1型糖尿病易感位點rs231775的檢測方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測1型糖尿病易感位點的方法及試劑盒，所述方法包括如下步驟：(1)提取樣品的基因組DNA，擴增樣品的CTLA-4基因外顯子中包含rs231775位點的區(qū)域，得到擴增產(chǎn)物；(2)使用HRM分析技術檢測擴增產(chǎn)物中SNP位點的基因型。采用HRM分析技術對擴增后的CTLA-4基因外顯子中包含rs231775位點的區(qū)域進行基因型分析，該方法操作簡單、快速，使用成本低，結果準確，可以實現(xiàn)批量檢測；使用上述試劑盒可以清晰的判斷受檢人群是否攜帶1型糖尿病易感基因，將1型糖尿病易感人群從人群中篩選出來，改變不良的生活習慣，達到預防的目的。
【專利說明】1型糖尿病易感位點rs231 775的檢測方法及試劑盒 【【技術領域】】
[0001] 本發(fā)明涉及一種1型糖尿病易感性的檢測方法及試劑盒，更具體的說是 通過測定與1型糖尿病相關基因細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(cyt〇t〇Xic T lymphocyte_associatedantigen4，CTLA-4)的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP)預測受試者對于1型糖尿病的易感性，該方法可用于疾病的輔助診斷、 治療和新藥開發(fā)，屬于分子生物學和醫(yī)學領域。 【【背景技術】】
[0002] 糖尿病是常見病、多發(fā)病，其患病率正隨人民生活水平的提高、人口老化和生活方 式的改變迅速增加。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO)估計，全球目前有超過1.5億糖尿病患者，到 2025年這一數(shù)字將增加一倍。我國現(xiàn)有糖尿病患者3千萬，居世界第2位。糖尿病已成 為發(fā)達國家中繼心血管病和腫瘤之后的第三大非傳染性疾病，對社會和經(jīng)濟帶來沉重的負 擔，是嚴重威脅人類健康的世界性公共衛(wèi)生問題。根據(jù)WHO和國際糖尿病聯(lián)盟（IDF)專家 組的建議，糖尿病可分為1型、2型、其他特殊類型及妊娠糖尿病四種。研究表明，1型糖尿 病占糖尿病總發(fā)病人數(shù)的1 %?10%，且近年來該病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。
[0003] 糖尿病的病因和發(fā)病機制較為復雜，至今尚未完全明了。目前認為1型糖尿病 (type I diabetes，TlDM)是一種在遺傳與環(huán)境相互作用下，以T細胞介導的特異性胰島β 細胞自身免疫性破壞為主要發(fā)病機制的一種疾病。1型糖尿病具有多基因遺傳背景，易感性 十分復雜，疾病的發(fā)生是多種基因相互作用、相互影響的結果。近年來，隨著對1型糖尿病 相關基因的研究日趨深入，證實了多種基因在1型糖尿病的發(fā)生發(fā)展中的作用，為1型糖尿 病的早期診斷和治療提供了理論依據(jù)。
[0004] 細胞毒性Τ淋巴細胞相關抗原4基因位于染色體2q33,編碼Τ細胞表面的一種膜 蛋白。研究表明，只有激活的T細胞才表達CTLA-4分子，并與抗原遞呈細胞膜上的B7分子 結合，傳遞負性調節(jié)信號，終止T細胞活化和抑制免疫反應的進行，對T細胞增生起負性調 節(jié)作用。研究表明CTLA-4基因外顯子I第17密碼子49位點A/G多態(tài)性（rs231775)，導 致CTLA-4信號肽區(qū)域內的蘇氨酸變?yōu)楸彼?，與機體免疫應答的過度激活相關，是1型糖 尿病的獨立危險因素之一。
[0005] 現(xiàn)有技術檢測1型糖尿病易感人群，采用雜交芯片法或玻璃板芯片法，以及采用 taqman探針，前兩種方法準確率低、假陰性和假陽性率較高，且不能批量檢測；另一種直接 測序法雖然準確率高，但其成本也很高，同樣很難實現(xiàn)批量檢測。
[0006] 因此，有必要提出一種新的檢測方法以解決上述問題。 【
【發(fā)明內容】
】
[0007] 本發(fā)明的主要目的是提供一種輔助診斷1型糖尿病的方法，該方法操作簡單、快 速，使用成本低，結果準確，可以實現(xiàn)批量檢測。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供一種用于檢測1型糖尿病易感位點的試劑盒，該試劑盒 包括PCR引物及含有該引物的試劑盒，其可以實現(xiàn)擴增與HRM分析。
[0009] 為了解決上述問題，本發(fā)明采用的技術方案是：一種檢測1型糖尿病易感位點的 方法，包括如下步驟：（1)提取樣品的基因組DNA，擴增樣品的CTLA-4基因外顯子中包含 rs231775號位點的區(qū)域，得到擴增產(chǎn)物；（2)使用HRM分析技術檢測擴增產(chǎn)物中SNP位點的 基因型。
[0010] 進一步的，CTLA-4基因的rs231775位點的基因型帶有GG時，該CTLA-4基因所屬 樣品的測試者對于1型糖尿病的易感性高于基因型不帶GG的測試者。
[0011] 進一步的，使用特異性引物擴增樣品的CTLA-4基因外顯子中包含rs231775位點 的區(qū)域，該特異性引物是指針對CTLA-4基因上rs231775號SNP位點而設計，能特異性擴增 出包含上述SNP位點的DNA片段的引物對。
[0012] 進一步的，所述特異性引物具有SEQ ID N0 :2和SEQ ID N0 :3所示的核苷酸序列。
[0013] 進一步的，使用HRM分析技術直接檢測擴增后包含上述SNP位點的DNA片段的引 物對的基因型。
[0014] 進一步的，將擴增后包含上述SNP位點的DNA片段的引物對轉移至分析裝置，然后 使用HRM分析技術對該引物對的基因型進行分析。
[0015] 進一步的，所述1型糖尿病易感位點的檢測方法在體外非診斷性檢測1型糖尿病 易感性方面的應用。
[0016] 為了解決上述問題，本發(fā)明采用的另一技術方案是：一種用于檢測1型糖尿病易 感位點的試劑盒，其可以對CTLA-4基因外顯子中包含rs231775號位點的區(qū)域進行擴增及 HRM技術分析。
[0017] 進一步的，所述試劑盒包括特異性擴增CTLA-4基因外顯子中包含rs231775位點 的區(qū)域的特異性引物。
[0018] 進一步的，所述特異性引物具有SEQ ID N0 :2和SEQ ID N0 :3所示的核苷酸序列。
[0019] 進一步的，試劑盒的組分及含量包括5ul2X LightCycler480High Resolution Melting Master Mix、1.2ul25mM MgC12 溶液、lul2 μ M Primer Mix、lul5ng/μ 1 左右 DNA、 1.8ul H20、具有SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列的特異性引物。
[0020] 進一步的，所述試劑盒在檢測1型糖尿病易感性方面的應用。
[0021] 與現(xiàn)有技術相比較，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：采用HRM分析技術對擴增后的CTLA-4 基因外顯子中包含rs231775位點的區(qū)域進行基因型分析，該方法操作簡單、快速，使用成 本低，結果準確，可以實現(xiàn)批量檢測。 【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0022] 圖1是CTLA-4基因 rs231775位點基因型的HRM檢測結果；
[0023] 圖2是Tapman探針法截圖，顯示了 rs231775的一種SNP基因型的探針檢測結果。 【【具體實施方式】】
[0024] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。下列實施例中未注明具體條件的實驗 方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人、分子克隆、實驗室手冊（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照廠商所建議的條件。
[0025] 本發(fā)明提供了一種1型糖尿病易感位點的檢測方法及試劑盒，所述方法包括如下 步驟：（1)提取樣品的基因組DNA，擴增樣品的CTLA-4基因外顯子中包含rs231775號位點 的區(qū)域，得到擴增產(chǎn)物；（2)使用HRM分析技術檢測擴增產(chǎn)物中SNP位點的基因型。該1型 糖尿病易感位點的檢測方法及檢測試劑盒還可以用于檢測1型糖尿病的易感性。
[0026] 所述的rs231775位于CTLA-4的外顯子中（片段重疊群contig :ΝΤ_005403· 17位 置54942132A>G)，其中，脫氧核糖核酸（DNA)序列編號：rs231775位置基于SEQ ID Ν0:1 所示的核苷酸序列；引物1基于SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列；引物2基于SEQ ID NO : 3所示的核苷酸序列；擴增產(chǎn)物3基于SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列。
[0027] 經(jīng)過多年研究證明了 CTLA-4基因單核苷酸多態(tài)性位點rs231775與1型糖尿病密 切相關，而且發(fā)現(xiàn)了它的新功能：CTLA-4基因單核苷酸多態(tài)性位點rs231775位于CTLA-4 外顯子中的基因型的改變將導致1型糖尿病的發(fā)病風險升高，其中關聯(lián)研究結果顯示，在 CTLA-4基因 rs231775A - G在病例和對照組中的分布存在顯著性差異（p < 0. 05)，該SNP 多態(tài)性可改變轉錄因子結合位點。
[0028] CTLA-4基因的詳細序列可參見登錄號為rs231775的核苷酸序列（可參見網(wǎng)址 http ://www. ncbi. nlm. nih. gov/) 〇
[0029] 實施例1 :突光PCR檢測
[0030] 一、實驗材料
[0031] LightCycler480熒光定量PCR儀購自瑞士羅氏（Roche)公司，聚合酶鏈反應液 (LightCycler480High Resolution Melting Master)由瑞士羅氏（Roche)公司定制合成。 [0032] 二、引物及探針設計與合成：
[0033] 以CTLA-4基因外顯子的部分序列為模板，使用Primer Premier5軟件分析引物， 并由上海生工生物工程有限公司定制合成。
[0034] 檢測用引物：
[0035] CTLA-4 基因 rs231775 上游引物序列：5' -CTTGGATTTCAGCGGCACA-3' (SEQ ID NO ：2)
[0036] CTLA-4基因 rs231775下游引物序列：5'-
[0037] GAAGAGAAGAAAAAACAGGAGAGTG-3, (SEQ ID NO :3)
[0038] 三、樣本檢測：
[0039] 實驗共檢測50例1型糖尿病病例和50例正常對照人群，每例收集血樣標本約 2ml，用酚/氯仿抽屜基因組DNA，抽提結果用微量紫外/可見光分光光度計（Thermo Fisher 公司）檢測。
[0040] 按如下體系進行突光PCR擴增，最后用roche lc480softwarel. 5掃描并聚類分析
[0041]
【權利要求】
1. 一種1型糖尿病易感位點的檢測方法，其特征在于：包括步驟： ⑴提取樣品的基因組DNA，擴增樣品的細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(CTLA-4)基因 外顯子中包含rs231775位點的區(qū)域，得到擴增產(chǎn)物；和 (2)使用高分辨烙解曲線（high-resolution melt，HRM)分析技術檢測擴增產(chǎn)物中單 核苷酸多態(tài)性（SNP)位點的基因型。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于：CTLA-4基因的rs231775位點的基因型帶有 GG時，該CTLA-4基因所屬樣品的測試者對于1型糖尿病的易感性高于基因型未帶有GG的 測試者。
3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于：使用特異性引物擴增樣品的CTLA-4基因外 顯子中包含rs231775位點的區(qū)域，該特異性引物是指針對CTLA-4基因上rs231775號SNP 位點而設計，能特異性擴增出包含上述SNP位點的DNA片段的引物對。
4. 如權利要求3所述的方法，其特征在于：所述特異性引物具有SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列。
5. 如權利要求3所述的方法，其特征在于：使用HRM分析技術直接檢測擴增后包含上 述SNP位點的DNA片段的引物對的基因型。
6. 如權利要求3所述的方法，其特征在于：將擴增后包含上述SNP位點的DNA片段的 引物對轉移至分析裝置，然后使用HRM分析技術對該引物對的基因型進行分析。
7. -種用于檢測1型糖尿病易位點的試劑盒，其特征在于：對CTLA-4基因外顯子中包 含rs231775號位點的區(qū)域進行擴增及HRM技術分析。
8. 如權利要求7所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括特異性擴增CTLA-4基因 外顯子中包含rs231775位點的區(qū)域的特異性引物。
9. 如權利要求8所述的試劑盒，其特征在于：所述特異性引物具有SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列。
10. 如權利要求9所述的試劑盒，其特征在于：試劑盒的組分及含量包括5ul2X LightCycler480High Resolution Melting Master Mix、1.2ul25mM MgC12 溶液、lul2 μ Μ PrimerMix、lul5ng/μl左右DNA、l·8ulH20、具有SEQIDN0:2和SEQIDN0 :3所示的核 苷酸序列的特異性引物。
【文檔編號】C12Q1/68GK104059989SQ201410331380
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年7月10日 優(yōu)先權日:2014年7月10日
【發(fā)明者】黃迅威, 張?zhí)熘? 沈玲宇, 邵敏華 申請人:光瀚健康咨詢管理(上海)有限公司