專利名稱：一種肝細(xì)胞癌相關(guān)蛋白hsp70的表達(dá)純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因重組技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種肝細(xì)胞癌相關(guān)蛋白HSP70的表達(dá)純化方法。
背景技術(shù)：
肝細(xì)胞癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，由于早期肝細(xì)胞癌不易發(fā)現(xiàn)，一旦出現(xiàn)癥狀，多已到達(dá)晚期。因此發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌早期診斷的腫瘤標(biāo)志物至關(guān)重要。有研究報(bào)道 HSP70基因在早期肝細(xì)胞癌中表達(dá)陽性率明顯高于癌旁組織，并且細(xì)胞內(nèi)HSP70表達(dá)增加與肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，且可能是肝細(xì)胞癌發(fā)展惡化的重要標(biāo)志(引自l、Wang SM, Ooi LL, Hui KM, et al. Identification and validation of a novel gene signature associated with the recurrence of human hepatocellular carcinoma[J]. Clin Cancer Res,2007,13(21) :6275-6283. ；2、Looi KS,Nakayasu ES,Diaz RA,et al. Using proteomic approach to identify tumor-associated antigens as markers in hepatocellular carcinoma [J], J proteome Res, 2008, 7 (9) :4004-4012.)其中 HSP70 為熱休克蛋白的一種，熱休克蛋白是一類在生物進(jìn)化中高度保守，廣泛存在于原核及真核生物中的蛋白質(zhì)，是生物細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的誘導(dǎo)產(chǎn)物。HSP70家族在進(jìn)化上高度保守，種屬間同源性高(引自蔣業(yè)貴，王宇明，李奇切.熱休克蛋白70在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其意義.免疫學(xué)雜志，2002; 18(1) :64-66)。通過制備肝細(xì)胞癌相關(guān)蛋白HSP70，可作為抗原免疫小鼠制備相應(yīng)的單克隆抗體，最終應(yīng)用于臨床作為早期肝細(xì)胞癌診斷的生物標(biāo)志物之一。在實(shí)踐上擁有巨大的應(yīng)用潛力，是當(dāng)前生物醫(yī)藥研究的熱點(diǎn)之一。本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是通過生物學(xué)軟件進(jìn)行分析成功選取HPS70抗原性強(qiáng)的部分設(shè)計(jì)引物后合成此目的片段后構(gòu)建重組質(zhì)粒以及重組蛋白的表達(dá)以及純化方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于制備肝細(xì)胞癌相關(guān)蛋白HSP70作為抗原制備相應(yīng)的抗體，最終作為早期肝細(xì)胞癌診斷的指標(biāo)，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明提供了一種肝細(xì)胞癌相關(guān)蛋白HSP70的表達(dá)純化方法，包括以下步驟(1)目的基因HSP70的合成；(2)分別雙酶切HSP70基因與載體，連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化宿主菌，構(gòu)建HSP70基因工程菌；(3)培養(yǎng)HSP70基因工程菌，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白；(4)純化所得融合蛋白；其中，上述步驟⑴所述的目的基因的合成為設(shè)計(jì)上游弓丨物CGGAATTCCACGGCAAGGTGGAGA下游引物為CCCTCGAGTTACTGCGAGTCGTTGAAGTA。從Hela細(xì)胞系中提取總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后所得cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性8min，94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，共30個(gè)循環(huán)，最后 72°C后延伸8min。上述步驟(2)所述載體為pET3h及PGEX-4T-1，所用的限制性內(nèi)切酶為EcoRI和 ιοΙ，所用宿主菌為大腸桿菌。上述步驟C3)所述的培養(yǎng)工程菌的培養(yǎng)基為LB液體培養(yǎng)基，誘導(dǎo)溫度為30°C，誘導(dǎo)時(shí)間為4h。上述步驟(4)所述的純化方法為將誘導(dǎo)后的菌液分裝在離心管中4°C離心， 2164g, IOmin0用PBS緩沖液重懸加入蛋白酶抑制劑(PMSF)后反復(fù)凍融8次，進(jìn)行超聲處理至SDS-PAGE顯示沉淀中蛋白純度> 80%。將沉淀最后用6M尿素溶解。另一方面，本發(fā)明還提供了上述表達(dá)純化方法制得的肝細(xì)胞癌相關(guān)蛋白HSP70的單克隆抗體用作肝細(xì)胞癌早期診斷的生物標(biāo)志物的用途。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為所選取的序列為HSP70的人源序列且通過生物學(xué)軟件分析后使用的是與小鼠同源性低，免疫原性好的區(qū)域，這樣最后表達(dá)出的HSP70蛋白可以用來免疫， 制備相應(yīng)的單克隆抗體。目前HSP70的表達(dá)方法一般為選取目的片段后經(jīng)過酶切與只有一種HIS標(biāo)簽的PET3M載體質(zhì)粒相連接，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，誘導(dǎo)結(jié)束后，超聲破碎，離心收集，將收集的上清液按法瑪西亞公司的HISTrap純化試劑盒操作說明進(jìn)行純化。并且需要摸索純化的最佳條件。而本專利所采用的是分別與帶有兩種標(biāo)簽的表達(dá)載體相連接，一種可以用來免疫，一種可以用來篩選，解決了后續(xù)單抗篩選中抗標(biāo)簽抗體的干擾。本專利中純化蛋白所用的方法相對于目前應(yīng)用的方法比較簡單，并且節(jié)約成本，不需要購買純化試劑盒，只需反復(fù)凍融后在冰浴中超聲，最后離心用6M尿素溶解即可獲得純度大于80%的純化蛋白可以用于小鼠的免疫。與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明有如下優(yōu)點(diǎn)(1)通過相關(guān)的生物學(xué)軟件選取與小鼠同源性低且免疫原性好的區(qū)域進(jìn)行特異的引物設(shè)計(jì)，通過原核表達(dá)目的蛋白且將其純化后的融合蛋白作為抗原免疫小鼠制備相應(yīng)的單克隆抗體為后續(xù)制備肝細(xì)胞癌早期診斷試劑盒提供原料，奠定基礎(chǔ)。(2)本專利中所述的HSP70蛋白純化方法簡單，所需成本低，且HSP70蛋白經(jīng)純化后的純度可以用來免疫小鼠用于單克隆抗體的制備。


圖1示出的是本發(fā)明選取的HSP70基因序列表。圖2示出了人HSP70基因PCR擴(kuò)增結(jié)果的電泳圖。其中，1 :HSP70PCR產(chǎn)物，M :DNA Marker0圖3示出了重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定的電泳圖。其中，1 :pET32a-HSP70重組質(zhì)粒雙酶切，2 :pGEX-4T-l_HSP70重組質(zhì)粒雙酶切，M DNA Marker。圖 4 示出了 pET3h_HSP70 重組蛋白的 SDS-PAGE 圖。其中，M =Marker, 1,3,5,7 誘導(dǎo)前菌液SDS-PAGE圖，2，4，6，8 誘導(dǎo)后重組蛋白的 SDS-PAGE 圖，9 空 BL21 菌 SDS-PAGE 圖。圖 5 示出了 pGEX-4T-l-HSP70 重組蛋白 SDS-PAGE 圖。
其中，M =Marker, 1,3,5,7 誘導(dǎo)前菌液SDS-PAGE圖，2，4，6，8 誘導(dǎo)后重組蛋白的 SDS-PAGE 圖，9 空 BL21 菌 SDS-PAGE 圖。圖6是重組蛋白經(jīng)純化后的SDS-PAGE圖其中，1 純化后重組蛋白，M =Marker。
具體實(shí)施例方式HSP70的核苷酸序列為CACGGCAA GGTGGAGATC ATCGCCAACG ACCAGGGCAA CCGCACCACC CCCAGCTACGTGGCCTTCAC GGACACCGAG CGGCTCATCG GGGATGCGGC CAAGAACCAG GTGGCGCTGAACCCGCAGAA CACCGTGTTT GACGCGAAGC GGCTGATCGG CCGCAAGTTC GGCGACCCGGTGGTGCAGTC GGACATGAAG CACTGGCCTT TCCAGGTGAT CAACGACGGA GACMGCCCAAGGTGCAGGT GAGCTACAAG GGGGAGACCA AGGCATTCTA CCCCGAGGAG ATCTCGTCCATGGTGCTGAC CAAGATGAAG GAGATCGCCG AGGCGTACCT GGGCTACCCG GTGACCAACGCGGTGATCAC CGTGCCGGCC TACTTCAACG ACTCGCAGHSP70的氨基酸序列為HGKVEIIA NDQGNRTTPS YVAFTDTERL I⑶AAKNQVA LNPQNTVFDA KRLIGRKFGDPVVQSDMKHW PFQVIND⑶K PKVQVSYKGE TKAFYPEEIS SMVLTKMKEI AEAYLGYPVTNAVITVPAYF NDSQ根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列初步估算蛋白質(zhì)的分子量為14.7kDa，則含有HIS標(biāo)簽的蛋白分子量為14. 7+20 = 34. 7kDa，如圖4中所示，含有GST標(biāo)簽的蛋白分子量大約為 14. 7+26 = 40. 7kDa。如圖5所示。最終證明經(jīng)誘導(dǎo)后所獲得的蛋白的確是HSP70蛋白。實(shí)施例1重組質(zhì)粒pET3h-HSP70 及 pGEX-4T-l_HSP70 的構(gòu)建1.目的基因HSP70的合成設(shè)計(jì)上游引物CGGAATTCCACGGCAAGGTGGAGA下游引物為CCCTCGAGTTACTGCGAGTCGTTGAAGTA。從Hela細(xì)胞系中提取總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后所得cDNA 為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性8min，94°C變性30s，58°C退火30s，72°C 延伸30s，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C后延伸8min。2.分別雙酶切HSP70基因與pET3h及pGEX_4T_l載體，連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化宿主菌，構(gòu)建HSP70基因工程菌；實(shí)施例2HSP70融合蛋白的表達(dá)純化1培養(yǎng)HSP70基因工程菌，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白；誘導(dǎo)溫度為30°C，誘導(dǎo)時(shí)間為 4h。2純化所得融合蛋白將誘導(dǎo)后的菌液分裝在離心管中4°C離心，2164g，10min。用 PBS緩沖液重懸加入蛋白酶抑制劑(PMSF)后反復(fù)凍融8次，進(jìn)行超聲處理至SDS-PAGE顯示沉淀中蛋白純度>80%。將沉淀最后用6M尿素溶解。
權(quán)利要求
1.一種肝細(xì)胞癌相關(guān)蛋白HSP70的表達(dá)純化方法，其特征在于包括如下步驟(1)目的基因HSP70的合成；(2)分別雙酶切HSP70基因與載體，連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化宿主菌，構(gòu)建HSP70基因工程菌；(3)培養(yǎng)HSP70基因工程菌，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白；(4)純化所得融合蛋白；其中，上述步驟(1)所述的目的基因的合成為設(shè)計(jì)上游引物 CGGAATTCCACGGCAAGGTGGAGA下游引物為 CCCTCGAGTTACTGCGAGTCGTTGAAGTA。從Hela細(xì)胞系中提取總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后所得cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性8min，94°C變性30s，58°C退火30s，72 °C延伸30s，共30個(gè)循環(huán)，最后 72°C后延伸8min。上述步驟⑵所述載體為PET3M及pGEX-4T-l，所用的限制性內(nèi)切酶為EcoRI和B10I， 所用宿主菌為大腸桿菌。上述步驟C3)所述的培養(yǎng)工程菌的培養(yǎng)基為LB液體培養(yǎng)基，誘導(dǎo)溫度為30°C，誘導(dǎo)時(shí)間為4h。上述步驟(4)所述的純化方法為將誘導(dǎo)后的菌液分裝在離心管中4°C離心，2164g， IOmin0用PBS緩沖液重懸加入蛋白酶抑制劑(PMSF)后反復(fù)凍融8次，進(jìn)行超聲處理至 SDS-PAGE顯示沉淀中蛋白純度> 80%。將沉淀最后用6M尿素溶解。
2.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)純化方法制得的肝細(xì)胞癌相關(guān)蛋白HSP70的單克隆抗體用作肝細(xì)胞癌早期診斷的生物標(biāo)志物的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種肝細(xì)胞癌相關(guān)蛋白HSP70的表達(dá)純化方法。該方法包括以下步驟合成目的基因HSP70；將基因與質(zhì)粒載體分別用EcoRI與XhoI進(jìn)行雙酶切后連接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，提取重組質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，然后純化。該純化后的蛋白可以用來免疫小鼠以制備相應(yīng)的單克隆抗體。
文檔編號G01N33/574GK102229941SQ20111014369
公開日2011年11月2日 申請日期2011年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月31日
發(fā)明者單瑞輝, 吳紅, 唐曉波, 李新禹, 李淑珍, 陳莉 申請人:哈爾濱醫(yī)科大學(xué)