專利名稱:糖尿病自身免疫抗體檢測復(fù)合芯片及其制備、檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)研究及臨床應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及糖尿病自身免疫抗體檢測復(fù)合芯片及其制備、檢測方法。
背景技術(shù)：
糖尿病是目前危害人類健康與生活質(zhì)量最嚴(yán)重的疾病之一，它以血糖濃度持續(xù)性增高為主要癥狀表現(xiàn)，通過多種嚴(yán)重并發(fā)癥而危害健康。據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟(KDF)對全球糖尿病的發(fā)病現(xiàn)狀及世界衛(wèi)生組織(WHO)對糖尿病發(fā)病情況作出的最新預(yù)測指出，目前全球已診斷出II型糖尿病患者達(dá)1.3億人，我國超過4000萬人。預(yù)計(jì)到2025年，全球糖尿病患者將突破3億，我國糖尿病患者總數(shù)接近1億。在我國，隨著經(jīng)濟(jì)生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，糖尿病患者人群正迅速發(fā)展，預(yù)防和治療糖尿病已成為我國重大社會(huì)課題。
糖尿病依病因可分為兩類，I型和II型，這兩種類型的糖尿病起因不同、對患者的危害以及治療方法都截然不同。早在80年代，就有人觀察到一部分臨床診斷為II型糖尿病患者在血液中可檢出特異性的胰島細(xì)胞自身抗體，這類患者易出現(xiàn)繼發(fā)性的口服降糖藥治療失效，必須依賴胰島素治療。隨后的大量研究表明，這類患者實(shí)際屬于I型糖尿病中的免疫中介亞型，為一種起病晚的成人隱匿性I型糖尿病(LADA)，起病原因?yàn)樽陨砻庖呶蓙y。但由于這類病人的臨床表現(xiàn)與II型糖尿病很難鑒別，絕大多數(shù)醫(yī)院又無相關(guān)抗體的檢測手段，通常都診斷為II型糖尿病，從而使用不適當(dāng)?shù)腎I型糖尿病治療方法，延誤病情，導(dǎo)致患者健康乃至生命的損失。
在1999年，世界衛(wèi)生組織(WHO)專家評議報(bào)告“糖尿病及其并發(fā)癥的定義、診斷和分型”第一部分中提出了糖尿病新分型。其中，I型糖尿病被分為免疫中介型和特發(fā)型兩個(gè)亞型，并指出，確診免疫中介I型糖尿病，主要依賴在糖尿病患者中檢出針對胰島β細(xì)胞各種抗原的自身免疫抗體。人們目前已發(fā)現(xiàn)了多種與糖尿病相關(guān)的自身免疫抗體，其中最重要的自身免疫抗體包括胰島細(xì)胞自身抗體(ICAs)；谷氨酸脫羧酶抗體(GADA)；蛋白酪氨酸磷酸酶樣跨膜蛋白抗體(ICA512/IA-2)；胰島素抗體(IAA)。因胰島細(xì)胞自身抗體的出現(xiàn)遠(yuǎn)早于臨床癥狀，在I型糖尿病臨床的前期，多種自身抗體在外周血就可檢測出，其最遠(yuǎn)時(shí)間可達(dá)8年，可及時(shí)預(yù)測未來I型糖尿病發(fā)生。對這類患者如采取相應(yīng)治療措施，會(huì)大大延緩發(fā)病時(shí)間，甚至最終改變疾病的預(yù)后。
糖尿病自身免疫抗體在檢測中由于出現(xiàn)情況、時(shí)間和強(qiáng)度并不一致，而且各種自身免疫抗體單一檢出率都不超過80％，所以，任何單一的檢測都很可能造成實(shí)際患者的漏診。因此，糖尿病自身免疫抗體必須聯(lián)合檢測，在臨床上才可用于分型確診，進(jìn)而影響治療和患者預(yù)后的重要實(shí)用價(jià)值。目前常規(guī)的糖尿病診斷仍是以臨床癥狀結(jié)合血糖濃度和口服糖耐量實(shí)驗(yàn)等相對實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)來診斷，它已不適合進(jìn)行分型確診，同時(shí)因其自身原因常會(huì)受到各種因素的干擾，有時(shí)會(huì)產(chǎn)生波動(dòng)較大的檢測結(jié)果，也就是說檢測結(jié)果不穩(wěn)定。另外已有人嘗試采用特異性的血清免疫學(xué)方法來輔助分型診斷，但一般都是針對每種自身免疫抗體進(jìn)行單獨(dú)檢測，因此檢測成本高，一般患者難以采用，同時(shí)也難以作為體檢篩查的手段，不能提供適應(yīng)目前糖尿病患者增加所需要的相應(yīng)的高通量標(biāo)準(zhǔn)化檢測手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決現(xiàn)有糖尿病臨床分型確診不準(zhǔn)確和檢測成本高的問題。
為解決現(xiàn)有的問題，本發(fā)明的解決方案是提供一種糖尿病自身免疫抗體檢測復(fù)合芯片，包括外殼1和檢測微陣列3，其特殊之處在于，所述外殼1是上表面設(shè)置有多個(gè)反應(yīng)池2的玻璃薄片，反應(yīng)池內(nèi)均設(shè)置有一個(gè)檢測微陣列3，每個(gè)檢測微陣列3分別由四種同一規(guī)格大小的微型固相檢測片組成，所述的微型固相檢測片分別是胰島細(xì)胞微型固相檢測片4、重組人谷氨酸脫羧酶65KD蛋白微型固相檢測片5、重組人胰島細(xì)胞抗原512蛋白微型固相檢測片6和重組人胰島素蛋白微型固相檢測片7。
上述微型固相檢測片大小在0.1mm2～9mm2之間。
上述玻璃薄片規(guī)格為22mm×75mm，厚度1mm～3mm，其上表面設(shè)置有3～200個(gè)反應(yīng)池2，所述反應(yīng)池2是邊長為0.2mm～18mm的正方形。
上述反應(yīng)池2容量為10μl～100μl。
上述胰島細(xì)胞微型固相檢測片4上包含有約1×103～1×106個(gè)胰島細(xì)胞；所述每個(gè)蛋白微型固相檢測片上包含有2個(gè)～10個(gè)相應(yīng)的蛋白點(diǎn)樣點(diǎn)。
一種上述的糖尿病自身免疫抗體檢測復(fù)合芯片的制備方法如下首先準(zhǔn)備微型固相檢測片，本發(fā)明中的微型固相檢測片，根據(jù)其上的檢測基質(zhì)種類不同分為胰島細(xì)胞微型固相檢測片、重組人谷氨酸脫羧酶65KD蛋白微型固相檢測片、重組人胰島細(xì)胞抗原512蛋白微型固相檢測片和重組人胰島素蛋白微型固相檢測片；這四個(gè)微型固相檢測片的制備中，檢測片采用經(jīng)硅化處理的玻璃蓋玻片或透明聚苯乙烯蓋玻片或醋酸纖維膜，其中胰島細(xì)胞微型固相檢測片4的制備采用細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合細(xì)胞爬片技術(shù)，另外三種蛋白微型固相檢測片的制備方法是依次包括將蛋白與磷酸鹽緩沖液混合后調(diào)節(jié)蛋白溶液的濃度；將蛋白溶液再加入40％的甘油，混勻；采用市售的DNA微陣列儀點(diǎn)樣儀在基質(zhì)平面上點(diǎn)樣；點(diǎn)樣后孵育3小時(shí)；用牛血清白蛋白溶液封閉，使用時(shí)切割為0.1mm2～9mm2的微型檢測片；然后進(jìn)行組裝①選用表面上設(shè)有3～200個(gè)反應(yīng)池的玻璃薄片，每個(gè)反應(yīng)池均為邊長是0.2mm～18mm的正方形，容量10μl～100μl；②在反應(yīng)池內(nèi)設(shè)置有一個(gè)檢測微陣列，由四個(gè)同一規(guī)格大小的不同種類的微型固相檢測片排列并以透明黏合劑黏附固定于其內(nèi)制成。
上述微型固相檢測片的制備方案是①胰島細(xì)胞微型固相檢測片的制備首先選取對胰島細(xì)胞自身抗體抗體敏感的體外培養(yǎng)細(xì)胞，所述的對胰島細(xì)胞自身抗體抗體敏感的體外培養(yǎng)細(xì)胞包括胰島細(xì)胞瘤手術(shù)切除組織培養(yǎng)的胰島β細(xì)胞瘤細(xì)胞，以及哺乳動(dòng)物胰腺組織內(nèi)胰島細(xì)胞；然后進(jìn)行檢測基質(zhì)的培養(yǎng)培養(yǎng)方法是先參照胰島細(xì)胞體外培養(yǎng)法進(jìn)行原代培養(yǎng)，再在傳代后使貼壁的單層培養(yǎng)細(xì)胞生長于檢測片的表面，待細(xì)胞生長貼附整個(gè)檢測片表面超過50％后，取出檢測片，放入磷酸鹽緩沖液洗滌，再于檢測片表面滴加固定液固定30min，固定后浸入磷酸鹽緩沖液-甘油混合液置于-20℃儲(chǔ)存，使用時(shí)切割為0.1mm2～9mm2的微型檢測片；②重組人谷氨酸脫羧酶65KD蛋白微型固相檢測片的制備中，點(diǎn)樣試劑采用美國sigma公司純化重組人谷氨酸脫羧酶65KD蛋白，磷酸鹽緩沖液稀釋，pH7.5，終濃度范圍在10μg～200μg/ml，加入40％甘油，混勻，采用微陣列點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣。點(diǎn)樣密度在100～2000點(diǎn)/cm2，點(diǎn)樣后以含L型多聚谷氨酸的0.5％牛血清白蛋白封閉，-20℃儲(chǔ)存。使用時(shí)切割為0.1mm2～9mm2的微型檢測片，每個(gè)微型檢測片含有2個(gè)～10個(gè)蛋白點(diǎn)樣點(diǎn)；
③重組人胰島細(xì)胞抗原512蛋白微型固相檢測片的制備中，試劑采用美國sigma公司重組純化重組人胰島細(xì)胞抗原512蛋白β-亞型，磷酸鹽緩沖液稀釋，pH7.5，終濃度范圍在10μg～200μg/ml，加入40％甘油，混勻，采用微陣列點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣。點(diǎn)樣密度在100～2000點(diǎn)/cm2，點(diǎn)樣后以含L型多聚谷氨酸的0.5％牛血清白蛋白封閉，-20℃儲(chǔ)存。使用時(shí)切割為0.1mm2～9mm2的微型檢測片，每個(gè)微型檢測片含有2個(gè)～10個(gè)蛋白點(diǎn)樣點(diǎn)；④微型重組人胰島素蛋白固相檢測片的制備中，試劑采用美國sigma公司合成人胰島素蛋白，磷酸鹽緩沖液稀釋，pH7.5，終濃度范圍在10μg～200μg/ml，加入40％甘油，混勻，采用微陣列點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣。點(diǎn)樣密度在100～2000點(diǎn)/cm2，點(diǎn)樣后以含L型多聚谷氨酸的0.5％牛血清白蛋白封閉，-20℃儲(chǔ)存。使用時(shí)切割為0.1mm2～9mm2的微型檢測片，每個(gè)微型檢測片含有2個(gè)～10個(gè)蛋白點(diǎn)樣點(diǎn)；①、②、③和④中所述檢測片可采用經(jīng)硅化處理(APES)的玻璃蓋玻片或市售的透明聚苯乙烯蓋玻片。
上述制備方法還包括包裝步驟，將芯片表面用錫箔紙包裹，再密封包裝。
芯片儲(chǔ)存于-20℃條件下，運(yùn)輸時(shí)置于不高于4℃的恒溫容器內(nèi)。
一種上述的糖尿病自身免疫抗體檢測復(fù)合芯片的檢測方法如下先采用間接熒光法檢測，檢測結(jié)果再以生物芯片激光共聚焦掃描儀掃描判定，也可以采用其他種類的微陣列掃描儀掃描實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果，通過軟件或?qū)I(yè)人士進(jìn)行判讀；也可使用普通熒光顯微鏡直接觀察，由專業(yè)人士對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定。以上所述反應(yīng)池中的任意兩個(gè)作為質(zhì)控反應(yīng)池，其余均為檢測反應(yīng)池。
上述間接熒光法中，首先進(jìn)行預(yù)處理①將芯片取出后，室溫放置5min，打開包裝；②在每個(gè)反應(yīng)池加入50μl磷酸鹽緩沖液，放入37℃水浴中孵育15min；③滴加1％牛血清白蛋白50μl室溫下封閉20min；然后對檢測反應(yīng)池的進(jìn)行檢測，操作步驟是①將一份患者待測血清以1∶5用磷酸鹽緩沖液稀釋，直接滴加于一個(gè)檢測反應(yīng)池表面，37℃孵育1h；②磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次5min；
③加入熒光標(biāo)記的鼠抗人IgG單克隆抗體，37℃孵育1h；④含1％吐溫的磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次10min；⑤滴加封裱劑封片；對質(zhì)控微陣列反應(yīng)池的進(jìn)行檢測，操作步驟是與上述對檢測反應(yīng)池的檢測同步進(jìn)行，僅將對檢測反應(yīng)池的檢測操作步驟中所用患者待測血清換為陽性對照檢測液或陰性對照檢測液，其余步驟相同；陽性對照檢測液是將健康成人血清，經(jīng)1500轉(zhuǎn)離心10min，將純化的人谷氨酸脫羧酶自身抗體、人胰島細(xì)胞抗原512蛋白自身抗體、人胰島素蛋白自身抗體單克隆抗體各5u或相當(dāng)于此量的濃縮溶液溶于健康成人血清制備而成；陰性對照檢測液是將健康成人血清，經(jīng)1500轉(zhuǎn)離心10min，取上清液制備而成。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有下述優(yōu)點(diǎn)①利用當(dāng)前最新的蛋白芯片和細(xì)胞芯片技術(shù)，通過血清中糖尿病自身免疫抗體存在與否或其含量多少，為免疫中介性糖尿病患者的分型鑒別提供重要依據(jù)，也可廣泛用于糖尿病高危人群中I型糖尿病臨床前期和發(fā)病早期的預(yù)測，因此具有重要的臨床實(shí)用價(jià)值。
②高通量。使用一張檢測芯片可同時(shí)檢測數(shù)位至數(shù)十位患者血清，一次提供每份血清中三種糖尿病自身免疫抗體的相關(guān)信息，非常適合在人群中進(jìn)行大批量篩查診斷使用。
③檢測成本低廉，經(jīng)濟(jì)性強(qiáng)。一張芯片可檢測數(shù)位至數(shù)十位患者血清，每份血清四種糖尿病診斷標(biāo)志物，相當(dāng)于常規(guī)數(shù)百次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；但所需檢測試劑用量僅相當(dāng)于常規(guī)檢測的試劑用量的1/20～1/50，可大大降低檢測成本，具有非常強(qiáng)的經(jīng)濟(jì)性，易普及。
④特異性強(qiáng)、靈敏度高。以純化蛋白為檢測底物，避免了常規(guī)檢測中的干擾，保證了高度的檢測特異性，有效的避免了假陽性和假陰性的檢測結(jié)果的產(chǎn)生。同時(shí)采用最新固相檢測芯片制作工藝，保證了其檢測的高靈敏度。
⑤穩(wěn)定的質(zhì)量控制。高度純化的抗原蛋白保證了抗原質(zhì)量的穩(wěn)定，減小批間批內(nèi)差異，從而有效的實(shí)現(xiàn)檢測標(biāo)準(zhǔn)化，降低檢測結(jié)果的波動(dòng)。同時(shí)每張芯片都具有獨(dú)立的質(zhì)控微陣列，保證了每張芯片質(zhì)量的可靠性。
⑥檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。芯片采用間接熒光法檢測，檢測結(jié)果以生物芯片專用激光共聚焦掃描儀掃描后通過智能化的分析軟件判定，消除了通常實(shí)驗(yàn)室檢測人為判定結(jié)果可能造成失誤的因素。
⑦通過細(xì)胞芯片技術(shù)，可對以往較難檢測的胰島細(xì)胞自身抗體胰島細(xì)胞自身抗體進(jìn)行精確的檢測。相對于傳統(tǒng)胰島細(xì)胞自身抗體檢測的冰凍切片免疫組化法，具有高檢測靈敏度、無背景干擾、批間差異小、質(zhì)量可靠，操作簡便等多種優(yōu)點(diǎn)，可以完全取代以往的檢測法。



圖1是芯片的表面結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是單個(gè)檢測反應(yīng)池的結(jié)構(gòu)示意圖。
附圖標(biāo)記說明如下1-外殼，2-反應(yīng)池，3-檢測微陣列，4-胰島細(xì)胞微型固相檢測片，5-重組人谷氨酸脫羧酶65KD蛋白微型固相檢測片，6-重組人胰島細(xì)胞抗原512蛋白微型固相檢測片，7-重組人胰島素蛋白微型固相檢測片。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明涉及糖尿病自身免疫抗體檢測復(fù)合芯片、其制備及檢測方法，主要用于檢測糖尿病輔助診斷上的四個(gè)重要指標(biāo)胰島細(xì)胞自身抗體、人谷氨酸脫羧酶自身抗體、人胰島細(xì)胞抗原512蛋白自身抗體和人胰島素蛋白自身抗體。以下將通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但不應(yīng)理解為保護(hù)范圍僅限于下述
(一)一種糖尿病自身免疫抗體檢測蛋白芯片，包括外殼1和檢測微陣列3，所述外殼1是規(guī)格為22mm×75mm，厚度是1mm的玻璃薄片，所述玻璃薄片上表面設(shè)置有78個(gè)反應(yīng)池2，所述反應(yīng)池2是表面邊長為2.5mm，底邊2.0mm，深0.5mm的倒置臺(tái)形。在每個(gè)反應(yīng)池2內(nèi)均設(shè)置有一個(gè)檢測微陣列3，檢測微陣列3由四個(gè)面積是1mm2、方形的微型固相檢測片組成它們分別是胰島細(xì)胞微型固相檢測片4、重組人谷氨酸脫羧酶65KD蛋白微型固相檢測片5、重組人胰島細(xì)胞抗原512蛋白微型固相檢測片6和重組人胰島素蛋白微型固相檢測片7。每個(gè)細(xì)胞微型固相檢測片內(nèi)包含有1×105個(gè)單層貼壁人胚胎胰島β細(xì)胞，所說的每個(gè)微型固相檢測片上包含有6個(gè)蛋白點(diǎn)樣點(diǎn)。
(二)一種糖尿病自身免疫抗體檢測復(fù)合芯片的制備方法如下首先準(zhǔn)備微型固相檢測片，所說的微型固相檢測片根據(jù)其上的蛋白種類不同分為胰島細(xì)胞微型固相檢測片、重組人谷氨酸脫羧酶65KD蛋白微型固相檢測片、重組人胰島細(xì)胞抗原512蛋白微型固相檢測片和重組人胰島素蛋白微型固相檢測片。
①胰島細(xì)胞微型固相檢測片的制備檢測基質(zhì)是胰島細(xì)胞瘤手術(shù)切除組織培養(yǎng)的胰島β細(xì)胞瘤細(xì)胞，通過胰島細(xì)胞體外培養(yǎng)法進(jìn)行原代培養(yǎng)，傳代后使貼壁的單層培養(yǎng)細(xì)胞生長于檢測片的表面，此例中檢測片采用經(jīng)硅化處理(APES)的玻璃蓋玻片，待細(xì)胞貼附生長占整個(gè)檢測片表面50％后，取出檢測片，放入磷酸鹽緩沖液洗滌，再于檢測片表面滴加4％多聚甲醛的固定液固定30min，固定后浸入磷酸鹽緩沖液-甘油混合液置于-20℃儲(chǔ)存，磷酸鹽緩沖液-甘油混合液的比例為1∶1，PH7.4，使用時(shí)切割為1mm2的矩形微型檢測片，每個(gè)細(xì)胞微型固相檢測片內(nèi)包含有1×105個(gè)單層貼壁人胚胎胰島β細(xì)胞。固定液也可以是含1％冰醋酸的95％的乙醇溶液。
②重組人谷氨酸脫羧酶65KD蛋白微型固相檢測片的制備中，檢測片采用透明聚苯乙烯蓋玻片，厚度0.1mm，點(diǎn)樣試劑采用美國sigma公司純化重組人谷氨酸脫羧酶65KD蛋白，磷酸鹽緩沖液稀釋，PH7.5，終濃度100μg/ml，加入40％甘油，混勻，采用微陣列點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣。點(diǎn)樣密度600點(diǎn)/cm2，點(diǎn)樣后以含L型多聚谷氨酸的0.5％牛血清白蛋白封閉，-20℃儲(chǔ)存。使用時(shí)切割為1mm2的矩形微型檢測片，每個(gè)微型檢測片含有6個(gè)蛋白點(diǎn)樣點(diǎn)。
③重組人胰島細(xì)胞抗原512蛋白微型固相檢測片的制備中，檢測片采用透明聚苯乙烯蓋玻片，厚度0.1mm，試劑采用美國sigma公司重組純化重組人胰島細(xì)胞抗原512蛋白β-亞型，磷酸鹽緩沖液稀釋，pH7.5，終濃度100μg/ml，加入40％甘油，混勻，采用微陣列點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣。點(diǎn)樣密度600點(diǎn)/cm2，點(diǎn)樣后以含L型多聚谷氨酸的0.5％牛血清白蛋白封閉，-20℃儲(chǔ)存。使用時(shí)切割為1mm2的矩形微型檢測片，每個(gè)微型檢測片含有6個(gè)蛋白點(diǎn)樣點(diǎn)。
④重組人胰島素蛋白微型固相檢測片的制備中，檢測片采用透明聚苯乙烯蓋玻片，厚度0.1mm，試劑采用美國sigma公司合成人胰島素蛋白，磷酸鹽緩沖液稀釋，pH7.5，終濃度范圍在100μg/ml，加入40％甘油，混勻，采用微陣列點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣。點(diǎn)樣密度在600點(diǎn)/cm2，點(diǎn)樣后以含L型多聚谷氨酸的0.5％牛血清白蛋白封閉，-20℃儲(chǔ)存。使用時(shí)切割為1mm2的矩形微型檢測片，每個(gè)微型檢測片含有6個(gè)蛋白點(diǎn)樣點(diǎn)。
然后進(jìn)行組裝，①選用含78個(gè)反應(yīng)池的玻璃薄片，所說的反應(yīng)池是表面邊長為2.5mm，底邊2.0mm，深0.5mm的倒置臺(tái)形；②將四種同一大小的不同種類的微型蛋白檢測片排列并以透明黏合劑黏附固定于其內(nèi)，制成芯片。
最后還包括包裝步驟，將芯片表面用錫箔紙包裹，再密封包裝，儲(chǔ)存于-20℃條件下，運(yùn)輸時(shí)置于不高于4℃的恒溫容器內(nèi)。
(三)一種糖尿病自身免疫抗體檢測復(fù)合芯片的檢測方法如下首先進(jìn)行間接熒光法檢測，上面所說的78個(gè)反應(yīng)池中的任意兩個(gè)指定為質(zhì)控反應(yīng)池，其余76個(gè)是檢測反應(yīng)池。
第一步檢測前準(zhǔn)備①將芯片取出后，室溫放置5min，打開包裝；②在每個(gè)反應(yīng)池，即78個(gè)反應(yīng)池中均加入50μl磷酸鹽緩沖液，放入37℃水浴中孵育15min；③滴加1％牛血清白蛋白50μl室溫下封閉20min。
第二步對檢測反應(yīng)池的檢測操作步驟是①將一份患者待測血清以1∶5用磷酸鹽緩沖液稀釋，直接滴加于一個(gè)反應(yīng)池表面，37℃孵育1h，該芯片上的76個(gè)可用于76份血清的檢測；②磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次5min；③加入熒光標(biāo)記的鼠抗人IgG單克隆抗體，37℃孵育1h，所說的熒光標(biāo)記可選用市售FITC標(biāo)記；④含1％吐溫的磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次10min；⑤滴加封裱劑封片，所說的封裱劑是甘油與0.5％磷酸鹽緩沖液以1∶1混合制備的，PH7.4。
第三步與第二步同步操作，對質(zhì)控反應(yīng)池的檢測操作步驟是僅將操作步驟中所用患者待測血清換為陽性對照檢測液或陰性對照檢測液，其余步驟相同。所說的陽性對照檢測液按下述方式制備健康成人血清，1500轉(zhuǎn)離心10min，將純化的人谷氨酸脫羧酶自身抗體、人胰島細(xì)胞抗原512蛋白自身抗體、人胰島素蛋白自身抗體單克隆抗體各5u溶于160JDF單位的胰島細(xì)胞自身抗體陽性血清(通過國際青少年糖尿病基金會(huì)標(biāo)準(zhǔn)血清定標(biāo))制成；所說的陰性對照檢測液按下述方式制備健康成人血清，1500轉(zhuǎn)離心10min，取上清液制成。
然后以生物芯片激光共聚焦掃描儀掃描，觀察結(jié)果。
(四)針對本發(fā)明的芯片，本發(fā)明提供以下的結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)。本例中選用ScanArray共聚焦微陣列掃描儀掃描后觀察結(jié)果。
本標(biāo)準(zhǔn)以一個(gè)檢測反應(yīng)池的檢測結(jié)果為例，實(shí)際檢測結(jié)果判定中其他檢測微陣列判定方法相同①當(dāng)胰島細(xì)胞微型固相檢測片上的細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)后平均熒光強(qiáng)度與陰性質(zhì)控微陣列中胰島細(xì)胞微型檢測片上的細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)后平均熒光強(qiáng)度比值超過20∶1時(shí)，則ICA檢測陽性，否則為陰性，②當(dāng)重組人谷氨酸脫羧酶65KD蛋白微型固相檢測片上蛋白點(diǎn)樣點(diǎn)的平均熒光強(qiáng)度與陰性質(zhì)控微陣列中重組人谷氨酸脫羧酶65KD蛋白微型固相檢測片上蛋白點(diǎn)樣點(diǎn)的平均熒光強(qiáng)度比值超過50∶1時(shí)，則人谷氨酸脫羧酶自身抗體檢測陽性，否則為陰性；③當(dāng)重組人胰島細(xì)胞抗原512蛋白微型固相檢測片上蛋白點(diǎn)樣點(diǎn)的平均熒光強(qiáng)度與陰性質(zhì)控微陣列中重組人胰島細(xì)胞抗原512蛋白微型固相檢測片上蛋白點(diǎn)樣點(diǎn)的平均熒光強(qiáng)度比值超過50∶1時(shí)，則人胰島細(xì)胞抗原512蛋白自身抗體檢測陽性，否則為陰性；④當(dāng)重組人胰島素蛋白微型固相檢測片上蛋白點(diǎn)樣點(diǎn)的平均熒光強(qiáng)度與陰性質(zhì)控微陣列中重組人胰島素蛋白微型固相檢測片上蛋白點(diǎn)樣點(diǎn)的平均熒光強(qiáng)度比值超過50∶1時(shí)，則人胰島素蛋白自身抗體檢測陽性，否則為陰性。
本發(fā)明的芯片上附帶兩個(gè)額外的質(zhì)控反應(yīng)池，可對芯片的質(zhì)量進(jìn)行檢測。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)是如果陽性質(zhì)控微陣列微型細(xì)胞檢測片中細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度與背景熒光強(qiáng)度的比值高于20∶1，每個(gè)微型蛋白檢測片上蛋白點(diǎn)樣點(diǎn)的平均熒光強(qiáng)度與背景熒光強(qiáng)度的比值高于50∶1；同時(shí)陰性質(zhì)控微陣列微型細(xì)胞檢測片中細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度與背景熒光強(qiáng)度的比值低于20∶1，每個(gè)檢測片上蛋白點(diǎn)樣點(diǎn)的平均熒光強(qiáng)度與背景熒光強(qiáng)度的比值低于50∶1表明則表明此芯片質(zhì)量良好，本次檢測結(jié)果有效。
權(quán)利要求
1.一種糖尿病自身免疫抗體檢測復(fù)合芯片，包括外殼(1)和檢測微陣列(3)，其特征在于所述外殼(1)是上表面設(shè)置有多個(gè)反應(yīng)池(2)的玻璃薄片，反應(yīng)池內(nèi)均設(shè)置有一個(gè)檢測微陣列(3)，每個(gè)檢測微陣列(3)分別由四種同一規(guī)格大小的微型固相檢測片組成，所述的微型固相檢測片分別是胰島細(xì)胞微型固相檢測片(4)、重組人谷氨酸脫羧酶65KD蛋白微型固相檢測片(5)、重組人胰島細(xì)胞抗原512蛋白微型固相檢測片(6)和重組人胰島素蛋白微型固相檢測片(7)。
2.如權(quán)利要求
1所述的糖尿病自身免疫抗體檢測復(fù)合芯片，其特征在于所述微型固相檢測片大小在0.1mm2～9mm2之間。
3.如權(quán)利要求
1或2所述的糖尿病自身免疫抗體檢測復(fù)合芯片，其特征在于所述玻璃薄片規(guī)格為22mm×75mm，厚度1mm～3mm，其上表面設(shè)置有3～200個(gè)反應(yīng)池(2)，所述反應(yīng)池(2)是邊長為0.2mm～18mm的正方形。
4.如權(quán)利要求
3所述的糖尿病自身免疫抗體檢測復(fù)合芯片，其特征在于所述反應(yīng)池(2)容量為10μl～100μl。
5.如權(quán)利要求
4所述的糖尿病自身免疫抗體檢測復(fù)合芯片，其特征在于所述胰島細(xì)胞微型固相檢測片(4)上包含有約1×103～1×106個(gè)胰島細(xì)胞；所述每個(gè)蛋白微型固相檢測片上包含有2個(gè)～10個(gè)相應(yīng)的蛋白點(diǎn)樣點(diǎn)。
6.一種如權(quán)利要求
1所述的糖尿病自身免疫抗體檢測復(fù)合芯片的制備方法，其特征在于首先準(zhǔn)備微型固相檢測片，本發(fā)明中的微型固相檢測片，根據(jù)其上的檢測基質(zhì)種類不同分為胰島細(xì)胞微型固相檢測片、重組人谷氨酸脫羧酶65KD蛋白微型固相檢測片、重組人胰島細(xì)胞抗原512蛋白微型固相檢測片和重組人胰島素蛋白微型固相檢測片；這四個(gè)微型固相檢測片的制備中，檢測片采用經(jīng)硅化處理的玻璃蓋玻片或透明聚苯乙烯蓋玻片或醋酸纖維膜，其中胰島細(xì)胞微型固相檢測片的制備采用細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合細(xì)胞爬片技術(shù)，另外三種蛋白微型固相檢測片的制備方法依次包括將蛋白與磷酸鹽緩沖液混合后調(diào)節(jié)蛋白溶液的濃度；將蛋白溶液再加入40％的甘油，混勻；采用市售的DNA微陣列儀點(diǎn)樣儀在基質(zhì)平面上點(diǎn)樣；點(diǎn)樣后孵育3小時(shí)；用牛血清白蛋白溶液封閉；在使用時(shí)切割為0.1mm2～9mm2的微型檢測片；然后進(jìn)行組裝①選用表面上設(shè)有3～200個(gè)反應(yīng)池的玻璃薄片，每個(gè)反應(yīng)池均為邊長是0.2mm～18mm的正方形，容量10μl～100μl；②在反應(yīng)池內(nèi)設(shè)置有一個(gè)檢測微陣列，由四個(gè)同一規(guī)格大小的不同種類的微型固相檢測片排列并以透明黏合劑黏附固定于其內(nèi)制成。
7.如權(quán)利要求
6所述的糖尿病自身免疫抗體檢測復(fù)合芯片的制備方法，其特征在于所述微型固相檢測片的準(zhǔn)備中，①胰島細(xì)胞微型固相檢測片的制備首先選取對胰島細(xì)胞自身抗體抗體敏感的體外培養(yǎng)細(xì)胞，所述的對胰島細(xì)胞自身抗體抗體敏感的體外培養(yǎng)細(xì)胞包括胰島細(xì)胞瘤手術(shù)切除組織培養(yǎng)的胰島β細(xì)胞瘤細(xì)胞以及哺乳動(dòng)物胰腺組織內(nèi)胰島細(xì)胞；然后進(jìn)行檢測基質(zhì)的培養(yǎng)培養(yǎng)方法是先參照胰島細(xì)胞體外培養(yǎng)法進(jìn)行原代培養(yǎng)，再在傳代后使貼壁的單層培養(yǎng)細(xì)胞生長于檢測片的表面，待細(xì)胞生長貼附整個(gè)檢測片表面超過50％后，取出檢測片，放入磷酸鹽緩沖液洗滌，再于檢測片表面滴加固定液固定30min，固定后浸入磷酸鹽緩沖液-甘油混合液置于-20℃儲(chǔ)存，使用時(shí)切割為0.1mm2～9mm2的微型檢測片；②重組人谷氨酸脫羧酶65KD蛋白微型固相檢測片的制備中，點(diǎn)樣試劑采用純化重組人谷氨酸脫羧酶65KD蛋白，磷酸鹽緩沖液稀釋，pH7.5，終濃度范圍在10μg～200μg/ml，加入40％甘油，混勻，采用微陣列點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣。點(diǎn)樣密度在100～2000點(diǎn)/cm2，點(diǎn)樣后以含L型多聚谷氨酸的0.5％牛血清白蛋白封閉，-20℃儲(chǔ)存。使用時(shí)切割為0.1mm2～9mm2的微型檢測片，每個(gè)微型檢測片含有2個(gè)～10個(gè)蛋白點(diǎn)樣點(diǎn)；③重組人胰島細(xì)胞抗原512蛋白微型固相檢測片的制備中，試劑采用重組純化重組人胰島細(xì)胞抗原512蛋白β-亞型，磷酸鹽緩沖液稀釋，pH7.5，終濃度范圍在10μg～200μg/ml，加入40％甘油，混勻，采用微陣列點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣。點(diǎn)樣密度在100～2000點(diǎn)/cm2，點(diǎn)樣后以含L型多聚谷氨酸的0.5％牛血清白蛋白封閉，-20℃儲(chǔ)存。使用時(shí)切割為0.1mm2～9mm2的微型檢測片，每個(gè)微型檢測片含有2個(gè)～10個(gè)蛋白點(diǎn)樣點(diǎn)；④重組人胰島素蛋白微型固相檢測片的制備中，試劑采用合成人胰島素蛋白，磷酸鹽緩沖液稀釋，pH7.5，終濃度范圍在10μg～200μg/ml，加入40％甘油，混勻，采用微陣列點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣。點(diǎn)樣密度在100～2000點(diǎn)/cm2，點(diǎn)樣后以含L型多聚谷氨酸的0.5％牛血清白蛋白封閉，-20℃儲(chǔ)存。使用時(shí)切割為0.1mm2～9mm2的微型檢測片，每個(gè)微型檢測片含有2個(gè)～10個(gè)蛋白點(diǎn)樣點(diǎn)；①、②、③和④中所述的檢測片采用經(jīng)硅化處理(APES)的玻璃蓋玻片或市售的透明聚苯乙烯蓋玻片。
8.如權(quán)利要求
6或7所述的糖尿病自身免疫抗體檢測復(fù)合芯片的制備方法，其特征在于所述制備方法還包括包裝步驟，將芯片表面用錫箔紙包裹，再密封包裝。
9.一種采用權(quán)利要求
1的糖尿病自身免疫抗體檢測復(fù)合芯片的檢測方法，其特征在于先采用間接熒光法檢測，檢測結(jié)果再以生物芯片激光共聚焦掃描儀掃描判定，或采用其他種類的微陣列掃描儀掃描實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果，通過軟件或?qū)I(yè)人士進(jìn)行判讀；或僅使用普通熒光顯微鏡直接觀察，再由專業(yè)人士對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定；所述反應(yīng)池中的任意兩個(gè)分別作為陰性質(zhì)控反應(yīng)池和陽性質(zhì)控反應(yīng)池，其余均為檢測反應(yīng)池。
10.如權(quán)利要求
9所述的糖尿病自身免疫抗體檢測復(fù)合芯片的檢測方法，其特征在于所述間接熒光法中，首先進(jìn)行預(yù)處理，①將芯片取出后，室溫放置5min，打開包裝；②在每個(gè)反應(yīng)池加入50μl磷酸鹽緩沖液，放入37℃水浴中孵育15min；③滴加1％牛血清白蛋白50μl室溫下封閉20min；然后對檢測反應(yīng)池的進(jìn)行檢測，操作步驟是①將一份患者待測血清以1∶5用磷酸鹽緩沖液稀釋，直接滴加于一個(gè)檢測反應(yīng)池表面，37℃孵育1h；②磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次5min；③加入熒光標(biāo)記的鼠抗人IgG單克隆抗體，37℃孵育1h；④含1％吐溫的磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次10min；⑤滴加封裱劑封片；對質(zhì)控反應(yīng)池的檢測操作步驟是與對檢測反應(yīng)池的檢測同步，僅將檢測微陣列操作步驟中所用患者待測血清換為陽性對照檢測液或陰性對照檢測液，其余步驟相同；陽性對照檢測液是將健康成人血清，經(jīng)1500轉(zhuǎn)離心10min，將純化的人谷氨酸脫羧酶自身抗體、人胰島細(xì)胞抗原512蛋白自身抗體、人胰島素蛋白自身抗體單克隆抗體各5u或相當(dāng)于此量的濃縮溶液溶于健康成人血清制備而成；陰性對照檢測液是將健康成人血清，經(jīng)1500轉(zhuǎn)離心10min，取上清液制備而成。
專利摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)研究及臨床應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及糖尿病自身免疫抗體檢測復(fù)合芯片及其制備、檢測方法。本發(fā)明要解決現(xiàn)有糖尿病臨床分型確診不準(zhǔn)確和檢測成本高的問題。解決方案是糖尿病自身免疫抗體檢測復(fù)合芯片，外殼是上表面設(shè)置有多個(gè)反應(yīng)池的玻璃薄片，反應(yīng)池內(nèi)均設(shè)置有檢測微陣列，每個(gè)檢測微陣列分別由四個(gè)不同種類的、同一規(guī)格大小的蛋白微型固相檢測片組成，所述蛋白微型固相檢測片分別是胰島細(xì)胞微型固相檢測片、重組人谷氨酸脫羧酶65KD蛋白微型固相檢測片、重組人胰島細(xì)胞抗原512蛋白微型固相檢測片和重組人胰島素蛋白微型固相檢測片；制備方法是首先準(zhǔn)備微型固相檢測片，然后進(jìn)行組裝；檢測方法是先采用間接熒光法檢測，結(jié)果再以生物芯片激光共聚焦掃描儀判定。
文檔編號(hào)G01N33/53GKCN1176377SQ02145561
公開日2004年11月17日 申請日期2002年12月30日
發(fā)明者劉鐳, 羅毅, 王偉華, 劉 鐳 申請人:陜西超英生物醫(yī)學(xué)研究開發(fā)有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan