使用icos基cars增強抗腫瘤活性和car持久性的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供用于治療人中癌癥的組合物和方法。本發(fā)明包括施用基因修飾的Th17細胞以表達CAR，其具有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和ICOS細胞內(nèi)信號傳導結(jié)構(gòu)域。
【專利說明】使用I COS基CARS增強抗腫瘤活性和CAR持久性
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年2月22日提交的美國臨時申請系列號61/601，910的優(yōu)先權(quán)， 其內(nèi)容通過引用以它們的整體并入本文。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 基因修飾的表達嵌合抗原受體（CAR)的T細胞的開發(fā)已經(jīng)為許多新的用于癌癥和 其他病癥的潛在的療法找到了出路。一般而言，CARs包括細胞外抗原識別結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi) 結(jié)構(gòu)域。細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域精確的組成可為CAR和表達CAR的細胞群體提供獨特的特征。
[0005] ⑶278或可誘導的-T-細胞共刺激分子（IC0S)是一般在活化的T細胞上表達的共 刺激分子。已經(jīng)顯示，除了⑶28,經(jīng)可誘導的共刺激分子（IC0S，也稱為⑶278)的信號傳導 對于最佳的細胞因子分泌是必要的，因為兩種分子對于通過鼠 Thl7細胞的最佳的IL-17A 分泌是必須的（Park等，2005Nat. Immunol. 6:1133 - 1141)。最近鼠模型中的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)揭示 IC0S通過誘導轉(zhuǎn)錄因子c-MAF表達和所以反式激活I(lǐng)L-21產(chǎn)生而放大Thl7反應（Bauquet 等，2009Nat. Immunol. 10:167 - 175)。盡管已經(jīng)產(chǎn)生了包括IC0S的嵌合受體（美國專利出 版US2006/0247191)，但是不知道IC0S結(jié)構(gòu)域在影響CAR介導的抗腫瘤活性，CAR介導的 Treg增殖，或T細胞持久性中起什么作用。
[0006] 取決于存在的微環(huán)境線索，天然CD4+T細胞可分化成數(shù)種T輔助（TH)細胞系，包括 THl、TH2、Thl7、TH22 之一和調(diào)節(jié) T (Treg)細胞（O' Shea 等，2010Science327:1098 - 1102; Murphy等，2010Nat. Immunol. 11:674 - 680)。加強宿主防御的Thl7細胞在粘膜免疫性中 起主要作用，增強許多自身免疫病，并且釋放細胞因子，包括IL-17A和IL-17F(Korn等， 2009Annu. Rev. Immunol. 27:485 - 517)。Thl7細胞對腫瘤免疫性的貢獻不同，顯示對抗腫 瘤發(fā)生和原致癌性活性二者的潛能（Zou等，2010Nat. Rev. Immunol. 10:248 - 256)。所以， 識別控制Thl7應答的機制對于理解腫瘤免疫性是至關(guān)重要的。盡管最近在用于治療癌癥 的CAR基療法中取得了進展，但是現(xiàn)在已經(jīng)有了任何已知的使用遺傳改變的Thl7細胞的療 法。
[0007] 因此，本領(lǐng)域非常需要使用增加遺傳改變的Thl7細胞抗腫瘤活性和持久性的CAR 治療癌癥的組合物和方法。本發(fā)明解決了該需求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供編碼嵌合抗原受體（CAR)的分離的核酸序列，其中CAR包括抗原結(jié)合 結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和IC0S細胞內(nèi)信號傳導結(jié)構(gòu)域。
[0009] 在一個實施方式中，CAR的核酸序列進一步包括⑶3 ζ信號傳導結(jié)構(gòu)域。
[0010] 在一個實施方式中，分離的CAR的核酸序列包括SEQ ID Ν0:8的核酸序列。
[0011] 在一個實施方式中，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是抗體或其抗原結(jié)合片段。
[0012] 在一個實施方式中，抗原結(jié)合片段是Fab或scFv。
[0013] 在一個實施方式中，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合腫瘤抗原。在一個實施方式中，腫瘤抗原 與血液惡性腫瘤相關(guān)。在一個實施方式中，腫瘤抗原與實體瘤相關(guān)。
[0014] 在一個實施方式中，腫瘤抗原選自⑶19、⑶20、⑶22、R0R1、間皮蛋白、⑶33/IL3Ra、 c-Met、PSMA、糖脂 F77、EGFRvIII、⑶-2、NY-ES0-1TCR、MAGE A3TCR，和其任意組合。
[0015] 在一個實施方式中，CAR的核酸序列進一步包括包含共刺激分子的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域 的共刺激信號傳導區(qū)，所述共刺激分子選自CD27、CD28、4-1BB、0X40、CD30、CD40、PD-1、淋 巴細胞功能相關(guān)抗原-1 (LFA-1)、⑶2、⑶7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特異性結(jié)合⑶83的配體， 和其任意組合。
[0016] 在一個實施方式中，IC0S細胞內(nèi)信號傳導結(jié)構(gòu)域由SEQ ID N0:6的核酸序列編碼。
[0017] 在一個實施方式中，⑶3 ζ信號傳導結(jié)構(gòu)域由SEQ ID N0:7的核酸序列編碼。
[0018] 本發(fā)明也提供載體，其包括編碼嵌合抗原受體（CAR)的核酸序列，其中CAR包括抗 原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和IC0S細胞內(nèi)信號傳導結(jié)構(gòu)域。
[0019] 本發(fā)明也提供細胞，其包括編碼嵌合抗原受體（CAR)的核酸序列，其中CAR包括抗 原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和IC0S細胞內(nèi)信號傳導結(jié)構(gòu)域。
[0020] 本發(fā)明也提供用于哺乳動物中刺激T細胞介導的對靶細胞群體或組織的免疫應 答的方法，所述方法包括向哺乳動物施用有效量的基因修飾以表達CAR的細胞，其中CAR包 括抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和IC0S細胞內(nèi)信號傳導結(jié)構(gòu)域。
[0021] 本發(fā)明也提供哺乳動物中提供抗腫瘤免疫性的方法，所述方法包括向哺乳動物施 用有效量的基因修飾以表達CAR的細胞，其中CAR包括抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和IC0S 細胞內(nèi)信號傳導結(jié)構(gòu)域，從而在哺乳動物中提供抗腫瘤免疫性。
[0022] 本發(fā)明也提供治療具有與升高的腫瘤抗原表達相關(guān)的疾病、病癥或狀況的哺乳動 物的方法，所述方法包括向哺乳動物施用有效量的基因修飾以表達CAR的細胞，其中CAR包 括抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和IC0S細胞內(nèi)信號傳導結(jié)構(gòu)域，從而治療哺乳動物。
[0023] 在一個實施方式中，細胞選自自體Thl7細胞和自體Tcl7細胞。
[0024] 本發(fā)明也提供治療具有癌癥的人的方法，所述方法包括向人施用基因改造的表達 CAR的細胞，其中CAR包括抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和IC0S細胞內(nèi)信號傳導結(jié)構(gòu)域，其 中細胞選自Thl7細胞和Tcl7細胞。
[0025] 在一個實施方式中，人抵抗至少一種化療劑。
[0026] 本發(fā)明也提供在診斷有癌癥的人中產(chǎn)生基因改造的T細胞的持續(xù)性群體的方法， 所述方法包括向人施用基因改造的表達CAR的細胞，其中CAR包括抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié) 構(gòu)域和IC0S細胞內(nèi)信號傳導結(jié)構(gòu)域，其中基因改造的細胞的持續(xù)性群體在施用之后在人 中持續(xù)至少一個月，和其中細胞選自Thl7細胞和Tcl7細胞。
[0027] 在一個實施方式中，基因改造的T細胞的持續(xù)性群體包括選自下述的至少一種細 胞：施用至人的細胞、施用至人的細胞的子代，和其組合。
[0028] 在一個實施方式中，基因改造的T細胞的持續(xù)性群體包括記憶T細胞。
[0029] 在一個實施方式中，基因改造的T細胞的持續(xù)性群體在施用之后在人中持續(xù)至少 三個月。
[0030] 在一個實施方式中，基因改造的T細胞的持續(xù)性群體在施用之后在人中持續(xù)至少 四個月、五個月、六個月、七個月、八個月、九個月、十個月、i^一個月、十二個月、兩年或三 年。
[0031] 本發(fā)明也提供在診斷有癌癥的人中擴張基因改造的T細胞群體的方法，所述方法 包括向人施用基因改造的表達CAR的細胞，其中CAR包括抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和 ICOS細胞內(nèi)信號傳導結(jié)構(gòu)域，其中施用的基因改造的細胞選自Thl7細胞和Tcl7細胞，進一 步其中施用的基因改造的細胞在人中產(chǎn)生子代T細胞的群體。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0032] 當與附圖結(jié)合閱讀時，將更好地理解本發(fā)明的優(yōu)選實施方式的以下詳細描述。為 了說明本發(fā)明的目的，在附圖中顯示了目前優(yōu)選的實施方式。然而，應當理解本發(fā)明不限于 附圖顯示的實施方式的精確布置和手段。
[0033] 圖1描繪SSl-ICOS-z的核苷酸序列。含有SSl-ICOS-z CAR的cDNA序列克隆進 入第三代慢病毒載體并且在EF-1啟動子（SEQ ID N0:16)的控制下表達。SSl-ICOS-z含有 CD8前導序列、識別人間皮蛋白的SS1單鏈片段、CD8 α鏈的鉸鏈區(qū)、IC0S跨膜和細胞內(nèi)結(jié) 構(gòu)域和TCR-z信號轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域。
[0034] 圖2,包括圖2Α和圖2Β，描繪改變的Thl7細胞的產(chǎn)生。圖2Α描繪含有SS1單鏈 片段和不同細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的一組嵌合受體的示意性表示。新穎性IC0S基CAR含有與IC0S 細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域串聯(lián)的TCR-ζ信號轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域。圖2B描繪評估SSlscFv融合蛋白在人初 級CD4+T細胞上表達的流式細胞術(shù)試驗的結(jié)果，歸一化為針對所有受體的60%嵌合受體表 達。
[0035] 圖3描繪實施例實驗的結(jié)果，表明IC0S基CAR改變的Thl7細胞釋放大量的 IL17-A、IL-17F和CCL20但是少量的IL-2。Thl7細胞（4X 105,60 %嵌合受體陽性）與 2 X 105K562meso細胞在沒有Thl7極化細胞因子或IL-2的培養(yǎng)基中共培養(yǎng)。共培養(yǎng)24h之 后獲得上清液，并且通過ELISA分析細胞因子產(chǎn)生。誤差棒指示三重樣品的標準偏差（SD)。 三個實驗的代表。
[0036] 圖4描繪實施例實驗的結(jié)果，表明IC0S通過人Thl7細胞加強IL-17A產(chǎn)生。來自 5個不同正常供體的T H17細胞（4X 105,60%嵌合受體陽性）與2X105K562meso細胞在沒 有Thl7極化細胞因子或IL-2的培養(yǎng)基上共培養(yǎng)。共培養(yǎng)24h之后獲得上清液，并且通過 ELISA分析IL-17A產(chǎn)生。
[0037] 圖5,包括圖5A至圖5C，描繪實施例實驗的結(jié)果，表明IC0S基CAR改變的Thl7細 胞在腫瘤細胞中抗原識別之后釋放大量的IL17-A和IFNY但是少量的IL-2。Thl7細胞 (4\ 105,60%嵌合受體陽性）與2父1051(562、1(56211168〇或指示的腫瘤細胞在沒有11117極 化細胞因子或IL-2的培養(yǎng)基中共培養(yǎng)。共培養(yǎng)24h之后獲得上清液，并且通過ELISA分析 (A) IL-17A、⑶IL-2和（C) IFN γ。誤差棒指示兩個樣品的標準偏差（SD)。
[0038] 圖6,包括圖6A和圖6B，描繪實施例實驗的結(jié)果，其評估嵌合受體改變的Thl7/ Tcl7細胞的溶細胞活性。Tcl7和Thl7細胞的混合物（以4:1的比）與用CFSE染色的L55 靶細胞以指示的效應子-靶（E:T)比例共培養(yǎng)4h。圖6A圖解特異性細胞溶解，如使用流式 細胞術(shù)基試驗確定。圖6B描繪ED50,如對于每個組使用四參數(shù)邏輯回歸模型確定。四個實 驗的代表。
[0039] 圖7,包括圖7A和圖7B，描繪實施例實驗的結(jié)果，表明用IC0S基CAR改變的Thl7/ Tcl7細胞根除大的預先建立的腫瘤并且顯示增強的體內(nèi)持久性。在NSG小鼠的腰窩中建立 人初級M108腫瘤。8周之后，當腫瘤達到體積為500mm 3時，小鼠用在61和67天的2個瘤 內(nèi)注射10X 106個Thl7/Tcl7細胞（80% /60%嵌合受體-陽性）或PBS治療。圖7A描繪 平均腫瘤體積（+/-SEM)，所有組n = 9。在通過心臟內(nèi)穿刺T細胞注入之后51天獲得來自 用改變的Thl7/Tcl7細胞瘤內(nèi)注射治療的負載M108的NSG小鼠的外周血。圖7B圖解通過 FACS Trucount試驗存在的人⑶4+和⑶8+T細胞的定量。結(jié)果表達為每μ L外周血的平均 絕對Τ-細胞計數(shù)+/-SD (所有組η = 9)。
[0040] 圖8,包括圖8Α至8D，表明用ICOSz改變的ΤΗ17細胞顯示增加 CD161的表達。改 變的ΤΗ17細胞與照射的表達間皮蛋白的APC共培養(yǎng)。圖8Α和8Β描繪通過流式細胞術(shù)在 指示的時間點分析通過CAR+CD4+T細胞應答間皮蛋白特異性刺激的CD161表達。圖8C描繪 在第8天在數(shù)個不同的正常供體（η = 9)中表達⑶161的CAR+⑶4+Τ細胞的百分數(shù)被繪制。 圖8D描繪在第8天CAR+和CAR-細胞中的⑶161表達。誤差棒表示SEM(5個不同的正常 供體）。
[0041] 圖9,包括圖9A和圖9B，描繪使用包括其他共刺激結(jié)構(gòu)域組合的CAR的實施 例實驗的結(jié)果。圖9A描繪IC0S基CAR，其含有TCR-ζ信號轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域，以及IC0S和 CD137(4-1BB)共刺激結(jié)構(gòu)域三者。圖9B描繪下述圖，其圖解并入CD137信號傳導結(jié)構(gòu)域 以及IC0S不改變用僅僅含有IC0S共刺激結(jié)構(gòu)域的CAR改變的Thl7細胞的細胞因子曲 線。11117細胞（4\ 105,60%嵌合受體陽性）與2\ 1051(562、1(56211168〇或指示的腫瘤細胞在 沒有外源性細胞因子的情況下共培養(yǎng)。共培養(yǎng)24h之后獲得上清液，并且通過ELISA分析 IL-17A、IL-2和IFNY。誤差棒指示兩個樣品中的標準偏差（SD)。
[0042] 圖10,包括圖10A至10C，是一系列圖像，表明ICOSz改變的TH17細胞顯示增加的 TH17相關(guān)的基因表達。改變的TH17細胞用源自固定的酵母的重組體間皮蛋白刺激?；?表達水平在刺激之前第0天并且抗原識別后4h、8h、24h和96h測定。圖10A描繪選擇的差 別表達的基因的歸一化的Log2表達（FC>2, FDR〈0. 05)。誤差棒表示SEM(3個不同的正常 供體）。圖10B描繪T輔助簽名基因在4h相對于Oh的表達的log2倍變化的熱圖。圖3C 描繪精巧通路富集的熱圖（IPA，p〈0.01)。

【具體實施方式】
[0043] 本發(fā)明涉及組合物和方法用于治療癌癥，包括但不限于血液學惡性腫瘤和實體 瘤。本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)導表達嵌合抗原受體（CAR)的Thl7細胞的過繼細胞轉(zhuǎn)移的策略。CAR是 結(jié)合基于抗體的針對期望的抗原（例如，腫瘤抗原）的特異性與T細胞受體-激活細胞內(nèi) 結(jié)構(gòu)域以產(chǎn)生展示特異性抗腫瘤細胞免疫活性的嵌合蛋白的分子。
[0044] 本發(fā)明一般涉及基因修飾以表達期望的CAR的T細胞的使用。表達CAR的T細胞 本文稱為CAR T細胞或CAR修飾的T細胞。優(yōu)選地，細胞可被基因修飾以在其表面上表達 抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，賦予不依賴MHC的新型抗原特異性。在一些情況下，T細胞被基因修飾以 表達CAR，其將特異性抗體的抗原識別結(jié)構(gòu)域與CD3- ζ鏈或Fc γ RI蛋白質(zhì)的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域 結(jié)合為單個嵌合蛋白。
[0045] 在一個實施方式中，本發(fā)明的CAR包括具有抗原識別結(jié)構(gòu)域的細胞外結(jié)構(gòu)域、跨 膜結(jié)構(gòu)域和細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在一個實施方式中，使用天然與CAR中的結(jié)構(gòu)域之一相關(guān)聯(lián)的 跨膜結(jié)構(gòu)域。在另一實施方式中，跨膜結(jié)構(gòu)域可被選擇或通過氨基酸取代修飾，以避免此類 結(jié)構(gòu)域與相同的或不同的表面膜蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域的結(jié)合以使得與受體復合物的其他 成員的相互作用最小化。在一些實施方式中，細胞外結(jié)構(gòu)域也包括鉸鏈結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，鉸 鏈結(jié)構(gòu)域包括⑶8 α鉸鏈結(jié)構(gòu)域。
[0046] 就細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域而言，本發(fā)明的CAR可設計為本身包括IC0S信號傳導結(jié)構(gòu)域或與 用于本發(fā)明的CAR背景的任何其他期望的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域（一個或多個）結(jié)合。在一個實施 方式中，CAR的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域可設計為進一步包括⑶3- ζ、4-1ΒΒ和/或⑶28的信號傳導 結(jié)構(gòu)域。例如，CAR的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域可包括但不限于IC0S、⑶3- ζ、4-1ΒΒ和⑶28信號傳導 組件和其組合。因此，本發(fā)明提供CAR T細胞和它們用于過繼性療法的方法。
[0047] 在一個實施方式中，本發(fā)明的CAR T細胞可通過將包括期望的CAR的慢病毒載體 引入細胞產(chǎn)生，所述CAR是例如包括抗間皮蛋白、⑶8 α鉸鏈、IC0S跨膜結(jié)構(gòu)域和人IC0S和 CD3(信號傳導結(jié)構(gòu)域的CAR。在一個實施方式中，本發(fā)明的CAR Τ細胞能夠在體內(nèi)復制產(chǎn) 生可導致持續(xù)的腫瘤控制的長期持久性。
[0048] 在另一實施方式中，本發(fā)明的CAR T細胞可通過將編碼期望的CAR的RNA轉(zhuǎn)染進 入細胞產(chǎn)生，所述CAR是例如包括抗間皮蛋白、⑶8 α鉸鏈、IC0S跨膜結(jié)構(gòu)域和人IC0S和 CD3 4信號傳導結(jié)構(gòu)域的CAR。在一個實施方式中，CAR在基因修飾的CAR Τ細胞中瞬時表 達。
[0049] 在一個實施方式中，本發(fā)明涉及施用基因修飾的表達CAR的T細胞用于使用淋巴 細胞注入治療具有癌癥或處在具有癌癥風險的患者。優(yōu)選地，自體淋巴細胞注入用于治療。 自體PBMCs收集自需要治療的患者并且使用本文所述的和本領(lǐng)域已知的方法將T細胞活化 和擴張并且然后注入回到患者。
[0050] 在一個實施方式中，本發(fā)明涉及基因修飾的表達CAR的Thl7細胞用于治療具有癌 癥的患者。本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)IC0S信號傳導結(jié)構(gòu)域包括在CAR的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中增加 Thl7 持久性，增加 IL-17產(chǎn)生，增加 Thl7細胞的抗腫瘤活性，并且減少IL-2產(chǎn)生。在一個實施 方式中，減少表達含有CAR的IC0S的Thl7細胞產(chǎn)生的IL-2減少免疫抑制Treg細胞的增 殖。
[0051] 在仍另一實施方式中，本發(fā)明一般涉及治療處在發(fā)展癌癥風險的患者。本發(fā)明也 包括治療惡性腫瘤或自身免疫病，其中化療和/或免疫療法在患者中導致顯著的患者的免 疫抑制，從而增加患者發(fā)展癌癥的風險。
[0052] 本發(fā)明包括使用表達抗間皮蛋白CAR，包括⑶3- ζ和IC0S共刺激結(jié)構(gòu)域的Thl7 細胞（也稱為表達CAR的Thl7細胞）。在一個實施方式中，本發(fā)明表達CAR的Thl7細胞可 經(jīng)歷強勁的體內(nèi)擴張并且可建立抗原特異性記憶細胞，其以高水平在血液和骨髓中持續(xù)延 長的時間量。在一些情況下，注入患者的本發(fā)明表達CAR的Thl7細胞可消除具有某種形式 癌癥的患者體內(nèi)的癌細胞。但是，本發(fā)明不限于表達CAR的Thl7細胞。而是，本發(fā)明包括 與一個或多個細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合的任何抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域選自IC0S信 號傳導結(jié)構(gòu)域、CD137(4-1BB)信號傳導結(jié)構(gòu)域、CD28信號傳導結(jié)構(gòu)域、CD3(信號結(jié)構(gòu)域， 和其任意組合。
[0053] 定義
[0054] 除非另有定義，本文使用的所有的技術(shù)和科學術(shù)語具有與本發(fā)明涉及領(lǐng)域的技術(shù) 人員通常理解的相同的含義。盡管可在測試本發(fā)明的實踐中使用類似于或等于本文描述的 那些的任何方法和物質(zhì)，但優(yōu)選的材料和方法在本文中進行描述。在描述和要求保護本發(fā) 明中，將使用以下術(shù)語。
[0055] 也應理解本文使用的術(shù)語僅是為了描述【具體實施方式】的目的，并不意欲是限制性 的。
[0056] 本文使用冠詞"一個（a) "和"一個（an) "，指的是該冠詞語法對象的一個或多于一 個（即，指的是至少一個）。以例子說明，"一個元件"表示一個元件或多于一個的元件。
[0057] 如本文使用的"大約"，當指的是可測量的值諸如量、時間期間等時，表示包括從給 定值± 20 %或± 10 %的變化，更優(yōu)選± 5 %，甚至更優(yōu)選± 1 %，和還要更優(yōu)選± 0. 1 %的變 化，只要這種變化適于實施公開的方法。
[0058] "活化"，如本文所用的，指的是已經(jīng)被充分刺激以誘導可檢測的細胞增殖的T細胞 的狀態(tài)?；罨部膳c誘導的細胞因子產(chǎn)生和可檢測的效應子功能相關(guān)。術(shù)語"活化的T細 胞"等指的是經(jīng)歷細胞分裂的T細胞。
[0059] 術(shù)語"抗體"，如本文所用的，指的是與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白分子。抗 體可為源于自然源或源于重組源的完整的免疫球蛋白，并可為完整免疫球蛋白的免疫 反應部分。抗體通常為免疫球蛋白分子的四聚物。本發(fā)明中的抗體可以以多種形式存 在，包括例如，多克隆抗體、單克隆抗體、Fv、Fab和F(ab) 2，以及單鏈抗體和人源化抗體 (Harlow 等，1999,In:Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY ；Harlow 等，1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor, New York ;Houston 等，1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:5879-5883 ;Bird 等，1988, Science242:423-426)。
[0060] 術(shù)語"抗體片段"指的是完整抗體的一部分，并指的是完整抗體的抗原決定可變 區(qū)。抗體片段的例子包括但不限于Fab、Fab'、F(ab'） 2和Fv片段，由抗體片段形成的線性 抗體、scFv抗體和多特異性抗體。
[0061] "抗體重鏈"，如本文所用的，指的是以它們自然發(fā)生構(gòu)象存在于所有抗體分子的 兩種類型的多肽鏈中較大的鏈。
[0062] "抗體輕鏈"，如本文所用的，指的是以它們自然發(fā)生構(gòu)象存在于所有抗體分子的 兩種類型的多肽鏈中較小的鏈，κ和λ輕鏈指的是兩種主要的抗體輕鏈同種型。
[0063] 如本文所用的，術(shù)語"合成抗體"，指利用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的抗體，諸如例如，由 如本文所述的噬菌體表達的抗體。該術(shù)語也應當被解釋為指已經(jīng)由DNA分子的合成產(chǎn)生的 抗體，所述DNA分子編碼抗體并且該DNA分子表達抗體蛋白或規(guī)定抗體的氨基酸序列，其中 DNA或氨基酸序列已經(jīng)利用本領(lǐng)域可用和公知的合成DNA或氨基酸序列技術(shù)獲得。
[0064] 如本文所用的，術(shù)語"抗原"或"Ag"被定義為激發(fā)免疫應答的分子。該免疫應答可 涉及抗體產(chǎn)生，或特異性免疫活性細胞的活化，或兩者。技術(shù)人員將理解任何大分子--實 際上包括所有的蛋白質(zhì)或肽，可用作抗原。此外，抗原可源自重組或基因組DNA。技術(shù)人員 將理解任何DNA--其包括編碼引起免疫應答的蛋白質(zhì)的核苷酸序列或部分核苷酸序列， 因此編碼如本文使用的術(shù)語"抗原"。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解抗原不必單獨地由基因 的全長核苷酸序列編碼。容易顯而易見的是本發(fā)明包括但不限于，多于一個的基因的部分 核苷酸序列的用途，并且這些核苷酸序列以不同的組合進行布置，以引起期望的免疫應答。 此外，技術(shù)人員將理解抗原根本不必由"基因"進行編碼。容易顯而易見的是抗原可被產(chǎn)生、 合成或可源自生物學樣本。這種生物學樣本可包括但不限于組織樣本、腫瘤樣本、細胞或生 物學流體。
[0065] 如本文所用的，術(shù)語"抗腫瘤效應"，指的是生物學效應，其可由腫瘤體積的減少、 腫瘤細胞數(shù)的減少、轉(zhuǎn)移數(shù)的減少、預期壽命的增加或與癌性狀況相關(guān)的各種生理癥狀的 改善清楚表示。"抗腫瘤效應"也可由本發(fā)明的肽、多核苷酸、細胞和抗體在預防腫瘤在第一 位置發(fā)生的能力清楚表示。
[0066] 根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"自體抗原"指由免疫系統(tǒng)錯誤識別為外源（foreign)的任何自 身抗原。自體抗原包括但不限于細胞蛋白、磷蛋白、細胞表面蛋白、細胞脂質(zhì)、核酸、糖蛋白， 包括細胞表面受體。
[0067] 如本文所用的，術(shù)語"自身免疫疾病"被定義為由自身免疫應答產(chǎn)生的病癥。自體 免疫疾病是對自身抗原的不適當和過度應答的結(jié)果。自身免疫疾病的例子包括但不限于阿 狄森氏疾病、斑禿、強直性脊柱炎、自身免疫肝炎、自身免疫腮腺炎、克羅恩氏疾病、糖尿病 (1型）、營養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥、附睪炎、腎小球性腎炎、格雷夫斯氏疾病、吉蘭-巴 雷綜合征、橋本氏疾病、溶血性貧血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、尋常型 天皰瘡、牛皮癬、風濕熱、類風濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、硬皮病、斯耶格倫氏綜合征、脊椎關(guān)節(jié)病 變、甲狀腺炎、血管炎、白癜風、粘液性水腫、惡性貧血、潰瘍性結(jié)腸炎等等。
[0068] 如本文所用的，術(shù)語"自體"指關(guān)于源自相同個體的任何物質(zhì)，它隨后被再次引入 該個體。
[0069] "同種異基因的（allogeneic) "指的是源自相同物種的不同動物的移植物。
[0070] "異種的（xenogeneic) "指的是源自不同物種的動物的移植物。
[0071] 如本文所用的，術(shù)語"癌癥"被定義為以畸變細胞的快速和失控生長為特征的疾 病。癌細胞可局部蔓延或通過血流和淋巴系統(tǒng)蔓延至身體的其他部分。各種癌癥的例子包 括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、皮膚癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、腎癌、肝癌、 腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等等。
[0072] 如本文使用的術(shù)語"共刺激配體"包括特異性結(jié)合T細胞上的關(guān)聯(lián)（cognate)共 刺激分子的抗原呈遞細胞（例如，aAPC、樹突細胞、B細胞等等）上的分子，由此除了通過 例如將TCR/CD3復合物與用肽負載的MHC分子結(jié)合提供的初級信號之外，還提供介導T細 胞應答的信號，所述T細胞應答包括但不限于增殖、活化、分化等等。共刺激配體可包括但 不限于 CD7、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、0X40L、可誘導的共刺激配體 (IC0S-L)、細胞間粘附分子（ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋 巴毒素 β受體、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、結(jié)合Toll配體受體的激動劑或抗體和與B7-H3 特異性結(jié)合的配體。共刺激配體也包括，特別是與存在于T細胞上的共刺激分子特異性結(jié) 合的抗體，和與⑶83特異性結(jié)合的配體，所述共刺激分子諸如但不限于⑶27、⑶28、4-1ΒΒ、 0X40、CD30、CD40、PD-1、IC0S、淋巴細胞功能相關(guān)抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、 B7-H3。
[0073] "共刺激分子"指的是與共刺激配體特異性結(jié)合的T細胞上的關(guān)聯(lián)結(jié)合伴侶，由此 介導T細胞的共刺激應答，諸如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于MHCI類分子、BTLA 和Toll配體受體。
[0074] 如本文所用的，"共刺激信號"指的是與初級信號結(jié)合，諸如TCR/CD3連接作用，導 致T細胞增殖和/或關(guān)鍵分子的上調(diào)或下調(diào)的信號。
[0075] "疾病"是動物的一種健康狀態(tài)，其中動物不能保持穩(wěn)態(tài)，和其中如果不改善該疾 病，則動物的健康繼續(xù)惡化。與之相比，動物中的"病癥"是一種健康狀態(tài)，其中動物能夠保 持穩(wěn)態(tài)，但其中動物的健康狀態(tài)與它沒有處于該病癥相比不太有利。保持不治療，病癥不必 定引起動物健康狀態(tài)的進一步降低。
[0076] 如本文所用的，"有效量"，指提供治療性或預防性益處的量。
[0077] "編碼"指的是多核苷酸諸如基因、cDNA或mRNA中核苷酸的特異性序列用作模板 合成在生物學過程中的其他多聚體和大分子的固有性質(zhì)，所述多聚體和大分子具有核苷酸 (即，rRNA、tRNA和mRNA)的限定序列或氨基酸的限定序列中的任一個和由其產(chǎn)生的生物學 性質(zhì)。因此，如果相應于那個基因的mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯在細胞或其他生物學系統(tǒng)中產(chǎn)生蛋 白質(zhì)，則基因編碼蛋白質(zhì)。核苷酸序列等同mRNA序列并通常提供在序列表中的編碼鏈，和 用作轉(zhuǎn)錄基因或cDNA的模板的非編碼鏈兩者，都可被稱為編碼那個基因或cDNA的蛋白質(zhì) 或其他產(chǎn)物。
[0078] 如本文所用的，"內(nèi)源的"指的是來自有機體、細胞、組織或系統(tǒng)的或在有機體、細 胞、組織或系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)生的任何物質(zhì)。
[0079] 如本文所用的，術(shù)語"外源的"指的是任何從有機體、細胞、組織或系統(tǒng)引入的或在 有機體、細胞、組織或系統(tǒng)外產(chǎn)生的物質(zhì)。
[0080] 如本文所用的，術(shù)語"表達"被定義為由它的啟動子驅(qū)動的特定核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄 和/或翻譯。
[0081] "表達載體"指的是包括重組多核苷酸的載體，所述重組多核苷酸包括可操作地連 接至待表達的核苷酸序列的表達控制序列。表達載體包括足夠的用于表達的順式作用元 件；用于表達的其他元件可由宿主細胞供應或在體外表達系統(tǒng)中供應。表達載體包括所有 本領(lǐng)域已知的那些，諸如并入重組多核苷酸的粘粒、質(zhì)粒（例如，裸露或包含在脂質(zhì)體中） 和病毒（例如，慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒）。
[0082] "同源的"指的是兩個多肽之間或兩個核酸分子之間的序列相似性或序列同一性。 當兩個比較序列中的位置被相同的堿基或氨基酸單體亞單元占據(jù)時，例如，如果兩個DNA 分子的每一個中的位置被腺嘌呤占據(jù)，則所述分子在那個位置上是同源的。兩個序列之間 的同源性百分比為由兩個序列共有的匹配或同源的位置數(shù)除以比較的位置數(shù)X100的函 數(shù)。例如，如果兩個序列中10個位置中的6個是匹配或同源的，則兩個序列是60%同源的。 以例子說明，DNA序列ATTGCC和TATGGC享有50 %的同源性。通常，當比對兩個序列以給出 最大同源性時，進行比較。
[0083] 如本文所用的，術(shù)語"免疫球蛋白"或"Ig"被定義為起到抗體作用的一類蛋白質(zhì)。 由B細胞表達的抗體有時被稱為BCR(B細胞受體）或抗原受體。包括在該類蛋白質(zhì)中的五 個成員為IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA為存在于身體分泌物諸如唾液、淚液、母乳、胃腸 分泌物和呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物中的初級抗體。IgG是最常見的循環(huán)抗體。IgM 是在多數(shù)對象的初級免疫應答中產(chǎn)生的主要免疫球蛋白。它在凝集反應、補體結(jié)合和其他 抗體應答中是最有效的免疫球蛋白，并且在抵御細菌和病毒方面是很重要的。IgD是不具有 已知抗體功能的免疫球蛋白，但可用作抗原受體。IgE是在暴露于過敏原后，通過引起從肥 大細胞和嗜堿性粒細胞釋放介體，介導速發(fā)過敏性的免疫球蛋白。
[0084] 如本文所用的，"指導物質(zhì)"包括出版物、記錄、圖表或任何其他可用于傳達本發(fā)明 組合物和方法的有用性的表達媒介。本發(fā)明的試劑盒的指導物質(zhì)可例如被附加在包含本發(fā) 明的核酸、肽和/或組合物的容器上，或與包含核酸、肽和/或組合物的容器一起運送。可 選地，指導物質(zhì)可與容器分開地運送，目的是指導物質(zhì)和化合物由接受者配合使用。
[0085] "分離的"指從自然狀態(tài)改變或移出。例如，天然存在于活動物中的核酸或肽不是 "分離的"，但部分或完全與它的自然狀態(tài)的共存物質(zhì)分離的同一核酸或肽是"分離的"。分 離的核酸或蛋白可以以基本上純化的形式存在，或例如，可存在于非自然環(huán)境，諸如宿主細 胞。
[0086] 在本發(fā)明的內(nèi)容中，對于通常發(fā)生的核酸堿基使用以下縮寫。"A"指的是腺苷，"C" 指的是胞嘧啶，"G"指的是鳥苷，"T"指的是胸苷，和"U"指的是尿苷。
[0087] 除非另有規(guī)定，"編碼氨基酸序列的核苷酸序列"包括為彼此簡并版本并編碼相同 的氨基酸序列的所有核苷酸序列。短語編碼蛋白質(zhì)或RNA的核苷酸序列也可包括內(nèi)含子， 其程度為編碼該蛋白質(zhì)的核苷酸序列可在某些版本中包含內(nèi)含子（一個或多個）。
[0088] 如本文所用的，"慢病毒"指的是逆轉(zhuǎn)錄病毒科的屬。在逆轉(zhuǎn)錄病毒中慢病毒是唯 一能夠感染非分裂細胞的；它們可傳遞顯著量的遺傳信息進入宿主細胞的DNA，所以它們 是基因傳遞載體的最有效的方法之一。HIV、S1V和FIV都是慢病毒的例子。源自慢病毒的 載體提供了完成顯著水平基因體內(nèi)轉(zhuǎn)移的工具。
[0089] 如本文所用的，術(shù)語"調(diào)節(jié)"指與缺少治療或化合物的對象中的應答水平相比，和/ 或與以其他方式相同但未治療的對象中的應答水平相比，介導對象中應答水平的可檢測的 增加或減少。該術(shù)語包括擾亂和/或影響天然信號或應答，由此介導對象優(yōu)選人的有益的 治療性應答。
[0090] 除非另有規(guī)定，"編碼氨基酸序列的核苷酸序列"包括為彼此簡并版本并編碼相同 的氨基酸序列的所有核苷酸序列。編碼蛋白質(zhì)和RNA的核苷酸序列可包括內(nèi)含子。
[0091] 術(shù)語"可操作地連接"指的是調(diào)節(jié)序列和異源核酸序列之間的功能連接，其產(chǎn)生后 者的表達。例如，當?shù)谝缓怂嵝蛄形挥谂c第二核酸序列的功能關(guān)系中時，第一核酸序列與第 二核酸序列可操作地連接。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄或表達，則啟動子被可操 作地連接至編碼序列。通常地，可操作地連接的DNA序列是鄰近的，其中在相同的閱讀框中 必須連接兩個蛋白編碼區(qū)。
[0092] 術(shù)語"過表達的"腫瘤抗原或腫瘤抗原的"過表達"意欲指示相對于來自組織或器 官的正常細胞的表達水平，來自疾病區(qū)如患者的特定組織或器官內(nèi)的實體瘤的細胞中腫瘤 抗原表達的異常水平。具有以腫瘤抗原過表達為特征的實體瘤或血液學惡性腫瘤的患者可 由本領(lǐng)域已知的標準測定確定。
[0093] 免疫原性組合物的"腸胃外"施用包括例如皮下（s.c)、靜脈內(nèi)（i.v.)、肌肉內(nèi) (i.m.)或胸骨內(nèi)注射，或注入技術(shù)。
[0094] 術(shù)語"患者"、"對象"、"個體"等等在本文中可交換使用，并指的是服從本文描述方 法的任何動物或其細胞，不論是體外或原位。在一些非限制性實施方式中，患者、對象或個 體為人。
[0095] 如本文所用的，術(shù)語"多核苷酸"被定義為核苷酸鏈。此外，核酸為核苷酸的多聚 體。因此，如本文所用的，核酸和多核苷酸是可交換的。本領(lǐng)域技術(shù)人員具有核酸為可被水 解成單體"核苷酸"的多核苷酸的一般常識。單體核苷酸可被水解成核苷。如本文所用的， 多核苷酸包括但不限于通過本領(lǐng)域可用的任何手段獲得的所有的核酸序列，所述手段包括 但不限于重組手段，即，從重組文庫或細胞基因組，利用普通克隆技術(shù)和PCR?等等克隆核 酸序列，和合成手段。
[0096] 如本文所用的，術(shù)語"肽"、"多肽"和"蛋白質(zhì)"可交換使用，并指的是由肽鍵共價 連接的氨基酸殘基組成的化合物。蛋白或肽必須包含至少兩個氨基酸，和對可構(gòu)成蛋白質(zhì) 或肽的序列的氨基酸的最大數(shù)目沒有限制。多肽包括任何肽或蛋白質(zhì)，所述肽或蛋白質(zhì)包 括通過肽鍵相互連接的兩個或多個氨基酸。如本文所用的，該術(shù)語指的是短鏈，其在本領(lǐng)域 中也例如通常被稱為肽、寡肽和寡聚體；和較長鏈，其在本領(lǐng)域中通常被稱為蛋白質(zhì)，其具 有很多類型。"多肽"包括例如生物學活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚體、異二聚 體、多肽的變體、修飾多肽、衍生物、類似物、融合蛋白等等。多肽包括天然肽、重組肽、合成 肽或其組合。
[0097] 如本文所用的，術(shù)語"啟動子"被定義為開始多核苷酸序列的特異性轉(zhuǎn)錄需要的， 由細胞的合成機器或引入的合成機器識別的DNA序列。
[0098] 如本文所用的，術(shù)語"啟動子/調(diào)節(jié)序列"指可操作地連接至啟動子/調(diào)節(jié)序列的 基因產(chǎn)物表達所需的核酸序列。在一些例子中，該序列可為核心啟動子序列，并且在其他例 子中，該序列也可包括基因產(chǎn)物表達所需的增強子序列和其他調(diào)節(jié)元件。啟動子/調(diào)節(jié)序 列可例如為以組織特異方式表達基因產(chǎn)物的序列。
[0099] "組成型"啟動子為核苷酸序列，其當與編碼或規(guī)定基因產(chǎn)物的多核苷酸可操作地 連接時，使得在細胞的多數(shù)或所有生理學條件下在細胞中產(chǎn)生基因產(chǎn)物。
[0100] "誘導型"啟動子為核苷酸序列，其當與編碼或規(guī)定基因產(chǎn)物的多核苷酸可操作地 連接時，使得在基本上僅當相應于啟動子的誘導物存在于細胞中時，在細胞中產(chǎn)生基因產(chǎn) 物。
[0101] "組織-特異性"啟動子為核苷酸序列，其當與編碼基因或由基因規(guī)定的多核苷酸 可操作地連接時，使得基本上只要細胞為相應于啟動子的組織類型的細胞，則在細胞中產(chǎn) 生基因產(chǎn)物。
[0102] 如本文所用的，關(guān)于抗體的術(shù)語"特異性結(jié)合"指識別特異性抗原但基本上不識別 或結(jié)合樣本中的其他分子的抗體。例如，特異性結(jié)合來自一個物種的抗原的抗體也可結(jié)合 來自一個或多個物種的抗原。但是，這種跨種反應性本身不改變抗體的特異性類別。在另 一個實例中，特異性結(jié)合抗原的抗體也可結(jié)合抗原的不同等位基因形式。然而，這種交叉反 應性本身不改變抗體的類別成為特異性的。在一些例子中，術(shù)語"特異性的結(jié)合"或"特異 性地結(jié)合"可參考抗體、蛋白質(zhì)或肽與第二化學種類的相互作用使用，用于指該相互作用依 賴化學種類上特定結(jié)構(gòu)（例如，抗原決定簇或表位）的存在；例如，抗體通常識別和結(jié)合特 異性蛋白結(jié)構(gòu)而不是一般地識別和結(jié)合蛋白質(zhì)。如果抗體對表位"A"是特異性的，則在包 含標記的"A"和抗體的反應中存在包含表位A (或游離的、未標記的A)的分子，將降低結(jié)合 至抗體的標記的A的量。
[0103] 通過術(shù)語"刺激"指通過結(jié)合刺激分子（例如，TCR/⑶3復合物）與它的關(guān)聯(lián)配體， 由此介導信號轉(zhuǎn)導事件--諸如但不限于經(jīng)TCR/CD3復合物的信號轉(zhuǎn)導--誘導的初級應 答。刺激可介導某些分子的改變的表達，諸如TGF-β的下調(diào)和/或細胞骨架結(jié)構(gòu)的再組織 等等。
[0104] "刺激分子"，作為本文使用的術(shù)語，指與存在于抗原呈遞細胞上的關(guān)聯(lián)刺激配體 特異性結(jié)合的T細胞上的分子。
[0105] 如本文所用的，"刺激配體"指如此配體，其當存在于抗原呈遞細胞（例如，aAPC、樹 突細胞、B-細胞等等）上時，可與T細胞上的關(guān)聯(lián)結(jié)合伴侶（在本文中被稱為"刺激分子"） 特異性結(jié)合，由此介導T細胞的初級應答，其包括但不限于，活化、免疫應答的開始、增殖等 等。刺激配體在本領(lǐng)域中是公知的，并包括，特別是利用肽、抗CD3抗體、超激動劑抗CD28 抗體和超激動劑抗CD2抗體負載的MHC I類分子。
[0106] 術(shù)語"對象"、"患者"和"個體"在本文互換使用，并且意欲包括在其內(nèi)可引起免疫 應答的活有機體（例如，哺乳動物）。對象的例子包括人、狗、貓、小鼠、大鼠和其轉(zhuǎn)基因物 種。
[0107] 如本文所用的，"基本上純化的"細胞為基本上不含其他細胞類型的細胞?；旧?純化的細胞也指的是已經(jīng)與以其天然發(fā)生狀態(tài)與其正常相關(guān)聯(lián)的其他細胞類型分離的細 胞。在一些例子中，基本上純化的細胞群指的是均質(zhì)細胞群。在其他例子中，該術(shù)語簡單地 指的是已經(jīng)與以其天然狀態(tài)與其正常相關(guān)聯(lián)的細胞分離的細胞。在一些實施方式中，體外 培養(yǎng)細胞。在其他實施方式中，不在體外培養(yǎng)細胞細胞。
[0108] 如本文所用的，術(shù)語"治療性的"表示治療和/或預防。治療性效應通過疾病狀態(tài) 的抑制、緩和或根除獲得。
[0109] 術(shù)語"治療有效量"指的是將引起由研究者、獸醫(yī)、醫(yī)學醫(yī)生或其他臨床醫(yī)生正在 尋找的組織、系統(tǒng)或?qū)ο蟮纳飳W或醫(yī)學應答的對象化合物的量。術(shù)語"治療有效量"包括 以下的化合物的量：當被施用時，其足以防止治療的病癥或疾病的跡象或癥狀中的一個或 多個的發(fā)展，或以一定程度減輕治療的病癥或疾病的跡象或癥狀中的一個或多個。治療有 效量將根據(jù)化合物、疾病和其嚴重性、和待治療的對象的年齡、重量等而變化。
[0110] "治療"疾病，作為本文使用的術(shù)語，指降低對象經(jīng)歷的疾病或病癥的至少一種跡 象或癥狀的頻率或嚴重性。
[0111] 如本文所用的，術(shù)語"轉(zhuǎn)染的"或"轉(zhuǎn)化的"或"轉(zhuǎn)導的"指的是如此過程，通過該過 程外源的核酸被轉(zhuǎn)移或引入宿主細胞。"轉(zhuǎn)染的"或"轉(zhuǎn)化的"或"轉(zhuǎn)導的"細胞是已經(jīng)由外 源核酸轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導的細胞。該細胞包括初級對象細胞和它的子代。
[0112] 如本文所用的，短語"轉(zhuǎn)錄控制下"或"可操作地連接"指啟動子處于與多核苷酸 有關(guān)的正確的位置和朝向，以控制通過RNA聚合酶進行的轉(zhuǎn)錄的開始和多核苷酸的表達。
[0113] "載體"為物質(zhì)組合物，其包括分離的核酸，并且其可用于傳遞分離的核酸至細胞 內(nèi)部。很多載體在本領(lǐng)域中是已知的，包括但不限于線性多核苷酸、與離子或兩性分子化合 物相關(guān)的多核苷酸、質(zhì)粒和病毒。因此，術(shù)語"載體"包括自主復制的質(zhì)粒或病毒。該術(shù)語 也應被解釋為包括便于將核酸轉(zhuǎn)移入細胞的非質(zhì)粒和非病毒化合物，諸如例如聚賴氨酸化 合物、脂質(zhì)體等等。病毒載體的例子包括但不限于，腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病 毒載體等等。
[0114] 范圍：在該公開中，本發(fā)明的多個方面可以以范圍形式中示出。應當理解范圍形 式中的描述僅是為了方便和簡潔，并不應被解釋為對本發(fā)明范圍不可動搖的限制。因此，范 圍的描述應被考慮為已具體公開了所有可能的子范圍以及處于那個范圍內(nèi)的單個數(shù)值。例 如，范圍諸如從1至6的描述應被考慮為已具體公開了子范圍諸如從1至3、從1至4、從1 至5、從2至4、從2至6、從3至6等，以及那個范圍內(nèi)的單個數(shù)字，例如，1、2、2. 7、3、4、5、 5. 3和6。不管范圍的寬度如何，這一點是適用的。
[0115] 描述
[0116] 本發(fā)明提供組合物和方法用于治療癌癥以及其他疾病。癌癥可以是血液學惡性腫 瘤、實體瘤、原發(fā)或轉(zhuǎn)移性腫瘤。使用本發(fā)明的組合物和方法可治療的其他疾病包括病毒、 細菌和寄生蟲感染以及自身免疫病。
[0117] 在一個實施方式中，本發(fā)明提供工程化的表達CAR的細胞（例如，Thl7細胞），其 中CAR T細胞展示抗腫瘤性質(zhì)。本發(fā)明的CAR可被工程化以包括細胞外結(jié)構(gòu)域，所述細胞 外結(jié)構(gòu)域具有融合至T細胞抗原受體復合物ζ鏈（例如，CD3()的細胞內(nèi)信號傳導結(jié)構(gòu) 域的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的CAR當在T細胞中表達時，能夠基于抗原結(jié)合特異性改變 (redirect)抗原識別。示例性抗原為間皮蛋白，因為該抗原在大部分癌上表達。然而，本 發(fā)明不限于靶向間皮蛋白。相反地，本發(fā)明包括任何抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，當其結(jié)合其關(guān)聯(lián)抗原 時，影響腫瘤細胞，以便腫瘤細胞不生長、被促使死亡或以其他方式被影響，以便患者的腫 瘤負荷（tumor burden)縮小或消除?？乖Y(jié)合結(jié)構(gòu)域優(yōu)選與來自共刺激分子和ζ鏈中的 一個或多個的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合。優(yōu)選地，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域與選自IC0S信號傳導結(jié)構(gòu)域、 CD137(4-1BB)信號傳導結(jié)構(gòu)域、CD28信號傳導結(jié)構(gòu)域、CD3(信號結(jié)構(gòu)域和其任何組合的 一個或多個細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合。
[0118] 在一個實施方式中，本發(fā)明的CAR包括IC0S信號傳導結(jié)構(gòu)域。這是因為本發(fā)明部 分基于CAR-介導的Thl7細胞的T-細胞應答可通過添加共刺激結(jié)構(gòu)域進一步增強的發(fā)現(xiàn)。 例如，包括IC0S信號傳導結(jié)構(gòu)域，與其他相同的沒有被工程化表達IC0S的CAR T細胞相比 顯著增加表達CAR的Thl7細胞的IL-17產(chǎn)生、抗腫瘤活性和體內(nèi)持久性。重要地，CAR中包 括IC0S信號傳導結(jié)構(gòu)域也顯著減少IL-2產(chǎn)生。在一個實施方式中，減少和/或消除IL-2 產(chǎn)生是有益的，因為CAR不觸發(fā)調(diào)節(jié)T細胞增殖。
[0119] 在一些實施方式中，本發(fā)明涉及編碼CAR的逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體，其穩(wěn)定地 并入Thl7細胞并且穩(wěn)定地在其中表達。在其他實施方式中，本發(fā)明涉及編碼CAR的RNA，其 轉(zhuǎn)染進入Thl7細胞并且在其中瞬時表達。細胞中CAR的瞬時非整合表達減輕了與CAR在 細胞中永久和整合表達的考慮。
[0120] 鉬合物
[0121] 本發(fā)明提供了包括細胞外結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體（CAR)。細胞外 結(jié)構(gòu)域包括靶-特異性結(jié)合元件，其另外被稱為抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一些實施方式中，細胞 外結(jié)構(gòu)域也包括鉸鏈結(jié)構(gòu)域。細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域或另外的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域包括共刺激信號傳導區(qū) 和ζ鏈部分。共刺激信號傳導區(qū)指的是包括共刺激分子的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的一部分CAR。共 刺激分子為除抗原受體或它們的配體外淋巴細胞對抗原的有效應答所需要的細胞表面分 子。
[0122] 在CAR的細胞外結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域之間，或在CAR的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu) 域之間，可并入間隔結(jié)構(gòu)域。如本文所用的，術(shù)語"間隔結(jié)構(gòu)域"通常指起到將跨膜結(jié)構(gòu)域 連接至多肽鏈的細胞外結(jié)構(gòu)域或細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域作用的任何寡肽或多肽。間隔結(jié)構(gòu)域可包括 上至300個氨基酸，優(yōu)選地10至100個氨基酸和最優(yōu)選地25至50個氨基酸。
[0123] 本發(fā)明包括表達CAR的逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體構(gòu)建體，其可直接轉(zhuǎn)導進入細 胞。本發(fā)明也包括可直接轉(zhuǎn)染進入細胞的RNA構(gòu)建體。用于產(chǎn)生用于轉(zhuǎn)染的mRNA的方法 包括用具有專用設計的引物模板的體外轉(zhuǎn)錄（IVT)，隨后多聚腺苷酸添加，以產(chǎn)生構(gòu)建體， 其含有3'和5'非翻譯序列（"UTR")、5'帽和/或內(nèi)部核糖體進入位點（IRES)、待表達的 基因和多聚腺苷酸尾，典型地長度為50-2000個堿基。如此產(chǎn)生的RNA可有效地轉(zhuǎn)染不同 類型的細胞。在一個實施方式中，模板包括CAR的序列。
[0124] 優(yōu)選地，CAR包括細胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。細胞外結(jié)構(gòu)域和跨 膜結(jié)構(gòu)域可源自此類結(jié)構(gòu)域的任何期望來源。
[0125] 在一些情況下，本發(fā)明CAR的鉸鏈結(jié)構(gòu)域包括⑶8 α鉸鏈結(jié)構(gòu)域。在一個實施方 式中，CD8鉸鏈結(jié)構(gòu)域包括SEQ ID Ν0:4的核酸序列。在另一實施方式中，CD8鉸鏈結(jié)構(gòu)域 包括由SEQ ID Ν0:4的核酸序列編碼的氨基酸序列。
[0126] 抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域
[0127] 在一個實施方式中，本發(fā)明的CAR包括另外被稱為抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的靶-特異性 結(jié)合元件。部分的選擇取決于限定靶細胞表面的配體的類型和數(shù)目。例如，可選擇抗原結(jié) 合結(jié)構(gòu)域，以識別用作與具體疾病狀態(tài)相關(guān)的靶細胞上的細胞表面標記的配體。因此，可用 作本發(fā)明的CAR的抗原部分結(jié)構(gòu)域的配體的細胞表面標記的例子包括與病毒、細菌和寄生 蟲感染，自身免疫疾病和癌細胞相關(guān)的那些標記。
[0128] 在一個實施方式中，本發(fā)明的CAR可經(jīng)由工程化特異性結(jié)合至腫瘤細胞上抗原的 期望抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域而被工程化，以便靶向興趣腫瘤抗原。在本發(fā)明的內(nèi)容中，"腫瘤抗原" 或"過度增生性病癥（hyperproliferative disorder)抗原"或"與過度增生性病癥相關(guān)的 抗原"指的是對于特定過度增生性病癥諸如癌癥共同的抗原。本文討論的抗原僅以實例的 方式被包括。該列舉不意欲是窮盡的，并且更多的實例對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是容易顯而 易見的。
[0129] 腫瘤抗原是由引起免疫應答特別是T-細胞介導的免疫應答的腫瘤細胞產(chǎn)生的蛋 白質(zhì)。本發(fā)明的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的選擇將取決于待治療癌癥的具體類型。腫瘤抗原在本 領(lǐng)域中是公知的，并包括例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)的抗原、癌胚抗原（CEA)、β-人絨毛膜促性 腺素 、α -胎蛋白（AFP)、凝集素-反應的AFP、甲狀腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶 反轉(zhuǎn)錄酶、RU1、RU2 (AS)、腸羧酸酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺-特異性抗 原（PSA)、PAP、NY-ES0-1、LAGE-la、p53、prostein、PSMA、Her2/neu、存活素和端粒酶、前列 腺-癌腫瘤抗原-l(PCTA-l)、MGE、ELF2M、中性白細胞彈性蛋白酶、印hrinB2、CD22、胰島素 生長因子（IGF)-I、IGF-II、IGF-I受體和間皮素。
[0130] 在一個實施方式中，腫瘤抗原包括與惡性腫瘤相關(guān)的一個或多個抗原癌癥表位。 惡性腫瘤表達可用作免疫攻擊的靶抗原的許多蛋白。這些分子包括但不限于組織-特異性 抗原諸如MART-1、黑素瘤中的酪氨酸酶和GP100、和前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶（PAP) 和前列腺-特異性抗原（PSA)。其他靶分子屬于轉(zhuǎn)化相關(guān)分子諸如致癌基因 HER-2/Neu/ ErbB-2的組。而另一組的靶抗原為胎性癌抗原諸如癌胚抗原（CEA)。在B-細胞淋巴瘤中， 腫瘤-特異性個體基因型免疫球蛋白構(gòu)成對個體腫瘤唯一的真正的腫瘤-特異性免疫球蛋 白抗原。B-細胞分化抗原諸如CD19、CD20和CD37是B-細胞淋巴瘤中靶抗原的其他候選 物。這些抗原中的一些（CEA、HER-2、⑶19、⑶20、個體基因型）已經(jīng)有限成功地用作利用單 克隆抗體的被動免疫療法的標靶。
[0131] 本發(fā)明中提及的該類型腫瘤抗原也可為腫瘤-特異性抗原（TSA)或腫瘤相關(guān)抗原 (TAA)。TSA為對腫瘤細胞唯一的，并不發(fā)生在身體的其他細胞上。TAA相關(guān)的抗原不是對腫 瘤細胞唯一的，并且相反，其在不能誘導對抗原的免疫耐受狀態(tài)的狀況下，也在正常細胞上 進行表達。腫瘤上的抗原表達可在使免疫系統(tǒng)能夠反應抗原的狀況下發(fā)生。TAA可為在胚 胎發(fā)育期間，當免疫系統(tǒng)不成熟并且不能反應時，在正常細胞上表達的抗原，或它們可為在 正常細胞上以極低的水平正常存在的抗原，但其在腫瘤細胞上以高得多的水平進行表達。
[0132] TSA或TAA抗原的非限制性例子包括以下：分化抗原諸如MART-1/ MelanA(MART-l)、gpl00(Pmell7)、酪氨酸酶、TRP-UTRP-2和腫瘤-特異性多譜系抗原諸如 MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5 ;過表達的胚胎抗原諸如CEA ;過表達的致癌基 因和突變的腫瘤-抑制基因諸如p53、Ras、HER-2/neu ;由染色體易位產(chǎn)生的獨特的腫瘤抗 原諸如 BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、1GH-IGK、MYL-RAR ;和病毒抗原，諸如 Epstein Barr 病毒 抗原EBVA和人乳頭瘤病毒（HPV)抗原E6和E7。其他大的、基于蛋白的抗原包括TSP-180、 MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、pl85erbB2、pl80erbB-3、c-met、nm-23Hl、PSA、 TAG-72、CA19-9、CA72-4、CAM17. 1、NuMa、K-ras、β -聯(lián)蛋白、CDK4、Mum-l、pl5、pl6、43-9F、 5T4、791Tgp72、a -胎蛋白、β -HCG、BCA225、BTAA、CA125、CA15-3\CA27. 29\BCAA、CA195、 CA242、CA-50、CAM43、CD68/P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、 MG7-Ag、M0V18、NB/70K、NY-C0-l、RCASl、SDCCAG16、TA-90\Mac-2 結(jié)合蛋白 \ 親環(huán)蛋白 C 相 關(guān)蛋白、TAAL6、TAG72、TLP 和 TPS。
[0133] 在優(yōu)選的實施方式中，CAR的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域部分靶向下述抗原，其包括但不限 于 CD19、CD20、CD22、R0R1、間皮蛋白、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂 F77、EGFRvIII、⑶-2、 MY-ES0-1TCR、MAGE A3TCR 等等。
[0134] 取決于期望的待靶向的抗原，本發(fā)明的CAR可被工程化以包括適當?shù)膶ζ谕目?原靶特異的抗原結(jié)合部分。例如，如果間皮蛋白是期望的待靶向的抗原，那么間皮蛋白的抗 體可用作用于并入本發(fā)明的CAR的抗原結(jié)合部分。
[0135] 在一個實施方式中，本發(fā)明CAR的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域部分靶向間皮蛋白。優(yōu)選地，本 發(fā)明CAR的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域部分是SSlscFv，其識別人間皮蛋白，其中SSlscFv的核酸序列 包括SEQ ID N0:3中闡釋的序列。在另一實施方式中，本發(fā)明的CAR的SSlscFv部分包括 由序列SEQ ID N0:3中闡釋的核酸序列編碼的氨基酸序列。
[0136] 跨臘結(jié)構(gòu)域
[0137] 對于跨膜結(jié)構(gòu)域，CAR可被設計以包括融合至CAR的細胞外結(jié)構(gòu)域的跨膜結(jié)構(gòu)域。 在一個實施方式中，使用天然與CAR中的結(jié)構(gòu)域之一相關(guān)聯(lián)的跨膜結(jié)構(gòu)域。在一些例子中， 可選擇跨膜結(jié)構(gòu)域，或通過氨基酸取代進行修飾，以避免將這樣的結(jié)構(gòu)域結(jié)合至相同或不 同的表面膜蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，從而最小化與受體復合物的其他成員的相互作用。
[0138] 跨膜結(jié)構(gòu)域可源于天然來源或合成來源。在天然來源中，該結(jié)構(gòu)域可源于任何膜 結(jié)合蛋白或跨膜蛋白。具體用于本發(fā)明的跨膜區(qū)可源于T-細胞受體的α、β或ζ鏈、 CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、 ⑶137、⑶154、IC0S(即至少包括上述中的跨膜區(qū)（一個或多個））?？蛇x地，跨膜結(jié)構(gòu)域可 為合成的，在該情況下，它將包括占主導的疏水殘基諸如亮氨酸和纈氨酸。優(yōu)選地，將在合 成跨膜結(jié)構(gòu)域的每一端上發(fā)現(xiàn)苯基丙氨酸、色氨酸和纈氨酸的三聯(lián)體。任選地，短的寡肽或 多肽連接體，優(yōu)選長度在2和10個氨基酸之間，可在CAR的跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞質(zhì)信號傳導 結(jié)構(gòu)域之間形成連接。甘氨酸-絲氨酸雙聯(lián)體提供了特別合適的連接體。
[0139] 優(yōu)選地，本發(fā)明CAR的跨膜結(jié)構(gòu)域包括IC0S跨膜結(jié)構(gòu)域。在一個實施方式中，IC0S 跨膜結(jié)構(gòu)域包括SEQ ID N0:5的核酸序列。在另一實施方式中，IC0S跨膜結(jié)構(gòu)域包括由SEQ ID N0:5的核酸序列編碼的氨基酸序列。
[0140] 細朐質(zhì)結(jié)構(gòu)域
[0141] 本發(fā)明的CAR的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或另外的細胞內(nèi)信號傳導結(jié)構(gòu)域是造成其中已放 置CAR的免疫細胞的至少一種正常效應子功能的活化的原因。術(shù)語"效應子功能"指的是 細胞的專有功能。例如，T細胞的效應子功能可為包括細胞因子分泌的細胞溶解活性或輔 助活性。因此術(shù)語"細胞內(nèi)信號傳導結(jié)構(gòu)域"指的是轉(zhuǎn)導效應子功能信號并指導細胞實施 專有功能的蛋白部分。盡管通?？墒褂谜麄€細胞內(nèi)信號傳導結(jié)構(gòu)域，但在很多例子中，不必 使用整個鏈。就使用細胞內(nèi)信號傳導結(jié)構(gòu)域的截短部分而言，這種截短部分可用于代替完 整的鏈，只要它轉(zhuǎn)導效應子功能信號。術(shù)語細胞內(nèi)信號傳導結(jié)構(gòu)域因此指包括足以轉(zhuǎn)導效 應子功能信號的細胞內(nèi)信號傳導結(jié)構(gòu)域的任何截短部分。
[0142] 用于本發(fā)明的CAR的細胞內(nèi)信號傳導結(jié)構(gòu)域的優(yōu)選例子包括T細胞受體（TCR)的 細胞質(zhì)序列和協(xié)同行動以在抗原受體結(jié)合后開始信號轉(zhuǎn)導的共受體，以及這些序列的任何 衍生物或變體和具有相同的功能能力的任何合成序列。
[0143] 已知通過TCR單獨產(chǎn)生的信號不足以完全活化T細胞，并且也需要次級或共刺激 信號。因此，T細胞活化可認為由兩個不同類的細胞質(zhì)信號傳導序列介導：通過TCR開始抗 原-依賴性初級活化的那些（初級細胞質(zhì)信號傳導序列）和以抗原-非依賴性方式起作用 以提供次級或共刺激信號的那些（次級細胞質(zhì)信號傳導序列）。
[0144] 初級細胞質(zhì)信號傳導序列以刺激方式或以抑制方式調(diào)節(jié)TCR復合物的初級活化。 以刺激方式起作用的初級細胞質(zhì)信號傳導序列可包含信號傳導基序，其已知為基于免疫受 體酪氨酸的活化基序或ITAM。
[0145] 包含在本發(fā)明中具有具體用途的初級細胞質(zhì)信號傳導序列的ITAM的例子包括源 于 TCR ζ、FcR γ、FcRP、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b 和 CD66d 的那些。 特別優(yōu)選地，本發(fā)明的CAR中的細胞質(zhì)信號傳導分子包括源于CD3 ζ的細胞質(zhì)信號傳導序 列。
[0146] 在優(yōu)選的實施方式中，CAR的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域可被設計以本身包括CD3_(信號傳 導結(jié)構(gòu)域，或可與在本發(fā)明的CAR的內(nèi)容中有用的任何其他期望的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域（一個或 多個）聯(lián)合。例如，CAR的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域可包括CD3(鏈部分和共刺激信號傳導區(qū)。共刺 激信號傳導區(qū)指的是包括共刺激分子的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的一部分CAR。共刺激分子是淋巴 細胞對抗原的有效應答所需的除抗原受體或它們的配體外的細胞表面分子。這種分子的 例子包括 CD27、CD28、4-1BB(CD137)、0X40、CD30、CD40、PD-1、IC0S、淋巴細胞功能相關(guān)抗 原-1 (LFA-1)、⑶2、⑶7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和與⑶83特異性結(jié)合的配體等等。因此，盡 管本發(fā)明主要以IC0S作為共刺激信號傳導元件的例子，但其他共刺激元件也位于本發(fā)明 的范圍內(nèi)。
[0147] 本發(fā)明的CAR的細胞質(zhì)信號傳導部分內(nèi)的細胞質(zhì)信號傳導序列可以隨機或以規(guī) 定的順序相互連接。任選地，短的寡肽或多肽連接體，優(yōu)選長度在2和10個氨基酸，可形成 該連接。甘氨酸-絲氨酸雙聯(lián)體提供了特別合適的連接體。
[0148] 在一個實施方式中，細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域被設計以包括CD3_(的信號傳導結(jié)構(gòu)域和 IC0S的信號傳導結(jié)構(gòu)域。在另一個實施方式中，細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域被設計以包括CD3-(的信號 傳導結(jié)構(gòu)域和4-1BB的信號傳導結(jié)構(gòu)域。還在另一個實施方式中，細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域被設計以 包括⑶3- ζ的信號傳導結(jié)構(gòu)域和IC0S和4-1BB的信號傳導結(jié)構(gòu)域。
[0149] 在一個實施方式中，本發(fā)明的CAR中的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域被設計以包括IC0S的信號傳 導結(jié)構(gòu)域和⑶3-ζ的信號傳導結(jié)構(gòu)域，其中IC0S的信號傳導結(jié)構(gòu)域包括SEQ ID N0:6中 提出的核酸序列和⑶3-ζ的信號傳導結(jié)構(gòu)域包括SEQ ID NO: 7中提出的核酸序列。
[0150] 在一個實施方式中，本發(fā)明CAR的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域被設計為包括IC0S的信號傳導結(jié) 構(gòu)域和⑶3-ζ的信號傳導結(jié)構(gòu)域，其中IC0S的信號傳導結(jié)構(gòu)域包括由SEQ ID N0:6闡釋 的核酸序列編碼的氨基酸序列和⑶3-ζ的信號傳導結(jié)構(gòu)域包括由SEQ ID NO: 7闡釋的核 酸序列編碼的氨基酸序列。
[0151]
[0152] 本發(fā)明包括DNA構(gòu)建體，其包括CAR的序列，其中該序列包括抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核 酸序列，其可操作地連接至細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的核酸序列。可用于本發(fā)明的CAR的示例性細胞 內(nèi)結(jié)構(gòu)域包括但不限于⑶3-ζ、IC0S、⑶28、4-1ΒΒ等等的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。在一些情況下， CAR可包括CD3- ζ、ICOS、CD28、4-1BB等等的任何組合。
[0153] 在一個實施方式中，本發(fā)明的CAR包括抗間皮蛋白scFv(例如SSlscFv)、人⑶8 鉸鏈、IC0S跨膜結(jié)構(gòu)域和人IC0S和CD3 ζ信號傳導結(jié)構(gòu)域。在一個實施方式中，本發(fā)明的 CAR包括SEQ ID Ν0:8闡釋的核酸序列。在另一實施方式中，本發(fā)明的CAR包括由SEQ ID NO:8闡釋的核酸序列編碼的氨基酸序列。
[0154] 編碼期望分子的核酸序列可利用在本領(lǐng)域中已知的重組方法獲得，諸如例如利用 標準的技術(shù)，通過從表達基因的細胞中篩選文庫，通過從已知包括該基因的載體中得到該 基因，或從包含該基因的細胞和組織中直接分離。可選地，感興趣的基因可被合成生產(chǎn)，而 不被克隆。
[0155] 本發(fā)明也提供了其中插入本發(fā)明的DNA的載體。源于逆轉(zhuǎn)錄病毒諸如慢病毒的載 體是實現(xiàn)長期基因轉(zhuǎn)移的合適工具，因為它們允許轉(zhuǎn)基因長期、穩(wěn)定的整合并且其在子細 胞中增殖（propagation)。慢病毒載體具有超過源自致癌逆轉(zhuǎn)錄病毒諸如鼠科白血病病毒 的載體的額外優(yōu)點，因為它們可轉(zhuǎn)導非增殖的細胞，諸如肝細胞。它們也具有低免疫原性的 額外優(yōu)點。
[0156] 簡單概括，通常通過可操作地連接編碼CAR多肽或其部分的核酸至啟動子，并將 構(gòu)建體并入表達載體，實現(xiàn)編碼CAR的天然或合成核酸的表達。該載體對于復制和整合真 核細胞可為合適的。典型的克隆載體包含可用于調(diào)節(jié)期望核酸序列表達的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止 子、初始序列和啟動子。
[0157] 本發(fā)明的表達構(gòu)建體也可利用標準的基因傳遞方案，用于核酸免疫和基因療 法?；騻鬟f的方法在本領(lǐng)域中是已知的。見例如美國專利號5, 399, 346、5, 580, 859、 5, 589, 466,在此通過引用全文并入。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了基因療法載體。
[0158] 該核酸可被克隆入許多類型的載體。例如，該核酸可被克隆入如此載體，其包括但 不限于質(zhì)粒、噬菌粒、噬菌體衍生物、動物病毒和粘粒。特定的感興趣載體包括表達載體、復 制載體、探針產(chǎn)生載體和測序載體。
[0159] 進一步地，表達載體可以以病毒載體形式提供給細胞。病毒載體技術(shù)在本領(lǐng)域 中是公知的并在例如 Sambrook 等（2001，Molecular Cloing:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)和其他病毒學和分子生物學手冊中進行了描 述。可用作載體的病毒包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒和慢病 毒。通常，合適的載體包含在至少一種有機體中起作用的復制起點、啟動子序列、方便的限 制酶位點和一個或多個可選擇的標記（例如，W0 01/96584 ;W0 01/29058;和美國專利號 6, 326, 193)。
[0160] 已經(jīng)開發(fā)許多基于病毒的系統(tǒng)，用于將基因轉(zhuǎn)移入哺乳動物細胞。例如，逆轉(zhuǎn)錄病 毒提供了用于基因傳遞系統(tǒng)的方便的平臺?？衫迷诒绢I(lǐng)域中已知的技術(shù)將選擇的基因插 入載體并包裝入逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。該重組病毒可隨后被分離和傳遞至體內(nèi)或離體的對象細 胞。許多逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)在本領(lǐng)域中是已知的。在一些實施方式中，使用腺病毒載體。許 多腺病毒載體在本領(lǐng)域中是已知的。在一個實施方式中，使用慢病毒載體。
[0161] 額外的啟動子元件，例如增強子，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄開始的頻率。通常地，這些位于起始位 點上游的30-110bp區(qū)域中，盡管近來已經(jīng)顯示許多啟動子也包含起始位點下游的功能元 件。啟動子元件之間的間隔經(jīng)常是柔性的，以便當元件相對于另一個被倒置或移動時，保持 啟動子功能。在胸苷激酶（tk)啟動子中，啟動子元件之間的間隔可被增加隔開50bp，活性 才開始下降。取決于啟動子，表現(xiàn)出單個元件可合作或獨立地起作用，以起動轉(zhuǎn)錄。
[0162] 合適的啟動子的一個例子為即時早期巨細胞病毒（CMV)啟動子序列。該啟動子 序列為能夠驅(qū)動可操作地連接至其上的任何多核苷酸序列高水平表達的強組成型啟動子 序列。合適的啟動子的另一個例子為延伸生長因子-la (EF-la)。然而，也可使用其他組 成型啟動子序列，包括但不限于類人猿病毒40(SV40)早期啟動子、小鼠乳癌病毒（MMTV)、 人免疫缺陷病毒（HIV)長末端重復（LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、鳥類白血病病毒啟動子、 艾伯斯坦-巴爾（Epstein-Barr)病毒即時早期啟動子、魯斯氏肉瘤病毒啟動子、以及人基 因啟動子，諸如但不限于肌動蛋白啟動子、肌球蛋白啟動子、血紅素啟動子和肌酸激酶啟動 子。進一步地，本發(fā)明不應被限于組成型啟動子的應用。誘導型啟動子也被考慮為本發(fā)明 的一部分。誘導型啟動子的使用提供了分子開關(guān)，其能夠當這樣的表達是期望的時，打開可 操作地連接誘導型啟動子的多核苷酸序列的表達，或當表達是不期望的時關(guān)閉表達。誘導 型啟動子的例子包括但不限于金屬硫蛋白啟動子、糖皮質(zhì)激素啟動子、孕酮啟動子和四環(huán) 素啟動子。
[0163] 為了評估CAR多肽或其部分的表達，被引入細胞的表達載體也可包含可選擇的標 記基因或報道基因中的任一個或兩者，以便于從尋求通過病毒載體轉(zhuǎn)染或感染的細胞群中 鑒定和選擇表達細胞。在其他方面，可選擇的標記可被攜帶在單獨一段DNA上并用于共轉(zhuǎn) 染程序?？蛇x擇的標記和報道基因兩者的側(cè)翼都可具有適當?shù)恼{(diào)節(jié)序列，以便能夠在宿主 細胞中表達。有用的可選擇標記包括例如抗生素抗性基因，諸如neo等等。
[0164] 報道基因用于鑒定潛在轉(zhuǎn)染的細胞并用于評價調(diào)節(jié)序列的功能性。通常地，報道 基因為以下基因：其不存在于受體有機體或組織或由受體有機體或組織進行表達，并且其 編碼多肽，該多肽的表達由一些可容易檢測的性質(zhì)例如酶活性清楚表示。在DNA已經(jīng)被引 入受體細胞后，報道基因的表達在合適的時間下進行測定。合適的報道基因可包括編碼熒 光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、分泌型堿性磷酸酶的基因或綠色螢光蛋白基 因（例如，Ui-Tei等，2000FEBS Letters479:79-82)。合適的表達系統(tǒng)是公知的并可利用 已知技術(shù)制備或從商業(yè)上獲得。通常，顯示最高水平的報道基因表達的具有最少5個側(cè)翼 區(qū)的構(gòu)建體被鑒定為啟動子。這樣的啟動子區(qū)可被連接至報道基因并用于評價試劑調(diào)節(jié)啟 動子-驅(qū)動轉(zhuǎn)錄的能力。
[0165] 將基因引入細胞和將基因表達入細胞的方法在本領(lǐng)域中是已知的。在表達載體的 內(nèi)容中，載體可通過在本領(lǐng)域中的任何方法容易地引入宿主細胞，例如，哺乳動物、細菌、酵 母或昆蟲細胞。例如，表達載體可通過物理、化學或生物學手段轉(zhuǎn)移入宿主細胞。
[0166] 將多核苷酸引入宿主細胞的物理方法包括磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、粒子轟擊、顯 微注射、電穿孔等等。生產(chǎn)包括載體和/或外源核酸的細胞的方法在本領(lǐng)域中是公知的。見 例如 Sambrook 等（2001，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)。將多核苷酸引入宿主細胞的優(yōu)選方法為磷酸I丐轉(zhuǎn)染。
[0167] 將感興趣的多核苷酸引入宿主細胞的生物學方法包括使用DNA和RNA載體。病毒 載體，特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，已經(jīng)成為最廣泛使用的將基因插入哺乳動物例如人細胞的 方法。其他病毒載體可源自慢病毒、痘病毒、單純皰疹病毒I、腺病毒和腺伴隨病毒等等。見 例如美國專利號5, 350, 674和5, 585, 362。
[0168] 將多核苷酸引入宿主細胞的化學手段包括膠體分散系統(tǒng)，諸如大分子復合物、納 米膠囊、微球、珠；和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)，包括水包油乳劑、膠束、混合膠束和脂質(zhì)體。用作體外 和體內(nèi)遞送工具（delivery vehicle)的示例性膠體系統(tǒng)為脂質(zhì)體（例如，人造膜囊）。
[0169] 在使用非病毒傳遞系統(tǒng)的情況下，示例性傳遞工具為脂質(zhì)體?？紤]使用脂質(zhì)制劑， 以將核酸引入宿主細胞（體外、離體（ex vivo)或體內(nèi)）。在另一方面，該核酸可與脂質(zhì)相 關(guān)聯(lián)。與脂質(zhì)相關(guān)聯(lián)的核酸可被封裝入脂質(zhì)體的水性內(nèi)部中，散布在脂質(zhì)體的脂雙層內(nèi)，經(jīng) 與脂質(zhì)體和寡核苷酸兩者都相關(guān)聯(lián)的連接分子附接至脂質(zhì)體，陷入脂質(zhì)體，與脂質(zhì)體復合， 分散在包含脂質(zhì)的溶液中，與脂質(zhì)混合，與脂質(zhì)聯(lián)合，作為懸浮液包含在脂質(zhì)中，包含在膠 束中或與膠束復合，或以其他方式與脂質(zhì)相關(guān)聯(lián)。與組成相關(guān)聯(lián)的脂質(zhì)、脂質(zhì)/DNA或脂質(zhì) /表達載體不限于溶液中的任何具體結(jié)構(gòu)。例如，它們可存在于雙分子層結(jié)構(gòu)中，作為膠束 或具有"坍縮的（collapsed)"結(jié)構(gòu)。它們也可簡單地被散布在溶液中，可能形成大小或形 狀不均一的聚集體。脂質(zhì)為脂肪物質(zhì)，其可為天然發(fā)生或合成的脂質(zhì)。例如，脂質(zhì)包括脂 肪小滴，其天然發(fā)生在細胞質(zhì)以及包含長鏈脂肪族烴和它們的衍生物諸如脂肪酸、醇類、胺 類、氨基醇類和醛類的該類化合物中。
[0170] 適于使用的脂質(zhì)可從商業(yè)來源中獲得。例如，二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿（"DMPC"）可 從Sigma, St. Louis, M0 中獲得；憐酸二嫁錯酯（"DCP"）可從K&K Laboratories (Plainview， NY)中獲得；膽固醇（"Choi"）可從Calbiochem-Beh環(huán)中獲得；二肉豆蘧酰磷脂酰甘油 ("DMPG"）和其他脂質(zhì)可從 Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL)中獲得。氯仿或 氯仿/甲醇中的脂質(zhì)原液可被保存在大約_20°C下。氯仿用作唯一的溶劑，因為它比甲醇 更容易蒸發(fā)。"脂質(zhì)體"為通用術(shù)語，其包括通過產(chǎn)生封閉的脂雙層或聚集體而形成的多種 單一和多層脂質(zhì)工具。脂質(zhì)體可以以具有含有磷脂雙層膜和內(nèi)部水性介質(zhì)的囊泡結(jié)構(gòu)為特 征。多層脂質(zhì)體具有由水性介質(zhì)分開的多個脂質(zhì)層。當磷脂懸浮在過量的水性溶液中時， 它們自發(fā)形成。在形成封閉的結(jié)構(gòu)和使水和溶解的溶質(zhì)陷入脂雙層之間前，該脂質(zhì)成分經(jīng) 歷自身重排（Ghosh等，191Glycobiology5 :505-10)。然而，也包括與正常的囊泡結(jié)構(gòu)相比 具有溶液中的不同結(jié)構(gòu)的組合物。例如，脂質(zhì)可呈現(xiàn)膠束結(jié)構(gòu)或僅作為脂質(zhì)分子的非均一 聚集體而存在。同樣考慮的是脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺-核酸復合物。
[0171] 不管用于將外源核酸引入宿主細胞，或以其他方式將細胞暴露于本發(fā)明的抑制劑 的方法，為了證實在宿主細胞中存在重組DNA序列，可實施多種測定。這樣的測定包括例如 本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的"分子生物學"測定，諸如DNA印跡法和RNA印跡法、RT-PCR和PCR ; "生物化學"測定，諸如例如通過免疫學手段（EL1SA和蛋白質(zhì)印跡）或通過本文描述的鑒定 落入本發(fā)明范圍內(nèi)的試劑的測定，檢測特定肽的存在或不存在。
[0172] RNA 轉(zhuǎn)染
[0173] 在一個實施方式中，本發(fā)明基因修飾的T細胞通過引入RNA被修飾。在一個實施 方式中，體外轉(zhuǎn)錄的RNA CAR可以瞬時轉(zhuǎn)染的形式被引入細胞。通過使用聚合酶鏈式反應 (PCR)-產(chǎn)生的模板的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA。來自任何來源感興趣的DNA可直接通過使用適當 的引物和RNA聚合酶的PCR轉(zhuǎn)化成用于體外mRNA合成的模板。DNA的來源可以，例如，基因 組DNA、質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA、cDNA、合成的DNA序列或任何其他適當?shù)腄NA來源。用于體 外轉(zhuǎn)錄的期望的模板是本發(fā)明的CAR。例如，用于RNA CAR的模板包括細胞外結(jié)構(gòu)域，其包 括抗腫瘤抗體的單鏈可變區(qū)；包括CD8a的鉸鏈和跨膜結(jié)構(gòu)域的跨膜結(jié)構(gòu)域；和包括CD3-4 的信號傳導結(jié)構(gòu)域和IC0S的信號傳導結(jié)構(gòu)域的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
[0174] 在一個實施方式中，用于PCR的DNA包括可讀框。DNA可來自天然產(chǎn)生的DNA序 列，所述序列來自有機體基因組。在一個實施方式中，DNA為基因的一部分的全長感興趣基 因?；蚩砂ㄒ恍┗蛉康?'和/或3'非翻譯區(qū)（UTR)?；蚩砂ㄍ怙@子和內(nèi)含子。 在一個實施方式中，用于PCR的DNA為人基因。在另一個實施方式中，用于PCR的DNA為包 括5'和3'UTR的人基因。DNA可可選地為通常不在天然產(chǎn)生的有機體中表達的人工DNA序 列。示例性人工DNA序列為包括連接（ligate)在一起以形成編碼融合蛋白的可讀框的基 因部分的序列。連接在一起的DNA的部分可來自單一有機體或來自多于一個有機體。
[0175] 可用作用于PCR的DNA的來源的基因包括編碼多肽的基因，其對有機體提供治療 性或預防效果或可用于診斷有機體的疾病或狀況。優(yōu)選的基因為以下基因：其有助于短期 治療，或其中有關(guān)于劑量或所表達基因的安全性的關(guān)注。例如，對于治療癌癥、自體免疫狀 況、寄生蟲的、病毒的、細菌的、真菌的或其他的感染，所表達的轉(zhuǎn)基因（一個或多個）可編 碼擔當用于免疫系統(tǒng)的細胞的配體或受體的多肽，或可起到刺激或抑制有機體免疫系統(tǒng)的 作用。在一些實施方式中，不期望具有持久持續(xù)的免疫系統(tǒng)的刺激，也不必產(chǎn)生在成功治療 后延續(xù)的變化，因為這可隨后引出新的問題。對于自體免疫狀況的治療，可期望驟然抑制或 壓制免疫系統(tǒng)，但不是長期的，其可導致患者變得對感染過度敏感。
[0176] PCR用于產(chǎn)生用于mRNA體外轉(zhuǎn)錄的模板，其用于轉(zhuǎn)染。用于進行PCR的方法是本 領(lǐng)域廣泛已知的。設計用于PCR的引物，以具有與用作用于PCR的模板的DNA的區(qū)基本上 互補的區(qū)。"基本上互補的"，如本文所用，指的是在核苷酸的序列中大多數(shù)或所有的引物序 列中的堿基是互補的，或一個或多個堿基是非互補的，或錯配的?；旧匣パa的序列能夠在 用于PCR的退火條件下，用預期的DNA靶標退火或雜交。引物可被設計以與DNA模板的任 何部分基本上互補。例如，可設計引物以擴增通常在細胞中轉(zhuǎn)錄的基因的部分（可讀框）， 包括5'和3'UTR。也可設計引物以擴增編碼特定感興趣結(jié)構(gòu)域的基因的部分。在一個實施 方式中，設計引物以擴增包括全部或部分的5'和3'UTR的人cDNA的編碼區(qū)?？捎糜赑CR 的引物通過本領(lǐng)域廣泛已知的合成方法產(chǎn)生。"正向引物"為包括與在位于要擴增的DNA序 列上游的DNA模板上的核苷酸基本上互補的核苷酸的區(qū)域的引物。本文使用的"上游"指 的是對于相對于編碼鏈擴增的DNA序列的位置5'。"反向引物"是包括與位于要擴增的DNA 序列下游的雙鏈DNA模板基本上互補的核苷酸區(qū)域的引物。本文使用的"下游"指的是對 于相對于編碼鏈擴增的DNA序列的位置3'。
[0177] 任何可用于PCR的DNA聚合酶可用于本文公開的方法。試劑和聚合酶從很多來源 商業(yè)可得。
[0178] 也可使用具有促進穩(wěn)定性和/或翻譯效率的能力的化學結(jié)構(gòu)。RNA優(yōu)選具有5'和 3'UTR。在一個實施方式中，5'UTR的長度在0和3000個核苷酸之間。添加至編碼區(qū)的5' 和3'UTR序列的長度可通過不同的方法改變，包括但不限于，設計對UTR的不同區(qū)域退火的 PCR的引物。利用該方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可在轉(zhuǎn)錄RNA的轉(zhuǎn)染后修改實現(xiàn)最優(yōu)翻譯效率所 需要的5'和3'UTR長度。
[0179] 5'和3'UTR可為針對感興趣基因的天然產(chǎn)生的、內(nèi)源性5'和3'UTR?？蛇x地，對 感興趣基因不是內(nèi)源性的UTR序列可通過將UTR序列并入正向和反向引物或通過模板的任 何其他修飾添加。對感興趣基因不是內(nèi)源性的UTR序列的使用可有助于修改RNA的穩(wěn)定性 和/或翻譯效率。例如，已知3' UTR序列中AU-富集的元件可降低mRNA的穩(wěn)定性。因此， 基于本領(lǐng)域廣泛已知的UTR性質(zhì)，可選擇或設計3' UTR，以增加轉(zhuǎn)錄RNA的穩(wěn)定性。
[0180] 在一個實施方式中，5'UTR可包括內(nèi)源性基因的Kozak序列?？蛇x地，當對感興趣 基因不是內(nèi)源性的5'UTR如上述通過PCR添加時，共有Kozak序列可通過添加5'UTR序列 重新設計。Kozak序列可增加一些RNA轉(zhuǎn)錄物的翻譯效率，但似乎不是所有的RNA都需要以 實現(xiàn)有效的翻譯。對于很多mRNA的Kozak序列的要求是本領(lǐng)域已知的。在其他實施方式 中，5' UTR可源于RNA病毒，其RNA基因組在細胞中是穩(wěn)定的。在其他實施方式中，不同的核 苷酸類似物可用于3'或5' UTR，以阻止mRNA的外切核酸酶降解。
[0181] 為了能夠?qū)崿F(xiàn)從DNA模板合成RNA，而不需要基因克隆，轉(zhuǎn)錄的啟動子應被附接至 轉(zhuǎn)錄的序列的DNA模板上游。當擔當RNA聚合酶的啟動子的序列被添加至正向引物的5'末 端時，RNA聚合酶啟動子變?yōu)椴⑷朕D(zhuǎn)錄的可讀框的PCR產(chǎn)物上游。在一個優(yōu)選實施方式中， 啟動子為T7聚合酶啟動子，如本文其他地方描述的。其他有用的啟動子包括但不限于T3 和SP6RNA聚合酶啟動子。對于T7、T3和SP6啟動子的共有核苷酸序列是本領(lǐng)域已知的。
[0182] 在優(yōu)選的實施方式中，mRNA具有5'末端上的帽和3'poly (A)尾兩者，其確定細胞 中的核糖體結(jié)合、翻譯開始和mRNA的穩(wěn)定性。在環(huán)形DNA模板上，例如質(zhì)粒DNA，RNA聚合 酶產(chǎn)生長的多聯(lián)產(chǎn)物，其不適于真核細胞中的表達。在3'UTR末端上線性化的質(zhì)粒DNA的 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生正常尺寸的mRNA，其在真核轉(zhuǎn)染中不是有效的，即使它在轉(zhuǎn)錄后多聚腺苷酸化。
[0183] 在線性DNA模板上，噬菌體T7RNA聚合酶可延長轉(zhuǎn)錄物的3'末端超過模板的 最后喊基（Schenborn 和 Mierendorf，Nuc Acids Res.，13:6223-36(1985) ;Nacheva 和 Berzal-Herranz, Eur.J. Biochem. , 270:1485-65(2003))〇
[0184] polyA/T延伸進入DNA模板的整合的常規(guī)方法為分子克隆。然而整合入質(zhì)粒DNA 的polyA/T序列可引起質(zhì)粒不穩(wěn)定性，這是為何從細菌細胞獲得的質(zhì)粒DNA模板通常以缺 失和其他差錯被高度污染。這使克隆程序不僅是費力和耗時的，而且經(jīng)常是不可靠的。這 是為何允許用P〇lyA/T3' 一段序列而不是克隆的DNA模板的構(gòu)建方法是高度期望的。
[0185] 轉(zhuǎn)錄的DNA模板的polyA/T片段可在PCR期間通過使用包括polyT尾諸如100T 尾（尺寸可為50-5000T)的反向引物，或在PCR后通過任何其他方法，包括但不限于DNA連 接或體外重組而產(chǎn)生。P 〇ly(A)尾也提供了對RNA的穩(wěn)定性并減少了它們的降解。通常， poly (A)尾的長度與轉(zhuǎn)錄的RNA穩(wěn)定性正相關(guān)。在一個實施方式中，poly (A)尾在100和 5000個腺苷之間。
[0186] RNA的Poly⑷尾可在通過使用poly⑷聚合酶諸如大腸桿菌polyA聚合酶 (E-PAP)的體外轉(zhuǎn)錄后進一步延長。在一個實施方式中，增加 poly (A)尾長度從100個核苷 酸至300和400個之間的核苷酸導致RNA的翻譯效率增加大約兩倍。另外，不同的化學基 團附接至3'末端可增加 mRNA穩(wěn)定性。這樣的附接可包括修飾的/人工的核苷酸、適配體 和其他化合物。例如，ATP類似物可利用poly (A)聚合酶并入poly (A)尾。ATP類似物可進 一步增加 RNA的穩(wěn)定性。
[0187] 5'帽也為RNA分子提供了穩(wěn)定性。在優(yōu)選的實施方式中，通過本文公開的方 法生產(chǎn)的RNA包括5'帽。5'帽利用本領(lǐng)域已知的并在本文中描述的技術(shù)提供（Cougot 等，Trends in Biochem.Sci·，29:436-444 (2001) ;St印inski 等，RNA, 7:1468-95 (2001); Elango 等，Biochim. Biophys. Res. Commun.，330:958-966 (2005))。
[0188] 通過本文公開的方法生產(chǎn)的RNA也可包括內(nèi)部核糖體進入位點（IRES)序列。IRES 序列可為任何病毒的、染色體的或人工設計的序列，其起動結(jié)合至mRNA的不依賴帽的核糖 體，并便于翻譯的開始?？砂ㄈ魏芜m于細胞電穿孔的溶質(zhì)，所述溶質(zhì)可包括促進細胞滲透 性和生存力的因素，諸如糖、肽、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、抗氧化劑和表面活性劑。
[0189] RNA可利用很多不同方法中的任一種引入靶細胞，所述方法例如商業(yè)可得的方法， 其包括但不限于電穿孔（Amaxa Nucleofector_II(Amaxa Biosystems, Cologne, Germany)) ，（ECM830(BTX)(Harvard Instruments, Boston, Mass.)或 Gene Pulser II (BioRad，Denve r, Colo.)，Multiporator(Eppendort, Hamburg Germany)，利用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法的陽離子脂質(zhì)體 介導的轉(zhuǎn)染、聚合物包封、肽介導的轉(zhuǎn)染或生物射彈粒子遞送系統(tǒng)諸如"基因槍"（見例如， Nishikawa 等，Hum Gene Ther·，12 (8) :861-70 (2001))。
[0190] 某閔修飾的T細朐
[0191] 在一些實施方式中，CAR序列利用反轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體傳遞入細胞。表達CAR 的反轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體可利用作為運載體的轉(zhuǎn)導的細胞或包封的、結(jié)合的或裸載體的 無細胞局部或全身傳遞，傳遞入不同類型的真核細胞以及傳遞入組織和整個有機體。所用 方法可用于其中穩(wěn)定表達是需要的或充足的任何目的。
[0192] 在其他實施方式中，CAR序列利用體外轉(zhuǎn)錄的mRNA傳遞入細胞。體外轉(zhuǎn)錄的mRNA CAR可利用作為運載體的轉(zhuǎn)染的細胞或包封的、結(jié)合的或裸mRNA的無細胞局部或全身傳 遞，傳遞入不同類型的真核細胞以及傳遞入組織和整個有機體。所用方法可用于其中瞬時 表達是需要的或充足的任何目的。
[0193] 所公開的方法可在基礎(chǔ)研究和療法中，在癌癥、干細胞、急性和慢性感染以及自體 免疫疾病的領(lǐng)域中，調(diào)整T細胞活性，包括評估基因修飾的T細胞殺死靶癌癥細胞的能力。
[0194] 該方法也提供了通過改變例如啟動子或輸入RNA的量，在寬范圍中控制表達水平 的能力，使其可能單獨調(diào)節(jié)表達水平。此外，基于PCR的mRNA產(chǎn)生的技術(shù)大大促進具有不 同結(jié)構(gòu)和它們結(jié)構(gòu)域的組合的嵌合受體mRNA的設計。例如，改變在相同細胞中的多嵌合受 體上的不同細胞內(nèi)效應器/共刺激因子（costimulator)結(jié)構(gòu)域允許確定受體組合的結(jié)構(gòu)， 所述受體組合評估對抗多抗原靶標的最高水平的細胞毒性，同時對于正常細胞的最低細胞 毒性。
[0195] 本發(fā)明RNA轉(zhuǎn)染方法的一個優(yōu)點是RNA轉(zhuǎn)染是基本上瞬時的和無載體的：RNA轉(zhuǎn) 基因可被傳遞至淋巴細胞并在簡短的體外細胞活化之后在其中表達，作為最小表達盒，而 不需要任何額外的病毒序列。在這些條件下，轉(zhuǎn)基因整合入宿主細胞基因組是不可能的。細 胞的克隆是不必要的，因為RNA的轉(zhuǎn)染效率和它均勻修飾整個淋巴細胞群的能力。
[0196] T細胞通過體外轉(zhuǎn)錄的RNA(IVT-RNA)的基因修飾利用兩種不同的策略，其兩者已 經(jīng)在不同的動物模型中成功測試。細胞通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法或電穿孔，利用體外轉(zhuǎn)錄的RNA進 行轉(zhuǎn)染。優(yōu)選地，期望利用不同的修飾使IVT-RNA穩(wěn)定，以便實現(xiàn)轉(zhuǎn)移的IVT-RNA的持久表 達。
[0197] 一些IVT載體在文獻中已知，其以標準化的方式用作體外轉(zhuǎn)錄的模板，并且其已 經(jīng)以產(chǎn)生穩(wěn)定化的RNA轉(zhuǎn)錄物的方式進行基因修飾。目前用于本領(lǐng)域的方案基于具有以下 結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒載體：能夠?qū)崿F(xiàn)RNA轉(zhuǎn)錄的5'RNA聚合酶啟動子，隨后是通過未翻譯區(qū)（UTR)位 于3'和/或5'的側(cè)翼的感興趣基因，和包括50-70A核苷酸的3'多聚腺苷酸盒。在體外轉(zhuǎn) 錄前，環(huán)形質(zhì)粒通過II型限制酶在多聚腺苷酸盒下游線性化（識別序列對應于切割位點）。 多腺苷酸盒因此對應于轉(zhuǎn)錄物中后面的P〇ly(A)序列。作為該程序的結(jié)果，一些核苷酸作 為酶切割位點的部分在線性化后保持，并延長或掩蓋3'末端上的poly(A)序列。不清楚該 非生理學懸突（overhang)是否影響從這樣的構(gòu)建體細胞內(nèi)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的量。
[0198] RNA具有超過更多傳統(tǒng)質(zhì)?；虿《痉椒ǖ臄?shù)個優(yōu)點。來自RNA來源的基因表達不 需要轉(zhuǎn)錄，并且蛋白質(zhì)產(chǎn)物在轉(zhuǎn)染后快速產(chǎn)生。進一步地，因為RNA不得不僅獲得接近細胞 質(zhì)而不是細胞核的機會，并且因此通常的轉(zhuǎn)染方法導致極高的轉(zhuǎn)染率。另外，基于質(zhì)粒的方 法要求驅(qū)動感興趣基因表達的啟動子在研究的細胞中是活性的。
[0199] 在另一方面，RNA構(gòu)建體可通過電穿孔傳遞入細胞。見例如，核酸構(gòu)建體進入 哺乳動物細胞的電穿孔的制劑和方法，如US 2004/0014645、US 2005/0052630A1、US 2005/0070841A1、US 2004/0059285A1、US 2004/0092907A1 中教導的。包括任何已知 細胞類型的電穿孔需要的電場強度的各種參數(shù)通常在有關(guān)研究文獻以及本領(lǐng)域很多專 利和申請中已知。見例如美國專利號6, 678, 556、美國專利號7, 171，264和美國專利號 7, 173, 116。用于電穿孔的治療性應用的裝置是商業(yè)可得的，例如，MedPulser?DNA電穿孔 療法系統(tǒng)（Inovio/Genetronics, San Diego, Calif.)，并且在諸如美國專利號 6, 567, 694 ; 美國專利號6, 516, 223、美國專利號5, 993, 434、美國專利號6, 181，964、美國專利號 6, 241，701和美國專利號6, 233, 482的專利中描述；電穿孔也可用于體外轉(zhuǎn)染細胞，如例如 US20070128708A1中描述的。電穿孔也可用于體外傳遞核酸進入細胞。因此，利用本領(lǐng)域技 術(shù)人員已知的很多可用的設備和電穿孔系統(tǒng)中的任一個進入包括表達構(gòu)建體的核酸的細 胞的電穿孔介導的給藥呈現(xiàn)了令人興奮的傳遞感興趣RNA至靶細胞的新方法。
[0200] T細朐的來源
[0201] 擴張之前，從受試者獲得T細胞的來源。對象的例子包括人、狗、貓、小鼠、大鼠和 其轉(zhuǎn)基因物種。優(yōu)選地，對象是人。T細胞可獲得自許多來源，包括外周血單核細胞、骨髓、 淋巴結(jié)組織、脾組織和腫瘤。在本發(fā)明的某些實施方式中，可使用本領(lǐng)域可用的任何數(shù)量的 T細胞系。在本發(fā)明的某些實施方式中，T細胞可獲得自使用技術(shù)人員已知的任何數(shù)量的 技術(shù)，比如ficoll分離從受試者收集的單位血液。在一種優(yōu)選的實施方式中，通過單采血液 成分術(shù)或白細胞采集獲得來自個體的循環(huán)血液的細胞。單采血液成分術(shù)產(chǎn)物典型地含有淋 巴細胞，包括T細胞、單核細胞、粒細胞、B細胞，其他成核白細胞、紅細胞和血小板。在一個 實施方式中，可清洗通過單采血液成分術(shù)收集的細胞，以移除血漿部分并將細胞放置在適 當?shù)木彌_液或培養(yǎng)基中，用于隨后的處理步驟。在本發(fā)明的一個實施方式中，細胞用磷酸鹽 緩沖鹽水（PBS)清洗。在可選實施方式中，清洗溶液缺少鈣并可缺少鎂或可缺少很多-- 如果不是全部--二價陽離子。沖洗之后，細胞可重新懸浮在各種生物相容性緩沖液中，t匕 如，例如，無 Ca、無 Mg PBS?？蛇x地，可移除單采血液成分術(shù)樣本的不期望成分和細胞直接 重新懸浮在培養(yǎng)基中。
[0202] 在另一實施方式中，通過溶解紅細胞和耗減單核細胞從外周血分離T細胞，例如， 通過利用PERC0LL?梯度的離心。可選地，T細胞可分離自臍帶。在任何情況下，特定的T 細胞亞群可通過陽性或陰性選擇技術(shù)被進一步分離。
[0203] 通過陰性選擇的T細胞群的富集可利用涉及對陰性選擇的細胞獨特的表面標記 的抗體的組合完成。優(yōu)選的方法為細胞分選和/或選擇，其經(jīng)陰性磁性免疫粘附或使用針 對存在于陰性選擇的細胞上的細胞表面標記的單克隆抗體的混合物的流式細胞術(shù)進行。例 如，為了通過陰性選擇富集⑶4+細胞，單克隆抗體混合物通常包括對⑶14、⑶20、⑶lib、 CD16、HLA-DR 和 CD8 的抗體。
[0204] 對于通過陽性或陰性選擇分離期望的細胞群，可改變細胞和表面（例如，顆粒諸 如珠）的濃度。在某些實施方式中，可期望顯著減少其中珠和細胞被混合在一起的體積 (即，增加細胞濃度），以確保細胞和珠的最大接觸。例如，在一個實施方式中，使用20億細 胞/ml的濃度。在一個實施方式中，使用10億細胞/ml的濃度。在進一步的實施方式中，使 用多于1億細胞/ml。在進一步的實施方式中，使用10、15、20、25、30、35、40、45或50X10 6 細胞/ml的細胞濃度。還在另一個實施方式中，使用75、80、85、90、95或100父106細胞>1 的細胞濃度。在進一步的實施方式中，可使用125或150X 106細胞/ml的濃度。使用高濃 度可產(chǎn)生增加的細胞產(chǎn)量、細胞活化和細胞擴張。
[0205] 在相關(guān)的實施方式中，可期望使用更低濃度的細胞。通過顯著稀釋T細胞和表面 (例如，顆粒諸如珠）的混合物，顆粒和細胞之間的相互作用被最小化。這選擇表達高數(shù)量 的結(jié)合至顆粒的期望抗原的細胞。例如，在稀濃度，CD4+T細胞比CD8+T細胞表達更高水平 的⑶28并更有效地被捕獲。
[0206] 用于刺激的T細胞可也在沖洗步驟之后冷凍，其不需要單核細胞移除步驟。盡管 不希望被理論限制，通過去除細胞群體中的粒細胞和以一些程度去除單核細胞，冷凍和隨 后的解凍步驟提供了更均一的產(chǎn)物。在移除血漿和血小板的沖洗步驟之后，細胞可懸浮在 冷凍液中。盡管許多冷凍液和參數(shù)是本領(lǐng)域已知的并且將用于該背景下，但是在非限制性 例子中，一種方法包括使用含有20 % DMS0和8 %人血清白蛋白的PBS，或其他適當?shù)募毎?冷凍媒介。然后細胞以每分鐘Γ的速度被冷凍至_80°C并且存儲在液氮儲罐的蒸汽相中。 可使用受控冷凍的其他方法以及在_20°C下或液氮中不受控的即刻冷凍。
[0207] Thl7/Tcl7 細朐
[0208] 在一個實施方式中，本發(fā)明涉及基因修飾的Thl7細胞。已經(jīng)被修飾以表達本發(fā)明 的CAR的Thl7細胞被朝著特異性抗原（例如間皮蛋白）改變，并且因此可用于治療與特異 性抗原相關(guān)的癌癥。本發(fā)明是基于令人吃驚的發(fā)現(xiàn)，CAR的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中并入IC0S信號 傳導結(jié)構(gòu)域增加 Thl7持久性、增加 IL-17產(chǎn)生、增加抗腫瘤活性和減少IL-2產(chǎn)生。
[0209] T輔助細胞（也稱為效應子T細胞或Th細胞）是淋巴細胞的亞組（一類白血細胞 或白細胞），其在建立和最大化免疫系統(tǒng)的能力和尤其激活和引導其他免疫細胞方面具有 重要的作用。不同的類型的Th細胞已經(jīng)認識為啟動分化過程結(jié)果并且與特定表型相關(guān)。T 細胞發(fā)育之后，成熟的、幼稚（意思是它們從未暴露于它們可應答的抗原）的T細胞離開胸 腺并且開始遍布身體分布。幼稚T細胞已知分化成T-輔助1 (Thl)、T-輔助2 (Th2)、T-輔 助17(Thl7)或調(diào)節(jié)T細胞（Treg)表型。
[0210] 這些Th細胞類型的每個分泌細胞因子、蛋白質(zhì)或肽，其刺激或與其他白細胞，包 括Th細胞相互作用。但是，每個細胞類型具有特殊的表型和活性干擾并且通常與其他的沖 關(guān)。
[0211] Thl、Th2和Thl7(炎癥T-輔助或炎癥Th)，通過分泌促炎癥細胞因子，比如IL-1、 IL-6、TNF-a、IL-17、IL21、IL23,和/或通過活化和/或抑制其他T細胞包括其他Th細胞 (例如Thl細胞抑制Th2和Thl7, Th2抑制Thl和Thl7)促進炎癥應答。相反，Tregs是免 疫系統(tǒng)的組分，其抑制與免疫應答相關(guān)的其他細胞的生物活性。尤其，Tregs可分泌免疫抑 制細胞因子TGF-β和白細胞介素10,并且已知能夠限制或抑制炎癥。
[0212] Thl7細胞或展示Thl7細胞表型的其他細胞可具有各種特異的表型性質(zhì)，這取決 于使用的條件。此類表型性質(zhì)包括產(chǎn)生IL-17A和IFNY。而且，在它們初級擴張之后，擴張 的Thl7細胞繼續(xù)產(chǎn)生IL-17A和IFN γ事件。在一些情況下，Thl7細胞共表達R0R γ t和 T-bet，轉(zhuǎn)錄因子，其分別調(diào)節(jié)Thl7和Thl細胞發(fā)育。在一些情況下，擴張的T細胞在它們 的細胞表面上共表達IL-23R和⑶161，與臍帶Thl7細胞相關(guān)的表型標記。在一些情況下， Thl7細胞表達RORyt。
[0213] 在一個實施方式中，本發(fā)明提供純化的IC0S+⑶28+臍帶血液Thl7前體細胞群體， 其當被刺激時分泌升高水平的CCL20、IL-17F和IFN γ。本發(fā)明的細胞可用于臨床應用，用 于設計用于具有癌癥、傳染病和自身免疫性的患者的免疫療法。
[0214] Thl7細朐的活化和擴張
[0215] 不論在T細胞基因修飾以表達期望的CAR之前或之后，T細胞都可通常使用以 下所述的方法活化和擴張：例如美國專利6, 352, 694 ;6, 534, 055 ;6, 905, 680 ;6, 692, 964 ; 5, 858, 358 ；6, 887, 466 ；6, 905, 681 ；7, 144, 575 ；7, 067, 318 ；7, 172, 869 ；7, 232, 566 ； 7, 175, 843 ;5, 883, 223 ;6, 905, 874 ;6, 797, 514 ;6, 867, 041 ;和美國專利申請公布號 20060121005。
[0216] 通常地，本發(fā)明的T細胞通過與表面的接觸進行擴張，所述表面具有附著于其的 刺激CD3/TCR復合物相關(guān)信號的試劑和刺激T細胞表面上的共刺激分子的配體。特別地， T細胞群可如本文所述的諸如通過與固定在表面上的抗CD3抗體或其抗原-結(jié)合片段或抗 ⑶2抗體接觸，或通過和與鈣離子載體組合的蛋白激酶C激活劑（例如，苔蘚抑制素）接 觸進行刺激。對于T細胞表面上的輔助分子的共刺激，使用結(jié)合輔助分子的配體。例如， T細胞群可在適于刺激T細胞增殖的條件下與抗CD3抗體和抗CD28抗體接觸。為了刺激 Thl7細胞的增殖，細胞可接觸抗⑶3抗體和抗ICOS抗體。Thl7細胞可也被表達ICOS配 體（IC0SL)的人工抗原呈遞細胞（aAPC)刺激。刺激可在存在Thl7-極化細胞因子的情況 下進行。Thl7-極化細胞因子的例子包括但不限于IL-6、IL-1 β和IL-23細胞因子和中和 IFNy和IL-4抗體。
[0217] Τ細胞可通過使試劑與Τ細胞上的細胞表面部分接觸刺激。在本發(fā)明的一個方面 中，針對⑶3和IC0S的抗體被負載至aAPC。此外，刺激可包括結(jié)合TCR/⑶3復合物和啟動 初級刺激信號的任何配體。該配體可用作負載到aAPC上或由aAPC表達的初級活化試劑。 結(jié)合IC0S和啟動IC0S信號轉(zhuǎn)導通路，因此造成細胞與CD3配體的共刺激和增強T細胞的 群體活化的任何配體是IC0S配體和因此是共刺激試劑。
[0218] T細胞可暴露于下述珠，其包括結(jié)合TCR/CD3復合物和啟動初級刺激信號的第一 試劑和結(jié)合IC0S和啟動IC0S信號轉(zhuǎn)導通路的第二試劑，因此造成細胞與⑶3配體的共刺 激和增強T細胞群體的活化。
[0219] 刺激的細胞被活化，如由信號轉(zhuǎn)導的引導、細胞表面標記的表達和/或增殖所顯 示。適于Thl7細胞的標記包括但不限于它們分泌升高水平的IL-17A、IL-17F和CCL20的 能力。而且，與CD28共刺激的細胞相比，按照IC0S共刺激方法產(chǎn)生和擴張的細胞擴張不僅 僅展示提高的Thl7相關(guān)細胞因子的產(chǎn)生，而且也展示升高的IFN γ、TNF α和IL-21分泌。
[0220] 在通過刺激Τ細胞上的IC0S產(chǎn)生Thl7細胞的背景下，aAPC可被工程化以包括結(jié) 合T細胞的TCR/⑶3復合物的第一試劑和結(jié)合IC0S的第二試劑，aAPC可進一步被工程化， 以包括促進Thl7分化的細胞因子。示例性Thl7分化細胞因子包括但不限于IL-2、IL-6、 IL-23 和 IL-1。
[0221] 因此，T細胞刺激可包括aAPC，其已經(jīng)被基因修飾以表達刺激試劑、共刺激試劑 和/或細胞因子以及其他多肽。aAPC可使用本文公開的方法或本領(lǐng)域用于基因修飾細胞 的已知的方法被工程化，以表達和分泌任何期望的細胞因子，促進Thl7分化。細胞因子可 以是細胞因子的全長、片段、同源物、變體或突變體。細胞因子包括能夠影響另一細胞的生 物學功能的蛋白質(zhì)。受細胞因子影響的生物學功能可包括但不限于細胞生長，細胞分化 或細胞死亡。在刺激Thl7細胞的刺激時，細胞因子可結(jié)合細胞表面上的特異性受體，從 而促進Thl7分化。優(yōu)選的細胞因子包括造血生長因子、白細胞介素、干擾素、免疫球蛋白 超家族分子、腫瘤壞死因子家族分子和/或趨化因子等等。細胞因子包括但不限于粒細 胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF)、腫瘤壞死因子a (TNFa)、腫瘤壞死因子β (TNFi3)、 巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF)、白細胞介素-1 (IL-1)、白細胞介素-2(IL-2)、白細胞 介素-4(IL-4)、白細胞介素-5(IL-5)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-IO(IL-IO)、 白細胞介素-12(IL-12)、白細胞介素-15(IL-15)、白細胞介素-21(IL-21)、白細胞介 素-23(IL_23)、干擾素 a (IFNa)、干擾素 β (IFNi3)、干擾素 γ (IFNY)和IGIF等等。更 優(yōu)選的細胞因子包括促進Thl7分化的細胞因子，其包括但不限于IL-2、IL-6、IL-1 (例如， IL-1 β )。一旦具備本文提供的教導，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，本發(fā)明包括任何Thl7分化 促進細胞因子，比如本領(lǐng)域已知的那些，以及將來任何公開的那些。
[0222] 除了工程化aAPC以包括Thl7分化促進細胞因子，aAPC可被工程化以包括可阻礙 干擾Thl7分化過程的細胞因子的抑制分子。例如，aAPC可被工程化，以分泌中和抗體，其 可抑制干擾Thl7分化的細胞因子。干擾Thl7分化過程的細胞因子包括但不限于IFNY和 IL-4〇
[0223] 當aAPC已經(jīng)被工程化以表達促進Thl7分化的期望的細胞因子和/或干擾Thl7 分化的細胞因子的抑制劑時，提供了激活和/或刺激T細胞的群體，以促進Thl7在沒有外 源性添加的細胞因子的情況下分化的方法。此外，這種Thl7分化可發(fā)生在體內(nèi)。
[0224] 在某些實施方式中，T細胞的初級刺激信號和共刺激信號可通過不同的方案提供。 例如，提供每個信號的試劑可在溶液中或連接至表面。當連接至表面時，試劑可被連接至同 一表面（即，以"cis"形式）或分開的表面（S卩，以"trans"形式）。可選地，一種試劑可被 連接至表面和另一種試劑處于溶液中。在一個實施方式中，提供共刺激信號的試劑被結(jié)合 至細胞表面，并且提供初級活化信號的試劑在溶液中或被連接至表面。在一些實施方式中， 兩種試劑可都在溶液中。在另一個實施方式中，試劑可處于可溶形式，隨后被交聯(lián)至表面， 諸如表達Fc受體或抗體的細胞或?qū)⒔Y(jié)合該試劑的其他結(jié)合劑。在這點上，見例如用于人造 抗原呈遞細胞（aAPC)的美國專利申請公布號20040101519和20060034810,其被考慮用于 活化和擴張本發(fā)明的T細胞。
[0225] 在一個實施方式中，兩種試劑被固定在珠上，在同一珠即"cis"上或分開的珠即 "trans"上。作為例子，提供初級活化信號的試劑為抗CD3抗體或其抗原-結(jié)合片段，和提 供共刺激信號的試劑為抗IC0S抗體或其抗原-結(jié)合片段；并且兩種試劑都以相等的分子 數(shù)量被共固定至同一珠。在一個實施方式中，使用結(jié)合至用于Thl7細胞生長的珠的每種抗 體的1:1比率。在本發(fā)明的某些方面中，使用結(jié)合至珠的抗⑶3:IC0S抗體的比率，以便與 利用1:1比率觀察到的擴張相比，觀察到Thl7細胞擴張的增加。在一個實施方式中，結(jié)合 至珠的⑶3: IC0S抗體的比率處于100:1至1:100的范圍中和其間的所有整數(shù)值。在本發(fā) 明的一個方面中，比抗⑶3抗體更多的抗IC0S抗體被結(jié)合至顆粒，即⑶3: IC0S的比率小于 1。在本發(fā)明的某些實施方式中，結(jié)合至珠的抗IC0S抗體與抗⑶3抗體的比率大于2:1。在 一個具體的實施方式中，使用結(jié)合至珠的抗體的1:100的⑶3: IC0S比率。在另一個實施方 式中，使用結(jié)合至珠的抗體的1:75的⑶3: IC0S比率。在進一步的實施方式中，使用結(jié)合至 珠的抗體的1:50的⑶3: IC0S比率。在另一個實施方式中，使用結(jié)合至珠的抗體的1:30的 ⑶3: IC0S比率。在一個優(yōu)選實施方式中，使用結(jié)合至珠的抗體的1:10的⑶3: IC0S比率。 在另一個實施方式中，使用結(jié)合至珠的抗體的1:3的CD3:IC0S比率。還在另一個實施方式 中，使用結(jié)合至珠的抗體的3:1的⑶3: IC0S比率。
[0226] 從1:500至500:1和其間任何整數(shù)值的顆粒與細胞的比率可用于刺激T細胞或其 他靶細胞。因為在本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地領(lǐng)會到，顆粒與細胞的比率可取決于相對于靶 細胞的顆粒大小。例如，小尺寸的珠僅可結(jié)合一些細胞，而較大的珠能結(jié)合很多。在某些實 施方式中，細胞與顆粒的比率在從1:100至100:1的范圍內(nèi)和其間任何整數(shù)值，和在進一步 的實施方式中，該比率包括1:9至9:1和其間任何整數(shù)值，也可用于刺激T細胞?？耿?-和 抗IC0S-結(jié)合的顆粒與產(chǎn)生T細胞刺激的T細胞的比率可如以上記錄的變化，然而某些優(yōu) 選的值包括 1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、 2 :1、3:1、4:1、5:1、6:1、7 :1、8:1、9:1、10:1 和 15:1，一個優(yōu)選的比率為至少 1:1 顆粒每個 T 細胞。在一個實施方式中，使用1:1或更小的顆粒與細胞的比率。在一個具體的實施方式 中，優(yōu)選的顆粒：細胞比率為1:5。在進一步的實施方式中，顆粒與細胞的比率可根據(jù)刺激 天數(shù)而改變。例如，在一個實施方式中，顆粒與細胞的比率在第一天為從1:1至10:1，和額 外的顆粒此后每天或每隔一天直至10天，以從1:1至1:10的最終比率（基于添加日的細 胞計數(shù)）被添加至細胞。在一個具體的實施方式中，顆粒與細胞的比率在刺激的第一天為 1:1并在刺激的第三和第五天被調(diào)節(jié)至1:5。在另一個實施方式中，顆粒在每天或每隔一天 的基礎(chǔ)上添加，以在第一天最終比率為1:1，并在刺激的第三和第五天最終比率為1:5。在 另一個實施方式中，顆粒與細胞的比率在刺激的第一天為2:1并在刺激的第三和第五天被 調(diào)節(jié)至1:10。在另一個實施方式中，顆粒在每天或每隔一天的基礎(chǔ)上添加，以在第一天最終 比率為1:1，和在刺激的第三和第五天最終比率為1:10。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解多種其他 比率可適于用于本發(fā)明。特別地，比率將根據(jù)顆粒大小和細胞大小和類型而變化。
[0227] 在本發(fā)明的進一步的實施方式中，細胞諸如T細胞，與包被試劑的珠組合，隨后分 離該珠和細胞，并且隨后培養(yǎng)該細胞。在一個可選實施方式中，在培養(yǎng)前，不分離包被試劑 的珠和細胞，而是在一起進行培養(yǎng)。在進一步的實施方式中，珠和細胞首先通過施加力諸如 磁力被聚集，產(chǎn)生增加的細胞表面標記的連接作用，由此誘導細胞刺激。
[0228] 作為例子，可通過允許附接抗⑶3和抗ISC0的順磁珠接觸T細胞，來連接細胞表 面蛋白。在一個實施方式中，細胞（例如，1〇 4至1〇9個T細胞）和珠（例如，以1:1比率的 順磁珠）在緩沖液優(yōu)選PBS (沒有二價陽離子諸如，鈣和鎂）中進行聯(lián)合。此外，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可容易理解可使用任何細胞濃度。例如，靶細胞可在樣本中非常稀少并僅占〇. 01%的 樣本，或整個樣本（即，100% )可包括感興趣的靶細胞。因此，任何細胞數(shù)量都在本發(fā)明的 內(nèi)容內(nèi)。在某些實施方式中，可期望顯著降低其中顆粒和細胞混合在一起的體積（即，增加 細胞濃度），以確保細胞和顆粒的最大接觸。例如，在一個實施方式中，使用大約20億細胞 /ml的濃度，在另一個實施方式中，使用多于1億細胞/ml。在進一步的實施方式中，使用細 胞濃度10、15、20、25、30、35、40、45或50X 106細胞/ml。還在另一個實施方式中，使用細胞 濃度75、80、85、90、95或100\10 6細胞/1111，在進一步的實施方式中，可使用125或150\106 細胞/ml的濃度。利用高濃度可產(chǎn)生增加的細胞產(chǎn)量、細胞活化和細胞擴張。進一步地，使 用高細胞濃度允許更有效地捕獲可微弱表達感興趣的靶抗原的細胞，諸如CD28-陰性T細 胞。這樣的細胞群可具有治療價值并將在某些實施方式中期望獲得。例如，利用高濃度的 細胞允許更有效選擇正常具有更弱CD28表達的CD8+T細胞。
[0229] 在本發(fā)明的一個實施方式中，混合物可被培養(yǎng)數(shù)個小時（大約3個小時）至大約 14天或其間任何個小時的整數(shù)值。在另一個實施方式中，混合物可被培養(yǎng)21天。在本發(fā)明 的一個實施方式中，珠和T細胞在一起培養(yǎng)大約八天。在另一個實施方式中，珠和T細胞在 一起培養(yǎng)2-3天。也可期望數(shù)個周期的刺激，以便T細胞的培養(yǎng)時間可為60天或更多天。 適于T細胞培養(yǎng)的條件包括適當?shù)呐囵B(yǎng)基（例如，最小必需培養(yǎng)基或RPM1培養(yǎng)基1640或 X-viv〇15,（Lonza))，其可包含增殖和存活必需的因子，包括血清（例如，胎牛或人血清）、 白細胞介素-2 (IL-2)、胰島素、IFN- γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFp 和 TNF-α或技術(shù)人員已知的用于細胞生長的任何其他添加劑。用于細胞生長的其他添加劑 包括但不限于表面活性劑、人血漿蛋白粉（plasmanate)和還原劑諸如N-乙?；?半胱氨 酸和 2-巰基乙醇。培養(yǎng)基可包括 RPMI1640、AM-V、DMEM、MEM、a -MEM、F-12、X-Vivol5 和 X-Vivo20、優(yōu)選的（Optimizer)，具有添加的氨基酸、丙酮酸鈉和維生素、無血清或補充適當 量的血清（或血漿）或限定的激素組，和/或足夠T細胞的生長和擴張量的細胞因子（一 個或多個）?？股?，例如青霉素和鏈霉素，僅被包括在實驗培養(yǎng)物中，而不包括在注入對象 的細胞培養(yǎng)物中。靶細胞被保持在支持生長必需的條件下，例如，適當?shù)臏囟龋ɡ纾?7°C ) 和氣氛（例如，空氣加5% C02)。
[0230] 已經(jīng)暴露于變化刺激時間的T細胞可顯示不同的特性。例如，典型的血液或單采 的（apheresed)外周血單核細胞產(chǎn)物具有比細胞毒性或抑制T細胞群（Tc，CD8+)更多的輔 助T細胞群（Th，⑶4+)。因此，取決于治療目的，用主要包括Th細胞的T細胞群注入對象可 為有利的。類似地，如果已經(jīng)分離了 Tc細胞的抗原-特異性亞型，則它可有益于以更大的 程度擴張該亞型。
[0231] 進一步地，除了⑶4和⑶8標記，其他表型標記在細胞擴張過程的進程期間，也顯 著地但以大部分可重復地變化。因此，這種重復性使針對具體目的調(diào)節(jié)活化的T細胞產(chǎn)物 的能力能夠?qū)崿F(xiàn)。
[0232] 本領(lǐng)域技術(shù)人員容易認識到本文所述的細胞刺激方法可在各種環(huán)境（即，容器） 中進行。例如，此類容器可以是培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)袋，或能夠容納細胞的任何容器，優(yōu)選地在無菌 環(huán)境中。在本發(fā)明的一個實施方式中，生物反應器也是可用的。例如，當前數(shù)個制造商制造 了可用于生長細胞的設備并且用于與本發(fā)明的方法一起使用。見例如，覆蓋生物反應器的 專利比如美國專利號6, 096, 532 ;5, 985, 653 ;5, 888, 807 ;5, 190, 878,其每一篇通過引用以 其整體并入本文。
[0233] 治療件應用
[0234] 本發(fā)明包括被修飾以表達CAR的細胞（例如，Thl7細胞），該CAR將特異性抗體的 抗原識別結(jié)構(gòu)域與⑶3-ζ、⑶28、4_1BB、IC0S或任何其組合的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域聯(lián)合。因此，在 一些例子中，轉(zhuǎn)導的Thl7細胞可引起CAR-介導的T-細胞應答。
[0235] 本發(fā)明提供了 CAR改變初級T細胞對腫瘤抗原的特異性的用途。因此，本發(fā)明也 提供了刺激對哺乳動物的靶細胞群或組織的T細胞-介導的免疫應答的方法，其包括以下 步驟：施用給哺乳動物表達CAR的T細胞，其中CAR包括特異性地與預定標靶相互作用的結(jié) 合部分，包括例如人CD3(的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的ζ鏈部分，和共刺激信號傳導區(qū)。
[0236] 在一個實施方式中，本發(fā)明包括一類細胞療法，其中Τ細胞被基因修飾以表達CAR 并且CAR T細胞被注入至需要其的受試者中。注入的細胞能夠殺死受試者中的腫瘤細胞。 不像抗體療法，CAR T細胞能夠在體內(nèi)復制，產(chǎn)生可導致持續(xù)的腫瘤控制的長期持久性。
[0237] 在一個實施方式中，本發(fā)明的CAR T細胞可經(jīng)歷穩(wěn)固的體內(nèi)T細胞擴張并可持續(xù) 延長的時間量。在另一個實施方式中，本發(fā)明的CAR T細胞發(fā)展成可被重新活化以抑制任 何額外腫瘤形式或生長的特異性記憶T細胞。例如，料想不到的是在由基因修飾的Thl7細 胞中表達的CAR中包括IC0S信號傳導結(jié)構(gòu)域?qū)е略黾?Thl7持久性和增加抗腫瘤活性。不 希望被任何具體理論限制，在遇到并隨后消除表達替代抗原的靶細胞后，CAR T細胞可體內(nèi) 分化成中心記憶樣狀態(tài)。
[0238] 不希望被任何具體理論限制，由CAR-修飾T細胞引起的抗腫瘤免疫性應答可以 是主動或被動免疫應答。另外，CAR介導的免疫應答可以是過繼免疫療法的一部分，其中 CAR-修飾T細胞誘導特異性針對CAR中抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的免疫應答。例如，表達抗間皮蛋 白CAR的基因修飾的Thl7細胞引起特異性針對表達間皮蛋白的細胞的免疫應答。
[0239] 盡管本文公開的數(shù)據(jù)具體公開了慢病毒載體包括SSlscFv、人⑶8 α鉸鏈、IC0S跨 膜結(jié)構(gòu)域、和IC0S和CD3 ζ信號傳導結(jié)構(gòu)域，本發(fā)明應解釋為包括對構(gòu)建體組成部分中的 每一個的任何數(shù)量的變化，如本文其他地方所述的。即，本發(fā)明包括CAR中任何抗原結(jié)合結(jié) 構(gòu)域產(chǎn)生特異性針對抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的CAR-介導的T-細胞應答的用途。例如，本發(fā)明CAR 的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可靶向腫瘤抗原，用于治療癌癥的目的。
[0240] 可治療的癌癥包括沒有被血管化或基本上還沒有被血管化的腫瘤，以及血管化的 腫瘤。癌癥可包括非實體瘤（諸如血液學腫瘤，例如白血病和淋巴瘤）或可包括實體瘤。用 本發(fā)明的CAR治療的癌癥類型包括但不限于癌、胚細胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴惡 性腫瘤、良性和惡性腫瘤、和惡性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人腫瘤/癌癥和兒童 腫瘤/癌癥。
[0241] 血液學癌癥為血液或骨髓的癌癥。血液學（或血原性）癌癥的例子包括白血病， 包括急性白血?。ㄖT如急性淋巴細胞白血病、急性髓細胞白血病、急性骨髓性白血病和成 髓細胞性、早幼粒細胞性、粒-單核細胞性、單核細胞性和紅白血?。⒙园籽。ㄖT如慢 性髓細胞（粒細胞性）白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴細胞白血?。?、真性紅細胞增 多癥、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤（無痛和高等級形式）、多發(fā)性骨髓瘤、瓦 爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥、重鏈疾病、骨髓增生異常綜合征、多毛細胞白血病和脊髓發(fā)育 不良。
[0242] 實體瘤為通常不包含囊腫或液體區(qū)的組織的異常腫塊。實體瘤可為良性或惡性 的。不同類型的實體瘤以形成它們的細胞類型命名（諸如肉瘤、癌和淋巴瘤）。實體瘤諸 如肉瘤和癌的例子包括纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜 瘤、間皮瘤、尤因氏腫瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、淋巴惡性腫瘤、胰腺癌、乳腺癌、 肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝細胞癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲狀腺髓樣癌、 乳頭狀甲狀腺癌、嗜鉻細胞瘤皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞 癌、肝細胞瘤、膽管癌、絨膜癌、維爾姆斯氏腫瘤、子宮頸癌、睪丸腫瘤、精原細胞瘤、膀胱癌、 黑素瘤和CNS腫瘤（諸如神經(jīng)膠質(zhì)瘤（諸如腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤和混合神經(jīng)膠質(zhì)瘤）、成膠質(zhì) 細胞瘤（也已知為多形性成膠質(zhì)細胞瘤）星形細胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖細胞瘤、成神經(jīng)管 細胞瘤、神經(jīng)鞘瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì) 瘤、腦膜瘤、神經(jīng)細胞瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤和腦轉(zhuǎn)移）。
[0243] 在一個實施方式中，本發(fā)明CAR的抗原結(jié)合部分部分被設計為治療具體的癌癥。 例如，設計為靶向CD19的CAR可用于治療癌癥和病癥，包括但不限于前-BALL (兒童指征）、 成人ALL、套細胞淋巴瘤、擴散大B-細胞淋巴瘤，同種骨髓移植后的補救等等。
[0244] 在另一實施方式中，CAR可設計為靶向⑶22,以治療擴散大B-細胞淋巴瘤。
[0245] 在一個實施方式中，癌癥和病癥包括但不限于前-B ALL(兒童指征）、成人ALL、 套細胞淋巴瘤、擴散大B-細胞淋巴瘤，同種骨髓移植后的補救等等可使用靶向CD19、CD20、 ⑶22和R0R1的CAR的組合治療。
[0246] 在一個實施方式中，CAR可設計為靶向間皮蛋白，以治療間皮瘤、胰腺癌、卵巢癌等 等。在另一實施方式中，CAR可設計為靶向CD33/IL3Ra，以治療急性骨髓性白血病等等。在 進一步的實施方式中，CAR可設計為靶向c-Met，以治療三陰性乳腺癌、非小細胞肺癌等等。
[0247] 在一個實施方式中，CAR可設計為靶向PSMA，以治療前列腺癌等等。在另一實施方 式中，CAR可設計為靶向糖脂F(xiàn)77,以治療前列腺癌等等。在進一步的實施方式中，CAR可設 計為靶向EGFRvIII，以治療膠質(zhì)母細胞瘤等等。
[0248] 在一個實施方式中，CAR可設計為靶向⑶-2,以治療成神經(jīng)細胞瘤，黑素瘤等等。 在另一實施方式中，CAR可設計為靶向NY-ES0-1TCR，以治療骨髓瘤、肉瘤、黑素瘤等等。在 進一步的實施方式中，CAR可設計為靶向MAGE A3TCR，以治療骨髓瘤、肉瘤、黑素瘤等等。
[0249] 然而，本發(fā)明不應被解釋為僅限于本文公開的抗原標靶和疾病。相反地，本發(fā)明應 被解釋為包括任何與可使用CAR治療的疾病相關(guān)的抗原標靶。
[0250] 本發(fā)明的CAR-修飾T細胞也可用作對哺乳動物離體免疫和/或體內(nèi)療法的疫苗 類型。優(yōu)選地，哺乳動物為人。
[0251] 對于離體免疫，以下中的至少一項在將細胞施用進入哺乳動物前在體外發(fā)生：i) 擴張細胞，ii)將編碼CAR的核酸引入細胞，和/或iii)冷凍保存細胞。
[0252] 離體程序在本領(lǐng)域中是公知的，并在以下更完全地進行討論。簡單地說，細胞從哺 乳動物（優(yōu)選人）中分離并用表達本文公開的CAR的載體進行基因修飾（即，體外轉(zhuǎn)導或 轉(zhuǎn)染）。CAR-修飾的細胞可被施用給哺乳動物接受者，以提供治療益處。哺乳動物接受者 可為人，和CAR-修飾的細胞可相對于接受者為自體的。可選地，細胞可相對于接受者為同 種異基因的、同基因的（syngeneic)或異種的。
[0253] 在此通過引用并入的在美國專利號5, 199, 942中描述的造血干細胞和祖細胞的 離體擴張程序，可被應用至本發(fā)明的細胞。其他合適的方法在本領(lǐng)域中是已知的，因此本 發(fā)明不限于細胞離體擴張的任何具體方法。簡單地說，T細胞的離體培養(yǎng)和擴張包括：（1) 從外周血收獲物或骨髓外植體收集來自哺乳動物的CD34+造血干細胞和祖細胞；和（2)離 體擴張這樣的細胞。除了美國專利號5, 199, 942中描述的細胞生長因子，其他因子諸如 flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配體，也可用于培養(yǎng)和擴張細胞。
[0254] 除了就離體免疫而言使用基于細胞的疫苗之外，本發(fā)明也提供了體內(nèi)免疫以引起 針對患者中抗原的免疫應答的組合物和方法。
[0255] 通常地，如本文所述活化和擴張的細胞可用于治療和預防無免疫應答的個體中產(chǎn) 生的疾病。特別地，本發(fā)明的CAR-修飾的T細胞用于治療癌癥。在某些實施方式中，本發(fā) 明的細胞用于治療處于形成癌癥風險中的患者。因此，本發(fā)明提供了治療或預防癌癥的方 法，其包括施用給需要其的對象治療有效量的本發(fā)明的CAR-修飾的T細胞。
[0256] 本發(fā)明的CAR-修飾的T細胞可被單獨施用或作為藥物組合物與稀釋劑和/或與 其他組分諸如IL-2或其他細胞因子或細胞群結(jié)合施用。簡單地說，本發(fā)明的藥物組合物可 包括如本文所述的靶細胞群，與一種或多種藥學或生理學上可接受載體、稀釋劑或賦形劑 結(jié)合。這樣的組合物可包括緩沖液諸如中性緩沖鹽水、硫酸鹽緩沖鹽水等等；碳水化合物諸 如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白質(zhì)；多肽或氨基酸諸如甘氨酸；抗氧化劑； 螯合劑諸如EDTA或谷胱甘肽；佐劑（例如，氫氧化鋁）；和防腐劑。本發(fā)明的組合物優(yōu)選配 制用于靜脈內(nèi)施用。
[0257] 本發(fā)明的藥物組合物可以以適于待治療（或預防）的疾病的方式施用。施用的數(shù) 量和頻率將由這樣的因素確定，如患者的狀況、和患者疾病的類型和嚴重度--盡管適當 的劑量可由臨床試驗確定。
[0258] 當指出"免疫學上有效量"、"抗腫瘤有效量"、"腫瘤-抑制有效量"或"治療量"時， 待施用的本發(fā)明組合物的精確量可由醫(yī)師確定，其考慮患者（對象）的年齡、重量、腫瘤大 小、感染或轉(zhuǎn)移程度和狀況的個體差異。可通常指出：包括本文描述的T細胞的藥物組合物 可以以104至109個細胞/kg體重的劑量，優(yōu)選105至10 6個細胞/kg體重的劑量--包括 那些范圍內(nèi)的所有整數(shù)值--施用。T細胞組合物也可以以這些劑量多次施用。細胞可通 過使用免疫療法中公知的注入技術(shù)（見例如Rosenberg等，New Eng. J. of Med. 319:1676， 1988)施用。對于具體患者的最佳劑量和治療方案可通過監(jiān)測患者的疾病跡象并因此調(diào)節(jié) 治療由醫(yī)學領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。
[0259] 在某些實施方式中，可期望向?qū)ο笫┯没罨腡細胞，并隨后重新抽取（redraw) 血液（或?qū)嵤﹩尾裳撼煞中g(shù)），根據(jù)本發(fā)明活化來自其中的T細胞，和用這些活化和擴張 的T細胞再注入該患者。該過程可每幾個周進行多次。在某些實施方式中，T細胞可從10cc 至400cc的血液抽取中進行活化。在一些實施方式中，T細胞從20cc、30cc、40cc、50cc、 60cc、70cc、80cc、90cc或lOOcc的血液抽取中進行活化。不被理論所束縛，利用多份血液抽 取/多個再輸注方案可用于選出某些T細胞群。
[0260] 對象組合物的施用可以以任何方便的方式進行，包括通過噴霧法、注射、吞咽、輸 液、植入或移植。本文描述的組合物可被皮下、皮內(nèi)、瘤內(nèi)、結(jié)內(nèi)、脊髓內(nèi)、肌肉內(nèi)、通過靜脈 內(nèi)（i.v.)注射或腹膜內(nèi)施用給患者。在一個實施方式中，本發(fā)明的T細胞組合物通過皮內(nèi) 或皮下注射被施用給患者。在另一個實施方式中，本發(fā)明的T細胞組合物優(yōu)選通過i.v.注 射施用。T細胞的組合物可被直接注入腫瘤、淋巴結(jié)或感染位置。
[0261] 在本發(fā)明的某些實施方式中，利用本文描述的方法或本領(lǐng)域已知的其他將T細胞 擴張至治療性水平的方法活化和擴張的細胞，與任何數(shù)量的有關(guān)治療形式結(jié)合（例如，之 前、同時或之后）施用給患者，所述治療形式包括但不限于用試劑進行治療，諸如抗病毒療 法、西多福韋和白細胞介素-2、阿糖胞苷（也已知為ARA-C)或?qū)S患者的那他珠單抗治療 或?qū)εＦぐ_患者的厄法珠單抗治療或?qū)ML患者的其他治療。在進一步的實施方式中，本 發(fā)明的T細胞可與以下結(jié)合使用：化療、輻射、免疫抑制劑，諸如，環(huán)孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨 喋呤、麥考酚酯和FK506,抗體或其他免疫燒蝕劑諸如CAM PATH、抗-CD3抗體或其他抗體療 法、細胞毒素、氟達拉濱、環(huán)孢菌素、FK506、雷帕霉素、麥考酚酸、類固醇類、FR901228、細胞 因子和照射。這些藥物抑制鈣依賴性磷酸酶--I丐調(diào)磷酸酶（環(huán)孢菌素和FK506)或抑制對 生長因子誘導的信號傳導重要的P70S6激酶（雷帕霉素）（Liu等，Cell66:807-815, 1991 ; Henderson 等，Tmmun. 73:316-321, 1991 ;Bierer 等，Curr. Opin, Tmmun. 5:763-773, 1993) 〇 在進一步的實施方式中，本發(fā)明的細胞組合物與骨髓移植、利用化療劑諸如氟達拉濱、外部 光束放射療法（XRT)、環(huán)磷酰胺或抗體諸如0KT3或CAMPATH的T細胞燒蝕療法結(jié)合（例如， 之前、同時或之后）而施用給患者。在另一個實施方式中，本發(fā)明的細胞組合物在B-細胞 燒蝕療法諸如與CD20反應的試劑例如Rituxan后進行施用。例如，在一個實施方式中，對 象可經(jīng)歷高劑量化療，之后進行外周血干細胞移植的標準治療。在一些實施方式中，在移植 后，對象接受本發(fā)明的擴張的免疫細胞的注入。在一個額外的實施方式中，擴張的細胞在外 科手術(shù)前或外科手術(shù)后施用。
[0262] 施用給患者的以上治療的劑量將隨著治療狀況的精確屬性和治療的接受者而變 化。人施用的劑量比例可根據(jù)本領(lǐng)域接受的實踐實施。例如，CAMPATH的劑量對于成人患 者將通常在1至大約l〇〇mg的范圍中，通常每天施用，持續(xù)1和30天之間的時期。盡管在 一些例子中可使用上至40mg每天的較大劑量（美國專利號6, 120, 766中描述），但優(yōu)選的 日劑量為1至l〇mg每天。
[0263] 實驗實施例
[0264] 本發(fā)明通過參考以下實驗實施例進一步詳細地進行描述。這些實施例僅出于說明 性的目的提供，并不意欲為限制性的，除非另有規(guī)定。因此，本發(fā)明決不應被解釋為限于以 下實施例，而是應被解釋為包括由于本文提供的教導變得顯而易見的任何和全部的變化。
[0265] 沒有進一步的描述，相信利用先前的描述和以下的說明性實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可制造和利用本發(fā)明的化合物，并實踐請求保護的方法。以下工作實施例因此具體指出 本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，并不解釋為以任何方式限制本公開背景的剩余部分。
[0266] 實施例1 :用含有IC0S共刺激結(jié)構(gòu)域的CAR的Thl7細朐的改奪增強Thl7細朐的 功能、抗腫瘤活件和持久件。
[0267] 體外極化和擴張的大量Thl7細胞的過繼轉(zhuǎn)移是有吸引力的用于治療癌癥的療 法。⑶278,可誘導的共刺激分子（IC0S)已經(jīng)顯示為對于人Thl7細胞在它們初級活化之后 的持續(xù)的擴張是關(guān)鍵的。分析無論在嵌合抗原受體中是否并入IC0S細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域都可促 進抗原觸發(fā)之后的Thl7表型并且增強抗工程化的T細胞療法的抗腫瘤活性。
[0268] 現(xiàn)在描述在這些實驗中采用的物質(zhì)和方法。
[0269] Thl7和Tcl7細朐的分離、極化、轉(zhuǎn)導和擴張
[0270] 從賓夕法尼亞大學的人免疫學中心獲得血液樣品。使用RosetteSep Kits (干細 胞技術(shù)）陰性分離外周血⑶4+和⑶8+T細胞。在37°C和5% C02的培養(yǎng)箱中，在補充10% FCS、100-U/ml青霉素、100μ g/ml硫酸鏈霉素、10mM ifepes的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)細 胞。為了刺激，用以1:3的細胞與珠的比例包被針對⑶3和IC0S抗體的激活珠，培養(yǎng)⑶4+ 和 CD8+T 細胞。為了 Thl7 和 Tcl7 極化，在第 0 天添加 IL-lb(10ng/ml)、IL-6(10ng/ml)、 IL-23(20ng/ml)，和針對 IL-4 和 IFN-γ 的中和抗體（10mg/ml) (eBioscience)并且在整 個實驗中保持。所有實驗用含有內(nèi)源TGF-b來源的胎牛血清進行。在活化后第3天添加人 IL-2 (Chiron)至50IU/ml的終濃度。在活化之后約24h，以5的Μ0Ι用慢病毒載體轉(zhuǎn)導T 細胞。細胞計數(shù)和每2天進料并且一旦T細胞好像靜止，如通過減少的生長動力學和細胞 尺寸二者確定，它們用于功能試驗或冷凍保存。
[0271] T細朐增葙試駘
[0272] 用SS1融合蛋白轉(zhuǎn)導的冷凍保存的T細胞被解凍，沖洗，并且放置培養(yǎng)12h。T細 胞（4X10 5)與2X105K562.meso共培養(yǎng)。在指示的時間點，通過苔酚藍排斥對有活力的細 胞計數(shù)。細胞每2天用具有外源性細胞因子的新鮮培養(yǎng)基進料。
[0273] 再刺激的T細朐的細朐閔子產(chǎn)牛和細朐內(nèi)染色
[0274] 用SS1融合蛋白轉(zhuǎn)導的冷凍保存的T細胞被解凍，沖洗，并且放置培養(yǎng)16h。然后， 在T細胞中檢查SSlscFv融合蛋白的表達并且歸一化為對于所有的受體的60 %嵌合受體表 達。T細胞（4X105)然后與2父1051(562、1(562.11168〇、或腫瘤細胞共培養(yǎng)并且2411后收獲上 清液。使用 DuoSel? ELISA 開發(fā)系統(tǒng)測定 IL-17A、IL17-F、IL-2、IFN- γ、TNF- α 和 CCL20 的濃度。使用人IL-21ELISA Ready-SET-Go ! Set測定IL-21的濃度。
[0275] 抗體
[0276] 下列綴合的抗體購買自 BD Biosciences :抗 CD8 (FICT)、抗 CD4 (PerCp_Cy5. 5)、抗 CCR7(PE)?？笴D45R0(Alexa Fluor647)購買自 Biolegend?？笴D27(V450)和抗CD4(APC-H7) 購買自BD Bioscience?？耿?61PE購買自R&D。山羊抗小鼠 IgG血清的生物素化的 F(ab'）2片段（特異性針對鼠源的scFv)購買自Jackson ImmunoResearch。鏈霉抗生物素 (eFluor710)購買自 eBioscience，和鏈霉抗生物素（V450)購買自 BD Biosciences。
[0277] 流式細朐術(shù)某試駘以量化細朐-介導的細朐溶解
[0278] 靶細胞（L55)用CFSE染色并且以50, 000個細胞/孔種在96孔平板中。冷凍保存 的用SS1融合蛋白轉(zhuǎn)導的T細胞被解凍，沖洗，并且放置培養(yǎng)16h。然后，效應子和CFSE-標 記的靶細胞以一定的E:T范圍雙份共培養(yǎng)。培養(yǎng)物在37°C在5% C02下溫育4h。然后通過 胰酶消化和沖洗收集總的細胞。然后用抗CD45抗體染色T細胞30分鐘。沖洗之后，DNA嵌 入染料7AAD被添加至樣品，以區(qū)分死的和活的細胞事件。最后，沖洗細胞并且重新懸浮在 0. 4ml的1% HuSA PBS中和對珠計數(shù)。染色之后，樣品放置在冰上并且立即在LSRII Flow 細胞計數(shù)器上收集數(shù)據(jù)。每個樣品收集4000個珠子。
[0279] 流式細朐術(shù)分析
[0280] 為了評估表面表達，細胞在指示的時間點染色。各種SSlscFv融合蛋白在T細胞 上的表達使用生物素化的山羊抗小鼠 IgG檢測隨后用鏈霉抗生物素（V450)或鏈霉抗生物 素（eFluor710)染色。在LSRII流式細胞計數(shù)器使用DiVa軟件（BD Biosciences)分析樣 品，并且使用Flowjo軟件（TreeStar)評估結(jié)果。
[0281]
[0282] 賓夕法尼亞大學協(xié)會動物護理和使用委員會批準了所有動物實驗。NSG小鼠購買 自Jackson實驗室并且在賓夕法尼亞大學的飼養(yǎng)室飼養(yǎng)。小鼠圈養(yǎng)在微型隔離籠中的無病 原體條件下并且給予自由采食高壓滅菌的食物和酸化的水的自由。
[0283] 抗間皮蛋白CAR T細朐的體內(nèi)評估
[0284] 在存在PBS中50 % Matrigel溶液（BD Biosciences)的情況下皮下注射 5X 106M108細胞建立異種移植腫瘤。允許M108腫瘤在NSG小鼠中生長8周。
[0285] 為了評估改變的Thl7_Tcl7的瘤內(nèi)效果，用在61和67天2個瘤內(nèi)注射10X106T 細胞（Thl7:Tcl7以1:1比例）或PBS治療小鼠。
[0286] 用測徑器測量腫瘤維度，和使用公式V = 1/2XLXWXW計算腫瘤體積，其中L是 長度（最長維度）和W是寬度（最短維度）。在治療之后的第21和51天分別從眼球后出 血或心臟內(nèi)穿刺獲得外周血，和染色用于人⑶45、⑶4和⑶8T細胞的存在。在對人⑶45+群 體設門之后，使用 TruCount tubes (BD Biosciences)量化 CD4+和 CD8+子集。
[0287] 樣品收集
[0288] 來自三個不同的正常供體和用SSl-28z、SSl-BBz和SSl-ICOSz改變的Thl7細胞 被解凍和在補充10% FCS的RMPI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。然后，改變的Thl7細胞用源自 固定的酵母的重組體間皮蛋白刺激。在刺激之前的第〇天，和抗原識別后的4h、8h、24h和 4天收集細胞小球并且冷凍。
[0289] 微陣列靶制各和雜奪
[0290] 通過UPenn微陣列設施提供微陣列服務，包括通過Agilent Bioanalyzer和 Nanodrop分光光度法的總RNA樣品的質(zhì)量對照測試。如在AfTymetrix GeneChip表達分 析技術(shù)手冊中描述進行所有的方案。簡單地說，l〇〇ng的總RNA使用并入T7啟動子序列的 poly(T)和隨機低聚物啟動的逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)化成第一鏈cDNA。使用用于每個轉(zhuǎn)錄體的線性擴 增的T7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄之后是第二鏈cDNA合成，并且所得cRNA轉(zhuǎn)化成cDNA，片段化， 由Bioanalyzer評估，并且通過末端轉(zhuǎn)移酶末端標記生物素化。cRNA產(chǎn)量范圍從36-89ug， 并且cDNA添加至Affymetrix雜交混合物，在99°C下加熱5min并且在45°C下與人基因 LOST GeneChips(Affymetrix Inc. , Santa Clara CA)雜交 16h。然后在低（6X SSPE)和 高（100mM MES，0. 1M NaCl)嚴格性下沖洗微陣列并且用鏈霉抗生物素-藻紅蛋白染色。通 過添加生物素化的抗鏈霉抗生物素和另外的等分試樣的鏈霉抗生物素藻紅蛋白染色擴增 熒光。在570nm激發(fā)之后共焦掃描儀用于收集熒光信號。
[0291] 數(shù)據(jù)分析
[0292] Affymetrix命令控制臺和表達控制臺用于量化祀向基因的表達水平； Affymetrix提供的默認值用于所有分析參數(shù)。移除邊界像素，并且對每個探針計算75%內(nèi) 的平均強度像素。將出現(xiàn)在每個16微陣列區(qū)域的平均最低2%的探針強度設置為背景并 且減去該區(qū)域的所有特征。在表達控制臺中檢測陽性和陰性對照的探針組，并且設施質(zhì)量 控制參數(shù)被確認落入正常范圍。平均每個靶向基因的探針并且使用RMA算法進行陣間歸一 化。
[0293] 現(xiàn)在描述實驗的結(jié)果。
[0294] 結(jié)果
[0295] Thl7極化的細胞被工程化以表達單鏈可變片段，其結(jié)合與⑶28、⑶137 (41BB) 或CD278(IC0S)細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域串聯(lián)的融合至T細胞受體-ζ信號轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域的間皮蛋白 (SS1)。含有SSl-ICOS-z CAR的cDNA序列被克隆進入第三代慢病毒載體并且在EF-1啟動 子的控制下表達。SSl-ICOS-z含有⑶8前導序列、識別人間皮蛋白的SS1單鏈片段、⑶8 α 鏈的鉸鏈區(qū)、IC0S跨膜和細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、和TCR-z信號轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域。（圖1)。
[0296] 序列標示符
[0297]

【權(quán)利要求】
1. 編碼嵌合抗原受體（CAR)的分離的核酸序列，其中所述CAR包括抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨 膜結(jié)構(gòu)域和ICOS細胞內(nèi)信號傳導結(jié)構(gòu)域。
2. 權(quán)利要求1所述的分離的核酸序列，進一步包括CD3(信號傳導結(jié)構(gòu)域。
3. 權(quán)利要求1所述的分離的核酸序列，包括SEQ ID N0:8的核酸序列。
4. 權(quán)利要求1所述的分離的核酸序列，其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是抗體或其抗原結(jié)合 片段。
5. 權(quán)利要求4所述的分離的核酸序列，其中所述抗原結(jié)合片段是Fab或scFv。
6. 權(quán)利要求1所述的分離的核酸序列，其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合腫瘤抗原。
7. 權(quán)利要求1所述的分離的核酸序列，進一步包括包含共刺激分子的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的 共刺激信號傳導區(qū)，所述共刺激分子選自CD27、CD28、4-1BB、0X40、CD30、CD40、PD-1、淋巴 細胞功能相關(guān)抗原-1 (LFA-1)、⑶2、⑶7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特異性結(jié)合⑶83的配體，和 其任意組合。
8. 權(quán)利要求1所述的分離的核酸序列，其中所述IC0S細胞內(nèi)信號傳導結(jié)構(gòu)域由SEQ ID NO:6的核酸序列編碼。
9. 權(quán)利要求2所述的分離的核酸序列，其中所述CD3 4信號傳導結(jié)構(gòu)域由SEQ ID N0:7 的核酸序列編碼。
10. 細胞，其包括編碼嵌合抗原受體（CAR)的核酸序列，其中所述CAR包括抗原結(jié)合結(jié) 構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和IC0S細胞內(nèi)信號傳導結(jié)構(gòu)域。
11. 權(quán)利要求10所述的細胞，其中所述CAR進一步包括⑶3ζ信號傳導結(jié)構(gòu)域。
12. 權(quán)利要求10所述的細胞，其中所述核酸序列包括SEQ ID Ν0:8的核酸序列。
13. 權(quán)利要求10所述的細胞，其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是抗體或其抗原結(jié)合片段。
14. 權(quán)利要求13所述的細胞，其中所述抗原結(jié)合片段是Fab或scFv。
15. 權(quán)利要求10所述的細胞，其中所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合腫瘤抗原。
16. 權(quán)利要求10所述的細胞，其中所述CAR進一步包括包含共刺激分子的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu) 域的共刺激信號傳導區(qū)，所述共刺激分子選自⑶27、⑶28、4-1ΒΒ、0X40、⑶30、⑶40、ro-1、 淋巴細胞功能相關(guān)抗原-1 (LFA-1)、⑶2、⑶7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特異性結(jié)合⑶83的配 體，和其任意組合。
17. 權(quán)利要求10所述的細胞，其中所述IC0S細胞內(nèi)信號傳導結(jié)構(gòu)域由SEQ ID N0:6的 核酸序列編碼。
18. 權(quán)利要求11所述的細胞，其中所述⑶3 ζ信號傳導結(jié)構(gòu)域由SEQ ID N0:7的核酸 序列編碼。
19. 權(quán)利要求10所述的細胞，其中所述細胞選自Thl7細胞和Tcl7細胞。
20. 權(quán)利要求10所述的細胞，其中當所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合其相應的抗原時，所述 細胞展示抗腫瘤免疫性。
21. 用于哺乳動物中刺激T細胞介導的對靶細胞群體或組織的免疫應答的方法，所述 方法包括向哺乳動物施用有效量的基因修飾以表達CAR的細胞，其中所述CAR包括抗原結(jié) 合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和IC0S細胞內(nèi)信號傳導結(jié)構(gòu)域。
22. 權(quán)利要求21所述的方法，其中所述CAR進一步包括⑶3 ζ信號傳導結(jié)構(gòu)域。
23. 哺乳動物中提供抗腫瘤免疫性的方法，所述方法包括向所述哺乳動物施用有效量 的基因修飾以表達CAR的細胞，其中所述CAR包括抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和ICOS細 胞內(nèi)信號傳導結(jié)構(gòu)域，從而在所述哺乳動物中提供抗腫瘤免疫性。
24. 權(quán)利要求23所述的方法，其中所述CAR進一步包括⑶3 ζ信號傳導結(jié)構(gòu)域。
25. 治療具有與升高的腫瘤抗原表達相關(guān)的疾病、病癥或狀況的哺乳動物的方法，所述 方法包括向所述哺乳動物施用有效量的基因修飾以表達CAR的細胞，其中所述CAR包括抗 原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和IC0S細胞內(nèi)信號傳導結(jié)構(gòu)域，從而治療所述哺乳動物。
26. 權(quán)利要求25所述的方法，其中所述CAR進一步包括⑶3 ζ信號傳導結(jié)構(gòu)域。
27. 權(quán)利要求25所述的方法，其中所述細胞選自自體Thl7細胞和自體Tcl7細胞。
28. 治療具有癌癥的人的方法，所述方法包括向所述人施用基因改造的表達CAR的細 胞，其中所述CAR包括抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和IC0S細胞內(nèi)信號傳導結(jié)構(gòu)域，其中所 述細胞選自Thl7細胞和Tcl7細胞。
29. 權(quán)利要求28所述的方法，其中所述CAR進一步包括CD3 ζ信號傳導結(jié)構(gòu)域。
30. 權(quán)利要求28所述的方法，其中所述人抵抗至少一種化療劑。
31. 在診斷有癌癥的人中產(chǎn)生基因改造的Τ細胞的持續(xù)性群體的方法，所述方法包括 向所述人施用基因改造的表達CAR的細胞，其中所述CAR包括抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域 和IC0S細胞內(nèi)信號傳導結(jié)構(gòu)域，其中所述基因改造的細胞的持續(xù)性群體在施用之后在所 述人中持續(xù)至少一個月，并且其中所述細胞選自Thl7細胞和Tcl7細胞。
32. 權(quán)利要求31所述的方法，其中所述CAR進一步包括⑶3 ζ信號傳導結(jié)構(gòu)域。
33. 權(quán)利要求31所述的方法，其中所述基因改造的Τ細胞的持續(xù)性群體包括選自下述 的至少一種細胞：施用至所述人的細胞、施用至所述人的細胞的子代，和其組合。
34. 權(quán)利要求31所述的方法，其中所述基因改造的Τ細胞的持續(xù)性群體包括記憶Τ細 胞。
35. 權(quán)利要求31所述的方法，其中所述基因改造的Τ細胞的持續(xù)性群體在施用之后在 所述人中持續(xù)至少三個月。
36. 權(quán)利要求31所述的方法，其中所述基因改造的Τ細胞的持續(xù)性群體在施用之后 在所述人中持續(xù)至少四個月、五個月、六個月、七個月、八個月、九個月、十個月、十一個月、 十二個月、兩年或三年。
37. 權(quán)利要求31所述的方法，其中所述癌癥被治療。
38. 在診斷有癌癥的人中擴張基因改造的Τ細胞群體的方法，所述方法包括向所述人 施用基因改造的表達CAR的細胞，其中所述CAR包括抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和IC0S 細胞內(nèi)信號傳導結(jié)構(gòu)域，其中所述施用的基因改造的細胞選自Thl7細胞和Tcl7細胞，進一 步其中所述施用的基因改造的細胞在所述人中產(chǎn)生子代T細胞的群體。
39. 權(quán)利要求38所述的方法，其中所述CAR進一步包括⑶3 ζ信號傳導結(jié)構(gòu)域。
40. 權(quán)利要求38所述的方法，其中所述人中的所述子代Τ細胞包括記憶Τ細胞。
41. 權(quán)利要求38所述的方法，其中所述細胞是自體細胞。
42. 權(quán)利要求38所述的方法，其中所述子代Τ細胞的所述群體在施用之后在所述人中 持續(xù)至少三個月。
43. 權(quán)利要求38所述的方法，其中所述子代Τ細胞的所述群體在施用之后在所述人中 持續(xù)至少四個月、五個月、六個月、七個月、八個月、九個月、十個月、i^一個月、十二個月、兩 年或三年。
44.權(quán)利要求38所述的方法，其中所述癌癥被治療。
【文檔編號】C07K14/705GK104159917SQ201380010754
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2013年2月22日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月22日
【發(fā)明者】C·H·瓊, S·格丹卡里奧, Y·趙, J·朔勒 申請人:賓夕法尼亞大學董事會