專利名稱：一種檢測線粒體糖尿病的45個基因位點微陣列芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測線粒體糖尿病的45個基因位點微陣列芯片。可滿足不同層次醫(yī)院的要求，適用于糖尿病患者和高危人群的檢測，有助于臨床特殊類型糖尿病的正確診斷和分類，早發(fā)現(xiàn)病人，早預防，早治療。
背景技術(shù)：
糖尿病是一種由胰島素分泌缺陷和/或胰島素作用障礙所致的復雜代謝性疾病，發(fā)病率逐年上升，我國的糖尿病發(fā)病人數(shù)位居世界第二，其中90％為2型糖尿病，且發(fā)病年齡趨向年輕化。持續(xù)高血糖所引發(fā)的慢性并發(fā)癥已成為腎功能衰竭、失明和心腦血管疾病的主要原因，給個人、社會和國家醫(yī)療保健帶來了沉重的負擔，成為全球性的社會衛(wèi)生和經(jīng)濟問題。線粒體基因缺陷賦予了個體一定的糖尿病遺傳易感性。1999年世界衛(wèi)生組織制定了新的糖尿病分型標準，將線粒體基因缺陷型糖尿病列為特殊類型糖尿病，屬于β細胞遺傳缺陷疾病，線粒體糖尿病成為糖尿病中的主要亞型之一。然而目前臨床上對糖尿病的診斷通常只分為1型和2型，僅根據(jù)臨床實驗室的一般生化和免疫項目檢測難以正確診斷線粒體糖尿病，因此，檢測糖尿病的線粒體DNA易感基因位點，對于糖尿病的正確分類、線粒體糖尿病的早期診斷和積極預防有著重要的意義。
傳統(tǒng)的糖尿病線粒體基因突變檢測方法主要包括PCR-RFLP、AS-PCR和DNA測序方法等，這些方法在基因突變檢測中起了重要作用，但普遍存在著明顯的不足，諸如檢測基因位點有限、耗時長、操作繁瑣等，不適用于大批量、系統(tǒng)檢測，給線粒體糖尿病的臨床診斷帶來困難。
快速準確地檢測糖尿病線粒體基因突變是早期診斷線粒體糖尿病的關(guān)鍵指標。PCR-RFLP方法是經(jīng)典的生物學方法，但由于限制性內(nèi)切酶識別位點有限，難以實現(xiàn)同時檢測多個位點，且耗時較長；AS-PCR方法雖能準確檢測突變，但要求擴增條件非常優(yōu)化，且引物要有高度的特異性，否則易出現(xiàn)假限性或假陽性結(jié)果(Urata M，Wada Y，Kim SH，et al.High-sensitivity detection of the A3243Gmutation of mitochondrial DNA by a combination of allele-specific PCR and peptidenucleic acid-directed PCR clamping.Clin Chem，2004，502045-2051.)；DNA測序雖是目前公認的檢測新突變的金標準，但由于其對特殊結(jié)構(gòu)DNA序列無法測序，而且只有異質(zhì)性水平＞25％時才能檢出，而臨床常用標本外周血白細胞中異質(zhì)性水平通常都達不到這個標準，因此很易漏檢(Maitra A，Cohen Y，Gillespie SE，et al.The Human MitoChipa high-throughput sequencing microarray for mitochondrialmutation detection.Genome Res，2004，14812-819.)。因此，如何快速、準確檢測糖尿病線粒體基因突變是線粒體糖尿病臨床診斷的主要難題之一。
基因芯片是近年來興起的一項重要生物技術(shù)，越來越多地應用于基因表達、基因突變檢測、多態(tài)性分析和基因診斷(Poddar SK.Symmetric vs asymmetric PCRand molecular beacon probe in the detection of a target gene of adenovirus.Mol CellProbes，2000，1425-32.王軍，王升啟，程曉霞，等.寡核苷酸微陣列法檢測高血壓患者血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因多態(tài)性的臨床應用.中華檢驗醫(yī)學雜志[J]，2005，28276-277.)。Chee等于1996年利用標準的光刻和固相DNA合成技術(shù)合成寡核苷酸探針，成功研制了第一張線粒體基因測序芯片(Chee M.，Yang R.，Hubbell E.etal.Accessing genetic information with high-density DNA arrays.SCIENCE，1996，274610-614.)；其后，Maitra等于2004年也利用該項技術(shù)研發(fā)了用于癌癥線粒體基因突變檢測的雙鏈測序芯片(Maitra A，Cohen Y，Gillespie SE，et al.TheHuman MitoChipa high-throughput sequencing microarray for mitochondrialmutation detection.Genome Res，2004，14812-819.)。這兩種測序芯片可對線粒體基因進行系統(tǒng)的分析，但檢測技術(shù)和設(shè)備要求高，難以在臨床實踐中普遍應用。2005年P(guān)ark等研制了Cy3標記的RNA靶探針寡核苷酸芯片對年輕的成人發(fā)病型糖尿病(MODY)的HNF-1α突變進行了檢測(Park HG，Ham HO，Kim KH，HuhN.Oligonucleotide chip for the diagnosis of HNF-1α mutations.Biosensors andBioelectronics，2005，21637-644.)。Du等于2003年利用功能化單層金芯片檢測了線粒體tRNALeu(UUR)基因3243、3251、3256、3260、3302、3303和tRNAlys基因的8344共7個位點突變(Du WD，Marsac C，Kruschina M et al.Functionalizedself-assembled monolayer on gold for detection of human mitochondrial tRNA genemutations.Analytical Biochemistry，2003(322)14-25.)。但總的來說，這些芯片檢測的基因位點有限，均在十個以內(nèi)，而且均不是針對糖尿病相關(guān)的線粒體基因突變檢測。因此，本課題組對糖尿病線粒體基因突變進行了相關(guān)研究，制備的9個突變位點(tRNALeu(UUR)基因3243，3256，3290；ND1基因3316，3394，3593，3606，3618，3688)檢測芯片，以醛基玻片作為載體，10條探針的5′或3′端加長臂15T后經(jīng)氨基修飾后固定在玻片上，被檢測的目的DNA以熒光染料Cy3標記，陽性對照為3290位點的野生型探針和突變型探針混合液。利用該芯片對經(jīng)PCR-RFLP方法篩選出的已知突變標本進行了檢測，初步摸索了試驗條件，不足之處是芯片未設(shè)立陰性對照、Cy3熒光染料的背景較高、以及所檢測位點少(劉松梅，周新，李霞等.2型糖尿病線粒體基因8個突變位點的研究.中國病理生理雜志，2006，22586-591.)。之后，又研制了檢測28個突變位點(tRNALeu(UUR)基因3243，3250，3251，3252，3254，3256，3260，3264，3290，3302，3303；ND1基因3316，3391，3394，3398，3399，3421，3426，3460，3537，3593，3606，3618，3688，4136，4164，4200，4216)的檢測芯片，以尼龍膜為載體，56條探針經(jīng)長臂8T修飾后，用478A手工點樣儀(美國UVP公司)點樣，通過紫外線照射固定在尼龍膜上，被檢測的目的DNA以生物素標記，陽性對照為生物素標記的3243位點野生型探針和突變型探針混合液，陰性對照為5×SSC探針稀釋液。利用該膜芯片對200例2型糖尿病標本和210名正常對照標本進行了檢測，檢出了7種突變位點，具有成本低，無需特殊設(shè)備，經(jīng)濟實用特點。不足之處是膜芯片樣點不夠規(guī)整，所需的洗片和顯色過程耗時較長，目視化觀察判斷結(jié)果存在一定的假陽性率和假陰性率、以及不能系統(tǒng)檢測整個線粒體突變位點(劉松梅，周新，鄭芳等.基因芯片篩查2型糖尿病線粒體DNA堿基突變.中華醫(yī)學雜志，2006，86(40)2853-2857.)。因而，本課題組進一步研制了45個突變位點檢測的玻璃基因芯片。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測線粒體糖尿病的45個基因位點微陣列芯片。該芯片設(shè)計了監(jiān)控系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)。監(jiān)控系統(tǒng)包括堿基序列設(shè)計合理的野生型和突變型探針組成的陽性對照和平行對照，以及探針稀釋液組成的陰性對照；檢測系統(tǒng)由待檢的mtDNA 45個位點的野生型和突變型寡核苷酸探針組成。每張芯片包含1～3個0.04cm2的點樣矩陣，每個矩陣90條探針、324個樣點(18行×18列)，布控合理、規(guī)整，度高。實驗操作流程簡單，省時，成本低，僅需1次不對稱PCR擴增和Cy5標記、1次雜交反應，即可篩查1～3份不同標本的mtDNA45個位點。該芯片檢測所需試劑微量、結(jié)果準確、效率高，克服了傳統(tǒng)和現(xiàn)有方法中存在的不足(如漏檢、耗時長等)，達到了快速檢測線粒體糖尿病的臨床效果?？蓾M足不同層次醫(yī)院的要求，適用于糖尿病患者和高危人群的檢測，有助于臨床特殊類型糖尿病的正確診斷和分類，早發(fā)現(xiàn)病人，早預防，早治療。
為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施(1)計算機軟件輔助設(shè)計探針和引物該芯片是一種檢測多位點極為復雜的反應體系，涉及90條探針和18條引物的設(shè)計和篩選。本發(fā)明按疾病相關(guān)遺傳基因生物學規(guī)律，結(jié)合PCR理論，考慮一次性快速準確檢測線粒體糖尿病，既不漏診，也不誤診等方方面面，進行設(shè)計、排列組合，巧妙布控。采用生物軟件Primer Premier 5.0(PREMIER BiosoftInternational，CA)和NCBI BLAST軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)輔助設(shè)計和分析所需的探針和引物，使目的片段擴增和雜交反應，能在同一條件下完成，要求苛刻，技術(shù)含量高。
(2)芯片矩陣布控設(shè)計一張芯片上同時固定檢測mtDNA 45個突變位點的探針90條，囊括目前國內(nèi)外報道的與糖尿病相關(guān)的整個線粒體基因突變位點。每個基因位點的野生型和突變型探針，平行點印3個樣點，即6個樣點檢測1個基因位點，共點印324個樣點(18行×18列)，包括陽性對照、陰性對照和平行對照，組成微陣列芯片的質(zhì)量保證和檢測監(jiān)控體系，確保檢測的準確性，既防漏檢，又防誤診，減小誤差。具體布控矩陣如圖1所示。
(3)涉及多種復雜的反應過程該芯片涉及多種復雜反應過程，包括物理過程、化學反應、生物化學反應和分子生物學反應，如玻片的醛基化修飾，點樣，固定，DNA模板的提取，PCR擴增和標記，雜交、洗滌、顯色等。
檢測線粒體糖尿病時，只需患者的外周血100μl或帶毛囊的頭發(fā)3-5根、進行一次不對稱PCR和一次雜交反應，即可于6小時內(nèi)準確地檢測1～3份被檢標本是否存在上述45個基因位點突變。
(4)靶DNA標記和檢測基因芯片的被檢測目的片段的標記與擴增同步，采用Cy5熒光標記，無需顯色，洗片后直接使用熒光掃描儀觀察結(jié)果，節(jié)省實驗時間。
(5)熒光信號分析該微陣列芯片通過GenePix pro 4.0軟件獲取324個樣點的熒光信號強度，通過已知突變位點的野生型和突變型探針熒光信號強度比值，背景信號強度確立突變型的Cutoff值。GeneSpring 7.3軟件(Silicon Genetics company)分析45個基因位點野生型和突變型探針的檢測效率。
一種檢測線粒體糖尿病45個基因位點微陣列芯片的制備步驟是(1)以醛基玻片為載體玻片經(jīng)鉻酸洗液浸泡過夜，去除表面有機物等雜質(zhì)，然后用蒸餾水清洗，再用25％氨水浸泡過夜，水洗。pH為4.5氨丙基三甲氧基硅烷的95％乙醇浸20min，再用95％乙醇超聲清洗，純水超聲清洗，115℃烘干45min。最后在5％的戊二醛溶液中50min，超聲10min，水洗兩次，置于室溫干燥備用。
(2)設(shè)計引物和探針本發(fā)明研制的微陣列芯片可檢測目前國內(nèi)外報道的與糖尿病相關(guān)的線粒體基因45個突變位點。首先從MITOMAP、mtSNP、mtDB、PubMed、中國期刊網(wǎng)和重慶維普數(shù)據(jù)庫中檢索與糖尿病相關(guān)的線粒體基因突變位點，再以線粒體基因劍橋序列(GenBank#J01415.0 gi337188)作為參考序列，采用PrimerPremier5.0(PREMIER Biosoft International，CA)和NCBI BLAST軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，針對mtDNA 45個突變位點，設(shè)計特異性野生型和突變型寡核苷酸探針90條(請見表1，mtDNA 45個位點野生型和突變型探針序列)，退火溫度為59.2±1.4℃(56.7℃～62℃)，以及特異性擴增9個目的DNA片段序列(Sequence ID 1-9)引物18條(請見表2，9個目的片段的特異性擴增引物)。
未公開的引物7F和7R擴增范圍為mtDNA 14470-14944(Sequence ID 7)，該片段涵蓋了mtDNA 14577 T→C，14693 A→G，14709 T→C 3個突變位點。未公開的72條探針(表1中未標明下劃線的堿基序列)的G+C堿基含量為40％～60％、退火溫度為56.7～62℃，與已公開的9個位點探針可在同一個雜交反應體系發(fā)生反應，既可檢測位于線粒體16S rRNA基因、tRNALeu(UUR)基因、ND1基因、ND2基因、ND4基因、tRNAGlu基因和D-loop區(qū)的36個位點的堿基突變，又可檢測線粒體tRNALeu(UUR)基因和ND1基因的9個突變位點(已公開的玻璃載體基因芯片檢測位點)，進一步完善了基因芯片的設(shè)計和應用，達到了系統(tǒng)地檢測與糖尿病相關(guān)的整個線粒體基因的45個突變位點，檢測效率大為提高，不會漏檢上述36個突變位點，實現(xiàn)了使用該膜芯片檢測線粒體糖尿病既無漏診、又無誤診的目標。
(3)芯片點陣布控所研制的微陣列芯片為324個樣點組成的18行×18列的矩陣(圖1)，包括監(jiān)控系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)。
監(jiān)控系統(tǒng)包括3個部分，分別為①芯片陰性對照，為探針稀釋液(pH8.0，1×TE Buffer)，布控在有公共野生型探針的位點處，如點樣矩陣(圖1)中，mtDNA3200，3205與3206位點公用一條野生型探針，在mtDNA 3200和3205位點的突變型探針點樣處下方，點印陰性對照。若陰性對照雜交后無信號或信號與背景信號持同，表明正常；若有雜交信號或高于背景信號，表明探針稀釋液有污染或點樣過程有污染。②芯片陽性對照，為mtDNA 3243和5178兩個位點的4條探針按1∶1∶1∶1比例混合的5μM溶液，布控在微陣列芯片的左邊3列，共54(18×3)個陽性對照樣點，如圖1所示。若雜交后有信號，表明正常；若無信號，則說明實驗失敗或這兩個基因位點所處的片段同時缺失，但目前尚無此報道。③芯片平行對照，為各位點的5μM的探針溶液平行點印3個點，如圖1中mtDNA 1888位點的野生型探針和突變型探針各點印3個樣點，即6個樣點檢測1個基因位點。若信號強度均一，說明雜交和洗滌過程控制良好，探針的結(jié)合能力好，具有可重復性，否則表明探針的結(jié)合能力或特異性存在問題，或是雜交或洗滌過程控制欠佳。
檢測系統(tǒng)由線粒體基因45個位點的90條野生型和突變型寡核苷酸探針布控的樣點組成；每條探針均采用pH8.0的1×TE Buffer稀釋為5μM溶液，并點印3個平行點，即6個樣點(野生型和突變型探針各3個樣點)檢測1個基因位點，45個基因位點按照從左到右從小到大的順序排列(圖1)。如果應用于線粒體糖尿病高危人群篩選，當某個位點的突變型與野生型探針信號比值(ratio-1)≥1.1且消減背景信號后的兩者比值(ratio-2)≥1.3，則判定該位點發(fā)生突變。如果應用于臨床線粒體糖尿病確診，則ratio-1和ratio-2值均必須超過2.0或者其中之一超過3.0。
(4)監(jiān)控系統(tǒng)與檢測系統(tǒng)的點陣布控監(jiān)控系統(tǒng)與檢測系統(tǒng)的點陣布控在同一區(qū)域。采用Packard芯片點樣儀(Nanoliter Dispensing system，PackardInstrument Company)點印于醛基玻片上；室溫(25～30℃)保濕固定48～72小時，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。該微陣列芯片洗滌過程為室溫(25℃～30℃)以2×SSC-0.1％SDS洗滌5min×2次，在42℃以0.5×SSC-0.1％SDS洗滌15min×2次，室溫下雙蒸水洗滌10min，離心甩干。
表1 mtDNA 45個位點野生型和突變型探針序列


注帶下劃線突變位點的探針序列在研制者發(fā)表的文章中已公開表29個目的片段的特異性擴增引物

注帶下劃線引物序列(7F，7R)尚未公開，其余的16條引物序列在研制者發(fā)表的文章中已公開或來自文獻(Levin BC，Cheng H，Reeder DJ(1999)A human mitochondrial DNAstandard reference material for quality control in forensic identification，medical diagnosis，andmutation detection.Genomics 55135-146.Fukuda M，Nakano S，Imaizumi N，Kitazawa M，Nishizawa M，Kigoshi T，Uchida K(1999)Mitochondrial DNA mutations are associated with bothdecreased insulin secretion and advanced microvascular complications in Japanese diabeticsubjects.J Diabetes Complications 13277-283.)一種檢測線粒體糖尿病的45個基因位點微陣列芯片的檢測步驟是(1)收集病人標本，提取模板DNA。
(2)采用表2中9對引物進行不對稱多重PCR擴增目的DNA(Sequence ID 1-9)。不對稱PCR反應液是由10×buffer(晶美公司)，10μmol/L的各正向引物(1F-9F)，1μtmol/L各反向引物(1R-9R)，25mmol/L MgCl2(晶美公司)，10mmol/L dNTPs(含0.5nM Cy5-dCTP，由Amersham公司提供)，1U Tag DNA聚合酶(晶美公司)和無菌雙蒸水組成。引物1和4，2和3，5和6可行多重不對稱PCR。擴增條件為95℃預變性3min，35個循環(huán)(94℃變性45s，58℃退火35s，72℃延伸45s)，72℃延伸7min。
(3)PCR產(chǎn)物100℃煮沸變性，-20℃聚冷。
(4)42℃預雜交30min封閉芯片非特異性結(jié)合，將變性的Cy5標記ssDNA與預熱的雜交液1∶10混勻，充入反應艙42℃雜交3h。標記的被檢標本擴增的目的片段在相同的雜交反應條件下同時與監(jiān)控系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)的所有探針反應。
(5)室溫(25℃～30℃)以2×SSC-0.1％SDS洗滌5min×2次，在42℃以0.5×SSC-0.1％SDS洗滌15min×2次，室溫下雙蒸水洗滌10min，離心甩干。
(6)Axon Genepix 4000B芯片掃描儀在650nm波長采集芯片圖像(圖2)，GenePix Pro 4.0軟件獲取各個點的熒光強度和背景信號，根據(jù)信號比值判定被檢測位點是否發(fā)生突變，即可對線粒體糖尿病進行篩查和確診。(Cy5對光敏感，整個操作過程盡量避光)(7)與已公開的基因芯片比較，該微陣列芯片具有獨特優(yōu)點①1張芯片可同時檢測1～3份不同標本mtDNA 45個位點堿基突變；②操作簡單，無需單獨標記靶DNA，無需顯色，且Cy5標記的檢測熒光背景信號低；③可檢測mtDNA 45個位點堿基突變，無漏檢和誤診，在9個位點玻璃芯片和28個位點膜芯片所檢測報告陰性標本中檢出了位于線粒體16S rRNA基因、tRNALeu(UUR)基因、ND1基因、ND2基因、ND4基因、tRNAGlu基因和D-loop區(qū)的其它位點的堿基突變，并均經(jīng)DNA測序驗證(圖3)；④根據(jù)野生型和突變型探針熒光強度比值，以及背景信號強度，判斷被檢位點是否發(fā)生突變，結(jié)果科學客觀，其誤差遠遠小于膜芯片目視化觀察結(jié)果。該微陣列芯片的突變型探針和野生型探針的背景熒光強度分別為43.25±2.1，44.56±2.63；各基因位點的片內(nèi)平行對照點之間的熒光強度一致性好，變異系數(shù)小于5.6％；片間相同位點之間變異系數(shù)小于7.46％，減去背景信號的陽性探針熒光強度明顯高于陰性探針(t＝8.6，P＝0.000)，易于判斷結(jié)果；檢測結(jié)果假陰性率為0.53％，假陽性率為2.22％；而膜芯片的假陰性率為1.1％，假陽性率為4.9％。⑤成本低，反應體系微量，1次不對稱PCR的反應體系為25μl，1次雜交反應體系為200μl。
發(fā)明的優(yōu)點和效果本發(fā)明研制了一種快速檢測線粒體糖尿病的45位點微陣列芯片。該芯片具有很多優(yōu)點①9個目的DNA片段的擴增和Cy5熒光染料標記可在同一條件下進行，多重不對稱PCR可獲得大量Cy5-ssDNA，足以保證后續(xù)雜交反應所需的DNA量，省時并降低了實驗成本；②探針退火溫度為59.2±1.4℃(56.7℃～62℃)，在42℃進行雜交反應時可獲得滿意的雜交效果；③Cy5熒光染料標記，洗片后直接采用熒光掃描儀觀察結(jié)果，無需顯色，根據(jù)兩種探針雜交信號的強弱，可判斷被檢測位點是否發(fā)生突變，省時；④芯片包含監(jiān)控系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)兩個體系，可系統(tǒng)檢測糖尿病相關(guān)的線粒體基因45個突變位點，并有質(zhì)量控制；④提供的玻璃芯片可應用于臨床，具有很好的應用市場和經(jīng)濟效益。因此，該芯片可快速檢測線粒體基因45個位點突變，適用于糖尿病患者和高危人群的篩查，輔助線粒體糖尿病的確診。本發(fā)明為進一步拓展線粒體基因突變相關(guān)疾病的篩查提供了一條新的思路、奠定了基礎(chǔ)。


圖145個突變位點檢測微陣列芯片點樣矩陣圖中●，陽性對照；◎，突變型探針；⊙，野生型探針；○，陰性對照；數(shù)字為基因位點圖2Cy5標記45個突變位點檢測微陣列芯片檢測結(jié)果圖2A中a，3593 T→C突變，b，4833 A→G突變，c，16223 T基因型；圖2B中a，12026 A→G突變，b，16223 T基因型。
圖3微陣列芯片檢測的mtDNA15個突變位點經(jīng)測序驗證結(jié)果中箭頭所指為突變后的堿基，數(shù)字為突變的基因位點具體實施方式
實施例1樣品的處理和標記(1)新鮮全血標本采用改良NaI方法(喻紅，彭芳芳.醫(yī)學生物化學與分子生物學實驗技術(shù)，第1版，武漢大學出版社，2003)提取DNA模板。
(2)血痕標本取1.5×1.5cm2大小的血痕，浸人1ml雙蒸水中，振蕩混勻后，12,000rpm離心3min，去上清，加雙蒸水洗滌一次，然后加入200μl 5％的Chelex-100，56℃孵育20～30min后，煮沸8min，10,000rpm離心3min，取上清進行PCR擴增。
(3)毛球標本將3～4根毛發(fā)在距離根部3～4mm處剪斷，毛球浸于Chelex-100溶液中，置56℃保溫6～10h。振蕩5～10s。100℃煮沸10min后，10000r/min離心3min，取上清液待用。
樣本處理好之后，進行目的DNA擴增不對稱PCR反應液是由10×buffer，10μmol/L的各正向引物，1μmol/L各反向引物，25mmol/LMgCl2，10mmol/LdNTPs(含0.5nM Cy5-dCTP，由Amersham公司提供)和無菌雙蒸水組成。且引物1和4，2和3，5和6可行多重不對稱PCR。擴增條件為95℃預變性3min，35個循環(huán)(94℃變性45s，58℃退火35s，72℃延伸45s)，72℃延伸7min；PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定后，100℃煮沸10min變性后放入-20℃冰箱聚冷備用。
實施例2芯片制作方法將45個位點的90條氨基修飾的野生型和突變型探針用1×TE-Buffer(1mMTris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)，稀釋為終濃度為5μM；按照附圖一的所示的點樣矩陣排列在384孔板(Costar)中，通過芯片點樣儀(Nanoliter Dispensing system，Packard Instrument Company)點印于醛基修飾的載玻片表面，置于密閉的飽和鹽溶液上方保持相對濕度，室溫(25℃～30℃)下固定48～72小時，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 實施例3雜交反應和信號檢測42℃預熱雜交液(Roche)，充入芯片反應艙，預雜交30min，以封閉基片非特異性結(jié)合；取變性的標記PCR產(chǎn)物混合液45μl與預熱的雜交液按1∶10混合，避光充入反應艙，42℃雜交3小時。
室溫(25℃～30℃)以2×SSC-0.1％SDS洗滌5min×2次(20×SSC-Buffer8.766g氯化鈉，4.412g檸檬酸鈉，雙蒸水定容至50ml，氫氧化鈉調(diào)pH至7.5；0.1％SDS1克SDS(十二烷基磺酸鈉)溶于100ml雙蒸水)，在42℃以0.5×SSC-0.1％SDS洗滌15min×2次，室溫下雙蒸水洗滌10min，離心甩干。AxonGenepix 4000B芯片掃描儀在650nm波長采集芯片圖像(圖2)，GenePix Pro 4.0軟件獲取各個點的熒光強度和背景信號，根據(jù)信號比值判定被檢測位點是否發(fā)生突變。(Cy5對光敏感，整個操作過程盡量避光)GeneSpring 7.3軟件(Silicon Genetics company)對芯片的分析結(jié)果如下。
Gene Name Fold Change Description5178w3 19.45 5178 wild-type probe5178wl 17.99 5178 wild-type probe5178w2 17.03 5178 wild-type probe12026ml 6.356 12026 mutant probe12026m3 5.254 12026 mutant probe12026m2 4.485 12026 mutant probe4833w2 3.898 4833 wild-type probe3251w2 3.755 3250，3251，3252，3254 and 3256 public wild-type probe3391m3 3.231 3391 mutant probe3394m2 2.946 3394 mutant probe3606w3 2.766 3606 wild-type probe3391ml 2.766 3391 mutant probe
3606w2 2.744 3606 wild-type probe3606w1 2.667 3606 wild-type probe3394m3 2.603 3394 mutant probe3391m2 2.599 3391 mutant probe3394m1 2.555 3394 mutant probe3460w1 2.532 3460 wild-type probe3460w2 2.513 3460 wild-type probe3316w3 2.237 3316 wild-type probe3316w1 2.175 3316 wild-type probe16223w2 2.127 16223 wild-type probe3316w2 2.092 3316 wild-type probe12258w2 2.079 12258 wild-type probe12026w3 0.482 12026 wild-type probe12026w1 0.4412026 wild-type probe14577m1 0.386 14577 mutant probe3398m3 0.383 3398 mutant probe3302w3 0.372 3302 and 3303 public wild-type probe3254m3 0.373254 mutant probe15812m1 0.347 15812 mutant probe3254m1 0.345 3254 mutant probe15812w2 0.317 15812 wild-type probe15812w3 0.286 15812 wild-type probe15812w1 0.284 15812 wi1d-type probe15812m3 0.229 15812 mutant probe Gene NameP-value Description3206w2 0.049l 3200，3205 and 3206 public wild-type probe3399m3 0.0474 3399 mutant probe8381w2 0.0434 8381 wild-type probe4164w2 0.0409 4164 wild-type probe4164w3 0.0397 4164 wild-type probe8381w1 0.0389 8381 wild-type probe3206w3 0.0389 3200，3205 and 3206 public wi1d-type probe4200w3 0.0385 4200 wild-type probe4164w1 0.0361 4164 wild-type probe16223w2 0.0341 16223 wild-type probe3399m1 0.032 3399 mutant probe16223w3 0.03l 16223 wild-type probe3290w2 0.0281 3290 wild-type probe3618w2 0.028 3618 wild-type probe14709ml 0.025 14709 mutant probe4216w3 0.024 4216 wild-type probe3593w3 0.0214 3593 wild-type probe14577m1 0.0212 14577 mutant probe
14577w1 O.021114577 wild-type probe4216w2 0.01814216 wild-type probe14577w2 0.017214577 wild-type probe14693m3 0.015314693 mutant probe14577w3 0.014914577 wild-type probe3256m2 0.01483256 mutant probe14709w3 0.014214709 wild-type probe14577m3 0.011914577 mutant probe14577m2 0.011514577 mutant probe14693m1 0.00975 14693 mutant probe16223m1 0.00924 16223 mutant probe14709w2 0.00837 14709 wild-type probe12026w2 0.00693 12026 wild-type probe14709w1 0.00619 14709 wild-type probe4216w1 0.00581 4216 wild-type probe16223m2 O.00362 16223 mutant probe3606w1 0.00326 3606 wild-type probe3290w3 0.00291 3290 wild-type probe16223m3 0.00218 16223 mutant probe4136w2 0.000814 4136 wild-type probe3290w1 0.000639 3290 wild-type probe4136w1 0.000519 4136 wild-type probe3606w2 0.000326 3606 wild-type probe4136w3 0.000108 4136 wild-type probe
SEQUENCE LISTING<110>武漢大學<120>一種檢測線粒體糖尿病的45個基因位點微陣列芯片<130>mtDNA1657-2216<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>560<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1cttgaccgct ctgagctaaa cctagcccca aacccactcc accttactac cagacaacct 60tagccaaacc atttacccaa ataaagtata ggcgatagaa attgaaacct ggcgcaatag 120atatagtacc gcaagggaaa gatgaaaaat tataaccaag cataatatag caaggactaa 180cccctatacc ttctgcataa tgaattaact agaaataact ttgcaaggag agccaaagct 240aagacccccg aaaccagacg agctacctaa gaacagctaa aagagcacac ccgtctatgt 300agcaaaatag tgggaagatt tataggtaga ggcgacaaac ctaccgagcc tggtgatagc 360tggttgtcca agatagaatc ttagttcaac tttaaatttg cccacagaac cctctaaatc 420cccttgtaaa tttaactgtt agtccaaaga ggaacagctc tttggacact aggaaaaaac 480cttgtagaga gagtaaaaaa tttaacaccc atagtaggcc taaaagcagc caccaattaa 540gaaagcgttc aagctcaaca 560<210>2<211>596<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1agcgccttcc cccgtaaatg atatcatctc aacttagtat tatacccaca cccacccaag 60aacagggttt gttaagatgg cagagcccgg taatcgcata aaacttaaaa ctttacagtc 120agaggttcaa ttcctcttct taacaacata cccatggcca acctcctact cctcattgta 180cccattctaa tcgcaatggc attcctaatg cttaccgaac gaaaaattct aggctatata 240caactacgca aaggccccaa cgttgtaggc ccctacgggc tactacaacc cttcgctgac 300gccataaaac tcttcaccaa agagccccta aaacccgcca catctaccat caccctctac 360atcaccgccc cgaccttagc tctcaccatc gctcttctac tatgaacccc cctccccata 420cccaaccccc tggtcaacct caacctaggc ctcctattta ttctagccac ctctagccta 480gccgtttact caatcctctg atcagggtga gcatcaaact caaactacgc cctgatcggc 540gcactgcgag cagtagccca aacaatctca tatgaagtca ccctagccat cattct 596<210>3<211>318
<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1gacgcactct cccctgaact ctacacaaca tattttgtca ccaagaccct acttctaacc 60tccctgttct tatgaattcg aacagcatac ccccgattcc gctacgacca actcatacac120ctcctatgaa aaaacttcct accactcacc ctagcattac ttatatgata tgtctccata 180cccattacaa tctccagcat tccccctcaa acctaagaaa tatgtctgat aaaagagtta240ctttgataga gtaaataata ggagcttaaa cccccttatt tctaggacta tgagaatcga300acccatccct gagaatcc 318<210>4<211>753<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1ccctttcact tctgagtccc agaggttacc caaggcaccc ctctgacatc cggcctgctt 60cttctcacat gacaaaaact agcccccatc tcaatcatat accaaatctc tccctcacta120aacgtaagcc ttctcctcac tctctcaatc ttatccatca tagcaggcag ttgaggtgga180ttaaaccaga cccagctacg caaaatctta gcatactcct caattaccca cataggatga240ataatagcag ttctaccgta caaccctaac ataaccattc ttaatttaac tatttatatt300atcctaacta ctaccgcatt cctactactc aacttaaact ccagcaccac gaccctacta360ctatctcgca cctgaaacaa gctaacatga ctaacaccct taattccatc caccctcctc420tccctaggag gcctgccccc gctaaccggc tttttgccca aatgggccat tatcgaagaa480ttcacaaaaa acaatagcct catcatcccc accatcatag ccaccatcac cctccttaac540ctctacttct acctacgcct aatctactcc acctcaatca cactactccc catatctaac600aacgtaaaaa taaaatgaca gtttgaacat acaaaaccca ccccattcct ccccacactc660atcgccctta ccacgctact cctacctatc tcccctttta tactaataat cttatagaaa720tttaggttaa atacagacca agagccttca aag 753<210>5<211>506<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1cggtcaatgc tctgaaatct gtggagcaaa ccacagtttc atgcccatcg tcctagaatt 60aattccccta aaaatctttg aaatagggcc cgtatttacc ctatagcacc ccctctaccc120cctctagagc ccactgtaaa gctaacttag cattaacctt ttaagttaaa gattaagaga180accaacacct ctttacagtg aaatgcccca actaaatact accgtatggc ccaccataat240tacccccata ctccttacac tattcctcat cacccaacta aaaatattaa acacaaacta300ccacctacct ccctcaccaa agcccataaa aataaaaaat tataacaaac cctgagaacc 360aaaatgaacg aaaatctgtt cgcttcattc attgccccca caatcctagg cctacccgcc420
gcagtactga tcattctatt tccccctcta ttgatcccca cctccaaata tctcatcaac480aaccgactaa tcaccaccca acaatg 506<210>6<211>864<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1tgctagtaac cacgttctcc tgatcaaata tcactctcct acttacagga ctcaacatac 60tagtcacagc cctatactcc ctctacatat ttaccacaac acaatggggc tcactcaccc120accacattaa caacataaaa ccctcattca cacgagaaaa caccctcatg ttcatacacc180tatcccccat tctcctccta tccctcaacc ccgacatcat taccgggttt tcctcttgta240aatatagttt aaccaaaaca tcagattgtg aatctgacaa cagaggctta cgacccctta300tttaccgaga aagctcacaa gaactgctaa ctcatgcccc catgtctaac aacatggctt360tctcaacttt taaaggataa cagctatcca ttggtcttag gccccaaaaa ttttggtgca420actccaaata aaagtaataa ccatgcacac tactataacc accctaaccc tgacttccct480aattcccccc atccttacca ccctcgttaa ccctaacaaa aaaaactcat acccccatta540tgtaaaatcc attgtcgcat ccacctttat tatcagtctc ttccccacaa caatattcat600gtgcctagac caagaagtta ttatctcgaa ctgacactga gccacaaccc aaacaaccca660gctctcccta agcttcaaac tagactactt ctccataata ttcatccctg tagcattgtt720cgttacatgg tccatcatag aattctcact gtgatatata aactcagacc caaacattaa780tcagttcttc aaatatctac tcatcttcct aattaccata ctaatcttag ttaccgctaa840caacctattc caactgttca tcgg 864<210>7<211>475<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1tccaaagaca accatcattc cccctaaata aattaaaaaa actattaaac ccatataacc 60tcccccaaaa ttcagaataa taacacaccc gaccacaccg ctaacaatca atactaaacc120cccataaata ggagaaggct tagaagaaaa ccccacaaac cccattacta aacccacact180caacagaaac aaagcataca tcattattct cgcacggact acaaccacga ccaatgatat240gaaaaaccat cgttgtattt caactacaag aacaccaatg accccaatac gcaaaattaa300ccccctaata aaattaatta accactcatt catcgacctc cccaccccat ccaacatctc360cgcatgatga aacttcggct cactccttgg cgcctgcctg atcctccaaa tcaccacagg420actattccta gccatgcact actcaccaga cgcctcaacc gccttttcat caatc 475<210>8<211>511<212>DNA<213>Homo sapiens
<400>1cgcctacaca attctccgat ccgtccctaa caaactagga ggcgtccttg ccctattact 60atccatcctc atcctagcaa taatccccat cctccatata tccaaacaac aaagcataat120atttcgccca ctaagccaat cactttattg actcctagcc gcagacctcc tcattctaac180ctgaatcgga ggacaaccag taagctaccc ttttaccatc attggacaag tagcatccgt240actatacttc acaacaatcc taatcctaat accaactatc tccctaattg aaaacaaaat300actcaaatgg gcctgtcctt gtagtataaa ctaatacacc agtcttgtaa accggagatg360aaaacctttt tccaaggaca aatcagagaa aaagtcttta actccaccat tagcacccaa420agctaagatt ctaatttaaa ctattctctg ttctttcatg gggaagcaga tttgggtacc480acccaagtat tgactcaccc atcaacaacc g 511<210>9<211>455<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1aactccacca ttagcaccca aagctaagat tctaatttaa actattctct gttctttcat 60ggggaagcag atttgggtac cacccaagta ttgactcacc catcaacaac cgctatgtat120ttcgtacatt actgccagcc accatgaata ttgtacggta ccataaatac ttgaccacct180gtagtacata aaaacccaat ccacatcaaa accccctccc catgcttaca agcaagtaca240gcaatcaacc ctcaactatc acacatcaac tgcaactcca aagccacccc tcacccacta300ggataccaac aaacctaccc acccttaaca gtacatagta cataaagcca tttaccgtac360atagcacatt acagtcaaat cccttctcgt ccccatggat gacccccctc agataggggt420cccttgacca ccatcctccg tgaaatcaat atccc 45權(quán)利要求
1.一種檢測線粒體糖尿病45個基因位點微陣列芯片，它包括下列步驟A、以醛基玻片為載體；B、設(shè)計引物和探針首先從MITOMAP、mtSNP、mtDB、PubMed、中國期刊網(wǎng)和重慶維普數(shù)據(jù)庫中檢索與糖尿病的線粒體基因/mtDNA突變位點；其次以線粒體基因劍橋堿基序列/GenBank#J01415.0 gi337188為序列；第三是采用Primer Premier 5.0和NCBI BLAST軟件，針對mtDNA 45個突變位點，設(shè)計特異性擴增目的DNA序列引物；特異性野生型和突變型寡核苷酸探針，退火溫度為56.7℃～62℃，其5′端或3′端加載長臂15T后修飾氨基基團；C、芯片點陣布控微陣列芯片為324個樣點組成的18行×18列的矩陣，包括監(jiān)控系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)，監(jiān)控系統(tǒng)為①芯片陰性對照，為探針稀釋液，pH 8.0，1×TE Buffer，布控在有公共野生型探針的位點處，點樣矩陣中，mtDNA 3200，3205與3206位點公用1條野生型探針，在mtDNA 3200和3205位點的突變型探針點樣處下方，點印陰性對照；②芯片陽性對照，為mtDNA 3243和5178兩個位點的4條探針按1∶1∶1∶1比例混合的5μM溶液，布控在微陣列芯片的左邊3列，共54個陽性對照樣點；③芯片平行對照，為各位點的5μM探針溶液平行點印3個點，在矩陣中mtDNA 1888位點的野生型探針和突變型探針各點印3個樣點，共6個樣點檢測1個基因位點；檢測系統(tǒng)由mtDNA 45個位點的野生型和突變型寡核苷酸探針布控的樣點組成；每條探針采用pH8.0的1×TE Buffer稀釋為5μM溶液，并點印3個平行點，共6個樣點檢測1個基因位點，45個基因位點從左到右順序排列；D、監(jiān)控系統(tǒng)與檢測系統(tǒng)的點陣布控監(jiān)控系統(tǒng)與檢測系統(tǒng)的點陣布控在同一區(qū)域，采用Packard芯片點樣儀點印于醛基玻片上；室溫保濕固定48～72小時，4℃冰箱保存?zhèn)溆?；所述的特異性野生型和突變型寡核苷酸探?br> 所述的目的DNA序列引物
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測線粒體糖尿病45個基因位點微陣列芯片，其特征在于所述的微陣列芯片洗滌過程為，室溫以2×SSC-0.1％SDS洗滌5min×2次，在42℃以0.5×SSC-0.1％SDS洗滌15min×2次，室溫下雙蒸水洗滌10min，離心甩干。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測線粒體糖尿病的45個基因位點微陣列芯片。其步驟是以醛基玻片為載體，其次是引物和探針設(shè)計，第三是芯片點陣布控，最后是監(jiān)控系統(tǒng)與檢測系統(tǒng)的點陣布控。監(jiān)控系統(tǒng)由堿基突變位點的陰性對照、陽性對照和平行對照組成；檢測系統(tǒng)為待檢的mtDNA 45個位點的野生型和突變型探針。每芯片含1～3個0.04cm
文檔編號C12N15/11GK101016564SQ20061012537
公開日2007年8月15日 申請日期2006年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月8日
發(fā)明者劉松梅, 周新, 李霞, 鄭芳, 涂建成, 湯冬玲, 曲喜英, 田艷麗, 蔡春林 申請人:武漢大學