。另外，本發(fā)明還涉及上述檢測(cè)方法和易感基因在SARS的預(yù)防和控制以及遺傳咨詢中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
SARS是新近確定的人類傳染性疾病，由一種新型的冠狀病毒SARS-CoV引起。截止到2003年6月底，短短半年多的時(shí)間內(nèi)全球25個(gè)國(guó)家以上共報(bào)道8000多SARS病例，其中700多例死亡。SARS的迅速傳播、強(qiáng)感染性、難以預(yù)料的臨床進(jìn)展和高死亡率使其成為全球范圍內(nèi)的嚴(yán)重威脅。鑒于此，有效預(yù)防和治療該疾病是我國(guó)及至世界公眾健康的一個(gè)重要目標(biāo)。
資料顯示，個(gè)體對(duì)于SARS的易感性是不一樣的；比如，SARS-CoV血清反應(yīng)陽(yáng)性的個(gè)體可能患SARS，也可能只表現(xiàn)出輕微的感染癥狀。正如其它大多數(shù)傳染性疾病一樣，SARS的發(fā)展可能也是病原微生物、宿主遺傳因素和環(huán)境之間復(fù)雜的相互作用的結(jié)果。先前已有報(bào)道表明年老、糖尿病以及心臟病是SARS發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)因素；然而，機(jī)體遺傳因素對(duì)于SARS易感性的影響程度尚了解不多。雖然已有報(bào)道表明人類組織相容性復(fù)合體(HLA)基因的多態(tài)性(如HLA-B*4601、HLA-B*0703和HLA-DRB1*0301)與SARS發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，然而我們知道，獲得性免疫反應(yīng)從識(shí)別病原微生物(如SARS-CoV)到產(chǎn)生足夠多的具有保護(hù)作用的特異性抗體需要一定的時(shí)間。因此，在獲得性免疫反應(yīng)無(wú)法對(duì)機(jī)體提供有效保護(hù)作用期間，早期的非特異性的固有免疫反應(yīng)很可能在決定疾病的易感性方面起著更為重要的作用。
MBL是一種屬于膠凝素(collectin)家族的血清蛋白，在先天的固有免疫反應(yīng)中擔(dān)負(fù)重要角色。MBL是一種肝細(xì)胞來(lái)源的急性期反應(yīng)蛋白，它能夠通過(guò)其多個(gè)凝集素結(jié)構(gòu)域結(jié)合到入侵機(jī)體的細(xì)菌、真菌、病毒和原蟲(chóng)表面的重復(fù)甘露糖和N-乙酰氨基葡萄糖的糖結(jié)構(gòu)域上。MBL結(jié)合的這些部位是病原微生物的特征性結(jié)構(gòu)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表面并不存在。在結(jié)合到病原微生物上之后，MBL至少可以引發(fā)兩種保護(hù)作用。第一，MBL通過(guò)凝集素途徑介導(dǎo)補(bǔ)體系統(tǒng)的活化，這并不需要抗體的參與；第二，MBL能夠通過(guò)膠凝素受體直接促使吞噬調(diào)理作用。離體、在體實(shí)驗(yàn)均表明MBL缺陷可能對(duì)固有免疫系統(tǒng)的激活具有重要影響，并使得機(jī)體受到嚴(yán)重感染的風(fēng)險(xiǎn)增加。
已知，在對(duì)病毒感染起重要作用的SARS-CoV的S蛋白上，具有甘露糖等MBL可識(shí)別的糖結(jié)構(gòu)域類型。人們還發(fā)現(xiàn)在雞中，MBL能夠于體液免疫反應(yīng)發(fā)生之前參與中和傳染性支氣管炎冠狀病毒(IBV)。由于IBV與SARS-CoV一樣是冠狀病毒家族的成員，因此，有可能MBL也能夠結(jié)合到SARS-CoV的S蛋白上，并可能通過(guò)上面提到的兩種途徑發(fā)揮其抗病毒作用。
MBL在血清中的含量很大程度上受MBL基因的遺傳多態(tài)性控制。已知MBL基因具有一個(gè)位于編碼區(qū)的SNP G+230A，當(dāng)基因型為+230G/A或+230A/A時(shí)，血清MBL含量可為野生基因型+230G/G血清含量的10％或更低。MBL基因啟動(dòng)子區(qū)另外有2個(gè)SNP(G-550C和G-221C)與G+230A一起可影響血清中的MBL含量。對(duì)于由G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)這3個(gè)SNP組成的單倍型而言，決定血清中MBL表達(dá)水平為高的單倍型對(duì)包括HYA/HYA、HYA/LYA、HYA/LXA、LYA/LYA和LYA/LXA，決定血清中MBL表達(dá)水平為中的單倍型包括LXA/LXA、HYA/LYB和LYA/LYB，決定血清中MBL表達(dá)水平為低的單倍型包括LXA/LYB和LYB/LYB。
基于以上MBL的生物學(xué)功能，我們因此推測(cè)，MBL有可能是SARS-CoV感染的易感基因。MBL基因中的多態(tài)性影響MBL在血清中的表達(dá)水平，進(jìn)而導(dǎo)致基因型依賴性的SARS-CoV感染易感性的差異。
本發(fā)明的目的是通過(guò)病例-對(duì)照研究，分析MBL基因中上述可決定其血清含量的多態(tài)性位點(diǎn)，以檢查這些多態(tài)性位點(diǎn)和SARS-CoV感染易感性間是否具有相關(guān)性。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人通過(guò)病例-對(duì)照研究，分析了可決定血清中MBL表達(dá)水平的MBL基因的多態(tài)性，考察了MBL基因的這些多態(tài)性位點(diǎn)與SARS-CoV感染易感性的相關(guān)性。通過(guò)基于醫(yī)院的大規(guī)模病例對(duì)照研究，進(jìn)行了大量的臨床及實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)和大樣本的統(tǒng)計(jì)分析，判明攜帶MBL的230G/A或230A/A基因型的個(gè)體對(duì)SARS-CoV感染有更高的易感性。同時(shí)還判明，攜帶中或低MBL表達(dá)水平的單倍型的個(gè)體對(duì)SARS-CoV感染有更高的易感性(其中，決定血清中MBL表達(dá)水平為中的單倍型包括LXA/LXA、HYA/LYB和LYA/LYB，決定血清中MBL表達(dá)水平為低的單倍型包括LXA/LYB和LYB/LYB；這些單倍型是由MBL基因的G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)這3個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)構(gòu)建而成的)。
因此本發(fā)明鑒定了SARS-CoV感染的一種新的易感基因及其易感基因型和易感單倍型。
本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)與SARS-CoV感染易感性關(guān)聯(lián)的易感位點(diǎn)G+230A基因型的方法，該方法為PCR產(chǎn)物測(cè)序法。
本發(fā)明還提供了一種通過(guò)檢測(cè)MBL基因的G+230A位點(diǎn)來(lái)判定個(gè)體對(duì)SARS-CoV感染是否易感的方法。
本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)與SARS-CoV感染易感性關(guān)聯(lián)的易感單倍型LXA/LXA、HYA/LYB、LYA/LYB、LXA/LYB和LYB/LYB的方法，該方法為以PCR產(chǎn)物測(cè)序法確定G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)這3個(gè)SNP的基因型，然后以PHASE程序計(jì)算個(gè)體的單倍型。
本發(fā)明還提供了一種通過(guò)檢測(cè)由MBL基因的G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)這3個(gè)SNP組成的單倍型LXA/LXA、HYA/LYB、LYA/LYB、LXA/LYB和LYB/LYB來(lái)判定個(gè)體對(duì)SARS-CoV感染是否易感的方法。
本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)MBL基因多態(tài)性位點(diǎn)G-550C、G-221C和G+230A的引物對(duì)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種檢測(cè)與SARS-CoV感染關(guān)聯(lián)的MBL基因的G+230A位點(diǎn)及易感單倍型所包括的其它2個(gè)位點(diǎn)(G-550C和G-221C)的試劑盒，以及上述試劑盒在人群中預(yù)防與控制SARS-CoV感染的應(yīng)用。
一、如上所述，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)與SARS-CoV感染易感性關(guān)聯(lián)的MBL基因的G+230A位點(diǎn)基因型的方法，該方法為PCR產(chǎn)物測(cè)序法。具體的說(shuō)，包括了如下步驟1)對(duì)MBL基因G+230A位點(diǎn)所在區(qū)域設(shè)計(jì)基因序列特異性引物，并對(duì)樣本基因組DNA進(jìn)行熱啟動(dòng)和梯度的特異性PCR擴(kuò)增；2)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，以此判明MBL基因G+230A位點(diǎn)的基因型。
二、本發(fā)明提供了與SARS-CoV感染易感性關(guān)聯(lián)的2種易感基因型，即MBL基因的230G/A或230A/A基因型為SARS-CoV感染的易感基因型。并提供了一種通過(guò)檢測(cè)MBL基因G+230A位點(diǎn)的基因型來(lái)判定人群或個(gè)體對(duì)SARS-CoV感染易感性的方法。該方法包括1)對(duì)MBL基因G+230A位點(diǎn)所在區(qū)域設(shè)計(jì)基因序列特異性引物，并對(duì)樣本基因組DNA進(jìn)行熱啟動(dòng)和梯度的特異性PCR擴(kuò)增；2)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，以此判明MBL基因G+230A位點(diǎn)的基因型；3)當(dāng)某一個(gè)體的MBL基因的G+230A位點(diǎn)表現(xiàn)為230G/A或230A/A基因型時(shí)，則表明該個(gè)體在SARS-CoV感染流行時(shí)感染該病毒的風(fēng)險(xiǎn)更高。
三、本發(fā)明提供了與SARS-CoV感染易感性關(guān)聯(lián)的5種易感單倍型，即MBL基因LXA/LXA、HYA/LYB、LYA/LYB、LXA/LYB或LYB/LYB等5種單倍型組合為SARS-CoV感染的易感基因型。并提供了一種通過(guò)檢測(cè)由MBL基因的G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G-230A(A/B)這3個(gè)SNP組成的單倍型來(lái)判定人群或個(gè)體對(duì)SARS-CoV感染易感性的方法。具體的說(shuō)，包括了如下步驟1)對(duì)MBL基因G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)這3個(gè)位點(diǎn)所在區(qū)域設(shè)計(jì)基因序列特異性引物，并對(duì)樣本基因組DNA進(jìn)行熱啟動(dòng)和梯度的特異性PCR擴(kuò)增；2)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，以此判明MBL基因G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)這3個(gè)位點(diǎn)的基因型；3)以PHASE程序計(jì)算各個(gè)體中由MBL基因的G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)這3個(gè)位點(diǎn)組成的單倍型。
四、本發(fā)明提供了一種檢測(cè)與SARS-CoV感染易感性關(guān)聯(lián)的MBL基因的單倍型LXA/LXA、HYA/LYB、LYA/LYB、LXA/LYB和LYB/LYB的方法，該方法為以PCR產(chǎn)物測(cè)序法確定MBL基因的G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)這3個(gè)SNP的基因型，并以PHASE程序計(jì)算個(gè)體的單倍型。具體的說(shuō)，包括了如下步驟1)對(duì)MBL基因G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)這3個(gè)位點(diǎn)所在區(qū)域設(shè)計(jì)基因序列特異性引物，并對(duì)樣本基因組DNA進(jìn)行熱啟動(dòng)和梯度的特異性PCR擴(kuò)增；2)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，以此判明MBL基因G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)這3個(gè)位點(diǎn)的基因型；3)以PHASE程序計(jì)算各個(gè)體中由MBL基因的G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)這3個(gè)位點(diǎn)組成的單倍型。
4)當(dāng)某一個(gè)體表現(xiàn)為L(zhǎng)XA/LXA、HYA/LYB、LYA/LYB、LYA/LYB或LYB/LYB單倍型時(shí)，則表明該個(gè)體在SARS-CoV感染流行時(shí)感染該病毒的風(fēng)險(xiǎn)更高。
五、檢測(cè)MBL基因G+230A位點(diǎn)基因型的特異性引物對(duì)的序列為正向引物5’-CGGTCCCATTTGTTCTCACT-3’反向引物5’-TCACAAACTGCTGTGTGGAAT-3’檢測(cè)MBL基因的G-550C和G-221C位點(diǎn)基因型的特異性引物對(duì)的序列為正向引物5’-AATGGGAGGAGGATTCAAGG-3’反向引物5’-CCTTGTGACACTGCGTGACT-3’
六、本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種檢測(cè)與SARS-CoV感染關(guān)聯(lián)的MBL基因的G+230A位點(diǎn)及易感單倍型所包括的其它2個(gè)位點(diǎn)(G-550C和G-221C)的試劑盒，其內(nèi)裝有一個(gè)或多個(gè)容器，容器內(nèi)裝有用以檢測(cè)G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)這3個(gè)位點(diǎn)基因型的一種或多種組分。與之同時(shí)提供的可以是經(jīng)政府食品與藥品監(jiān)督管理部門(mén)審核的、有關(guān)藥品或生物制品制造、使用及銷售方面的信息。例如，在DNA的PCR擴(kuò)增方法實(shí)施中，直接檢測(cè)樣品的G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)這3個(gè)位點(diǎn)基因型的試劑盒，含有PCR的引物對(duì)(5’-CGGTCCCATTTGTTCTCACT-3’和5’-TCACAAACTGCTGTGTGGAAT-3’5’-AATGGGAGGAGGATTCAAGG-3’和5’-CCTTGTGACACTGCGTGACT-3’)，dNTPs，用于PCR反應(yīng)的DNA聚合酶及其緩沖液等。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，以上的組分僅是示意性的，所述用于PCR反應(yīng)的DNA聚合酶可以是TaqDNA聚合酶，例如，HotStar Taq酶、Klenow片段，Tth DNA聚合酶，VENT DNA聚合酶等能夠用于PCP擴(kuò)增的酶。但為保證特異性擴(kuò)增，除了引物和反應(yīng)條件的優(yōu)化外，應(yīng)優(yōu)選HotStar Taq酶。
使用方法說(shuō)明如下對(duì)樣品基因組DNA(其具體制備方法參見(jiàn)實(shí)施例)，分別用本發(fā)明提供的2對(duì)引物，按照如下反應(yīng)體系和條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增12.5-μl反應(yīng)體系為20～100ng基因組DNA，0.2μM引物，0.2mM dNTP，1.5nM MgCl2，1.0 unit HotStarTaqTMDNA聚合酶以及1×緩沖液(QIAGEN，Chatsworth，CA)。95℃ 15min預(yù)變性后進(jìn)行2個(gè)階段的擴(kuò)增，其變性和延伸條件一致，均為94℃30s和72℃50s，在第一階段的13個(gè)循環(huán)中，退火溫度從62℃開(kāi)始每個(gè)循環(huán)降0.5℃，第二階段擴(kuò)增的退火溫度則固定在56℃，最后的72℃延伸時(shí)間為7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)常規(guī)測(cè)序，根據(jù)峰圖判斷基因型。
七、本發(fā)明提供了與SARS-CoV感染易感性關(guān)聯(lián)的MBL基因G+230A位點(diǎn)及易感單倍型所包括的其它2個(gè)位點(diǎn)(G-550C和G-221C)的檢測(cè)方法及其在SARS-CoV感染人群預(yù)防和控制中的應(yīng)用。例如，由于本發(fā)明證實(shí)了MBL基因G+230A位點(diǎn)，或由G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)這3個(gè)位點(diǎn)組成的單倍型組合LXA/LXA、HYA/LYB、LYA/LYB、LXA/LYB或LYB/LYB，與SARS-CoV感染易感性存在關(guān)聯(lián)，因此，在SARS-CoV感染人群的預(yù)防和控制中，就需要對(duì)所咨詢的對(duì)象進(jìn)行MBL基因的G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)的基因型進(jìn)行分析，以判斷該對(duì)象是否攜帶有SARS-CoV感染易感基因型230G/A或230A/A，或者攜帶有易感單倍型組合LXA/LXA、HYA/LYB、LYA/LYB、LXA/LYB或LYB/LYB。對(duì)具有MBL基因230G/A或230A/A基因型，或者具有易感單倍型組合LXA/LXA、HYA/LYB、LYA/LYB、LXA/LYB或LYB/LYB的個(gè)體(表現(xiàn)為對(duì)SARS-CoV感染具有更高的易感性)，則可對(duì)之進(jìn)行科學(xué)的干預(yù)，包括建議及早進(jìn)行治療性預(yù)防或者若有可能則接種SARS疫苗等，這樣可以針對(duì)性地降低這些易感人群的SARS-CoV感染的風(fēng)險(xiǎn)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1該實(shí)施例設(shè)計(jì)并合成了2對(duì)引物，并且在該引物對(duì)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了一種檢測(cè)與SARS-CoV感染易感性關(guān)聯(lián)的MBL基因的G+230A位點(diǎn)，以及由G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)這3個(gè)SNP位點(diǎn)組成的易感單倍型組合LXA/LXA、HYA/LYB、LYA/LYB、LXA/LYB或LYB/LYB的方法。
1、基因組DNA的提取采取本領(lǐng)域常規(guī)的Miller改良鹽析法提取外周血白細(xì)胞基因組DNA。
1)取檸檬酸鈉或EDTA-Na2抗凝全血5ml(盡量不用肝素抗凝)，置于50ml有蓋離心管；2)加入3-5倍體積冷蒸餾水，反復(fù)顛倒混勻，冰中放置5分鐘，4℃2000rpm離心20分鐘；3)緩慢傾倒上清，沉淀加入預(yù)冷的0.1％Triton-X100((體積同上)，輕柔混勻沉淀，如上離心，棄上清；4)沉淀加入4ml裂解液(50Mm Tris-Cl-10mM EDTA，pH8.0)，徹底打碎沉淀，然后加入10％SDS至終濃度為0.5％，混勻；5)加入蛋白酶K(10mg/ml)至終濃度為200μg/ml，混勻，55℃3小時(shí)或37℃過(guò)夜消化(以過(guò)夜消化為佳)；6)加入6M NaCl 1.2ml，劇烈振蕩20秒，2,200rpm離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至另一個(gè)有蓋離心管；7)加入2倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇，反復(fù)顛倒混勻至出現(xiàn)絮狀DNA沉淀，挑出DNA至另一Eppendorf管；8)以75％預(yù)冷乙醇洗滌DNA沉淀2次；9)以0.5ml TE(10mM Tris-Cl-EDTA，pH8.0)或蒸餾水溶解DNA沉淀，電泳檢測(cè)DNA片段大小，或測(cè)260/2.80nm OD比值。
2、PCR擴(kuò)增分別用本發(fā)明提供的2對(duì)引物，按照如下反應(yīng)體系和條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增12.5-μl反應(yīng)體系為20～100ng基因組DNA，0.2μM引物，0.2mM dNTP，1.5mM MgCl2，1.0unitHotStarTaqTMDNA聚合酶以及1×緩沖液(QIAGEN，Chatsworth，CA)。95℃15min預(yù)變性后進(jìn)行2個(gè)階段的擴(kuò)增，其變性和延伸條件一致，均為94℃ 30s和72℃ 50s，在第一階段的13個(gè)循環(huán)中，退火溫度從62℃開(kāi)始每個(gè)循環(huán)降0.5℃，第二階段擴(kuò)增的退火溫度則固定在56℃。最后的72℃延伸時(shí)間為7min。PCR產(chǎn)物以測(cè)序法鑒定G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)這3個(gè)位點(diǎn)的基因型。
3、單倍型計(jì)算對(duì)于已經(jīng)測(cè)出G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)這3個(gè)位點(diǎn)的基因型的個(gè)體而言，應(yīng)用PHASE程序計(jì)算出其相應(yīng)的單倍型。
實(shí)施例2該實(shí)施例用實(shí)施例1建立起來(lái)的方法，對(duì)352例SARS患者、392例健康對(duì)照個(gè)體的MBL基因的G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)這3個(gè)位點(diǎn)的基因型進(jìn)行了分析。
1、試驗(yàn)對(duì)象2003年5月到2003年7月期間，從北京小湯山醫(yī)院的病房里收集符合世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)的SARS患者352例。這352例患者中，52例患有一些可能增加SARS風(fēng)險(xiǎn)的基礎(chǔ)性疾病，如糖尿病、高血壓、心臟病、肺結(jié)核、哮喘和腫瘤等重要疾病(為PI組)；另有20例是患有嚴(yán)重SARS的患者，他們?nèi)胱≈匕Y監(jiān)護(hù)病房(ICU)或者死亡(為PII組)；剩下280例為PIII組。另收集年齡、性別和種族匹配的健康個(gè)體392例作為對(duì)照人群。樣本收集過(guò)程按照國(guó)家人類基因組研究倫理學(xué)準(zhǔn)則進(jìn)行，并獲得了被募集對(duì)象的知情同意。
2、確定MBL基因G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)這3個(gè)位點(diǎn)的基因型及由此3個(gè)位點(diǎn)構(gòu)成的單倍型352例SARS患者和392例健康對(duì)照個(gè)體中MBL基因G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)這3個(gè)位點(diǎn)的基因型頻率分布如表1所示。
當(dāng)PI+PII+PIII與對(duì)照比較時(shí)，230G/G的頻率在SARS患者和健康對(duì)照中分別為65.6％和76.8％(OR值為1.73)，決定血清中MBL表達(dá)水平為高的單倍型的頻率在SARS患者和健康對(duì)照中分別為64.0％和74.5％(OR值為1.67)；當(dāng)PII+PIII與對(duì)照比較時(shí)，230G/G在SARS患者和健康對(duì)照中的頻率分別為64.3％和76.8％(OR值為1.84)；決定血清中MBL表達(dá)水平為高的單倍型組合的頻率在SARS患者和健康對(duì)照中分別為63.1％和74.5％(OR值為1.75)。因此，用本發(fā)明的方法解析了MBL的G+230A多態(tài)性位點(diǎn)及由G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)這3個(gè)位點(diǎn)組成的單倍型組合與SARS感染易感性的相關(guān)性。
應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，但所作改動(dòng)或修改的等價(jià)形式同樣落在本申請(qǐng)權(quán)利書(shū)所限定的范圍之內(nèi)。

CI可信限。通過(guò)執(zhí)行l(wèi)ogistic回歸分析多態(tài)性位點(diǎn)是否與SARS感染的易感性關(guān)聯(lián)，分析時(shí)校正了年齡和性別這兩種風(fēng)險(xiǎn)因素，并進(jìn)行了多重檢驗(yàn)校正。
a決定血清中MBL表達(dá)水平為高的單倍型組合包括HYA/HYA、HYA/LYA、HYA/LXA、IYA/LYA和LYA/LXA，決定血清中MBL表達(dá)水平為中的單倍型組合包括LXA/LXA、HYA/LYB和LYA/LYB，決定血清中MBL表達(dá)水平為低的單倍型組合包括LXA/LYB和LYB/LYB。
bG-550CG/G基因型與G/C+C/C基因型比較；G-221CG/G基因型與G/C+C/C基因型比較；G+230AG/G基因型與G/A+A/A基因型比較；單倍型高與中+低比較。
分型樣本的數(shù)目因?yàn)樯贁?shù)個(gè)體分型的失敗而有所變化。
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序列表<110>中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所<120>一種檢測(cè)與SARS-CoV感染相關(guān)的易感基因MBL基因型的方法及MBL易感基因<160>4<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1CGGTCCCATT TGTTTCTCACT 20<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2TCACAAACTG CTGTGTGGAA T 21<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3AATGGGAGGA GGATTCAAGG 20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4CCTTGTGACA CTGCGTGACT 20
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)MBL基因的G+230A位點(diǎn)的基因型的方法，該方法為PCR產(chǎn)物測(cè)序法，其特征在于包括以下方面1)對(duì)包含G+230A多態(tài)位點(diǎn)的MBL基因序列，設(shè)計(jì)特異性的引物，其序列為正向引物見(jiàn)序列表中序列1反向引物見(jiàn)序列表中序列2；2)對(duì)包含G+230A多態(tài)位點(diǎn)的MBL基因區(qū)域，以所設(shè)計(jì)引物，通過(guò)熱啟動(dòng)和梯度的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，以基因特異性引物進(jìn)行DNA擴(kuò)增；3)對(duì)PCR產(chǎn)物以常規(guī)測(cè)序法測(cè)序，根據(jù)測(cè)序峰圖結(jié)果判斷G+230A的基因型。
2.如權(quán)利要求1所述檢測(cè)MBL基因的G+230A位點(diǎn)的基因型的方法，其特征在于對(duì)包含G+230A多態(tài)位點(diǎn)的MBL基因序列所設(shè)計(jì)的特異性引物，其序列為正向引物見(jiàn)序列表中序列1；反向引物見(jiàn)序列表中序列2。
3.一種通過(guò)檢測(cè)MBL基因的G+230A位點(diǎn)來(lái)判定個(gè)體對(duì)SARS-CoV感染是否易感的方法，其特征在于當(dāng)某一個(gè)體的MBL基因的G+230A位點(diǎn)表現(xiàn)為基因型G/A或A/A時(shí)，則表明該個(gè)體對(duì)SARS-CoV感染具有更高的易感性。
4.一種檢測(cè)MBL基因的G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)3個(gè)SNP組成的單倍型的方法，該方法為PCR產(chǎn)物測(cè)序法，并以PHASE程序計(jì)算單倍型，其特征在于包括以下方面1)對(duì)包含G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)這3個(gè)SNP位點(diǎn)的MBL基因序列，設(shè)計(jì)特異性的引物，檢測(cè)MBL基因G+230A位點(diǎn)基因型的特異性引物對(duì)的序列為正向引物見(jiàn)序列表中序列1，反向引物見(jiàn)序列表中序列2；檢測(cè)MBL基因的G-550C和G-221C位點(diǎn)基因型的特異性引物對(duì)的序列為正向引物見(jiàn)序列表中序列3，反向引物見(jiàn)序列表中序列4；2)對(duì)PCR產(chǎn)物以常規(guī)測(cè)序法測(cè)序，根據(jù)測(cè)序峰圖結(jié)果判斷G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)這3個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型；3)以PHASE程序計(jì)算各個(gè)體中由MBL基因的G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)這3個(gè)位點(diǎn)組成的單倍型。
5.一種通過(guò)檢測(cè)MBL基因的G-550C(H/L)、G-221C(Y/X)和G+230A(A/B)3個(gè)SNP組成的單倍型來(lái)判定個(gè)體對(duì)SARS-CoV感染是否易感的方法，其特征在于當(dāng)某一個(gè)體的MBL的單倍型組合表現(xiàn)為L(zhǎng)XA/LXA、HYA/LYB、LYA/LYB、LXA/LYB或LYB/LYB時(shí)，則表明該個(gè)體對(duì)SARS-CoV感染具有更高的易感性。
6.一種檢測(cè)與SARS-CoV感染關(guān)聯(lián)的MBL基因的G+230A位點(diǎn)及易感單倍型所包括的其它2個(gè)位點(diǎn)(G-550C和G-221C)的試劑盒，包括擴(kuò)增用基因特異性引物、dNTP、用于PCR反應(yīng)的DNA聚合酶及其緩沖液的一種或多種，以及用于測(cè)序用的試劑中的一種或多種。
7.如權(quán)利要求1-6所述的任一項(xiàng)方法或其試劑盒在SARS-CoV感染的人群預(yù)防和控制以及遺傳咨詢中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及與SARS－CoV感染易感性相關(guān)的甘露糖結(jié)合凝集素基因(MBL)的G+230A的一種檢測(cè)方法，所述方法為PCR產(chǎn)物測(cè)序法。本發(fā)明還涉及與SARS－CoV感染易感性相關(guān)的由MBL基因G－550C、G－221C和G+230A這3個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)(SNP)組成的單倍型的檢測(cè)方法，所述方法為先用PCR產(chǎn)物測(cè)序確定3個(gè)SNP位點(diǎn)基因型，然后用PHASE程序計(jì)算單倍型。本發(fā)明進(jìn)一步涉及檢測(cè)上述多態(tài)性位點(diǎn)的試劑盒及使用。另外，本發(fā)明將MBL的G+230A多態(tài)位點(diǎn)及由G－550C、G－221C和G+230A這3個(gè)SNP組成的單倍型與SARS－CoV感染的易感性聯(lián)系起來(lái)，確定了MBL是SARS－CoV感染的一個(gè)新型易感基因，為SARS－CoV感染的人群預(yù)防和控制提供了新的遺傳咨詢內(nèi)容。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1896272SQ20051008299
公開(kāi)日2007年1月17日 申請(qǐng)日期2005年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月12日
發(fā)明者賀福初, 周鋼橋, 張紅星, 翟蕓, 智聯(lián)騰, 楊灝 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所