專利名稱：一種檢測i型糖尿病自身免疫抗體試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生化醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種檢測I型糖尿病自身免疫抗體試劑盒及其檢測方法，可用于I型糖尿病的預(yù)測和診斷。
背景技術(shù)：
—般的，I型糖尿病是一種自體免疫疾病，機(jī)體受到感染(尤其是病毒感染)、毒物等因素誘發(fā)而產(chǎn)生異常自身體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，導(dǎo)致胰島β細(xì)胞損傷，胰島素分泌減少，一旦發(fā)病需要依賴外源性胰島素補(bǔ)充以維持生命，所以I型糖尿病又稱胰島素依賴性糖尿病。此類糖尿病常見于兒童和青年患者，但是它可以在任何年齡段的人群中發(fā)生，并且此類糖尿病的患病率約占總糖尿病病例的10%?？梢娂霸绲貙型糖尿病進(jìn)行診斷以及高危人群中進(jìn)行預(yù)報(bào)具有重要的意義。對I型糖尿病的診斷主要通過檢測其自身免疫性抗體，抗體主要包括以下幾種:谷氨酸脫羧酶抗體(GAD)、胰島細(xì)胞 抗體(ICA)酪氨酸磷酸酶抗體(ΙΑ-2Α)及胰島素自身免疫性抗體(IAA)。目前測定GAD、IA-2、IAA常用的方法有放射免疫法、酶聯(lián)免疫法；用于ICA測定的主要用間接免疫熒光法，另外也有用酶聯(lián)免疫法及免疫組化法。放射免疫分析具有許多其它分析方法無可比擬的優(yōu)點(diǎn)。它既具有免疫反應(yīng)的高特異性，又具有放射性測量的高靈敏度，并且樣品用量少，?？蓽y至皮摩爾量。本方法有時(shí)會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)、假陽性反應(yīng)、組織樣品處理不夠迅速，不能滅活降解酶和鹽，有時(shí)會(huì)影響結(jié)果等，還存在使用放射性標(biāo)記物所引起的放射線輻射和污染等問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)是解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測I型糖尿病自身免疫抗體試劑盒及其檢測方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是按以下方式實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明利用293細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的一種熒光酶一抗原融合蛋白，可以與病人血清中的糖尿病自身抗體發(fā)生特異性結(jié)合。然后加入蛋白A瓊脂糖，沉淀融合蛋白-抗體復(fù)合物，離心后將未結(jié)合的融合蛋白從上清液中吸走。之后加入熒光素酶底物，利用熒光檢測儀檢測熒光強(qiáng)度，從而測定待測樣品中糖尿病自身抗體的含量。一種檢測I型糖尿病自身免疫抗體試劑盒,該試劑盒包含有:熒光素酶和糖尿病抗原的融合蛋白。一種檢測I型糖尿病自身免疫抗體試劑盒包含有:熒光素酶-GAD65融合蛋白、熒光素酶-1A-2融合蛋白、熒光素酶-ΙΑ-2β融合蛋白。
一種檢測I型糖尿病自身免疫抗體試劑盒包含有:
試劑1:1A:熒光素酶-GAD65融合蛋白，
IB:熒光素酶-1A-2融合蛋白，
IC:熒光素酶-ΙΑ-2β融合蛋白；
試劑2:標(biāo)準(zhǔn)液；
試劑3:
3Α:空白對照液，
3Β:健康人血清對照液；
試劑4:蛋白A瓊脂糖；
試劑5:Ranilla熒光底物。所述的試劑I的制備方法是:將Ranilla熒光基因與目的基因融合后轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中，然后在含有10%血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)36 60h，將收獲的細(xì)胞在冰浴中超聲處理15 30 min,然后將細(xì)胞裂解液于4°C，以6000 8000rpm轉(zhuǎn)速離心15 45 min后取上清，得到融合蛋白，后分裝凍干成該試劑盒中的試劑I。標(biāo)準(zhǔn)液是標(biāo)準(zhǔn)抗體NIBSC97/550。緩沖液是指0.01mol/L, ρΗ7.4磷酸鹽緩沖液。Ranilla熒光素酶是指:海腎熒光素酶，指熒光素酶的報(bào)告基因來自于海腎。就像螢火蟲熒光素酶一樣。Ranilla熒光基因來自于海腎。目的基因是指糖尿病抗原基因。將這兩種基因融合后進(jìn)行表達(dá)，會(huì)產(chǎn)生融合蛋白，在本專利中分別為熒光素酶-GAD-65融合蛋白、熒光素酶-ΙΑ-2融合蛋白、熒光素酶-ΙΑ-2β融合蛋白。一種檢測I型糖尿病自身免疫抗體試劑盒的檢測方法的步驟是:
試劑盒:
試劑1:1A:熒光素酶-GAD65融合蛋白，
IB:熒光素酶-ΙΑ-2融合蛋白，
IC:熒光素酶-ΙΑ-2β融合蛋白；
試劑2:標(biāo)準(zhǔn)液；
試劑3:
3Α:空白對照液，
3Β:健康人血清對照液；
試劑4:蛋白A瓊脂糖；
試劑5 =Ranilla熒光底物；
實(shí)驗(yàn)之前，將試劑盒和緩沖液在室溫下放置至少30min ；
(1)對試劑I用緩沖液進(jìn)行一定倍數(shù)的梯度稀釋，要保證抗原有一定的濃度，要求達(dá)到每微升中有IO7個(gè)熒光單位；
(2)加入15 30uL的病人血清、梯度稀釋的試劑2標(biāo)準(zhǔn)液、健康人血清對照液于N只離心管中，并且設(shè)置N個(gè)試管作為平行組(標(biāo)曲的濃度梯度可根據(jù)抗體的不同設(shè)定)；
(3)向每只管中加入40 SOuL的試劑I稀釋液，另外加兩只空管用來測熒光總強(qiáng)度；
(4)用漩渦振蕩器混勻每支管并蓋上蓋，不包括兩只測熒光總強(qiáng)度空管；
(5)在室溫下，孵育3 5h，讓糖尿病自身抗體與抗原特異性結(jié)合；
(6)孵育之后，向每只管中加入40 80uL的蛋白A瓊脂糖，不包括測總熒光強(qiáng)度空管，來捕捉抗原抗體復(fù)合物；
(7)用漩渦振蕩器混勻每支管并蓋上蓋，不包括測總熒光強(qiáng)度空管；
(8)于4°C緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過夜或于室溫緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物I 2h，使抗體與蛋白A瓊脂糖偶連，
(9)孵育之后，向每只管中加入I 2mL的2 8°C冷藏的緩沖液，不包括測總熒光強(qiáng)度空管，然后在4°C下1500 3000rpm離心15 30min，將蛋白A瓊脂糖偶連的抗原-抗體復(fù)合物離心至管底；
(10)離心后，將上清液小心吸去，沉淀用PBS將蛋白A瓊脂糖-抗原-抗體復(fù)合物懸起離心洗滌2 5次；
(11)然后向離心管中加入50uL Ranilla熒光底物，立即測定熒光強(qiáng)度；
(12)分析結(jié)果:
以標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為X軸，以結(jié)合率為Y軸做標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)患者血清的熒光強(qiáng)度，計(jì)算結(jié)合率，從曲線上讀取病人血清中自身抗體的濃度。結(jié)合率=(樣品測定值-3B測定值)/總熒光強(qiáng)度 抗體濃度=標(biāo)曲讀取值*相對倍數(shù)
陰性1.0 U/mL 陽性:> 1.0 U/mL
三種抗體只要有一種檢測為陽性，即可確定樣品含有糖尿病自身抗體，樣品來源人體患有I型糖尿病。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比所產(chǎn)生的有益效果是:
本發(fā)明在放射免疫技術(shù)的基礎(chǔ)上使用熒光素融合蛋白作為標(biāo)記物，做成試劑盒，加樣程序簡單，一次可分析大量標(biāo)本，并且具有較高的特異性和靈敏度。本發(fā)明使用微量熒光檢測儀檢測，與傳統(tǒng)的HPLC相比，操作簡單，直接接受標(biāo)準(zhǔn)
0.2mL離心管進(jìn)行隔離測定，無需開蓋堵截污染途徑，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠和操作人員安全。另外可采用不小于25uL樣品量進(jìn)行測定，達(dá)到微量省試劑的要求，并且高靈敏度、高信噪t匕，測量值穩(wěn)定可靠。
具體實(shí)施例方式下面對本發(fā)明的一種檢測I型糖尿病自身免疫抗體試劑盒及其檢測方法作以下詳細(xì)說明。本發(fā)明用293細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的一種熒光酶一抗原融合蛋白，可以與病人血清中的糖尿病自身抗體發(fā)生特異性結(jié)合。然后加入蛋白A瓊脂糖，沉淀融合蛋白-抗體復(fù)合物，離心后將未結(jié)合的融合蛋白從上清液中吸走。之后加入熒光素酶底物，利用熒光檢測儀檢測熒光強(qiáng)度，從而測定待測樣品中糖尿病自身抗體的含量。
本發(fā)明的一種檢測I型糖尿病自身免疫抗體試劑盒的檢測方法的步驟是:
(I)將Ranilla熒光基因與目的基因轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中，然后在含有10%血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)55h ;將收獲的細(xì)胞在冰浴中超聲處理I min，然后將細(xì)胞裂解液于4°C，以6000 8000rpm轉(zhuǎn)速離心20 min后取上清,后分裝凍干成檢測試劑盒試劑I ;
試劑盒:
試劑1:1A:熒光素酶-GAD65融合蛋白，
IB:熒光素酶-1A-2融合蛋白，
IC:熒光素酶-ΙΑ-2β融合蛋白；
試劑2:標(biāo)準(zhǔn)液；
試劑3:
3Α:空白對照液，
3Β:健康人血清對照液；
試劑4:蛋白A瓊脂糖；
試劑5:RaniIIa熒光底物；
標(biāo)準(zhǔn)液是標(biāo)準(zhǔn)抗體NIBSC97/550。緩沖液是指0.01mol/L, pH7.4磷酸鹽緩沖液。Ranilla熒光素酶是指:海腎熒光素酶，指熒光素酶的報(bào)告基因來自于海腎。就像螢火蟲熒光素酶一樣。Ranilla熒光基因來自于海腎。目的基因是指糖尿病抗原基因。將這兩種基因融合后進(jìn)行表達(dá)，會(huì)產(chǎn)生融合蛋白，在本專利中分別為熒光素酶-GAD-65融合蛋白、熒光素酶-1A-2融合蛋白、熒光素酶-ΙΑ-2β融合蛋白。試劑盒的試劑組成及預(yù)處理:
試劑編號:1Α
試劑名稱:熒光素酶-GAD65融合蛋白 試劑編號:1Β
試劑名稱:熒光素酶-ΙΑ-2融合蛋白 試劑編號:1C
試劑名稱:熒光素酶-ΙΑ-2 β融合蛋白
預(yù)處理方式:凍干粉:向每瓶中加入一定體積的緩沖液溶解混勻，2-8°C保存待用。
試劑編號:2 試劑名稱:標(biāo)準(zhǔn)液
預(yù)處理方式:利用逐步梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)液，以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)抗體NIBSC97/550的濃度為橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
試劑編號:3A 試劑名稱:空白對照液 試劑編號:3B
試劑名稱:健康人血清對照液 預(yù)處理方式:2-8°C保存待用。
試劑編號:4
試劑名稱:蛋白A瓊脂糖
預(yù)處理方式:凍干粉，向每瓶中加入一定體積的緩沖液溶解混勻，2-8°C保存待用。
試劑編號:5
試劑名稱=Ranilla熒光底物 預(yù)處理方式:2-8°C保存待用。(2)加入20uL的病人血清、梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液、對照液于N只離心管中，并且設(shè)置N個(gè)試管作為平行組；
(3)向每只管中加入50uL的融合蛋白稀釋液，另外加兩只空管用來測熒光總強(qiáng)度；
(4)用漩渦振蕩器混勻每支管并蓋上蓋，不包括測總熒光強(qiáng)度空管；
(5)在室溫下，孵育5h，讓糖尿病自身抗體與抗原特異性結(jié)合；
(6)孵育之后，向每只管中加入50uL的蛋白A瓊脂糖，不包括測總熒光強(qiáng)度空管，來捕捉抗原抗體復(fù)合物；
(7)用漩渦振蕩器混勻每支管并蓋上蓋，不包括測總熒光強(qiáng)度空管；
(8)4°C緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過夜或室溫lh，使抗體與蛋白A瓊脂糖結(jié)合；
(9)孵育之后，向每只管中加入ImL的2 8°C冷藏的緩沖液，不包括測總熒光強(qiáng)度管，然后在4°C下1500rpm離心30min，將蛋白A瓊脂糖偶連的抗原-抗體復(fù)合物離心至管底；
(10)離心后，將上清小心吸去，沉淀用PBS將蛋白A瓊脂糖-抗原-抗體復(fù)合物懸起離心洗滌2 5次；
(11)然后向離心管中加入50uL Ranilla熒光底物，立即測定熒光強(qiáng)度；
(12)分析結(jié)果:
以標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為X軸，以結(jié)合率為Y軸做標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)患者血清的熒光強(qiáng)度，計(jì)算結(jié)合率，從曲線上讀取病人血清中自身抗體的濃度。結(jié)合率=(樣品測定值-3B測定值)/總熒光強(qiáng)度 抗體濃度=標(biāo)曲讀取值*相對倍數(shù)
陰性1.0 U/mL 陽性:> 1.0 U/mL
三種抗體只要有一種檢測為陽性，即可確定樣品含有糖尿病自身抗體，樣品來源人體患有I型糖尿病。按上述實(shí)施例分別對107位健康人和98位已經(jīng)診斷為I型糖尿病的患者的血清進(jìn)行檢測，其結(jié)果如下:
1: 107位健康人血清的檢測結(jié)果 抗體:GAD-65陰性率:100%
抗體:IA-2陰性率:99% 抗體:ΙΑ-2 β陰性率:99% 。2:98位I型糖尿病患者血清的檢測結(jié)果 抗體:GAD-65 陽性率:75%
抗體:IA-2 陽性率:53%
抗體:ΙΑ-2β 陽性率:56%。3:利用2005雙抗體固相法研究此方法，特異性和靈敏度結(jié)果如下: 此方法的特異性和靈敏度結(jié)果:
抗體:GAD-65 特異性(η=100):96% 靈敏度(η=50):87%
抗體:ΙΑ-2 特異性(η=100):100% 靈敏度(η=50):73%
抗體:ΙΑ-2β 特異性(η=100):98% 靈敏度(η=50):74%。
權(quán)利要求
1.一種檢測I型糖尿病自身免疫抗體試劑盒，其特征在于該試劑盒包含有:熒光素酶和糖尿病抗原的融合蛋白。
2.一種檢測I型糖尿病自身免疫抗體試劑盒，其特征在于該試劑盒包含有:熒光素酶-GAD65融合蛋白、熒光素酶-1A-2融合蛋白、熒光素酶-1A-2 β融合蛋白。
3.—種檢測I型糖尿病自身免疫抗體試劑盒,其特征在于該試劑盒包含有: 試劑1:1A:熒光素酶-GAD65融合蛋白， IB:熒光素酶-ΙΑ-2融合蛋白， IC:熒光素酶-ΙΑ-2β融合蛋白； 試劑2:標(biāo)準(zhǔn)液； 試劑3: 3Α:空白對照液， 3Β:健康人血清對照液； 試劑4:蛋白A瓊脂糖； 試劑5:Ranilla熒光底物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種檢測I型糖尿病自身免疫抗體試劑盒，其特征在于所述的試劑I的制備方法是:將Ranilla熒光基因與目的基因融合后轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中，然后在含有10%血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)36 60h，將收獲的細(xì)胞在冰浴中超聲處理15 30min，然后將細(xì)胞裂解液于4°C，以6000 8000rpm轉(zhuǎn)速離心15 45 min后取上清，得到融合蛋白，后分裝凍干成該試劑盒中的試劑I。
5.一種檢測I型糖尿病自身免疫抗體試劑盒的檢測方法，其特征在于該檢測方法的步驟是: 試劑盒: 試劑1:1A:熒光素酶-GAD65融合蛋白， IB:熒光素酶-1A-2融合蛋白， IC:熒光素酶-ΙΑ-2β融合蛋白； 試劑2:標(biāo)準(zhǔn)液； 試劑3: 3Α:空白對照液， 3Β:健康人血清對照液； 試劑4:蛋白A瓊脂糖； 試劑5 =Ranilla熒光底物； 實(shí)驗(yàn)之前，將試劑盒和緩沖液在室溫下放置至少30min ； (1)對試劑I用緩沖液進(jìn)行一定倍數(shù)的梯度稀釋，要保證抗原有一定的濃度，要求達(dá)到每微升中有IO7個(gè)熒光單位； (2)加入15 30uL的病人血清、梯度稀釋的試劑2標(biāo)準(zhǔn)液、健康人血清對照液于N只離心管中，并且設(shè)置N個(gè)試管作為 平行組(標(biāo)曲的濃度梯度可根據(jù)抗體的不同設(shè)定)； (3)向每只管中加入40 SOuL的試劑I稀釋液，另外加兩只空管用來測熒光總強(qiáng)度；(4)用漩渦振蕩器混勻每支管并蓋上蓋，不包括兩只測熒光總強(qiáng)度空管； (5)在室溫下，孵育3 5h，讓糖尿病自身抗體與抗原特異性結(jié)合； (6)孵育之后，向每只管中加入40 80uL的蛋白A瓊脂糖，不包括測總熒光強(qiáng)度空管，來捕捉抗原抗體復(fù)合物； (7)用漩渦振蕩器混勻每支管并蓋上蓋，不包括測總熒光強(qiáng)度空管； (8)于4°C緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過夜或于室溫緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物I 2h，使抗體與蛋白A瓊脂糖偶連， (9)孵育之后，向每只管中加入I 2mL的2 8°C冷藏的緩沖液，不包括測總熒光強(qiáng)度空管，然后在4°C下1500 3000rpm離心15 30min，將蛋白A瓊脂糖偶連的抗原-抗體復(fù)合物離心至管底； (10)離心后，將上清液小心吸去，沉淀用PBS將蛋白A瓊脂糖-抗原-抗體復(fù)合物懸起離心洗滌2 5次； (11)然后向離心管中加入50uL Ranilla熒光底物，立即測定熒光強(qiáng)度； (12)分析結(jié)果。
6.一種檢測I型糖尿病自身免疫抗體試劑盒的檢測方法，其特征在于該檢測方法的步驟是: (1)將Ranilla熒光基因與目的基因轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中，然后在含有10%血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)55h ;將收獲的 細(xì)胞在冰浴中超聲處理I min，然后將細(xì)胞裂解液于4°C，以6000 8000rpm轉(zhuǎn)速離心20 min后取上清,后分裝凍干成檢測試劑盒試劑I ; 試劑盒: 試劑1:1A:熒光素酶-GAD65融合蛋白， IB:熒光素酶-1A-2融合蛋白， IC:熒光素酶-ΙΑ-2β融合蛋白； 試劑2:標(biāo)準(zhǔn)液； 試劑3: 3Α:空白對照液， 3Β:健康人血清對照液； 試劑4:蛋白A瓊脂糖； 試劑5 =Ranilla熒光底物； (2)加入20uL的病人血清、梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液、對照液于N只離心管中，并且設(shè)置N個(gè)試管作為平行組； (3)向每只管中加入50uL的融合蛋白稀釋液，另外加兩只空管用來測熒光總強(qiáng)度； (4)用漩渦振蕩器混勻每支管并蓋上蓋，不包括測總熒光強(qiáng)度空管； (5)在室溫下，孵育5h，讓糖尿病自身抗體與抗原特異性結(jié)合； (6)孵育之后，向每只管中加入50uL的蛋白A瓊脂糖，不包括測總熒光強(qiáng)度空管，來捕捉抗原抗體復(fù)合物； (7)用漩渦振蕩器混勻每支管并蓋上蓋，不包括測總熒光強(qiáng)度空管； (8)4°C緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過夜或室溫lh，使抗體與蛋白A瓊脂糖結(jié)合；(9)孵育之后，向每只管中加入ImL的2 8°C冷藏的緩沖液，不包括測總熒光強(qiáng)度管，然后在4°C下1500rpm離心30min，將蛋白A瓊脂糖偶連的抗原-抗體復(fù)合物離心至管底； (10)離心后，將上清小心吸去，沉淀用PBS將蛋白A瓊脂糖-抗原-抗體復(fù)合物懸起離心洗滌2 5次； (11)然后向離心管中加入50uL Ranilla熒光底物，立即測定熒光強(qiáng)度； (12 )分析結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明提供一種檢測I型糖尿病自身免疫抗體試劑盒及其檢測方法，屬于生化醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明是利用293細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的一種熒光酶－抗原融合蛋白，可以與病人血清中的糖尿病自身抗體發(fā)生特異性結(jié)合。然后加入蛋白A瓊脂糖，沉淀融合蛋白-抗體復(fù)合物，離心后將未結(jié)合的融合蛋白從上清液中吸走。之后加入熒光素酶底物，利用熒光檢測儀檢測熒光強(qiáng)度，從而測定待測樣品中糖尿病自身抗體的含量。本發(fā)明使用微量熒光檢測儀檢測，與傳統(tǒng)的HPLC相比，操作簡單，無需開蓋堵截污染途徑，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠和操作人員安全，達(dá)到微量省試劑的要求，并且高靈敏度、高信噪比，測量值穩(wěn)定可靠。
文檔編號G01N33/68GK103116030SQ20131003556
公開日2013年5月22日 申請日期2013年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月30日
發(fā)明者崔泰興, 唐東起, 李世武, 吳琦, 蘇紅霞, 葛瑞蕾 申請人:山東東興生物科技股份有限公司