專利名稱：一種檢測(cè)線粒體糖尿病45個(gè)基因位點(diǎn)膜芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為一種檢測(cè)線粒體糖尿病45個(gè)基因位點(diǎn)膜芯片。可滿足不同層次醫(yī)院的要求，適用于糖尿病患者和高危人群的檢測(cè)，有助于臨床特殊類型糖尿病的正確診斷和分類，早發(fā)現(xiàn)病人，早預(yù)防，早治療。
背景技術(shù)：
糖尿病是一種由胰島素分泌缺陷和/或胰島素作用障礙所致的復(fù)雜代謝性疾病，發(fā)病率逐年上升，我國(guó)的糖尿病發(fā)病人數(shù)位居世界第二，其中90％為2型糖尿病，且發(fā)病年齡趨向年輕化。持續(xù)高血糖所引發(fā)的慢性并發(fā)癥已成為腎功能衰竭、失明和心腦血管疾病的主要原因，給個(gè)人、社會(huì)和國(guó)家醫(yī)療保健帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)，成為全球性的社會(huì)衛(wèi)生和經(jīng)濟(jì)問(wèn)題。線粒體基因缺陷賦予了個(gè)體一定的糖尿病遺傳易感性。1999年世界衛(wèi)生組織制定了新的糖尿病分型標(biāo)準(zhǔn)，將線粒體基因缺陷型糖尿病列為特殊類型糖尿病，屬于β細(xì)胞遺傳缺陷疾病，線粒體糖尿病成為糖尿病中的主要亞型之一。然而目前臨床上對(duì)糖尿病的診斷通常只分為1型和2型，僅根據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)室的一般生化和免疫項(xiàng)目檢測(cè)難以正確診斷線粒體糖尿病，因此，檢測(cè)糖尿病的線粒體DNA易感基因位點(diǎn)，對(duì)于糖尿病的正確分類、線粒體糖尿病的早期診斷和積極預(yù)防有著重要的意義。
傳統(tǒng)的糖尿病線粒體基因突變檢測(cè)方法主要包括PCR-RFLP、AS-PCR和DNA測(cè)序方法等，這些方法在基因突變檢測(cè)中起了重要作用，但普遍存在著明顯的不足，諸如檢測(cè)基因位點(diǎn)有限、耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣等，不適用于大批量、系統(tǒng)檢測(cè)，給線粒體糖尿病的臨床診斷帶來(lái)困難。
快速準(zhǔn)確地檢測(cè)糖尿病線粒體基因突變是早期診斷線粒體糖尿病的關(guān)鍵指標(biāo)。PCR-RFLP方法是經(jīng)典的生物學(xué)方法，但由于限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)有限，難以實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)多個(gè)位點(diǎn)，且耗時(shí)較長(zhǎng)；AS-PCR方法雖能準(zhǔn)確檢測(cè)突變，但要求擴(kuò)增條件非常優(yōu)化，且引物要有高度的特異性，否則易出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果(Urata M，Wada Y，Kim SH，et al.High-sensitivity detection of the A3243Gmutation of mitochondrial DNA by a combination of allele-specific PCR and peptidenucleic acid-directed PCR clamping.Clin Chem，2004，502045-2051.)；DNA測(cè)序雖是目前公認(rèn)的檢測(cè)新突變的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于其對(duì)特殊結(jié)構(gòu)DNA序列無(wú)法測(cè)序，而且只有異質(zhì)性水平＞25％時(shí)才能檢出，而臨床常用標(biāo)本外周血白細(xì)胞中異質(zhì)性水平通常都達(dá)不到這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，很易漏檢(MaitraA，Cohen Y，Gillespie SE，et al.TheHuman MitoChipa high-throughput sequencing microarray for mitochondrialmutation detection.Genome Res，2004，14812-819.)。因此，如何快速、準(zhǔn)確檢測(cè)糖尿病線粒體基因突變是線粒體糖尿病臨床診斷的主要難題之一。
基因芯片是近年來(lái)興起的一項(xiàng)重要生物技術(shù)，越來(lái)越多地應(yīng)用于基因表達(dá)、基因突變檢測(cè)、多態(tài)性分析和基因診斷(Poddar SK.Symmetric vs asymmetric PCRand molecular beacon probe in the detection of a target gene of adenovirus.Mol CellProbes，2000，1425-32.王軍，王升啟，程曉霞，等.寡核苷酸微陣列法檢測(cè)高血壓患者血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因多態(tài)性的臨床應(yīng)用.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志[J]，2005，28276-277.)。Chee等于1996年利用標(biāo)準(zhǔn)的光刻和固相DNA合成技術(shù)合成寡核苷酸探針，成功研制了第一張線粒體基因測(cè)序芯片(Chee M.，Yang R.，Hubbell E.etal.Accessing genetic information with high-density DNA arrays.SCIENCE，1996，274610-614.)；其后，Maitra等于2004年也利用該項(xiàng)技術(shù)研發(fā)了用于癌癥線粒體基因突變檢測(cè)的雙鏈測(cè)序芯片(Maitra A，Cohen Y，Gillespie SE，et al.TheHuman MitoChipa high-throughput sequencing microarray for mitochondrialmutation detection.Genome Res，2004，14812-819.)。這兩種測(cè)序芯片可對(duì)線粒體基因進(jìn)行系統(tǒng)的分析，但檢測(cè)技術(shù)和設(shè)備要求高，難以在臨床實(shí)踐中普遍應(yīng)用。2005年P(guān)ark等研制了Cy3標(biāo)記的RNA靶探針寡核苷酸芯片對(duì)年輕的成人發(fā)病型糖尿病(MODY)的HNF-1α突變進(jìn)行了檢測(cè)(Park HG，Ham HO，Kim KH，HuhN.Oligonucleotide chip for the diagnosis of HNF-1αmutations.Biosensors andBioelectronics，2005，21637-644.)。Du等于2003年利用功能化單層金芯片檢測(cè)了線粒體tRNALeu(UUR)基因3243、3251、3256、3260、3302、3303和tRNAlys基因的8344共7個(gè)位點(diǎn)突變(Du WD，Marsac C，Kruschina M et al.Functionalizedself-assembled monolayer on gold for detection of human mitochondrial tRNA genemutations.Analytical Biochemistry，2003(322)14-25.)。但總的來(lái)說(shuō)，這些芯片檢測(cè)的基因位點(diǎn)有限，均在十個(gè)以內(nèi)，而且均不是針對(duì)糖尿病相關(guān)的線粒體基因突變檢測(cè)。因此，本課題組對(duì)糖尿病線粒體基因突變進(jìn)行了相關(guān)研究，制備的8個(gè)突變位點(diǎn)(tRNALeu(UUR)基因3256，3290；ND1基因3316，3394，3593，3606，3618，3688)檢測(cè)芯片，以尼龍膜作為載體，8條探針的5′或3′端加載長(zhǎng)臂8T，采用加樣槍點(diǎn)樣(0.5μl/次×5次)，自然風(fēng)干后，經(jīng)紫外照射固定在尼龍膜上，被檢測(cè)的目的DNA以生物素標(biāo)記。利用該膜芯片對(duì)經(jīng)PCR-RFLP方法篩選出的已知突變標(biāo)本進(jìn)行了檢測(cè)，初步摸索了試驗(yàn)條件，不足之處是芯片未設(shè)立對(duì)照、實(shí)驗(yàn)耗時(shí)太長(zhǎng)、樣點(diǎn)大小不均、以及所檢測(cè)位點(diǎn)少(劉松梅，周新，李霞等.2型糖尿病線粒體基因8個(gè)突變位點(diǎn)的研究.中國(guó)病理生理雜志，2006，22586-591.)。之后，又研制了檢測(cè)28個(gè)突變位點(diǎn)(tRNALeu(UUR)基因3243，3250，3251，3252，3254，3256，3260，3264，3290，3302，3303；ND1基因3316，3391，3394，3398，3399，3421，3426，3460，3537，3593，3606，3618，3688，4136，4164，4200，4216)的檢測(cè)芯片，以尼龍膜為載體，56條探針經(jīng)長(zhǎng)臂8T修飾后，用478A手工點(diǎn)樣儀(美國(guó)Axon)點(diǎn)樣，通過(guò)紫外線照射固定在尼龍膜上，被檢測(cè)的目的DNA以生物素標(biāo)記，陽(yáng)性對(duì)照為生物素標(biāo)記的3243位點(diǎn)野生型探針和突變型探針混合液，陰性對(duì)照為5×SSC探針稀釋液，平行對(duì)照為同一探針的平行點(diǎn)。利用該膜芯片對(duì)200例2型糖尿病標(biāo)本和210名正常對(duì)照標(biāo)本進(jìn)行了檢測(cè)，檢出了7種突變位點(diǎn)，具有成本低，無(wú)需特殊設(shè)備，經(jīng)濟(jì)實(shí)用特點(diǎn)。不足之處是該膜芯片不能系統(tǒng)檢測(cè)整個(gè)線粒體突變位點(diǎn)(劉松梅，周新，鄭芳等.基因芯片篩查2型糖尿病線粒體DNA堿基突變.中華醫(yī)學(xué)雜志，2006，86(40)2853-2857.)。因而，本課題組進(jìn)一步研制了45個(gè)突變位點(diǎn)檢測(cè)的膜芯片。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)線粒體糖尿病45個(gè)基因位點(diǎn)膜芯片。該芯片設(shè)計(jì)了監(jiān)控系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)監(jiān)控系統(tǒng)包括堿基序列設(shè)計(jì)合理的野生型和突變型探針組成的陽(yáng)性對(duì)照和平行對(duì)照，以及探針稀釋液組成的陰性對(duì)照；檢測(cè)系統(tǒng)由待檢的mtDNA 45個(gè)位點(diǎn)的野生型和突變型寡核苷酸探針組成。每張芯片包含90條探針、196個(gè)樣點(diǎn)(14行×14列)，其中16個(gè)陽(yáng)性對(duì)照點(diǎn)，布控合理、規(guī)整度高。實(shí)驗(yàn)操作流程簡(jiǎn)單，省時(shí)，成本低，僅需1次不對(duì)稱PCR擴(kuò)增、1次生物素標(biāo)記、1次雜交反應(yīng)，即可檢測(cè)線粒體基因45個(gè)位點(diǎn)。該芯片的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、效率高，克服了傳統(tǒng)和現(xiàn)有方法中存在的不足(如漏檢、耗時(shí)長(zhǎng)等)，達(dá)到了快速檢測(cè)線粒體糖尿病的臨床效果?？蓾M足不同層次醫(yī)院的要求，適用于糖尿病患者和高危人群的檢測(cè)，有助于臨床特殊類型糖尿病的正確診斷和分類，早發(fā)現(xiàn)病人，早預(yù)防，早治療。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施(1)計(jì)算機(jī)軟件輔助設(shè)計(jì)探針和引物該膜芯片是一種檢測(cè)多位點(diǎn)極為復(fù)雜的反應(yīng)體系，涉及90條探針和18條引物的設(shè)計(jì)和篩選。本發(fā)明按疾病相關(guān)遺傳基因生物學(xué)規(guī)律，結(jié)合PCR理論，考慮一次性快速準(zhǔn)確檢測(cè)線粒體糖尿病，既不漏診，也不誤診等方方面面，進(jìn)行設(shè)計(jì)、排列組合，巧妙布控。采用生物軟件Primer Premier 5.0(PREMIER BiosoftInternational，CA)和NCBI BLAST軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)輔助設(shè)計(jì)和分析所需的探針和引物，使目的片段擴(kuò)增和雜交反應(yīng)，能在同一條件下完成，要求苛刻，技術(shù)含量高。
(2)芯片矩陣布控設(shè)計(jì)一張膜芯片上同時(shí)固定檢測(cè)mtDNA 45個(gè)突變位點(diǎn)的探針90條，囊括目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道的與糖尿病相關(guān)的整個(gè)線粒體基因突變位點(diǎn)。每個(gè)基因位點(diǎn)的野生型和突變型探針，平行點(diǎn)印2個(gè)樣點(diǎn)，即4個(gè)樣點(diǎn)檢測(cè)1個(gè)基因位點(diǎn)，共點(diǎn)印196個(gè)樣點(diǎn)(14行×14列)，包括陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和平行對(duì)照，組成膜芯片的質(zhì)量保證和檢測(cè)監(jiān)控體系，確保檢測(cè)的準(zhǔn)確性，既防漏檢，又防誤診，減小誤差。具體布控矩陣如圖1所示。
(3)涉及多種復(fù)雜的反應(yīng)過(guò)程該膜芯片涉及多種復(fù)雜反應(yīng)過(guò)程，包括物理過(guò)程、化學(xué)反應(yīng)、生物化學(xué)反應(yīng)和分子生物學(xué)反應(yīng)，如尼龍膜的預(yù)處理，點(diǎn)樣，固定，DNA模板的提取，PCR擴(kuò)增和標(biāo)記，雜交、洗滌、顯色等。
檢測(cè)線粒體糖尿病時(shí)，只需患者的外周血100μl或帶毛囊的頭發(fā)3-5根、進(jìn)行一次不對(duì)稱PCR和一次雜交反應(yīng)，即可于8小時(shí)內(nèi)準(zhǔn)確地完成，被檢標(biāo)本是否存在上述45個(gè)基因位點(diǎn)突變的檢測(cè)過(guò)程。
(4)靶DNA標(biāo)記和顯色
該膜芯片被檢測(cè)目的片段為生物素標(biāo)記，以AP-親和素作用于NBT/BCIP顯色，可目視化觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，降低成本。
一種快速檢測(cè)線粒體糖尿病45個(gè)基因位點(diǎn)膜芯片的制備步驟是(1)以尼龍膜為載體剪1.5cm×2cm的尼龍膜，放入滅菌DdH2O浸泡10min，再浸入5×SSC 30min(20×SSC-Buffer8.766g氯化鈉，4.412g檸檬酸鈉，雙蒸水定容至50ml，氫氧化鈉調(diào)pH至7.5)，取出，自然風(fēng)干，4℃保存?zhèn)溆谩?br> (2)設(shè)計(jì)引物和探針本發(fā)明研制的膜芯片可檢測(cè)目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道的與糖尿病相關(guān)的線粒體基因45個(gè)突變位點(diǎn)。首先從MITOMAP、mtSNP、mtDB、PubMed、中國(guó)期刊網(wǎng)和重慶維普數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索與糖尿病相關(guān)的線粒體基因突變位點(diǎn)，再以線粒體基因劍橋序列(GenBank#J01415.0 gi337188)作為參考序列，采用Primer Premier 5.0(PREMIER Biosoft International，CA)和NCBI BLAST軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，針對(duì)mtDNA 45個(gè)突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性野生型和突變型寡核苷酸探針90條(請(qǐng)見(jiàn)表1，mtDNA 45個(gè)位點(diǎn)野生型和突變型探針序列)，退火溫度為59.2±1.4℃(56.7℃～62℃)，以及特異性擴(kuò)增9個(gè)目的DNA片段序列(Sequence ID 1-9)引物18條(請(qǐng)見(jiàn)表2，9個(gè)目的片段特異性擴(kuò)增引物)。
未公開(kāi)的引物7F和7R擴(kuò)增范圍為mtDNA 14470-14944(Sequence ID 7)，該片段涵蓋了mtDNA 14577 T→C，14693 A→G，14709 T→C 3個(gè)突變位點(diǎn)。未公開(kāi)的34條探針(表1中下劃線標(biāo)示的堿基序列)的G+C堿基含量為40％～60％、退火溫度為57.1～62℃，與已公開(kāi)的28個(gè)位點(diǎn)探針相近，確保能在同一個(gè)雜交反應(yīng)體系，既可檢測(cè)位于線粒體16S rRNA基因、ND2基因、ND4基因、tRNAGlu基因和D-loop區(qū)的17個(gè)位點(diǎn)的堿基突變，又可檢測(cè)線粒體tRNALeu(UUR)基因和ND1基因的28個(gè)突變位點(diǎn)(已公開(kāi)的膜芯片檢測(cè)位點(diǎn))，進(jìn)一步完善了膜芯片的設(shè)計(jì)和應(yīng)用，達(dá)到了系統(tǒng)地檢測(cè)與糖尿病相關(guān)的整個(gè)線粒體基因的45個(gè)突變位點(diǎn)，檢測(cè)效率大為提高，不會(huì)漏檢上述17個(gè)突變位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了使用該膜芯片檢測(cè)線粒體糖尿病既無(wú)漏診、又無(wú)誤診的目標(biāo)。
(3)芯片點(diǎn)陣布控所研制的膜芯片為196個(gè)樣點(diǎn)組成的14行×14列的矩陣(請(qǐng)見(jiàn)附圖1)，包括監(jiān)控系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)。
監(jiān)控系統(tǒng)包括3個(gè)部分，分別為①芯片陰性對(duì)照，為探針稀釋液(5×SSCBuffer)，布控在有公共野生型探針的位點(diǎn)處，點(diǎn)樣矩陣中，mtDNA 3200、3205與3206位點(diǎn)公用1條野生型探針，在mtDNA 3200和3205位點(diǎn)的突變型探針點(diǎn)樣處下方，點(diǎn)印陰性對(duì)照。若陰性對(duì)照雜交后無(wú)信號(hào)，表明正常；若有雜交信號(hào)，表明探針稀釋液有污染或點(diǎn)樣過(guò)程有污染。②芯片陽(yáng)性對(duì)照，為生物素標(biāo)記的mtDNA 3243位點(diǎn)的野生型和突變型探針1∶1混合的25μM溶液，布控在膜芯片的4個(gè)角，共16個(gè)陽(yáng)性對(duì)照樣點(diǎn)，如圖1所示。若雜交后有信號(hào)，表明正常；若無(wú)信號(hào)，則說(shuō)明實(shí)驗(yàn)失敗。③芯片平行對(duì)照，為各位點(diǎn)的25μM的探針溶液平行點(diǎn)印2個(gè)點(diǎn)，在矩陣中mtDNA 1888位點(diǎn)的野生型探針和突變型探針各點(diǎn)印2個(gè)樣點(diǎn)，即4個(gè)樣點(diǎn)檢測(cè)1個(gè)基因位點(diǎn)。若信號(hào)強(qiáng)度均一，說(shuō)明雜交和洗滌過(guò)程控制良好，探針的結(jié)合能力好，具有可重復(fù)性，否則表明探針的結(jié)合能力或特異性存在問(wèn)題，或是雜交或洗滌過(guò)程控制欠佳。
檢測(cè)系統(tǒng)由mtDNA 45個(gè)位點(diǎn)的90條野生型和突變型寡核苷酸探針布控的樣點(diǎn)組成；每條探針均采用5×SSC Buffer稀釋為25μM溶液，并點(diǎn)印2個(gè)平行點(diǎn)，即4個(gè)樣點(diǎn)(野生型和突變型探針各2個(gè)樣點(diǎn))檢測(cè)1個(gè)基因位點(diǎn)，45個(gè)基因位點(diǎn)按照從左到右從小到大的順序排列(圖1)。如果雜交后某個(gè)位點(diǎn)的突變型探針信號(hào)遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于野生型探針信號(hào)則判為突變型。
(4)芯片點(diǎn)樣和固定監(jiān)控系統(tǒng)與檢測(cè)系統(tǒng)的點(diǎn)陣布控在同一區(qū)域，采用478A芯片點(diǎn)樣儀(美國(guó)UVP公司)點(diǎn)印于經(jīng)滅菌雙蒸水和5×SSC Buffer預(yù)處理后的尼龍膜條；紫外線照射8min交聯(lián)固定；4℃保存?zhèn)溆谩Ｔ撃ば酒礈爝^(guò)程為，室溫以2×SSC-0.1％SDS振動(dòng)洗滌5min×2次，0.5×SSC-0.1％SDS振動(dòng)洗滌15min。
表1 mtDNA 45個(gè)位點(diǎn)野生型和突變型探針序列


注帶下劃線的17個(gè)突變位點(diǎn)的探針序列為本發(fā)明的特征技術(shù)，其它位點(diǎn)探針序列在研制者發(fā)表的文章中已公開(kāi)。
表2 9個(gè)目的片段特異性擴(kuò)增引物

注帶下劃線引物序列(7F，7R)為本發(fā)明內(nèi)容，其余的16條引物序列在研制者發(fā)表的文章中已公開(kāi)或來(lái)自文獻(xiàn)(Levin BC，cheng H，Reeder DJ(1999)A human mitochondrialDNA standard reference material for quality control in forensic identification，medical diagnosis，and mutation detection. Genomics 55135-146. Fukuda M，Nakano S，Imaizumi N，Kitazawa M，Nishizawa M，Kigoshi T，Uchida K(1999)Mitochondrial DNA mutations are associated with bothdecreased insulin secretion and advanced microvascular complications in Japanese diabeticsubjects.J Diabetes Complications 13277-283.)一種快速檢測(cè)線粒體糖尿病45個(gè)基因位點(diǎn)膜芯片的檢測(cè)步驟是(1)收集病人標(biāo)本，提取模板DNA。
(2)采用表2中9對(duì)引物進(jìn)行不對(duì)稱多重PCR擴(kuò)增目的DNA(Sequence ID 1-9)。不對(duì)稱PCR反應(yīng)液是由10×buffer(晶美公司)，10μmol/L的各正向引物(1F-9F)，1μmol/L各反向引物(1R-9R)，25mmol/LMgCl2(晶美公司)，10mmol/LdNTPs，1U Tag DNA聚合酶(晶美公司)和無(wú)菌雙蒸水組成。引物1和4，2和3，5和6可行多重不對(duì)稱PCR。擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性3min，35個(gè)循環(huán)(94℃變性45s，58℃退火35s，72℃延伸45s)，72℃延伸7min。
(3)產(chǎn)物純化后(QIAGEN公司)用生物素(Invitrogen公司)進(jìn)行標(biāo)記，100℃煮沸變性，-20℃聚冷。
(4)42℃預(yù)雜交30min封閉膜芯片非特異性結(jié)合，將變性的生物素標(biāo)記ssDNA與預(yù)熱的雜交液1∶10混勻，放入膜芯片42℃雜交2h。標(biāo)記的被檢標(biāo)本擴(kuò)增的目的片段在相同的雜交反應(yīng)條件下同時(shí)與監(jiān)控系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)的所有探針?lè)磻?yīng)。
(5)洗滌后，AP-親和素作用于NBT/BCIP顯色，目視化觀察結(jié)果(圖2)。根據(jù)雜交結(jié)果，即可對(duì)線粒體糖尿病進(jìn)行篩查和確診。
(6)檢測(cè)效果比較見(jiàn)表3，所有檢出的突變位點(diǎn)均經(jīng)DNA測(cè)序驗(yàn)證(圖3)。
表3 已公開(kāi)的與本發(fā)明的探針和引物檢測(cè)效果比較


發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果本發(fā)明研制了一種快速檢測(cè)線粒體糖尿病45位點(diǎn)膜芯片。該膜芯片具有很多優(yōu)點(diǎn)①芯片包含監(jiān)控系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)兩個(gè)體系，可系統(tǒng)檢測(cè)糖尿病相關(guān)的線粒體基因45個(gè)突變位點(diǎn)，并有質(zhì)量控制；②操作簡(jiǎn)單，易于掌握，省時(shí)，成本低；③可適應(yīng)不同層次醫(yī)院的臨床需求，具有很好的應(yīng)用市場(chǎng)和經(jīng)濟(jì)效益。因此，該芯片可快速檢測(cè)線粒體基因45個(gè)位點(diǎn)突變，適用于糖尿病患者和高危人群的篩查，輔助線粒體糖尿病的確診。本發(fā)明為進(jìn)一步拓展線粒體基因突變相關(guān)疾病的篩查提供了一條新的思路、奠定了基礎(chǔ)。


圖1mtDNA 45個(gè)突變位點(diǎn)檢測(cè)膜芯片點(diǎn)樣矩陣示意中●，陽(yáng)性對(duì)照；◎，突變型探針；⊙，野生型探針；○，陰性對(duì)照；數(shù)字為基因位點(diǎn)圖2生物素標(biāo)記mtDNA45個(gè)突變位點(diǎn)檢測(cè)微陣列膜芯片檢測(cè)結(jié)果中a，3290 T→C突變；b，16223 T基因型圖3膜芯片檢測(cè)的mtDNA15個(gè)突變位點(diǎn)經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果中箭頭所指為突變后的堿基，數(shù)字為突變的基因位點(diǎn)具體實(shí)施方式
實(shí)施例1樣品的處理和標(biāo)記(1)新鮮全血標(biāo)本采用改良NaI方法(喻紅，彭芳芳.醫(yī)學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，第1版，武漢大學(xué)出版社，2003)提取DNA模板。
(2)血痕標(biāo)本取1.5×1.5cm2大小的血痕，浸人1ml雙蒸水中，振蕩混勻后，12,000rpm離心3min，去上清，加雙蒸水洗滌一次，然后加入200μl5％的Chelex-100，56℃孵育20～30min后，煮沸8min，10,000rpm離心3min，取上清進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
(3)毛球標(biāo)本將3～4根毛發(fā)在距離根部3～4mm處剪斷，毛球浸于Chelex-100溶液中，置56℃保溫6～10h。振蕩5～10s。100℃煮沸10min后，10000r/min離心3min，取上清液待用。
樣本處理好之后，進(jìn)行目的DNA擴(kuò)增不對(duì)稱PCR反應(yīng)液是由10×buffer，10μmol/L的各正向引物，1μmol/L各反向引物，25mmol/L MgCl2，10mmol/L dNTPs和無(wú)菌雙蒸水組成。且引物1和4，2和3，5和6可行多重不對(duì)稱PCR。擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性3min，35個(gè)循環(huán)(94℃變性45s，58℃退火35s，72℃延伸45s)，72℃延伸7min；PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定后，QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)純化，生物素標(biāo)記(Invitrogen)，100℃煮沸10min變性后，放入-20℃冰箱聚冷，備用。
實(shí)施例2芯片制作方法尼龍膜放入DdH2O浸泡10min，浸入5×SSC 30min(20×SSC-Buffer8.766g氯化鈉，4.412g檸檬酸鈉，雙蒸水定容至50ml，氫氧化鈉調(diào)pH至7.5)，自然風(fēng)干；將45個(gè)位點(diǎn)的90條氨基修飾的野生型和突變型探針，用5×SSC-Buffer稀釋為終濃度為25μm的探針溶液，按點(diǎn)樣矩陣(圖1)排列在384孔板，用478A芯片點(diǎn)樣儀(美國(guó)UVP公司)點(diǎn)??；紫外線照射8min交聯(lián)固定；4℃保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例3雜交反應(yīng)和免疫顯色檢測(cè)突變42℃預(yù)熱雜交液(Roche)，將膜芯片浸入預(yù)雜交液，預(yù)雜交30min，以封閉基片非特異性結(jié)合；生物素標(biāo)記的ssDNA與預(yù)熱雜交液按1∶10混勻，42℃雜交2h。取出膜芯片，按下述步聚洗滌顯色。
(1)室溫(25℃～30℃)以2×SSC-0.1％SDS(十二烷基磺酸鈉，Sigma公司)振動(dòng)洗滌5min×2次，0.5×SSC-0.1％SDS振動(dòng)洗滌15min。
(2)馬來(lái)酸Buffer-0.3％Tween20洗脫5min(馬來(lái)酸Buffer馬來(lái)酸(順丁烯二酸)2.32克，氯化鈉1.7532克，溶于200ml雙蒸水，氫氧化鈉調(diào)pH為7.5；Tween20，Sigma公司)。
(3)1×封閉液封閉30min(1×封閉液9ml馬來(lái)酸Buffer+1ml10×封閉液(Roche))。
(4)浸入含0.025％的avidin-AP(華美公司)的1×封閉液中反應(yīng)30min。
(5)馬來(lái)酸Buffer-0.3％Tween20洗脫15min。
(6)檢測(cè)液(三羥甲基氨基甲烷1.2114克，氯化鈉0.5844克，氯化鎂1.0165克，溶于100ml雙蒸水，pH 9.5)平衡4min。
(7)在含2％的NBT/BCIP的檢測(cè)液中避光顯色(100μl+檢測(cè)液5ml)。
(8)待陽(yáng)性對(duì)照的顏色深度達(dá)到要求時(shí)，以高壓超純水沖洗膜條終止反應(yīng)。
根據(jù)藍(lán)紫色信號(hào)強(qiáng)弱判讀結(jié)果，若野生型探針的雜交信號(hào)遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于突變型探針，則為野生型；若突變型探針的雜交信號(hào)遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于野生型探針，則為突變型；若兩者信號(hào)強(qiáng)度比較接近，則疑為異質(zhì)型，需測(cè)序驗(yàn)證。結(jié)果見(jiàn)圖2，檢出的突變位點(diǎn)與測(cè)序結(jié)果一致(圖3)。
SEQUENCE LISTING<110>武漢大學(xué)<120>一種檢測(cè)線粒體糖尿病45個(gè)基因位點(diǎn)膜芯片<130>mtDNA1657-2216<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>560<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1cttgaccgct ctgagctaaa cctagcccca aacccactcc accttactac cagacaacct 60tagccaaacc atttacccaa ataaagtata ggcgatagaa attgaaacct ggcgcaatag120atatagtacc gcaagggaaa gatgaaaaat tataaccaag cataatatag caaggactaa180cccctatacc ttctgcataa tgaattaact agaaataact ttgcaaggag agccaaagct240aagacccccg aaaccagacg agctacctaa gaacagctaa aagagcacac ccgtctatgt300agcaaaatag tgggaagatt tataggtaga ggcgacaaac ctaccgagcc tggtgatagc360tggttgtcca agatagaatc ttagttcaac tttaaatttg cccacagaac cctctaaatc420cccttgtaaa tttaactgtt agtccaaaga ggaacagctc tttggacact aggaaaaaac480cttgtagaga gagtaaaaaa tttaacaccc atagtaggcc taaaagcagc caccaattaa540gaaagcgttc aagctcaaca560<210>2<211>596<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1agcgccttcc cccgtaaatg atatcatctc aacttagtat tatacccaca cccacccaag 60aacagggttt gttaagatgg cagagcccgg taatcgcata aaacttaaaa ctttacagtc120agaggttcaa ttcctcttct taacaacata cccatggcca acctcctact cctcattgta180cccattctaa tcgcaatggc attcctaatg cttaccgaac gaaaaattct aggctatata240caactacgca aaggccccaa cgttgtaggc ccctacgggc tactacaacc cttcgctgac300gccataaaac tcttcaccaa agagccccta aaacccgcca catctaccat caccctctac360atcaccgccc cgaccttagc tctcaccatc gctcttctac tatgaacccc cctccccata420cccaaccccc tggtcaacct caacctaggc ctcctattta ttctagccac ctctagccta480gccgtttact caatcctctg atcagggtga gcatcaaact caaactacgc cctgatcggc540gcactgcgag cagtagccca aacaatctca tatgaagtca ccctagccat cattct596<210>3
<211>318<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1gacgcactct cccctgaact ctacacaaca tattttgtca ccaagaccct acttctaacc 60tccctgttct tatgaattcg aacagcatac ccccgattcc gctacgacca actcatacac120ctcctatgaa aaaacttcct accactcacc ctagcattac ttatatgata tgtctccata180cccattacaa tctccagcat tccccctcaa acctaagaaa tatgtctgat aaaagagtta240ctttgataga gtaaataata ggagcttaaa cccccttatt tctaggacta tgagaatcga300acccatccct gagaatcc 318<210>4<211>753<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1ccctttcact tctgagtccc agaggttacc caaggcaccc ctctgacatc cggcctgctt 60cttctcacat gacaaaaact agcccccatc tcaatcatat accaaatctc tccctcacta120aacgtaagcc ttctcctcac tctctcaatc ttatccatca tagcaggcag ttgaggtgga180ttaaaccaga cccagctacg caaaatctta gcatactcct caattaccca cataggatga240ataatagcag ttctaccgta caaccctaac ataaccattc ttaatttaac tatttatatt300atcctaacta ctaccgcatt cctactactc aacttaaact ccagcaccac gaccctacta360ctatctcgca cctgaaacaa gctaacatga ctaacaccct taattccatc caccctcctc420tccctaggag gcctgccccc gctaaccggc tttttgccca aatgggccat tatcgaagaa480ttcacaaaaa acaatagcct catcatcccc accatcatag ccaccatcac cctccttaac540ctctacttct acctacgcct aatctactcc acctcaatca cactactccc catatctaac600aacgtaaaaa taaaatgaca gtttgaacat acaaaaccca ccccattcct ccccacactc660atcgccctta ccacgctact cctacctatc tcccctttta tactaataat cttatagaaa720tttaggttaa atacagacca agagccttca aag 753<210>5<211>506<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1cggtcaatgc tctgaaatct gtggagcaaa ccacagtttc atgcccatcg tcctagaatt 60aattccccta aaaatctttg aaatagggcc cgtatttacc ctatagcacc ccctctaccc120cctctagagc ccactgtaaa gctaacttag cattaacctt ttaagttaaa gattaagaga180accaacacct ctttacagtg aaatgcccca actaaatact accgtatggc ccaccataat240tacccccata ctccttacac tattcctcat cacccaacta aaaatattaa acacaaacta300ccacctacct ccctcaccaa agcccataaa aataaaaaat tataacaaac cctgagaacc360
aaaatgaacg aaaatctgtt cgcttcattc attgccccca caatcctagg cctacccgcc420gcagtactga tcattctatt tccccctcta ttgatcccca cctccaaata tctcatcaac480aaccgactaa tcaccaccca acaatg 506<210>6<211>864<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1tgctagtaac cacgttctcc tgatcaaata tcactctcct acttacagga ctcaacatac 60tagtcacagc cctatactcc ctctacatat ttaccacaac acaatggggc tcactcaccc120accacattaa caacataaaa ccctcattca cacgagaaaa caccctcatg ttcatacacc180tatcccccat tctcctccta tccctcaacc ccgacatcat taccgggttt tcctcttgta240aatatagttt aaccaaaaca tcagattgtg aatctgacaa cagaggctta cgacccctta300tttaccgaga aagctcacaa gaactgctaa ctcatgcccc catgtctaac aacatggctt360tctcaacttt taaaggataa cagctatcca ttggtcttag gccccaaaaa ttttggtgca420actccaaata aaagtaataa ccatgcacac tactataacc accctaaccc tgacttccct480aattcccccc atccttacca ccctcgttaa ccctaacaaa aaaaactcat acccccatta540tgtaaaatcc attgtcgcat ccacctttat tatcagtctc ttccccacaa caatattcat600gtgcctagac caagaagtta ttatctcgaa ctgacactga gccacaaccc aaacaaccca660gctctcccta agcttcaaac tagactactt ctccataata ttcatccctg tagcattgtt720cgttacatgg tccatcatag aattctcact gtgatatata aactcagacc caaacattaa780tcagttcttc aaatatctac tcatcttcct aattaccata ctaatcttag ttaccgctaa840caacctattc caactgttca tcgg 864<210>7<211>475<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1tccaaagaca accatcattc cccctaaata aattaaaaaa actattaaac ccatataacc 60tcccccaaaa ttcagaataa taacacaccc gaccacaccg ctaacaatca atactaaacc120cccataaata ggagaaggct tagaagaaaa ccccacaaac cccattacta aacccacact180caacagaaac aaagcataca tcattattct cgcacggact acaaccacga ccaatgatat240gaaaaaccat cgttgtattt caactacaag aacaccaatg accccaatac gcaaaattaa300ccccctaata aaattaatta accactcatt catcgacctc cccaccccat ccaacatctc360cgcatgatga aacttcggct cactccttgg cgcctgcctg atcctccaaa tcaccacagg420actattccta gccatgcact actcaccaga cgcctcaacc gccttttcat caatc 475<210>8<211>511<212>DNA
<213>Homo sapiens<400>1cgcctacaca attctccgat ccgtccctaa caaactagga ggcgtccttg ccctattact 60atccatcctc atcctagcaa taatccccat cctccatata tccaaacaac aaagcataat120atttcgccca ctaagccaat cactttattg actcctagcc gcagacctcc tcattctaac180ctgaatcgga ggacaaccag taagctaccc ttttaccatc attggacaag tagcatccgt240actatacttc acaacaatcc taatcctaat accaactatc tccctaattg aaaacaaaat300actcaaatgg gcctgtcctt gtagtataaa ctaatacacc agtcttgtaa accggagatg360aaaacctttt tccaaggaca aatcagagaa aaagtcttta actccaccat tagcacccaa420agctaagatt ctaatttaaa ctattctctg ttctttcatg gggaagcaga tttgggtacc480acccaagtat tgactcaccc atcaacaacc g 511<210>9<211>455<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1aactccacca ttagcaccca aagctaagat tctaatttaa actattctct gttctttcat 60ggggaagcag atttgggtac cacccaagta ttgactcacc catcaacaac cgctatgtat120ttcgtacatt actgccagcc accatgaata ttgtacggta ccataaatac ttgaccacct180gtagtacata aaaacccaat ccacatcaaa accccctccc catgcttaca agcaagtaca240gcaatcaacc ctcaactatc acacatcaac tgcaactcca aagccacccc tcacccacta300ggataccaac aaacctaccc acccttaaca gtacatagta cataaagcca tttaccgtac360atagcacatt acagtcaaat cccttctcgt ccccatggat gacccccctc agataggggt420cccttgacca ccatcctccg tgaaatcaat atccc 45權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)線粒體糖尿病45個(gè)基因位點(diǎn)膜芯片，它包括下列步驟A、以尼龍膜作為載體剪1.5cm×2cm的尼龍膜，放入滅菌DdH2O浸泡10min，再浸入5×SSC 30min，取出，風(fēng)干，4℃保存?zhèn)溆?；B、設(shè)計(jì)引物和探針首先從MITOMAP、mtSNP、mtDB、PubMed、中國(guó)期刊網(wǎng)和重慶維普數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索與糖尿病相關(guān)的線粒體基因/mtDNA突變位點(diǎn)；其次是以mtDNA劍橋序列/GenBank #J01415.0 gi337188為序列，采用PrimerPremier 5.0和NCBI BLAST軟件，針對(duì)mtDNA45個(gè)突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增目的DNA序列引物和野生型及突變型寡核苷酸探針，退火溫度為56.7℃～62℃，在5′或3′端修飾8個(gè)多聚T；C、芯片點(diǎn)陣布控膜芯片為196個(gè)樣點(diǎn)組成的14行×14列的矩陣，包括監(jiān)控系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)，監(jiān)控系統(tǒng)為①芯片陰性對(duì)照，為探針稀釋液5×SSCBuffer，布控在有公共野生型探針的位點(diǎn)處，點(diǎn)樣矩陣中，mtDNA 3200、3205與3206位點(diǎn)公用1條野生型探針，點(diǎn)樣矩陣中，mtDNA 3200，3205與3206位點(diǎn)公用1條野生型探針，在mtDNA 3200和3205位點(diǎn)的突變型探針點(diǎn)樣處下方，點(diǎn)印陰性對(duì)照；②芯片陽(yáng)性對(duì)照，標(biāo)記生物素的mtDNA 3243位點(diǎn)的野生型和突變型探針按1∶1比例混合的25μM溶液，設(shè)計(jì)布控在膜芯片的4個(gè)角，共16個(gè)陽(yáng)性對(duì)照樣點(diǎn)；③芯片平行對(duì)照，采取25μM的探針溶液，于各位點(diǎn)平行點(diǎn)印2個(gè)點(diǎn)，在矩陣點(diǎn)樣中，對(duì)mtDNA 1888位點(diǎn)的野生型探針和突變型探針，各點(diǎn)印2個(gè)樣點(diǎn)，共4個(gè)樣點(diǎn)檢測(cè)1個(gè)基因位點(diǎn)；檢測(cè)系統(tǒng)由mtDNA 45個(gè)位點(diǎn)的野生型和突變型寡核苷酸探針，設(shè)計(jì)布控樣點(diǎn)組成，每條探針采用5×SSC Buffer稀釋為25μM溶液，同時(shí)點(diǎn)印2個(gè)平行點(diǎn)，共4個(gè)樣點(diǎn)檢測(cè)1個(gè)基因位點(diǎn)，45個(gè)基因位點(diǎn)按照從左到右從小到大的順序排列；D、芯片點(diǎn)樣固定監(jiān)控系統(tǒng)與檢測(cè)系統(tǒng)點(diǎn)陣布控在同一區(qū)域，采用478A芯片點(diǎn)樣儀，點(diǎn)印于經(jīng)滅菌雙蒸水和5×SSC Buffer預(yù)處理后的尼龍膜條；紫外線照射8min交聯(lián)固定，4℃保存?zhèn)溆?；所述的特異性野生型和突變型寡核苷酸探?br> 所述的目的DNA序列引物
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)線粒體糖尿病45個(gè)基因位點(diǎn)膜芯片，其特征在于所述的膜芯片洗滌過(guò)程為，室溫以2×SSC-O.1％SDS振動(dòng)洗滌5min×2次，0.5×SSC-0.1％SDS振動(dòng)洗滌15min。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)線粒體糖尿病45個(gè)基因位點(diǎn)膜芯片，其步驟首先是以尼龍膜為載體，其次是設(shè)計(jì)引物和探針，第三是芯片點(diǎn)陣布控，最后是芯片點(diǎn)樣和固定。該芯片監(jiān)控系統(tǒng)由堿基突變位點(diǎn)的陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和平行對(duì)照組成；檢測(cè)系統(tǒng)為待檢的mtDNA 45個(gè)位點(diǎn)的野生型和突變型探針。每張芯片包含90條探針、196個(gè)樣點(diǎn)，布控合理、規(guī)整度高。實(shí)驗(yàn)操作流程簡(jiǎn)單，省時(shí)，成本低，僅需1次不對(duì)稱PCR擴(kuò)增、1次生物素標(biāo)記、1次雜交反應(yīng)，即可檢測(cè)mtDNA45個(gè)位點(diǎn)。檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、快速、效率高，可滿足不同層次醫(yī)院的要求，適用于糖尿病患者和高危人群的檢測(cè)，有助于臨床特殊類型糖尿病的正確診斷和分類，早發(fā)現(xiàn)病人，早預(yù)防，早治療。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1970791SQ20061012537
公開(kāi)日2007年5月30日 申請(qǐng)日期2006年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月8日
發(fā)明者劉松梅, 周新, 李霞, 鄭芳, 涂建成, 湯冬玲, 曲喜英, 田艷麗, 蔡春林 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)