專利名稱：一種輔助診斷肝細胞癌的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種輔助診斷肝細胞癌的試劑盒。
背景技術：
肝細胞癌(h印atocellular carcinoma,HCC)是一種常見的、致死率極高的惡性腫 瘤，每年約650， 000人死于HCC，且其發(fā)病率有增高的趨勢。該病多發(fā)于東南亞和非洲，其 中約有50%以上發(fā)生于中國，位居我國癌癥死亡率的第二位。HCC早期診斷較難，病情進展 快，預后水平低。手術切除一直被認為是HCC獲得根治的最佳手段，但是僅有10-20%的病 人適合通過手術來干預；除此之外，即使是根治性切除，5年內(nèi)仍有60_70%的病人會出現(xiàn) 轉(zhuǎn)移復發(fā)而危及生命，而局部治療的轉(zhuǎn)移復發(fā)率則更高。HCC的轉(zhuǎn)移是影響治療效果和預后 的最大障礙，是導致其高死亡率的主要原因。 近年來，針對HCC的轉(zhuǎn)移進行了大量研究并找到了許多重要的分子，如黏附分 子、細胞骨架及調(diào)節(jié)蛋白、基質(zhì)降解酶、癌基因及抑癌基因、血管生成的調(diào)控因子、腫瘤免疫 相關分子等。也即HCC的轉(zhuǎn)移過程與腫瘤細胞的黏附運動、細胞增殖、細胞外基質(zhì)、機體免 疫、腫瘤血管生成等多因素有關。盡管對HCC轉(zhuǎn)移進行了大量研究，但目前HCC轉(zhuǎn)移的分子 機制仍不明確，尚未發(fā)現(xiàn)預測HCC復發(fā)轉(zhuǎn)移的分子標志物和有效的治療靶標。
甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)是目前最常用的HCC診斷標志物，但是AFP 作為目前HCC篩查和病情監(jiān)測一個最主要的生物標志物仍不理想，其診斷靈敏度、特異性 和陽性預測率分別只有39% -65%、76% -94%和9% -50%。而且即使AFP陽性，也不能判 斷HCC有無轉(zhuǎn)移。除AFP外，根據(jù)美國FDA規(guī)定進入11 、 111期研究的還有AFP-L3 (AFP異 質(zhì)體3) 、 DCP ( y -脫羧基凝血酶原)、IGF-1 (胰島素樣生長因子-1)，此外有研究報道但未 進一步研究驗證的還有數(shù)十種標志物。但這些標志物在診斷HCC的靈敏度和特異性方面都 很有限，特別是不能滿足HCC早期、轉(zhuǎn)移以及復發(fā)診斷的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種輔助診斷肝細胞癌或輔助診斷肝細胞癌細胞轉(zhuǎn)移的 試劑盒。 本發(fā)明提供的試劑盒包括檢測Rab27B基因表達所用的化合物。
上述檢測Rab27B基因表達所用的化合物為以下1)或2):
1)檢測Rab27B基因的cDNA的PCR引物；
2)檢測Rab27B蛋白的單克隆抗體或多克隆抗體。 上述檢測Rab27B蛋白的單克隆抗體或多克隆抗體均可從商業(yè)途徑獲得。 上述Rab27B蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示；所述Rab27B基因是所述
Rab27B蛋白的編碼基因，優(yōu)選是序列表中序列1所示的基因。 上述試劑盒還包括酶聯(lián)免疫吸附劑測定(ELISA)所用的顯色液。 上述試劑盒還包括酶聯(lián)免疫吸附劑測定(ELISA)所用的反應終止液。
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上述的檢測Rab27B基因表達所用的化合物在制備如下1)或2)的試劑盒中的應
用也屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi) 1)輔助診斷肝細胞癌的試劑盒； 2)輔助診斷肝細胞癌細胞轉(zhuǎn)移的試劑盒。 上述檢測Rab27B基因表達所用的化合物為以下1)或2): 1)檢測Rab27B基因的cDNA的PCR引物； 2)檢測Rab27B蛋白的單克隆抗體或多克隆抗體。 上述檢測Rab27B蛋白的單克隆抗體或多克隆抗體均可從商業(yè)途徑獲得。 上述Rab27B蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示；所述Rab27B基因是所述
Rab27B蛋白的編碼基因，優(yōu)選是序列表中序列1所示的基因。 上述試劑盒還包括酶聯(lián)免疫吸附劑測定(ELISA)所用的顯色液。 上述試劑盒還包括酶聯(lián)免疫吸附劑測定(ELISA)所用的反應終止液。 實驗證明LMS組(采血時兩年內(nèi)無復發(fā)轉(zhuǎn)移組)Rab27B蛋白的濃度平均值為
2.08ng/iU， HMS組(采血時一年內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移組)為7.03ng/iU， AMS組(采血時已經(jīng)發(fā)
生轉(zhuǎn)移組)為17.80ng/iU，三組間的蛋白含量差異顯著。通過ROC曲線分析，將LMS組
作為陰性病例，AMS組和HMS組作為陽性病例計算得出診斷的最佳工作點為診斷特異度是
97. 06% ，靈敏度為63. 64% ;將LMS和HMS組作為陰性病例，AMS組作為陽性病例計算得出
診斷的最佳工作點為診斷特異度是98. 53% ，靈敏度為34. 38% ，因此Rab27B可作為診斷肝
細胞癌是否已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的潛在標志物。


圖1為不同HCC病人血清中Rab27B的蛋白含量。 圖2為ROC曲線分析Rab27B的診斷價值，(A) ROC分析Rab27B診斷轉(zhuǎn)移潛能LMS 組作為陰性病例，HMS和AMS組作為陽性病例；(B)ROC分析Rab27B診斷是否已經(jīng)轉(zhuǎn)移HMS 和LMS組作為陰性病例，AMS組作為陽性病例。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。 下述實施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。 實施例1、檢測不同肝細胞癌病人血清中Rab27B的蛋白含量本實施例使用的是酶聯(lián)免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbent assay,
ELISA)。 1、標準曲線的制作 分別取Rab27B標準蛋白(購自Santa Cruz公司，貨號sc-22993p)Ong、0. Olng、 0. 02ng、0. 05ng、0. lng、0. 2ng、0. 5ng、 lng、 1. 5ng禾P 2ng包被酶標板，每個梯度做2個平行 孔，4t:孵育過夜后，洗液洗滌3次；每孔加200ia 3%的牛血清白蛋白(Jackson公司) (BSA-IgG free)封閉，37。C孵育2h，洗滌3次；每孔加入Rab27B多抗(購自Santa Cruz 公司，貨號sc-22993) (1 : 1000PBS-BT稀釋)100iil，4。C孵育過夜后，洗滌3次；每孔加 入HRP-驢抗羊二抗(Jackson公司)(1 : 7500 PBS-BT稀釋)100 yl， 37。C孵育lh，洗滌3
4次；加入A、 B顯色液(北京康為世紀)(1 : 19) 100 1/孔，37t:顯色至藍色；加入終止液 80iil/孔，450nm波長測定0D值；繪制標準曲線。
2、肝細胞癌病人血清樣本 肝細胞癌病人血清收集自北京大學臨床腫瘤醫(yī)院，年齡為40至70歲，其中LMS組 (采血時兩年內(nèi)無復發(fā)轉(zhuǎn)移組)30例；HMS組(采血時一年內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移組)30例；AMS組(采 血時已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移組)30例。所有病例均經(jīng)手術及病理檢查確診。
3、測定病人血清樣本中Rab27B的含量(圖1) 血清樣本稀釋濃度(1 : 3500) ， 3組病人血清每例樣本每孔加入100 y 1包板，做 一個平行復孔，4t:孵育過夜后，洗液洗滌3次；每孔加200iil3^的牛血清白蛋白(BSA-IgG free)封閉，37。C孵育2h，洗滌3次；每孔加入Rab27B多抗(1 : 1000PBS-BT稀釋)100 yl， 4。C孵育過夜后，洗滌3次；每孔加入HRP-驢抗羊二抗(1 : 7500PBS-BT稀釋)100iil，37。C 孵育lh，洗滌3次；加入A、B顯色液(1 : 19)100iil/孔，37t:顯色至藍色；加入終止液 80iil/孔，450nm波長測定0D值；根據(jù)各自的0D值，計算各血清樣本中Rab27B的含量。結(jié) 果如圖1所示，根據(jù)所得到的Rab27B蛋白的標準曲線以及各組病人血清樣本所測得的OD 值，計算所得各組病人血清樣本中Rab27B蛋白的含量，其中LMS組Rab27B蛋白的濃度平均 值為2. 08ng/ii l，HMS組為7. 03ng/y l，AMS組為17. 80ng/y l，對各組樣本中Rab27B蛋白 含量進行統(tǒng)計學分析，發(fā)現(xiàn)各組之間的目的蛋白的含量差異具有顯著的統(tǒng)計學意義，也即 各組之間差異顯著。
4、統(tǒng)計學分析(圖2) 通過Excel軟件對各組病人血清樣本中Rab27B蛋白含量進行統(tǒng)計學描述分析，對 各組之間通過單因素方差分析各組間的差異；通過Gr即hPad Prism軟件繪制ROC曲線分 析Rab27B對于肝細胞癌轉(zhuǎn)移的鑒別診斷價值。結(jié)果如圖2所示A圖將LMS組作為陰性 病例，AMS組和HMS組作為陽性病例，分析結(jié)果可知曲線下面積為O. 9011，根據(jù)陽性似然 比(靈敏度/l-特異度)計算得出診斷的最佳工作點為診斷特異度是97.06%，靈敏度為 63. 64% ，因此Rab27B可作為診斷肝細胞癌轉(zhuǎn)移的潛在標志物。B圖將LMS和HMS組作為陰 性病例，AMS組作為陽性病例，分析結(jié)果可知曲線下面積為O. 9344，根據(jù)陽性似然比(靈敏 度A-特異度)計算得出診斷的最佳工作點為診斷特異度是98. 53%，靈敏度為34. 38%， 因此Rab27B可作為診斷肝細胞癌是否已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的潛在標志物。
權利要求
檢測Rab27B基因表達所用的化合物在制備如下1)或2)的試劑盒中的應用1)輔助診斷肝細胞癌的試劑盒；2)輔助診斷肝細胞癌細胞轉(zhuǎn)移的試劑盒。
2. 如權利要求l所述的應用，其特征在于所述檢測Rab27B基因表達所用的化合物為 以下l)或2):1) 檢測Rab27B基因的cDNA的PCR引物;2) 檢測Rab27B蛋白的單克隆抗體或多克隆抗體。
3. 如權利要求1或2所述的應用，其特征在于所述Rab27B蛋白的氨基酸序列如序列 表中序列2所示；所述Rab27B基因是所述Rab27B蛋白的編碼基因，優(yōu)選是序列表中序列1 所示的基因。
4. 如權利要求3所述的應用，其特征在于所述試劑盒還包括酶聯(lián)免疫吸附劑測定所 用的顯色液。
5. 如權利要求3或4所述的應用，其特征在于所述試劑盒還包括酶聯(lián)免疫吸附劑測 定所用的反應終止液。
6. —種輔助診斷肝細胞癌或輔助診斷肝細胞癌細胞轉(zhuǎn)移的試劑盒，包括檢測Rab27B 基因表達所用的化合物。
7. 如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述檢測Rab27B基因表達所用的化合物 為以下l)或2):1) 檢測Rab27B基因的cDNA的PCR引物;2) 檢測Rab27B蛋白的單克隆抗體或多克隆抗體。
8. 如權利要求6或7所述的試劑盒，其特征在于所述Rab27B蛋白的氨基酸序列如序 列表中序列2所示；所述Rab27B基因是所述Rab27B蛋白的編碼基因，優(yōu)選是序列表中序列 l所示的基因。
9. 如權利要求8所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括酶聯(lián)免疫吸附劑測定 所用的顯色液。
10. 如權利要求8或9所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括酶聯(lián)免疫吸附劑 測定所用的反應終止液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種輔助診斷肝細胞癌的試劑盒。本發(fā)明提供的試劑盒包括檢測Rab27B基因表達所用的化合物。上述的檢測Rab27B基因表達所用的化合物在制備輔助診斷肝細胞癌的試劑盒中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。上述檢測Rab27B基因表達所用的化合物為以下1)或2)1)檢測Rab27B基因的cDNA的PCR引物；2)檢測Rab27B蛋白的單克隆抗體或多克隆抗體。實驗證明LMS組(采血時兩年內(nèi)無復發(fā)轉(zhuǎn)移組)Rab27B蛋白的濃度平均值為2.08ng/μl，HMS組(采血時一年內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移組)為7.03ng/μl，AMS組(采血時已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移組)為17.80ng/μl，三組間的蛋白含量差異顯著。
文檔編號C12Q1/68GK101760557SQ201010118539
公開日2010年6月30日 申請日期2010年3月4日 優(yōu)先權日2010年3月4日
發(fā)明者姜穎, 孫薇, 賀福初, 魏漢東, 齊菲菲 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所