2型糖尿病易感基因位點及檢測方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及2型糖尿病易感基因位點及檢測方法和試劑盒。具體地，本發(fā)明公開了基于全基因組關(guān)聯(lián)分析研究而發(fā)現(xiàn)的2型糖尿病易感基因位點。本發(fā)明還提供了一種檢測2型糖尿病易感性的方法，它包括檢測個體的GRK5基因和RASGRP1基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白與正常相比是否存在變異，存在變異就表明該個體患2型糖尿病的可能性大于正常人群。本發(fā)明還公開了相應(yīng)的檢測試劑盒。
【專利說明】2型糖尿病易感基因位點及檢測方法和試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地涉及GRK5基因和RASGRP1基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)及其與2型糖尿病的相關(guān)性。本發(fā)明還涉及檢測這些SNP的方法和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]糖尿病是一組以 糖代謝異常為特征的由不同病理生理改變組成的綜合征，不同患者之間具有較大的異質(zhì)性，而其主要的兩種病理生理改變?yōu)橐葝u素分泌不足和胰島素抵抗。
[0003]現(xiàn)在約有九千兩百萬成年人患有2型糖尿病。雖然營養(yǎng)狀況和生活方式的改變、 肥胖發(fā)病率的增加等是導(dǎo)致2型糖尿病發(fā)病率增加的重要因素，遺傳因素同樣有著不可或缺的作用。在過去幾十年里，中國的2型糖尿病發(fā)病率顯著升高。研究表明，包括中國漢族人群在內(nèi)的東亞人群，其2型糖尿病的遺傳易感性高于西方人群。
[0004]雖然已開展了一些2型糖尿病相關(guān)基因及多態(tài)性的研究，過去幾年對2型糖尿病的相關(guān)風(fēng)險位點已經(jīng)有很多重要的研究發(fā)現(xiàn)，但是對于不同種族人群的2型糖尿病發(fā)病的遺傳背景了解尚淺。
[0005]近年來，單核苷酸多態(tài)性(SNP)和單倍型(haplotype)在多基因疾病研究中的廣泛運用，為在分子水平上研究2型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展的機制開辟了全新的思路。同時，高通量、低成本的SNP檢測手段的不斷出現(xiàn)也為SNP大規(guī)?？焖俜中吞峁┝丝赡堋?br> [0006]SNP的存在與否以及等位基因頻率存在人種及地域的差異，這就提示多基因疾病遺傳異質(zhì)性的存在，即同一疾病或性狀在不同的人群中可能是不同的遺傳因素造成的。
[0007]在歐美人群和部分亞洲人群中開展的2型糖尿病全基因組關(guān)聯(lián)分析研究(GWAS) 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)50多個2型糖尿病易感基因位點。然而這些易感基因的危險等位基因的效應(yīng)值均很小，其總體效應(yīng)值僅僅解釋2型糖尿病遺傳力的10~15%。
[0008]雖然已有許多關(guān)于各種基因多態(tài)性與2型糖尿病的研究，但沒有證實GRK5基因或 RASGRPI基因與2型糖尿病相關(guān)性的報道，更沒有證實本發(fā)明所述的GRK5基因或RASGRP1 基因SNP與2型糖尿病相關(guān)性的報道。
[0009]綜上所述，鑒于糖尿病嚴(yán)重影響人們身體健康的疾病，為了盡早診斷和治療2型糖尿病，本領(lǐng)域迫切需要尋找2型糖尿病易感基因(尤其是與中國漢族人群相關(guān)的2型糖尿病易感基因位點)，并開發(fā)檢測2型糖尿病的方法、試劑盒，或相關(guān)的治療藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的就是提供一種輔助診斷(尤其是早期輔助診斷)2型糖尿病的方法及檢測試劑盒。
[0011]本發(fā)明的另一目的是提供一種新的治療2型糖尿病的方法。
[0012]在本發(fā)明的第一方面，提供了一種體外非診斷性檢測樣品是否存在GRK5基因或RASGRPI基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，包括步驟:
[0013](a)用特異性引物擴增樣品的GRK5基因或RASGRP1基因，得到擴增產(chǎn)物；和
[0014](b)檢測擴增產(chǎn)物中是否存在選自下組的單核苷酸多態(tài)性:
[0015]GRK5 基因的 rsl0886471:即 SEQ ID N0.:1 中第 134 位 C — T;
[0016]RASGRP1 基因的 rs7403531:即 SEQ ID N0.: 2 中第 164 位 C — T。
[0017]在另一優(yōu)選例中，所述的GRK5基因的rsl0886471對應(yīng)于人第10號染色體的第 121，139，393 位(NCBI36/hgl8)。
[0018]在另一優(yōu)選例中，所述的RASGRP1基因的rs7403531對應(yīng)于人第15號染色體的 36，610，197 位(NCBI36/hgl8)。
[0019]在另一優(yōu)選例中，所述的基因特異性引物具有SEQ ID N0:3和4所示序列、或SEQ ID N0:5和6所示序列。
[0020]在另一優(yōu)選例中，所述的擴增產(chǎn)物的長度為100_2000bp且含有SEQ ID NO:1中第 134 位或 SEQ ID NO: 2 中第 164 位。
[0021]在本發(fā)明的第二方面，提供了一種檢測2型糖尿病的試劑盒，它包括特異性擴增 GRK5基因或RASGRPI基因或轉(zhuǎn)錄本的引物，所述的引物擴增出長度為100_2000bp且含有 SEQ ID NO:1中第134位或SEQ ID NO: 2中第164位的擴增產(chǎn)物。
[0022]在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還含有選自下組的試劑:
[0023](a)與SEQ ID NO:1中第134位或SEQ ID NO: 2中第164位的突變結(jié)合的探針；
[0024](b)識別SEQ ID NO:1中第134位或SEQ ID NO:2中第164位的突變限制性內(nèi)切
酶。`
[0025]在另一優(yōu)選例中，所述的突變是選自下組的單核苷酸多態(tài)性:
[0026]GRK5 基因的 rsl0886471:即 SEQ ID N0.:1 中第 134 位 C —T;
[0027]RASGRP1 基因的 rs7403531:BP SEQ ID N0.:2 中第 164 位 C —T。
[0028]在另一優(yōu)選例中，所述的引物具有SEQ ID N0:3和4所示序列、或SEQ ID N0:5和 6所示序列。
[0029]在本發(fā)明的第三方面，提供了一種GRK5基因或RASGRP1基因的用途，用于制備對 2型糖尿病易感性進行診斷的試劑或試劑盒。
[0030]在另一優(yōu)選例中，所述的試劑或試劑盒用于檢測選自下組的單核苷酸多態(tài)性:
[0031]GRK5 基因的 rsl0886471:即 SEQ ID N0.:1 中第 134 位 C — T;
[0032]RASGRP1 基因的 rs7403531:即 SEQ ID N0.:2 中第 164 位 C —T。
[0033]在另一優(yōu)選例中，所述的試劑包括特異性擴增GRK5基因或RASGRP1基因或轉(zhuǎn)錄本的引物、含有所述SNP位點的擴增產(chǎn)物、與所述SNP位點特異性結(jié)合的探針、特異性檢測所述SNP位點的核酸芯片。
[0034]在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒包括使用說明書以及一種或多種以下試劑:
[0035]容器(a)以及位于所述容器內(nèi)的特異性擴增GRK5基因或RASGRP1基因或轉(zhuǎn)錄本的引物；
[0036]容器(b)以及位于所述容器內(nèi)的與所述SNP位點特異性結(jié)合的探針；
[0037]容器(c)以及位于所述容器內(nèi)的特異性檢測所述SNP位點的核酸芯片。
[0038]在另一優(yōu)選例中，所述的核酸芯片還包括用于檢測額外的糖尿病(尤其是2型糖尿病)易感性位點的檢測點。
[0039]在另一優(yōu)選例中，所述的額外的糖尿病(尤其是2型糖尿病)易感性位點選自下組:
[0040]rs2206734 位點:位于第 6 號染色體第 20，802，863 位 CDKALl 中 A — G ;
[0041]rsl0814916位點:位于第9號染色體第4，283，150位GLIS3基因中C — A ;
[0042]rs2383208位點:位于第9號染色體第22，122，076位CDKN2B基因中A — G ;
[0043]rsl 1257655位點:位于第10號染色體第12，347，900位CDC123基因中T — C ;
[0044]rs2299620位點:位于第11號染色體第2，814，871位KCNQl基因中G — A ;
[0045]rs4430796位點:位于第17號染色體第33，172，153位HNFlB基因中G — A ;
[0046]rsl2010175 位點:位于 X 染色體第 152，515，832 位 FAM58A 基因中 G — A ;
[0047]rs5945326 位點:位于 X 染色體第 152，553，116 位 DUSP9 基因中 A — G。
[0048]在本發(fā)明的第四方面，提供了一種多核苷酸分子的用途，所述的分子包括特異性擴增含單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點的擴增產(chǎn)物的引物和/或與所述SNP位點特異性結(jié)合的探針，其特征在于，所述的核苷酸分子用于制備對2型糖尿病易感性進行診斷的試劑盒，并且所述的SNP位點自下組:
[0049]GRK5 基因的 rsl0886471:即 SEQ ID N0.:1 中第 134 位 C — T;
[0050]RASGRPI 基因的 rs7403531:即 SEQ ID N0.:2 中第 164 位 C — T。
[0051]在另一優(yōu)選例中，所述的SNP位點是GRK5基因的rsl0886471，并且所述的試劑盒
用于檢測高空腹胰島素易感性。
[0052]在另一優(yōu)選例中，所述的SNP位點是RASGRP1基因的rs7403531，并且所述的試劑盒用于檢測高ffiAlc易感性以及低HOMA-B易感性。
[0053]在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒用于檢測東亞人群(尤其是中國人群)的2型糖尿病易感性。
[0054]在本發(fā)明的第五方面，提供了一種對個體的2型糖尿病易感性進行診斷的方法， 其特征在于，它包括步驟:
[0055]檢測該個體的GRK5基因或RASGRP1基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白，并與正常的GRK5基因或RASGRP1基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白相比較，
[0056]其中，存在差異就表明該個體患2型糖尿病的可能性高于正常人群。
[0057]在另一優(yōu)選例中，檢測的是GRK5基因或RASGRP1基因或轉(zhuǎn)錄本，并與正常核苷酸序列比較差異。
[0058]在另一優(yōu)選例中，所述的差異是選自下組的單核苷酸多態(tài)性:
[0059]GRK5 基因的 rsl0886471:即 SEQ ID N0.:1 中第 134 位 C —T;
[0060]RASGRP1 基因的 rs7403531:即 SEQ ID N0.:2 中第 164 位 C —T。
[0061]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再累述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0062]圖1顯示了研究設(shè)計總結(jié)。[0063]圖2顯示了曼哈頓圖。表示的是第一階段的495686個實驗基因分型得到的SNP 位點的全基因組關(guān)聯(lián)分析。-1oglO P值是通過合并南北人群分析得出來的，矯正了年齡、性別和前兩個主成分。每個等位基因位點上的紅點為P值小于10-6的SNP。
[0064]圖3顯示了新發(fā)現(xiàn)的2個2型糖尿病位點的區(qū)域作圖。(A, B) Imputed SNP位點是通過MACH軟件分析獲得，采用2010年8月發(fā)布的千人基因組計劃信息中的194個亞洲人的連鎖不平衡(LD)信息作為參考。P值是通過合并南北人群分析得出來的，并且是控制了第一階段樣本中的年齡、性別和前兩個主成分。采用LocusZoom軟件繪制位于標(biāo)識SNP500kb 范圍內(nèi)的區(qū)域圖，并標(biāo)記出基因組(NCBIBuild 37)位置上相應(yīng)SNP位點的-1oglOP值?；蛭恢玫淖⑨寔碜訳CSC基因組瀏覽器的GRCh37。標(biāo)識SNP為紫色，而其它SNP的顏色是根據(jù)千人基因組計劃亞洲人群這些SNP與標(biāo)識SNP的LD(r2)來定的。重組率是用亮藍(lán)色細(xì)線表示以反應(yīng)局部LD的結(jié)構(gòu)。
[0065]圖4顯示了 GRK5基因連鎖不平衡圖。藍(lán)色框標(biāo)識的部分用于比較不同人群LD結(jié)構(gòu)。
[0066]圖5顯示了 RASGRP1基因連鎖不平衡圖。藍(lán)色框標(biāo)識的部分用于比較不同人群LD 結(jié)構(gòu)。(A) RASGRPI基因連鎖不平衡圖；(B) 4個SNP的r2值:2個2型糖尿病位點(rs7403531 和 rsl2593201)和 2 個 I 型糖尿病位點(rs7171171 和 rsl7574546)。
[0067]圖6顯示了 GRK5基因的表達(dá)分析。其中，人血液中GRK5基因的相對表達(dá)水平分別在30個2型糖尿病人(TT/n=3; TC/n=8; CC/n=19)和34個非糖尿病的對照樣本(TT/n=2; TC/ n=ll;CC/n=20，l個基因型缺失)中檢測分析。顯示的數(shù)據(jù)是均值和誤差(土SEM)表示的。 數(shù)據(jù)分析前對基因GRK5表達(dá)水平的值進行自然對數(shù)轉(zhuǎn)換。
【具體實施方式】
[0068]本發(fā)明人經(jīng)過深入而廣泛的研究，對大量候選基因的SNP進行了測定和分析。首次發(fā)現(xiàn)和證明了 GRK5基因或RASGRP1基因組序列與2型糖尿病密切相關(guān)，其中關(guān)聯(lián)研究結(jié)果顯示，在SEQ ID N0:1中第134位(134位C — T)的SNP(記為rsl0886471)和SEQ ID NO: 2中第164位的SNP (記為rs7403531)在對照組和病例組中的分布存在顯著性差異 (P〈0.05)，因此可作為輔助性檢測2型糖尿病(或其易感性)的特異性SNP。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0069]具體地，本發(fā)明人在8，569名2型糖尿病人和8，923名對照中國漢族人群中開展了全基因組關(guān)聯(lián)和驗證研究，并挑選了 10個單核苷酸多態(tài)性位點，分別兩個人群中驗證:在3，410名2型糖尿病人和3，412名對照人群中使用de novo方法驗證以及在 6，952名2型糖尿病人和11，865名對照人群中使用in silico方法驗證。結(jié)果表明，除了成功驗證之前確定的7個2型糖尿病位點(CDKAL1, CDKN2A/B, KCNQl, CDC123, GLIS3， HNFlB和DUSP9)并達(dá)到全基因水平的顯著外，本發(fā)明人還新發(fā)現(xiàn)了兩個2型糖尿病位點，分別為 GRK5 (rs 10886471:P=7.1X 1(T9)，和 RASGRPI (rs7403531:P=3.9X 1(T9)，其中與GRK5的相關(guān)性只在東亞人群中顯著。在對照人群中，增加2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險的位點 RASGRPl-rs7403531 與高 HbAlc 和低 HOMA-B 相關(guān)(P 值分別為 0.03 和 0.0209)，而 GRK5-rs 10886471與高空腹胰島素相關(guān)(P = 0.0169)但不與空腹血糖相關(guān)。本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)不僅為2型糖尿病的發(fā)病機制提供了新的視角，也提示2型糖尿病的易感性可能存在種族差異。
[0070]GRK5 基因
[0071 ] GRK5基因的序列是已知，其詳細(xì)序列和一些相關(guān)彳目息可參見網(wǎng)址http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/Genebank/ ；http://www.ncb1.nlm.nih.gov/SNP。為了方便起見，在 SEQ ID NO:1給出GRK5基因中與本發(fā)明SNP相關(guān)的核苷酸序列。
[0072]GRK5基因位于染色體區(qū)域10q26.11，編碼G蛋白偶聯(lián)受體激酶(GPCR kinase)家族成員5，該蛋白在磷酸化G蛋白偶聯(lián)受體和非G蛋白偶聯(lián)受體中起重要作用。
[0073]RASGRPI 基因
[0074]RASGRPI基因的序列是已知，其詳細(xì)序列和一些相關(guān)信息可參見網(wǎng)址http:// www.ncb1.nlm.nih.gov/Genebank/ ;http://www.ncb1.nlm.nih.gov/SNP。為了方便起見， 在SEQ ID NO: 2給出RASGRP1基因中與本發(fā)明SNP相關(guān)的核苷酸序列。
[0075]RASGRPI 基因位于染色體區(qū)域 15ql4,編碼 RAS guanyl releasing proteinl (RasGRPl)，該蛋白是Ras/MAPK信號通路中的鳥嘌呤核苷酸交換因子。RASGRPI主要在淋巴細(xì)胞中表達(dá)，在其他細(xì)胞包括胰島P細(xì)胞中也有表達(dá)。[0076]2型糖尿病易感性相關(guān)的SNP
[0077]本發(fā)明人通過全基因組關(guān)聯(lián)和驗證研究，挑選了 10個單核苷酸多態(tài)性位點，分別兩個人群中驗證。研究表明SEQ ID NO:1中第134位或SEQ ID NO: 2中第164位的SNP是與2型糖尿病易感性關(guān)聯(lián)性非常高的SNP。
[0078]具體而言，本發(fā)明揭示了 GRK5基因或RASGRP1基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)以及該多態(tài)性與2型糖尿病的相關(guān)性。
[0079]如本文所用，術(shù)語“本發(fā)明的單核苷酸多態(tài)性SNP”或“本發(fā)明SNP”包括:
[0080]GRK5基因的rsl0886471:即SEQ ID N0.:1中第134位C/T多態(tài)，等位基因型C 在2型糖尿病病人群中的頻率，要顯著高于在正常對照人群中的頻率；
[0081]RASGRP1基因的rs7403531，即SEQ ID N0.: 2中第164位T/C多態(tài)，等位基因型T 在2型糖尿病病人群中的頻率，要高于在正常對照人群中的頻率。
[0082]基于本發(fā)明的新發(fā)現(xiàn)，GRK5基因或RASGRP1基因或相應(yīng)的核酸分子有多方面的新用途。這些用途包括(但不限于):用于輔助性診斷2型糖尿病、或制備用于輔助性診斷2 型糖尿病的試劑或試劑盒。
[0083]檢測方法、檢測試劑及試劑盒
[0084]與GRK5基因或RASGRP1基因相關(guān)的多聚核苷酸可用于2型糖尿病(或與易感性) 的輔助診斷，尤其是早期輔助性診斷。另一方面，本發(fā)明的檢測方法可用于評估個體患糖尿病疾病(尤其是2型糖尿病)的易感性。
[0085]本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道，有大量的分析技術(shù)可用于檢測基因中所述位點是否存在單核苷酸多態(tài)性。這些技術(shù)包括(但并不限于):DNA測序、雜交測序；酶促錯配切割、異源雙鏈分析、點雜交、寡核苷酸陣列(DNA芯片)、Mini_sequencing、Taqman技術(shù)、分子信標(biāo)等， 變性高效液相色譜法(DHPLC)。
[0086]用于本發(fā)明的測試樣品沒有特別限制，對于檢測SNP而言，可以是從血液、組織等樣品中抽提出的DNA或mRNA。
[0087]本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”或“核酸芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷。用GRK5基因或RASGRP1基因特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴增也可檢測相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
[0088]檢測可以針對cDNA，也可針對基因組DNA。GRK5基因或RASGRPI基因的突變的形式包括與正常野生型DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等?？捎靡延械募夹g(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達(dá)，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
[0089]最方便的檢測本發(fā)明SNP的方法，是通過用GRK5基因或RASGRP1基因特異性引物擴增樣品的GRK5基因或RASGRP1基因，得到擴增產(chǎn)物；然后檢測擴增產(chǎn)物中是否存本發(fā)明的單核苷酸多態(tài)性。
[0090]應(yīng)理解，在本發(fā)明首次揭示了 GRK5基因或RASGRP1基因的SNP與2型糖尿病的相關(guān)性之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以方便地設(shè)計出可特異性擴增出含該SNP位置的擴增產(chǎn)物，然后通過測序等方法確定是否存在本發(fā)明的多核苷酸多態(tài)性。通常，引物的長度為 15-50bp，較佳地為20-30bp。雖然引物與模板序列完全互補是優(yōu)選的，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，在引物與模板存在一定的不互補(尤其是引物的5’端)的情況下，也能夠特異性地擴增(即僅擴增出所需的片段)。含有這些引物的試劑盒和使用這些引物的方法都在本發(fā)明范圍之內(nèi)，只要該引物擴增出的擴增產(chǎn)物含有本發(fā)明SNP的對應(yīng)位置。一種優(yōu)選的引物對具有SEQ ID NO:1中第134位或SEQ ID NO: 2中第164位的序列。
[0091]雖然擴增產(chǎn)物的長度沒有特別限制，但是通常擴增產(chǎn)物的長度為100_2000bp，較佳地為150-1500bp，更佳地為200-1000bp。這些擴增產(chǎn)物都應(yīng)含有SEQ ID NO:1中第134 位或SEQ ID NO:2中第164位。
[0092]本發(fā)明的主要優(yōu)點包括:
[0093]首次用實驗證實了 2種新SNP與2型糖尿病的密切相關(guān)性，進而提供了輔助性診斷2型糖尿病(或易感性)的方法和試劑盒。本發(fā)明可以為臨床診斷(尤其是早期診斷)2 型糖尿病提供極為有價值的輔助性參考指標(biāo)，從而有利于實現(xiàn)2型糖尿病的早診斷、早預(yù)防。
[0094]由于本發(fā)明的SNP與2型糖尿病具有非常高的關(guān)聯(lián)性，因此不僅可用于早期輔助性診斷2型糖尿病，而且可以未雨綢繆地使一些攜帶者在未發(fā)病前就采取合理的預(yù)防措施，從而提高攜帶者的生存期和生存質(zhì)量，因此具有極其重大的應(yīng)用價值和社會效益。當(dāng)然，最終診斷還應(yīng)當(dāng)用常規(guī)檢測方法進行確診。
[0095]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人,分子克隆:實驗室手冊(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0096]在本發(fā)明中，關(guān)于各基因的序列、SNP及其他一些有用信息，可在如下電子數(shù)據(jù)庫信息中找到:
[0097]PLINK, http://pngu.mgh.harvard, edu/ ~purcell/plink/; (version 1.07) SNPTEST,
[0098]https: //mathgen.stats, ox.ac.uk/genetics_software/snptest/snptest.html; (version 2.2.0)
[0099]IMPUTE, http: / /mathgen.stats, ox.ac.uk / impute / impute, html; (version2.1.2)
[0100]MACH, http://www.sph.umich.edu/csg/abecasis/MACH/;(version 1.0)
[0101]LocusZoom, http://csg.sph.umich.edu/locuszoom/;(version 1.1)
[0102]Hap1view, http://www.broad, mit.edu/mpg/haploview/; (version 4.2)
[0103]Genevar, http://www.sanger.ac.uk/resources /software / genevar/; (version 3.1.1)
[0104]實施例1
[0105]2型糖尿病相關(guān)的SNP的鑒定
[0106]1.1研究人群
[0107]本發(fā)明人在數(shù)個獨立的人群樣本中開展了 2型糖尿病的全基因組關(guān)聯(lián)分析研究 (GffAS)，該研究包含3個研究階段的。用于第一階段全基因組芯片分析的人群樣本共有 1，999例糖尿病患者和1，976例非糖尿病對照。該樣本來自以下幾個人群調(diào)查研究:《中國中老年人營養(yǎng)與健康狀況調(diào)查研究(NHAPC)》(312病例和815對照)、《腸道菌群與肥胖研究(GMOS) ))(82病例和163對照)、《復(fù)旦華山研究(FDHS) ))(807病例和339對照)以及《北京糖尿病調(diào)查(BDS)》(798病例和659對照)。用于第二階段驗證96個2型糖尿病位點的樣本共有13，517個費親緣關(guān)系的中國漢族人(6，570例糖尿病患者和6，947例非糖尿病對照)。該樣本來自《貴州畢節(jié)2型糖尿病調(diào)查研究(GBTDS)》、《北京2型糖尿病研究(BTDS))) 和《湖北2型糖尿病研究(HTDS)》。用于第三階段驗證10個2型糖尿病位點的人群包括: 來自上海(SDIID和SDS)的3，410例糖尿病患者和3，412例非糖尿病對照人群用denovo 基因分型驗證，來自亞洲糖尿病合作聯(lián)盟(AGEN-T2D)的6，952例糖尿病患者和11，865例非糖尿病對照人群用in silico驗證。各個階段的人群樣本無重復(fù)。分析2型糖尿病相關(guān)數(shù)量性狀的人群為基于人群的調(diào)查研究，來自《中國中老年人營養(yǎng)與健康狀況調(diào)查研究》和 《腸道菌群與肥胖研究》(共3，614人)。所有研究均經(jīng)過當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會的審查，且受試者簽署了知情同意書(表2)。
[0108]1.2基因分型和`質(zhì)控
[0109]第一階段的DNA樣本在基因芯片Illumina Human660ff-Quad BeadChip (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA)上進行基因分型。本發(fā)明人對基因分型的結(jié)果分別在個體樣本和單核苷酸多態(tài)性位點(SNP)水平加以質(zhì)控。針對個體樣本，本發(fā)明人剔除的樣本符合如下標(biāo)準(zhǔn)之一:1)基因分型的成功率〈97%(20人)，2)高雜合度3)性別錯誤(69人)，4)重復(fù)(19人)或者親緣關(guān)系(149人)。通過主成分析(PCA)，本發(fā)明人還去除了偏出人群基因背景的樣本(6人)。在SNP水平，本發(fā)明人去除了 CNV相關(guān)的SNP、Y染色體和線粒體染色體上的SNP。同時還去除了以下幾種情況的SNP:1)基因分型的成功率 <95%(I, 351個SNP)，2)次等位基因頻率<0.5%(63, 263個SNP)，3)對照組中，哈迪溫伯格平衡P〈10-6(l，047個SNP)。所有通過質(zhì)控的樣本被用于歸責(zé)分析(imputation)獲取分型的 SNP，其參考數(shù)據(jù)庫為 HapMap CHB+JPT (release n0.22)，采用的軟件為 MPUTE (version
2.1.2)。本發(fā)明人剔除imputed SNP的條件有:估計的成功率〈99%，或者等位基因頻率〈1%， 或者哈迪溫伯格平衡〈10'或者info measure ( 0.5.[0110]本發(fā)明人挑選了第一階段中最顯著的96個SNP位點在第二階段的3個不同人群中進行基因分型和驗證。在Fludigm EPl平臺上采用TaqMan SNPGenotyping Assays分型試劑對來自GBTDS，BTDS,和HTDS研究共6，570病例和6，947對照人群進行基因分型。 本發(fā)明人剔除了分型成功率〈93%的樣本，以及分型成功率〈95%、對照組中哈迪溫伯格平衡P〈5.2X 10_4的SNP位。GBTDS，BTDS和HTDS研究人群樣本的總體分型成功率分別是 99.7%, 99.4%,和99.4%。本發(fā)明人還對每個研究人群樣本的5%進行重復(fù)分型，發(fā)現(xiàn)分型結(jié)果的一致率分別為99.9%, 99.5%和99.5%。此外本發(fā)明人對135個第一階段用基因芯片分型的樣本在Fludigm EPl上用TaqMan SNP Genotyping Assays對96個位點進行重復(fù)驗證， 兩平臺間的SNP基因分型結(jié)果重復(fù)率為99.9%。
[0111]最后，根據(jù)第一階段和第二階段薈萃分析結(jié)果，本發(fā)明人挑選了 10個P值最小的 SNP位點用于第三階段驗證。第三階段驗證包括兩方面:一是在來自上海的6，822例樣本(2 型糖尿病3，410例和正常對照3，412例)中進行的de novo基因型分析；二是在來自有8 個獨立人群研究組成的AGEN合作聯(lián)盟的GWAS數(shù)據(jù)(2型糖尿病6，952例，正常對照11，865 例)中進行in silico驗證。米取Sequenom MassARRAY平臺進行de novo基因分型,質(zhì)控后分型成功率>90%的樣本用于關(guān)聯(lián)研究分析。232個重復(fù)樣本的SNP重復(fù)率為99%。in silico驗證的結(jié)果直接從AGEN的薈萃分析數(shù)據(jù)庫中獲得。
[0112]1.3統(tǒng)計分析
[0113]在第一階段，分別采用PLINK (version 1.07)和 SNPTEST (version 2.2.0)軟件分析基因分型得到的SNP和imputed SNP與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)關(guān)系。采用邏輯回歸分析方法分析SNP與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)關(guān)系，并計算比值比和95%置信區(qū)間。關(guān)聯(lián)分析模型I采取了疊加遺傳模型并校正了年齡、性別和前2個主成分。關(guān)聯(lián)分析模型2進一步矯正了體質(zhì)指數(shù)(BMI)。男性X染色體上的SNP視為純合子并定義為2，即效應(yīng)位點。為了檢驗關(guān)聯(lián)分析是否會因人群地區(qū)差異帶來偏差，本發(fā)明人首先在整個人群中進行分析(南北并為一體)， 然后分別在北京和上海分別分析并做薈萃分析。P值矯正了 genomic control inflation factor (A GC)。為了尋找更多的SNP2型糖尿病與相關(guān)的一致性的證據(jù)，本發(fā)明人經(jīng)人群分別以性別分開，在男女人群中分別計算了 SNP與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)關(guān)系。
[0114]用于第二階段驗證的SNP主要是根據(jù)第一階段關(guān)聯(lián)關(guān)系P的值大小進行挑選的， 且每個基因組區(qū)域挑選了 1-2個P值最小的SNP。第二階段的驗證分析主要是采取疊加遺傳模型，分別在每個人群中用邏輯回歸分析方法檢驗SNP與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)關(guān)系，并校正年齡和性別。米用 fixed-effect inverse varianceweighted 和 sample size weighted Z-score薈萃分析方法整合所有研究結(jié)果。用Cochran’ s Q statistics 分析關(guān)聯(lián)分析的異質(zhì)性。
[0115]本發(fā)明人還分析了 2型糖尿病相關(guān)SNP位點對2型糖尿病相關(guān)數(shù)量性狀的影響。該研究人群為基于人群的調(diào)查研究的人群，《中國中老年人營養(yǎng)與健康狀況調(diào)查研究 (NHAPC)》和《腸道菌群與肥胖研究(GMOS)》。NHAPC研究人群的SNP分型是采用基因芯片 Illumina Human660ff-Quad BeadChip (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA)分型，而GMOS研究人群的SNP分型是采用TaqMan SNP Genotyping Assays分析試劑分型.最終共有3，614 個樣本(2，229來自上海1，385來自上海)通過質(zhì)控。關(guān)聯(lián)研究采用疊加效應(yīng)遺傳模型，分別在北京和上海人群中進行分析，并矯正年齡、性別和研究項目。HOMA-B和HOMA-S值分別取自然對數(shù)加以轉(zhuǎn)換。關(guān)聯(lián)結(jié)果最終采用fixed-effect inverse variance weighted薈萃分析方法整合結(jié)果.HOMA-S和HOMA-B用Levy’ s HOMA計算模型計算.[0116]1.4順式表達(dá)數(shù)量座位(cis-eQTL)和外周血mRNA表達(dá)分析
[0117]對順式表達(dá)數(shù)量座位分析，本發(fā)明人在Genevar eQTL數(shù)據(jù)庫中查閱了 rsl0814916，rsl0886471 和 rs7403531 以及它們的代理 SNP (r2>0.5)的相關(guān)數(shù)據(jù)。Genevar eQTL數(shù)據(jù)庫中包括了來自于MuTHER協(xié)會的部分健康女性雙胞胎的166個脂肪組織、156 個淋巴細(xì)胞系和160個皮膚組織樣本eQTL信息。SNP與mRNA表達(dá)量之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系由斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)(Spearman’ s rank correlation)表示，并通過10000次置換試驗 (permutation)計算獲得P值。
[0118]本發(fā)明人對北京協(xié)和醫(yī)院于2011年12月招募的64名無關(guān)中國漢族研究對象進行了外周血的GRK5 mRNA表達(dá)量測定。所有研究參與者都提供了書面的同意書，研究方案也已通過了倫理審核。本發(fā)明人使用QIAGEN試劑盒與RNA Pure Blood試劑盒(CWBIO)分別提取了樣本外周血DNA及RNA。GRK5-rs 10886471位點的基因型由測序方法確定，所使用的引物如下:
[0119]5’ -TCCTACACTGGAACAAGCC-3’ (SEQ ID N0.:3)；
[0120]5’ -ACGGACTAATACAGACGGG-3’ (SEQ ID N0.:4)。
[0121]用于檢測RASGRP1基因的rs7403531的引物如下:
[0122]5’ -CATATTCCTGAACACTCTGG-3’ (SEQ ID N0.:5)；
[0123]5，-CCCATAGAACAAGTCTAAACC-3’ (SEQ ID N0.:6)
[0124]本發(fā)明人使用GoldStar TaqMan Mixture 試劑盒(CWBIO)在 Bio-Rad IQ5 平臺上使用qRT-PCR方法對GRK5-rs 10886471進行檢測。同時，標(biāo)準(zhǔn)化GRK5 mRNA表達(dá)量到相對于GAPDH的相對表達(dá)量。本發(fā)明人使用線性回歸計算GRK5-rs 1088647與GRK5表達(dá)量的關(guān)系，使用T檢驗比較兩組樣本間的GRK5表達(dá)量的不同。本發(fā)明人使用GRK5-rs 1088647的顯性遺傳模型計算線性回 歸，并矯正2型糖尿病的疾病狀態(tài)。本發(fā)明人使用單側(cè)P值表示統(tǒng)計檢驗的顯著程度。
[0125]1.5區(qū)域連鎖不平衡形式的比較
[0126]本發(fā)明人根據(jù)GRK5與RASGRP1上位點區(qū)域的連鎖不平衡作圖選取了相應(yīng)的基因組區(qū)域(見圖4與圖5)。本發(fā)明人使用varLD算法來分別比較、計算45個HapMap2中國漢族人(CHB)與60個HapMap2歐洲人(CEU)及45個HapMap2日本人(JPT)在這兩個區(qū)域的連鎖不平衡形式的不同。其結(jié)果由varLD算法計算獲得的蒙特卡羅P值表示。
[0127]1.6 結(jié)果
[0128]在第一階段研究中，本發(fā)明人對總共2，234，194個符合指控標(biāo)準(zhǔn)的SNP位點在 3712例來自于北京或上海的中國漢族樣本中進行了全基因組關(guān)聯(lián)分析。3712例研究樣本包括了 1839例2型糖尿病病例和1873例非糖尿病正常對照。分析結(jié)果顯示，第一階段研究樣本并不存在明顯的樣本分層情況，其基因組控制因子(Genomic control factor)值為
1.03。關(guān)聯(lián)分析分位數(shù)圖(Quantile-Quantileplot)顯示在低P值區(qū)域處的SNP位點,其關(guān)聯(lián)顯著程度明顯高于期望值。目前已報道的2型糖尿病位點有55個在中國漢族人群中是呈多態(tài)性的。其中4個位點與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)程度，在第一階段研究中已達(dá)到了全基因組顯著水平，即P值小于5X 10。它們分別處于基因CDKALl, CDKN2A/B, KCNQl與DUSP9區(qū)域(圖2)。在余下的51個報道位點中，發(fā)現(xiàn)有48個位點在第一階段研究中與2型糖尿病發(fā)病的關(guān)聯(lián)作用方向與報道的方向一致(二項分布檢驗P值=9.8X 10_12)。而且，其中的19 個位點與2型糖尿病關(guān)聯(lián)程度達(dá)到單位點顯著水平，即P值小于0.05)。在以上這些報道位點中，本發(fā)明人僅發(fā)現(xiàn)CDKALl-rs7754840對2型糖尿病發(fā)病的作用是存在人群差異性的。 其在中國漢族人群中作用功效大小明顯大于在歐洲人群中(遺傳異質(zhì)性P值=3.33x10-4)。 這個結(jié)果與本發(fā)明人先前的報道一致。
[0129]為了進一步驗證本發(fā)明的研究結(jié)果，本發(fā)明人將SNP位點根據(jù)其在第一階段中與 2型糖尿病關(guān)聯(lián)分析的P值從小到大排列。在排列過程中，本發(fā)明人去除了所有位于CDKALl 與KCNQl上的東亞人群2型糖尿病報道區(qū)域，且P值已達(dá)到全基因組顯著水平的SNP位點。根據(jù)P值從小到大的順序，本發(fā)明人在每個獨立的LD區(qū)域內(nèi)選取I至2個SNP，總共 96個SNP，84個獨立的LD區(qū)域進行第二階段驗證。本發(fā)明人在6570例2型糖尿病病例與6947例正常對照的第二階段樣本中檢測了此96個SNP位點的分型情況(表3)。結(jié)果顯示，96個SNP位點中僅SLC30A8-rsl3266634因Hardy-Weinberg不平衡而被去除。本發(fā)明人對剩余的95個SNP位點進行了 2型糖尿病的關(guān)聯(lián)分析。其中位于基因RASGRP1，GLI S3, CDKN2B, CDC123, HHEX, HNF1B, FAM58A與DUSP9區(qū)域的8個位點與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)關(guān)系在Bonferroni多重檢驗矯正后仍然顯著，即P值小于0.05除以95 (5.26x 10-4) ?結(jié)合第一與第二階段結(jié)果的薈萃分析顯示，位于基因RASGRP1，⑶KN2B，⑶C123，HHEX, HNF1B, FAM 58A與DUSP9區(qū)域的SNP位點與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)關(guān)系已達(dá)到全基因組顯著水平。其中， ⑶KN2B，HHEX,⑶C123，HNFlB與DUSP9區(qū)域的SNP位點在先前的研究中已被報道。另外， GLIS3-rsl0814916(P=5.29X 1(T7)與 GRK5-rs 10886471 (P=5.92x10-7)也已接近全基因組顯著水平。在之前的候選基因關(guān)聯(lián)研究中，已有報道發(fā)現(xiàn)GLIS3-rs7034200與2型糖尿病存在關(guān)聯(lián)關(guān)系，但并沒有被進一步證實。另一個位點FAM58A-rsl2010175與其臨近的2型糖尿病報道位點rs5945326-DUSP9在中國漢族人群中僅呈中等水平的連鎖關(guān)系(r2=0.35)。 但進一步的條件分析顯示這兩個位點與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)關(guān)系并不是獨立的(rsl2010175 矯正 rs5945326 后的 P 值=0.02)。
[0130]為了進一步驗證新位點與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)關(guān)系，本發(fā)明人從以上研究結(jié)果中挑選了 10個獨立的，且新發(fā)現(xiàn)的2型糖尿病SNP位點進行第三階段的驗證。這些位點的一二階段薈萃分析P值都小于5x 10_4，且與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)關(guān)系不存在性別差異。在此階段的研究中，本發(fā)明人首先將這些位點在3410例中國漢族人群2型糖尿病病例與3412例正常對照進行了分型驗證。同時，利用已發(fā)表的東亞人群2型糖尿病全基因組關(guān)聯(lián)研究的薈萃分析結(jié)果，本發(fā)明人進一步檢驗了這10個SNP位點與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)關(guān)系。這項東亞人群的薈萃分析使用了來自于AGEN-T2D協(xié)會的6952例2型糖尿病病例與11865例正常對照的全基因組SNP數(shù)據(jù)，其中有4026例病例與4654例對照來至于中國漢族人群，其余的 2926例病例與7211例對照分別來自于韓國、日本、馬來西亞和菲律賓人群。結(jié)合三個階段的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果后本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，位于基因GLIS3，GRK5和RASGRP1區(qū)域的3個SNP位點的P值也已達(dá)到了全基因組顯著水平(表1)。另外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)這三個位點與2型糖尿病關(guān)聯(lián)的關(guān)系不存在人群差異性(遺傳異質(zhì)性P值> 0.26)。且比較位點在中國漢族與東亞其他人群中的作用功效大小，同樣不存在顯著的差異性(遺傳異質(zhì)性P值> 0.14)(表 4)。當(dāng)本發(fā)明人在進行第三階段數(shù)據(jù)分析時，AGEN-T2D協(xié)會首先報道了位于GLIS3的一個位點為新的2型糖尿病位點。比較發(fā)現(xiàn)這個報道位點GLIS3-rs7041847與本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的 GLIS3-rsl0814916之間呈很強的連鎖關(guān)系(r2=0.93)。由此，本發(fā)明人僅將剩余的兩個位于GRK5與RASGRP1區(qū)域的位點認(rèn)為是新發(fā)現(xiàn)的2型糖尿病位點。
[0131]本發(fā)明人對以上發(fā)現(xiàn)比較了來自于歐洲D(zhuǎn)IAGRAM協(xié)會的2型糖尿病全基因組關(guān)聯(lián)研究薈萃分析結(jié)果。此薈萃分析數(shù)據(jù)集分析了來自于歐洲人群的8130例2型糖尿病病例與38987例正常對照的全基因組SNP數(shù)據(jù)。結(jié)果證實了 RASGRPl-rs7403531與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)關(guān)系(P=0.023，OR=L 06)，其位點作用功效在亞洲人群與歐洲人群中不存在顯著差異性(遺傳異質(zhì)性P=0.22)。且DIAGRAM的數(shù)據(jù)顯示，在rs7403531附近，存在兩個與 rs7403531 連鎖的 SNP 位點(rs8043085 與 rsl2593201,和 rs7403531 的 r2 ≥ 0.8)與 2 型糖尿病的關(guān)聯(lián)程度更加顯著(P ≤3.82x10-3，OR=L 07)(表4)。然而，GRK5_rs 10886471與 2型糖尿病的關(guān)聯(lián)關(guān)系并沒有在DIAGRAM的數(shù)據(jù)中得到驗證(P=0.352，OR=0.98，遺傳異質(zhì)性 P 值=4.42X10—6)(表 4)。
[0132]為了檢驗肥胖是否會影響這兩個新發(fā)現(xiàn)位點和2型糖尿病的關(guān)聯(lián)關(guān)系，本發(fā)明人在關(guān)聯(lián)分析的模型中進一步矯正了體重指數(shù)(BMI)。結(jié)果顯示，矯正了 BMI后的位點作用功效與之前沒有明顯變化(矯正BMIP值=1.73 X 10-8-2.87 X 1(T9，OR=L 10-1.12)。因此，可以判斷此關(guān)聯(lián)關(guān)系并不受肥胖影響。本發(fā)明人隨后在兩個人群研究(NHAPC和GM0S)樣本中，包括3614個中國漢族人群樣本(2142例空腹血糖正常個體、1211空腹血糖受損個體與 261例2型糖尿病個體)，進一步研究這兩個新發(fā)現(xiàn)位點與2型糖尿病相關(guān)的一些數(shù)量性狀的關(guān)聯(lián)關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GRK5-rs 10886471的2型糖尿病風(fēng)險等位基因會顯著升高空腹血漿胰島素水平(P=0.0204)，但其與空腹血糖無關(guān)。而RASGRPl-rs7403531的2型糖尿病風(fēng)險等位基因會顯著升高空腹血糖(P=0.0213)，并與HOMA-B的降低有關(guān)(P=0.0027)(表5)。 在空腹血糖正常個體中的相關(guān)分析研究，本發(fā)明人同樣得到了類似的結(jié)果(表5)。
[0133] 本發(fā)明人通過查閱Genevar eQTL數(shù)據(jù)庫對這兩個新發(fā)現(xiàn)位點及其附近連鎖的位點進行了順式表達(dá)數(shù)量座位(cis-eQTL)分析。分析結(jié)果顯示，rsl0886471的一個位于 GRK5內(nèi)含子上的連鎖SNP位點(rs4752300，與rs 10886471的r2=0.79)的2型糖尿病風(fēng)險等位基因與GRK5的mRNA表達(dá)水平在脂肪組織中呈正相關(guān)(P=6X 10_4，r=0.361)。對于rs7403531及其連鎖位點，本發(fā)明人并沒有發(fā)現(xiàn)其位于RASGRP1或附近基因的cis-eQTL 上。為了進一步驗證rsl0886471可能影響GRK5的mRNA表達(dá)水平這一發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人使用 qRT-PCR檢測了 64個無關(guān)中國漢族樣本，包括30例2型糖尿病病例與34例正常對照的外周血GRK5的mRNA表達(dá)水平。關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果證實了 rsl0886471的2型糖尿病風(fēng)險等位基因與GRK5的高表達(dá)量有關(guān)(P[dom]=0.02)，且此關(guān)系同時存在于2型糖尿病病例與正常對照組中。而且，表較兩組間的外周血GRK5表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病病例組比正常對照組的 GRK5表達(dá)量高40%(P=0.0048)(圖6和表6)。這些結(jié)果可以說明，rsl0886471的2型糖尿病風(fēng)險等位基因可能通過升高GRK5的表達(dá)量來增加2型糖尿病的風(fēng)險。但由于外周血并不是2型糖尿病發(fā)病的直接相關(guān)組織，所以這個結(jié)論有待進一步證實。
[0134]本發(fā)明人分別中國漢族人群與歐洲人群及日本人群在這兩個新發(fā)現(xiàn)位點附近區(qū)域的連鎖不平衡結(jié)構(gòu)(圖4與圖5A)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)中國漢族人群與歐洲人群在 GRK5-rs 10886471與RASGRPl_rs7403531區(qū)域存在顯著不同的連鎖不平衡形式(GRK5區(qū)域P=0.043，RASGRPI區(qū)域P=0.0043)，但并沒有發(fā)現(xiàn)中國漢族人群與日本人群之間的連鎖不平衡形式的不同(P≥0.101)(表7)。同時，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)GRK5-rsl0886471與 RASGRPl-rs7403531在東亞人群中的2型糖尿病風(fēng)險等位基因的頻率比在歐洲人群的高。 GRK5-rs 10886471的2型糖尿病風(fēng)險等位基因頻率在HapMap中國漢族人群(CHB)中為
0.79，日本人群(JPT)中為 0.74，歐洲人群(CEU)中為 0.48。RASGRPl-rs74035311 的 2 型糖尿病風(fēng)險等位基因頻率在HapMapCHB中的為0.33，JPT中為0.45，CEU中為0.28。
[0135]討論
[0136]本研究中本發(fā)明人不僅驗證了超過20個已報道的2型糖尿病易感位點，而且還發(fā)現(xiàn)了 2個新的2型糖尿病易感位點:GRK5 (rsl0886471)和RASGRP1 (rs7403531)。單核苷酸多態(tài)性位點(SNP)rsl0886471位于GRK5基因(G蛋白偶聯(lián)受體激酶5，G-protein-coupled Receptor Kinase 5)第3個內(nèi)含子內(nèi)，且其所在的連鎖不平衡區(qū)域(LD block)只包含 GRK5基因(圖4).進一步的區(qū)域作圖發(fā)現(xiàn)，rsl0886471是GRK5上關(guān)聯(lián)關(guān)系最顯著的位點 (圖3A).GRK5屬于G蛋白偶聯(lián)受體激酶(GPCR kinase)家族，在磷酸化G蛋白偶聯(lián)受體和非G蛋白偶聯(lián)受體中起重要作用，如:胰高血糖素受體(glucagon receptor), 0 2_腎上腺素受體(P 2-adrenergic receptor),熱休克蛋白70相互作用蛋白(Hsp70 interacting protein),及在調(diào)節(jié)血糖穩(wěn)態(tài)和炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白-NF k Bl/pl05等。體內(nèi)外的實驗研究發(fā)現(xiàn)，GRK5的缺失降低炎性細(xì)胞因子和趨化因子分泌、導(dǎo)致NFkB活性的降低。SNP rsl0886471的危險等位基因位點與GRK5mRNA的高表達(dá)水平、高空腹胰島素水平顯著相關(guān)， 與空腹血糖不相關(guān)。這些證據(jù)表明，在中國漢族人群或東亞人群中，該位點可能通過提高炎性反應(yīng)水平、降低胰島素敏感性的機制增加2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險。值得注意的是，GRK5是漢族或東亞人群特異性的2型糖尿病易感基因位點，在歐洲人群中GRK5-rs 10886471與2型糖尿病風(fēng)險并不相關(guān)，且GRK5-rs 10886471危險等位基因位點頻率在漢族人群中顯著高于歐美人群(分別為0.79和0.48)。在中國漢族人群中，其人群歸因危險度為8.66%。此外， GRK5的連鎖不平衡結(jié)構(gòu)在中國漢族與歐美人群中也存在顯著差異(P=0.0432)。
[0137]第二個新發(fā)現(xiàn)的2型糖尿病易感基因位點(rs7403531)位于染色體區(qū)域 chrl5ql4, RASGRPI基因的第二個內(nèi)含子內(nèi)(圖5A)。這個位點與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)關(guān)系在歐美人群中(DIAGRAM consortium)也得到了證實表S3，且其效應(yīng)值在這兩個人群中無顯著差異性。rs7403531危險等位基因位點的頻率在中國漢族人群中略高于歐洲人群(分別為0.33和0.28).區(qū)域作圖發(fā)現(xiàn)，這個區(qū)域內(nèi)的最顯著性位點為SNP rsl2593201 (與 rs7403531的r2=0.81)(圖3B和S5)，在歐美人群中(DIAGRAM consortium)也發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)果(P = 2.4X IO-3)。在第一階段的人群中進行條件分析發(fā)現(xiàn)，這兩個SNP位點均不是導(dǎo)致這種關(guān)聯(lián)關(guān)系的根本原因(P≥0.11).值得注意的是，rs7403531與之前發(fā)現(xiàn)的I型糖尿病位點rs7171171在歐洲人群中存在中等程度的連鎖不平衡(r2=0.46)，但是在中國漢族人群中卻不存在連鎖不平衡(r2=0.03)(圖5B)，提示RASGRP1與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)關(guān)系并不是由 I 型糖尿病相關(guān)位點導(dǎo)致的。RASGROI 編碼 RAS guanyl releasing protein I (RasGRPl), 該蛋白是Ras/MAPK信號通路中的鳥嘌呤核苷酸交換因子，且主要參與T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的功能和發(fā)育。RasGRPl缺失的小鼠模型主要表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞增殖，炎性細(xì)胞因子分泌，和細(xì)胞凋亡受損。RASGRP1主要在淋巴細(xì)胞中表達(dá)，在其他細(xì)胞包括胰島P細(xì)胞中也有表達(dá)。P細(xì)胞中RASGRP1的異?？蓪?dǎo)致胰島炎癥反應(yīng)和P細(xì)胞功能受損，這可能是導(dǎo)致2型糖尿病的發(fā)病主要病理機制。同時RASGRPl-rs74035312型糖尿病危險等位基因位點與高水平空腹血糖、低P細(xì)胞功能指數(shù)(HOMA-B)相關(guān)，表明rs7403531可能是同過損傷 ^細(xì)胞功能導(dǎo)致2型糖尿病的發(fā)生.然而需要更多的功能研究對此推掉加以驗證。
[0138]為了檢驗本研究中是否存在I型糖尿病的錯誤分類，本發(fā)明人同樣分析了所有已知I型糖尿病易感基因位點與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)關(guān)系。與已報道的2型糖尿病易感基因位點相反，僅少數(shù)I型糖尿病相關(guān)位點與2型糖尿病風(fēng)險趨勢性相關(guān)(P = 0.01-0.05，二項分布檢驗P=0.24)。該結(jié)果表明，第一階段的研究樣本中I型糖尿病的錯誤分類比例很低。 此外，本發(fā)明人還在不同醫(yī)院來源的5，678例糖尿病患者和8，438例非糖尿病人(谷氨酸脫羧酶和胰島素自身抗體陰性，大于30歲，無I型糖尿病病史)中分析RASGRPl-rs7403531 與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)SNP rs7403531的關(guān)聯(lián)比值比與本研究最終的比值比相似。 這些分析結(jié)果表明，本研究發(fā)現(xiàn)的RASGRP1和GRK5與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)關(guān)系不是由I型糖尿病相位點或者I型糖尿病錯誤分類等因素導(dǎo)致產(chǎn)生的。
[0139]綜上所述，本研究是至今在中國漢族人群中開展的最大的2型糖尿病全基因組關(guān)聯(lián)分析。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了 2個新的在全基因組關(guān)聯(lián)分析顯著水平的2型糖尿病易感基因位點(GRK5和RASGRP1)。特別值得注意的是，結(jié)果提示GRK5可能是東亞人群特有的2型糖尿病易感基因位點。本發(fā)明人還驗證了其他已報道的2型糖尿病易感基因位點:KCNQ1， CDKAL1，CDKN2B，CDC123，HNF1B, GLIS3,和DUSP9，這些位點在本研究中均達(dá)到全基因組關(guān)聯(lián)分析顯著水平。本發(fā)明的研究發(fā)現(xiàn)不僅為研究2型糖尿病的發(fā)病機理提供了新的見解， 還為研究2型糖尿病發(fā)病的人群異質(zhì)性提供了新的線索。
[0140]各階段的數(shù)據(jù)匯總于表1。其中，SNP(R/A)中，R表示高風(fēng)險等位基因(Risk)，A 表示其他等位基因。
[0141]表1的結(jié)果綜合表明:GRK5基因的rsl0886471的SNP(高風(fēng)險型為C)和RASGRP1 基因的rs7403531的SNP(高風(fēng)險型為T)與2型糖尿病的發(fā)生存在著顯著相關(guān)性。
[0142]實施例2
[0143]2型糖尿病易感性檢測試劑盒
[0144]如實施例1所述，存在GRK5基因的rsl0886471:即SEQ ID N0.:1中第134位C —T 的突變與2型糖尿病疾病密切相關(guān)。因此，可基于這個突變設(shè)計GRK5基因特異性引物在以病人的DNA為模板進行擴增進行檢測。
[0145]制備一試劑盒(100人次)，它含有:
[0146]
【權(quán)利要求】
1.一種體外非診斷性檢測樣品是否存在GRK5基因或RASGRP1基因的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，包括步驟:(a)用特異性引物擴增樣品的GRK5基因或RASGRP1基因，得到擴增產(chǎn)物；和(b)檢測擴增產(chǎn)物中是否存在選自下組的單核苷酸多態(tài)性:GRK5 基因的 rsl0886471:即 SEQ ID N0.:1 中第 134 位 C —T; RASGRPI 基因的 rs7403531:即 SEQ ID N0.:2 中第 164 位 C — T。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基因特異性引物具有SEQIDNO:3和 4所示序列、或SEQ ID N0:5和6所示序列。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的擴增產(chǎn)物的長度為100-2000bp且含有 SEQ ID NO:1 中第 134 位或 SEQ ID NO: 2 中第 164 位。
4.一種檢測2型糖尿病的試劑盒，其特征在于，它包括特異性擴增GRK5基因或 RASGRP1基因或轉(zhuǎn)錄本的引物，所述的引物擴增出長度為100-2000bp且含有SEQ ID NO:1 中第134位或SEQ ID NO:2中第164位的擴增產(chǎn)物。
5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，它還含有選自下組的試劑:(a)與SEQID NO:1中第134位或SEQ ID NO: 2中第164位的突變結(jié)合的探針；(b)識別SEQID NO:1中第134位或SEQ ID NO:2中第164位的突變限制性內(nèi)切酶。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述的突變是選自下組的單核苷酸多態(tài)GRK5 基因的 rsl0886471:即 SEQ ID N0.:1 中第 134 位 C — T;RASGRPI 基因的 rs7403531:即 SEQ ID N0.:2 中第 164 位 C — T。
7.一種GRK5基因或RASGRP1基因的用途，其特征在于，用于制備對2型糖尿病易感性進行診斷的試劑或試劑盒。
8.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述的試劑或試劑盒用于檢測選自下組的單核苷酸多態(tài)性:GRK5 基因的 rsl0886471:即 SEQ ID N0.:1 中第 134 位 C —T;RASGRPI 基因的 rs7403531:即 SEQ ID N0.:2 中第 164 位 C — T。
9.一種多核苷酸分子的用途，所述的分子包括特異性擴增含單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點的擴增產(chǎn)物的引物和/或與所述SNP位點特異性結(jié)合的探針，其特征在于，所述的核苷酸分子用于制備對2型糖尿病易感性進行診斷的試劑盒，并且所述的SNP位點自下組:GRK5 基因的 rsl0886471:即 SEQ ID N0.:1 中第 134 位 C —T;RASGRPI 基因的 rs7403531:即 SEQ ID N0.:2 中第 164 位 C — T。
10.如權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，所述的SNP位點是GRK5基因的 rsl0886471，并且所述的試劑盒用于檢測高空腹胰島素易感性；和/或所述的SNP位點是RASGRP1基因的rs7403531，并且所述的試劑盒用于檢測高HbAlc易感性以及低HOMA-B易感性。
【文檔編號】C12Q1/68GK103525899SQ201210226735
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2012年7月2日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月2日
【發(fā)明者】林旭, 黎懷星, 甘蔚, 王一欽, 魯玲 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院