專利名稱：高通量檢測自身免疫抗體的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗體檢測，尤其涉及自身免疫抗體的高通量檢測。
背景技術(shù)：
自身免疫性疾病臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，對實驗室檢查依賴性強。目前國內(nèi)外臨床上 常用的診斷技術(shù)包括間接免疫熒光染色、免疫印跡分析、酶聯(lián)免疫試驗、乳膠流動快速檢 測，以及Hep2細胞作抗核抗體檢測。間接免疫熒光染色檢測方法為通過預(yù)先固定，并用于 孵化與測試血清，抗體陽性的血清與被預(yù)先固定的抗原相結(jié)合，結(jié)果在核或胞漿染色，由于 不同的抗原或不同的自身免疫疾病可能產(chǎn)生較類似的染色，因而通常需要進一步鑒定，以 便確定自身抗體以及診斷相關(guān)的自身免疫疾病。免疫印跡分析檢測方法為細胞核或細胞 質(zhì)的蛋白提取物通過SDS凝膠分離和轉(zhuǎn)移膜用于測試血清，自身抗體在膜上與相應(yīng)蛋白相 結(jié)合產(chǎn)生免疫印跡反應(yīng)，根據(jù)免疫印跡的蛋白質(zhì)大小確定自身抗原的蛋白質(zhì)，進而診斷其 自身免疫性疾病。雖然間接免疫熒光染色，免疫印跡分析這兩種方法都有助于診斷疾病，但 是程序較為繁瑣和費時，它們很難同時分析多個樣品。乳膠流動快速檢測是一種快速，簡便 的檢測。自身免疫性疾病往往依賴于測試多種蛋白質(zhì)，但目前膠乳流量快速檢測只能檢測 一個蛋白，最多也只能檢測四種蛋白質(zhì)，因而有其局限性。酶聯(lián)免疫吸附試驗是一種高通量 檢測，可以分析96個樣品，但它只能檢測單一蛋白質(zhì)?，F(xiàn)有的自身免疫抗體的高通量檢測，通常是采用LIA(線性免疫測定)法。線性免 疫分析是通過一帶狀膜，上面預(yù)先印制多個蛋白質(zhì)(目前可達到十幾種蛋白)，用于監(jiān)測多 種自身抗體。產(chǎn)品的關(guān)鍵部分是印有多種蛋白質(zhì)的帶狀膜，它的制造不是太簡單有效，該膜 是將線噴印在膜上，印的蛋白質(zhì)數(shù)量非常有限，印制蛋白多了的話會產(chǎn)生交叉反應(yīng)從而顯 著降低檢測的分辨率。因此該方法檢測容量較低，其較低的檢測容量無法滿足檢測自身免 疫性疾病更多抗體的需要。并且，用LIA方法一次印一個蛋白質(zhì)，操作復(fù)雜，生產(chǎn)成本高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，而提出一種可高通量的 同時檢測多種自身抗體，該試劑盒生產(chǎn)方法簡單、快速、生產(chǎn)成本較低。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是，設(shè)計制造一種高通量檢測自身免疫 抗體的試劑盒，包括印制有多種抗原的膜、抗人IgG-酶結(jié)合物、指示染料以及質(zhì)控物，該 膜上有多個抗原印跡點，這些印跡點分別以物理接觸的方式點印上一種所述的抗原。該每個印跡點上點印一種所述的抗原的溶液，該溶液包括需印制的抗原、緩沖液 和短暫性染料，該溶液是將需印制的抗原用緩沖液稀釋到合適濃度后加入該短暫性染料。該抗原的溶液在每個抗原印跡點上的點樣量彡lul，形成的斑點直徑彡2mm。該膜為0. Imm厚、孔徑0.45um的硝酸纖維素膜。該膜可以單獨使用，也可以覆在 玻璃上使用。該短暫性染料包括溴酚藍。
該膜上殘余未吸附抗原的部位用含有惰性蛋白的緩沖液進行吸附。在該抗人IgG-酶結(jié)合物中，抗人IgG抗體是單抗或者多抗，標記的酶為辣根酶或 堿性磷酸酶。該指示染料為持久性染料，用以指示免疫反應(yīng)的存在，是酶結(jié)合物中酶的底物。該指示染料是單組分，或者是雙組分。該質(zhì)控物為正常人血清，HBsAg陰性，抗HCV抗體陰性，抗HIV抗體陰性，或為含有 抗人-IgG抗體的溶液。同現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的高通量檢測自身免疫抗體的試劑盒，通過在膜上以自 行確定的順序、將多種抗原以直接接觸的物理吸附方式進行點印，該膜可以不受限制的吸 附所需的抗原，配以試劑盒其它組分，可高通量的同時檢測多種自身抗體，并且，該試劑盒 生產(chǎn)方法簡單、快速、生產(chǎn)成本較低。


圖1為本發(fā)明的高通量檢測自身免疫抗體的試劑盒中的膜的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為采用本發(fā)明的試劑盒中的膜的進行檢測后的結(jié)果1示意圖。圖3為采用本發(fā)明的試劑盒中的膜的進行檢測后的結(jié)果2示意圖。圖4為采用本發(fā)明的試劑盒中的膜的進行檢測后的結(jié)果3示意圖。
具體實施例方式以下結(jié)合各附圖所示之最佳實施例作進一步詳述。本發(fā)明的高通量檢測自身免疫抗體的試劑盒實施例，包括1、印制有多種抗原的 膜；2、抗人IgG-酶結(jié)合物；3、指示染料，以及4、質(zhì)控物。其中，1、膜的印制1. 1、膜為0. Imm厚、孔徑0.45um的硝酸纖維素膜，該膜可以單獨使用，也可以是覆 載在玻璃基體上，還可以是覆載在其它的惰性材質(zhì)的基體上。1.2、需印制的抗原用緩沖液稀釋到合適濃度后加入一種短暫性染料，用于監(jiān)測印 制過程中有否漏加，該短暫性染料包含溴酚藍。1.3、制作工具是用毛細管、加樣器頭、針頭等有多孔道的點樣裝置將1、2、中的自 身抗原以物理接觸的方式點印在膜上。1. 4、印制抗原在每個斑點部位的點樣量彡Iul，斑點直徑彡2mm。1.5、殘余未吸附抗原的部位用含有惰性蛋白的緩沖液進行吸附，該惰性蛋白是指 與試劑盒中各組分不發(fā)生非特異反應(yīng)的蛋白。1. 6、膜在室溫下干燥后置于4度保存。2、抗人IgG-酶結(jié)合物2. 1、抗人IgG抗體可以是單抗或者多抗，標記的酶為辣根酶或堿性磷酸酶。2. 2、將抗人IgG-酶結(jié)合物稀釋至合適濃度。3、指示染料3. 1、該指示染料為持久性染料，可指示免疫反應(yīng)的存在，是酶結(jié)合物中酶的底物。3. 2、該指示染料可以是單組分，也可以是雙組分。
4、質(zhì)控物4. 1、質(zhì)控物為正常人血清，HBsAg陰性，抗HCV抗體陰性，抗HIV抗體陰性，或為含 有抗人-IgG抗體的溶液。參見圖1，膜1上印制有多個抗原的斑點10，并設(shè)有陰性質(zhì)控點11、陽性質(zhì)控點 12。斑點10處可以不受限制的吸附所需的所有抗原，比如CENP抗原101、PO抗原102以 及SS-B抗原103。參見圖2，為CENP抗原101陽性血清分析結(jié)果。參見圖3，為PO抗原102陽性血清分析結(jié)果。參見圖4，為SS-B抗原103陽性血清分析結(jié)果。采用本發(fā)明的高通量檢測自身免疫抗體的試劑盒實施例進行檢測的過程，大致包 括以下步驟1、每份樣品取一張印有抗原的膜，每張膜放入比印跡膜四周大2mm的容器內(nèi)2、加入1 100稀釋的待檢血清或質(zhì)控物anl，室溫1小時，吸出。3、加入洗液anl，浸泡1分鐘，吸出，如此洗5遍。4、加入酶結(jié)合物anl，室溫1小時，吸出。5、洗滌同上述步驟3。6、加入指示染料anl，室溫20分鐘，吸出。7、加入終止反應(yīng)的溶液，觀察結(jié)果。明顯呈色斑點為陽性，未呈色斑點為陰性。綜上，采用本發(fā)明的高通量檢測自身免疫抗體的試劑盒，比現(xiàn)有的LIA法有更高 的檢測容量，從而完美地滿足了診斷自身免疫性疾病中多種檢測的現(xiàn)實需要，極大地縮短 了生產(chǎn)流程，提高了生產(chǎn)效率，降低了生產(chǎn)成本。這種高通量的檢測方法，可以根據(jù)需要對 檢測容量加以擴展。以上，僅為本發(fā)明之較佳實施例，意在進一步說明本發(fā)明，而非對其進行限定。凡 根據(jù)上述之文字和附圖所公開的內(nèi)容進行的簡單的替換，都在本專利的權(quán)利要求保護范圍 之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種高通量檢測自身免疫抗體的試劑盒，其特征在于，包括印制有多種抗原的膜、 抗人IgG-酶結(jié)合物、指示染料以及質(zhì)控物，該膜上每個抗原印跡點上分別以物理接觸的方 式點印上測定自身抗體對應(yīng)的抗原。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該每個抗原印跡點上點印一種所述的抗 原的溶液，該溶液包括需印制的抗原、緩沖液和短暫性染料，該溶液是將需印制的抗原用 緩沖液稀釋到合適濃度后加入該短暫性染料。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，該抗原的溶液在每個抗原印跡點上的點 樣量彡Iul，形成的斑點直徑彡2mm。
4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，該膜為0.Imm厚、孔徑0.45um的硝酸纖維 素膜。
5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，該膜是覆載在玻璃基體上。
6.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，該短暫性染料包括溴酚藍。
7.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，該膜上殘余未吸附抗原的部位用含有惰 性蛋白的緩沖液進行吸附。
8.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，在該抗人IgG-酶結(jié)合物中，抗人IgG抗體 是單抗或者多抗，標記的酶為辣根酶或堿性磷酸酶。
9.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該指示染料為持久性染料，該指示染料是 單組分，或者是雙組分，用以指示免疫反應(yīng)的存在，是酶結(jié)合物中酶的底物。
10.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該質(zhì)控物為正常人血清，HBsAg陰性，抗 HCV抗體陰性，抗HIV抗體陰性，或為含有抗人-IgG抗體的溶液。
全文摘要
一種高通量檢測自身免疫抗體的試劑盒，其主要包括一種膜，在此膜上以自行確定的順序、將多種抗原以直接接觸的物理吸附方式進行點印，該膜可以不受限制的吸附所需的多種抗原，配以試劑盒其它組分，可高通量的同時檢測多種自身抗體。并且，本發(fā)明的試劑盒生產(chǎn)方法簡單、快速、生產(chǎn)成本較低。
文檔編號G01N33/577GK102053154SQ20091011013
公開日2011年5月11日 申請日期2009年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月9日
發(fā)明者姜昕, 李先強 申請人:深圳市宏信生物技術(shù)有限公司